CN114437974B - 芬氏纤维微菌属菌株及其在治理铬污染废水和土壤的应用 - Google Patents

芬氏纤维微菌属菌株及其在治理铬污染废水和土壤的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株芬氏纤维微菌属菌株，该菌株的分类命名为：芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)GRINML SWG3；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；地址为：中国武汉武汉大学；保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021990。本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株对Cr(Ⅵ)的耐受性极高，单独使用能促进土壤和废水中Cr(Ⅵ)的还原。该菌还可以通过还原体系中的Fe3+为Fe2+，利用生成的Fe2+对Cr(Ⅵ)的还原作用大幅度提高高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的还原能力和效率，适用于高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤以及Cr(Ⅵ)污染场地湿法解毒后高Fe3+环境下的治理。

Description

芬氏纤维微菌属菌株及其在治理铬污染废水和土壤的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术修复领域，涉及一株芬氏纤维微菌属菌株、培养方法以及利用该菌和Fe3+高效协同还原高毒性Cr(Ⅵ)的方法，可用于高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的治理以及Cr(Ⅵ)污染场地湿法解毒后高Fe3+环境下的治理。
背景技术
我国是世界铬盐生产和消费大国，在铬盐生产、电镀、制革等工业生产过程中产生了大量含铬废渣和废水，这些废渣的无序堆存和废水随意排放造成了土壤和水体铬污染严重。自然界中的铬通常以Cr(VI)形式存在，Cr(VI)的毒性是Cr(Ⅲ)的100倍。Cr(Ⅵ)的毒性极强，被列为对人体危害最大的8种化学物质之一，是国际公认的三种致癌金属物之一。因此，如何有效地将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，减少铬污染危害是铬污染治理的关键问题。
目前针对铬渣堆场Cr(Ⅵ)污染的治理多采用湿法解毒工艺，该法主要通过添加还原性化学药剂如FeS，FeSO4等及具有还原性的金属单质来治理铬渣堆场。然而经过湿法解毒后的铬污染土壤虽短时间内得到治理，但随着体系中Fe3+的大量生成，引起环境电位上升，出现大量的Cr(VI)返溶现象，因此需要对场地进行二次或多次治理。
利用微生物将毒害性大的Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，相比于传统修复方法，微生物法经济有效、操作方便，并且对环境友好，具有可持续性，利用微生物处理含铬工业废水及污染土壤具有广阔的应用前景。因此采用微生物治理湿法解毒后的铬污染土壤技术上是可行的。然而目前关于类似于湿法解毒后的Cr(VI)二次返溶土壤(Fe3+含量较高)是否同样可以采用微生物治理技术及Fe3+对微生物治理效果的影响报道较少，这限制了微生物法在高Fe3 +污染环境中的应用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株芬氏纤维微菌属菌株，该菌可将高毒性Cr(Ⅵ)还原为低毒性的Cr(Ⅲ)，可用于高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤治理。
本发明的第二个目的是提供一种可以富集培养上述芬氏纤维微菌属菌株的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述芬氏纤维微菌属菌株治理Cr(Ⅵ)污染废水的方法。
本发明的第四个目的是提供一种利用上述芬氏纤维微菌属菌株治理Cr(Ⅵ)污染土壤的治理方法。
本发明的第五个目的是提供一种利用上述芬氏纤维微菌属菌株及其协同Fe3+治理Cr(Ⅵ)污染土壤的治理方法。
为了实现上述目的，本发明提供一株芬氏纤维微菌属菌株，该菌株的分类命名为：芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)GRINML SWG3；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；地址为：中国武汉武汉大学；保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021990。
本发明还提供一种用于富集培养芬氏纤维微菌属菌株的培养基，该培养基配方为：葡萄糖2.0～4.0g/L，棉籽饼粉3.0～5.0g/L，Na2HPO4 0.5～1.0g/L，KCl0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，配置时将上述成分溶于水中，调整pH为6.5～7.2。
当用于培养芬氏纤维微菌属菌株时将上述成分溶于蒸馏水，当用于治理污水时将上述成分溶于废水。
本发明提供一种用于富集培养芬氏纤维微菌属菌株的培养方法，将芬氏纤维微菌属菌株接种至培养基中，在20～35℃的培养温度下，150～180rpm好氧震荡培养至对数期(OD600＝0.8～1.0)。
本发明还提供一种利用上述芬氏纤维微菌属菌株治理高浓度Cr(Ⅵ)污染废水的方法，将上述富集培养后的菌悬液接种至含有上述培养基成分的高浓度Cr(Ⅵ)污染废水中。
本发明还提供一种利用上述芬氏纤维微菌属菌株与Fe3+协同治理高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的治理方法。
利用芬氏纤维微菌属菌株与Fe3+协同治理高浓度Cr(Ⅵ)污染废水的方法，将含Fe3 +试剂和上述富集培养后的菌悬液加入至含有上述培养基成分的高浓度Cr(Ⅵ)污染废水中。
利用芬氏纤维微菌属菌株与Fe3+协同治理高浓度Cr(Ⅵ)污染土壤的方法，将含Fe3 +试剂和上述富集培养后的菌悬液接种至高浓度Cr(Ⅵ)污染土壤，并加入上述液体培养基。
进一步的，上述利用芬氏纤维微菌属菌株用于高浓度Cr(Ⅵ)污染废水的治理方法中，菌液接种量为5～15v/v％，Cr(Ⅵ)污染废水浓度为1～4000mg/L，水体pH值为3～9。
进一步的，上述利用芬氏纤维微菌属菌株用于高浓度Cr(Ⅵ)污染土壤的治理方法中，菌液接种量为5～20v/v％，Cr(Ⅵ)污染土壤浓度为50～3000mg/kg，土壤与溶液的质量体积比为1:1-5，水体pH值为3～9。
进一步的，上述利用芬氏纤维微菌属菌株与Fe3+协同治理高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的治理方法中，含Fe3+试剂为FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)2中的一种或多种，Fe3+浓度为0.5～8g/L。
进一步的，FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)2等均为可溶性的三价铁盐，当FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)2中的两种或三种混合时以任意比例混合均可。
本发明所用枯芬氏纤维微菌属菌株分离自青海某铬渣堆场Cr(Ⅵ)污染土壤。
本发明所用的枯芬氏纤维微菌属菌株具有较强的还原能力，可以将Cr(Ⅵ)还原为Cr(III)，同时在Fe3+存在的情况下将其还原为Fe2+，生成的Fe2+能作为电子供体进一步还原Cr(Ⅵ)，其本身又重新被氧化为Fe3+，接着菌株继续还原Fe3+为Fe2+，如此反复循环进行，从而促进了Cr(Ⅵ)的去除效率。
本发明的特点在于：
1)本发明提供了一株具有高效Cr(Ⅵ)还原能力的芬氏纤维微菌属菌株Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3及其分离筛选方法。
2)本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株能在较宽的pH值范围内(3～9)对Cr(Ⅵ)具有较高的耐受性，对Cr(Ⅵ)的耐受浓度高达4000mg/L。
3)本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株可以在有氧条件下快速地将高浓度高毒性的Cr(Ⅵ)还原，可用于高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的治理。
4)本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株协同Fe3+可以提高有氧条件下高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的还原能力和效率，可以在短时间内处理含Cr(Ⅵ)浓度为1～1000mg/L的废水和含Cr(Ⅵ)浓度为10～2000mg/kg的土壤。
5)本发明方法适用于湿法解毒后铬污染土壤及其他高Fe3+环境下的铬污染废水和土壤的治理。
6)本发明方法对Cr(Ⅵ)污染治理过程中不添加其他的任何有毒化学试剂，不会对环境造成二次污染。
7)本发明方法去除效率高，操作简单，且对人、畜安全，无环境污染问题。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一株芬氏纤维微菌属菌株及其处理Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的方法，该菌对Cr(Ⅵ)的耐受性极高，能促进土壤和废水中Cr(Ⅵ)的还原。此外，该芬氏纤维微菌属菌株通过Fe3+的协同可以大幅度提高该菌对Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的还原能力和效率，适用于高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤以及Cr(Ⅵ)污染场地湿法解毒后高Fe3+环境下的治理。本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株对人、畜安全，没有环境污染问题，并且治理方法具有操作简单、效率高、适用范围广的特点。
附图说明
图1为本发明菌种的菌落照片图。
图2为本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株GRINML SWG3的Cr(Ⅵ)的耐受能力。
图3为本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株GRINML SWG3高效还原废水中Cr(Ⅵ)效果。
图4为本发明提供的芬氏纤维微菌属菌株GRINML SWG3协同Fe3+高效还原废水中Cr(Ⅵ)效果。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供一株芬氏纤维微菌属菌株，该菌株的分类命名为：芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)GRINML SWG3；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；地址为：中国武汉武汉大学；保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021990。
用于富集培养上述芬氏纤维微菌属菌株的培养基(简称：富集培养基)，配方为：葡萄糖2.0～4.0g/L，棉籽饼粉3.0～5.0g/L，Na2HPO4 0.5～1.0g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L溶于蒸馏水中，调整pH为6.5～7.2。
配置时将各成分混合均匀，121℃下灭菌30min。
实施例1芬氏纤维微菌属Cellulosimicrobium sp.菌株GRINML SWG3的筛选及鉴定
实验菌株分离自青海省某铬渣堆场Cr(Ⅵ)污染土壤，其中Cr(Ⅵ)的浓度2119.27mg/kg，具体实施步骤如下：
1)固体平板的制作：将上述富集培养基成分以及K2Cr2O7 0.85～3.4g/L溶于锥形瓶蒸馏水中，加入琼脂10～20g/L，调整pH为6.5～7.2，封口后置于高温蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min。灭菌结束后取出锥形瓶冷却至50～60℃左右，将培养基液体均匀倒入无菌平板中，冷却至室温。
2)称取5g过20目筛的铬渣堆场Cr(Ⅵ)污染土壤样品放入到已灭菌的95mL去离子水中，在25℃摇床中150rpm震荡培养，每震荡2～3h后取出于室温中静置30min，利用显微镜检测判断上清液细菌的数量，直至上清液中微生物浓度达到108cfu/mL，取出摇瓶。
3)取1mL上清液，按照稀释涂布平板法，将上清液按101、102、103、104、105、106依次稀释，分别取100μL稀释液涂布在Cr(VI)浓度为100mg/L固体平板上，25℃培养72h。挑菌落生长较大的单菌落进行进一步平板划线，分离得到单菌落。挑取单菌落后，转入Cr(VI)浓度为200mg/L新的固体培养基平板中，利用平板划线分离法继续进行分离培养，转接过程中逐步提高Cr(Ⅵ)的浓度直至菌株无法生长，最终得到在平板上Cr(Ⅵ)耐受性为500mg/L的细菌。
菌体平板形态如图1所示，菌落颜色呈白色，菌落直径较小。
用16S rDNA克隆文库技术分析鉴定菌种。将1mL菌液离心得到菌泥，提取总DNA，利用PCR技术以原核生物通用引物27f和1492r扩增16S rDNA片段。将片段进行测序，所得序列经Blast比较表明，该菌株为Cellulosimicrobium sp.属细菌，命名为芬氏纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)GRINML SWG3。
实施例2芬氏纤维微菌属菌株Cr(Ⅵ)的耐受能力
将在富集培养基中生长到对数期(OD600＝0.8～1.0)的Cellulosimicrobiumsp.GRINML SWG3按5v/v％的接种量分别接种至高压蒸汽灭菌后的不同浓度(100～3000mg/L)的Cr(Ⅵ)富集培养基中，在25℃，150rpm好氧培养7天，每隔一定时间测定菌液OD600值，以监测细菌生长状况，绘制不同Cr(Ⅵ)浓度下的生长曲线。
不同Cr(Ⅵ)浓度下培养过程中的OD600值如图2所示。当Cr(Ⅵ)浓度为0～2000mg/L时，Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3生长状况良好；当Cr(Ⅵ)浓度为2500～3000mg/L时，Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3的生长开始受到抑制，但不显著；当Cr(Ⅵ)浓度为3500mg/L时，Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3的生长抑制严重。当Cr(Ⅵ)浓度为4000mg/L时，Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3的生长基本停止。因此，本发明菌株Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3对Cr(Ⅵ)耐受能力为4000mg/L。
实施例3芬氏纤维微菌属菌株高效还原废水中Cr(Ⅵ)
将在富集培养基中生长到对数期(OD600＝0.8～1.0)的Cellulosimicrobiumsp.GRINML SWG3按5v/v％的接种量分别接种至高压蒸汽灭菌的不同浓度(100～500mg/L)的Cr(Ⅵ)富集培养基中，在25℃，130rpm好氧培养7天，并且每隔一定时间用无菌注射器取5mL液体，用0.45μm过滤器过滤后装入离心管中，采用紫外分光光度法测定溶液中剩余Cr(Ⅵ)浓度，结果如图3所示。
经过7天的连续检测可知，72h内可100％还原100mg/L的Cr(Ⅵ)，120h内可100％还原300mg/L的Cr(Ⅵ)，168h内初始浓度为400mg/L的Cr(Ⅵ)溶液中Cr(Ⅵ)的还原率超过98％，说明该菌具有较强的Cr(Ⅵ)还原能力。
实例4芬氏纤维微菌属菌株协同Fe3+高效还原废水中Cr(Ⅵ)
将在富集培养基中生长到对数期(OD600＝0.8～1.0)的Cellulosimicrobiumsp.GRINML SWG3按5％的接种量分别接种至高压蒸汽灭菌的含有不同浓度(0～8.0g/L)Fe3+的含Cr(Ⅵ)(800mg/L)的富集培养基中，在25℃，130rpm好氧培养7天，并且每隔一定时间用无菌注射器取5mL液体，用0.45μm过滤器过滤后装入离心管中，采用紫外分光光度法测定溶液中剩余Cr(Ⅵ)浓度，结果如图4所示。
经过7天的连续检测可知，随着反应时间的延长，溶液中Cr(Ⅵ)的浓度逐渐降低。当体系内仅加入Cellulosimicrobium sp.时，168h内溶液中Cr(Ⅵ)的剩余浓度为234.71mg/L，Cr(Ⅵ)的还原率为70.66％。Fe3+的加入能提高溶液中Cr(Ⅵ)的还原率，且随着Fe3+浓度的提高，溶液中Cr(Ⅵ)剩余浓度逐渐降低。当Fe3+加入量为8g/L时，168h内Cr(Ⅵ)的还原率高达98.84％，说明该菌协同Fe3+比单独使用该菌具有更强的还原Cr(Ⅵ)的能力。
实例5芬氏纤维微菌属菌株协同Fe3+修复Cr(Ⅵ)污染土壤
分别取200g高浓度Cr(Ⅵ)(1186.79mg/kg)污染土壤样品，置于500mL锥形瓶中，加入200mL富集培养基溶液，分别加入0g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、4.0g/L和8.0g/L的Fe3+，混匀，然后将在富集培养基中生长到对数期(OD600＝0.8～1.0)的Cellulosimicrobiumsp.GRINML SWG3按10v/v％的接种量分别接种至上述不同Fe3+添加量的实验组，每15～30天补充培养基3～5mL，在25℃，好氧培养120天后，测试土壤中Cr(Ⅵ)浓度。
120天后Fe3+加入量为0g/L、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、4.0g/L和8.0g/L土壤中Cr(Ⅵ)含量由1186.79mg/kg分别下降到172.46mg/kg、123.37mg/kg、85.83mg/kg、31.85mg/kg、14.98mg/kg、6.74mg/kg，还原率分别为85.47％、89.60％、92.77％、97.32％、98.74％、99.43％。研究发现相较于仅加入Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3(Fe3+加入量为0g/L)的对照组，Fe3+的加入显著提高了Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3对高浓度Cr(Ⅵ)污染土壤的Cr(Ⅵ)还原效率，且随着Fe3+加入量的提高，土壤中Cr(Ⅵ)的还原效率也随之提高，说明Cellulosimicrobium sp.GRINML SWG3与Fe3+协同能促进高浓度Cr(Ⅵ)污染土壤的修复效果。
表1芬氏纤维微菌属菌株对污染土壤中Cr(Ⅵ)的还原效率
Figure BDA0003492827230000071
本发明提供了一株芬氏纤维微菌属菌株及高效处理Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的方法。该菌对Cr(Ⅵ)的耐受性极高，单独使用能促进土壤和废水中Cr(Ⅵ)还原为Cr(III)。此外，该菌还可以通过还原体系中的Fe3+为Fe2+，利用产生的Fe2+促进Cr(Ⅵ)的还原，从而实现高Fe3+环境下高浓度Cr(Ⅵ)污染废水和土壤的快速治理。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施案例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一株芬氏纤维微菌属菌株，其特征在于，该菌株的分类命名为：芬氏纤维微菌（Cellulosimicrobiumsp.）GRINML SWG3；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；地址为：中国 武汉 武汉大学；保藏日期为：2021年8月6日，保藏编号为：CCTCC NO：M2021990。
2.用于富集培养权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株的培养方法，其特征在于，将如权利要求1所述芬氏纤维微菌属菌株接种入培养基中，在20~35℃的培养温度下，150~180rpm好氧震荡培养至对数期OD600=0.8~1.0；
该培养基配方为：葡萄糖2.0~4.0 g/L，棉籽饼粉3.0~5.0 g/L，Na2HPO4 0.5~1.0 g/L，KCl 0.1~0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~1.0 g/L，配制时将上述成分溶于水中，调整pH为6.5~7.2。
3.一种利用权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株治理高浓度Cr6+污染废水的方法，其特征在于，将权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株采用如权利要求2所述的方法进行富集培养后制得菌悬液，接种菌悬液至含有培养基成分的高浓度Cr6+污染废水中；
其中，该培养基配方为：葡萄糖2.0~4.0 g/L，棉籽饼粉3.0~5.0 g/L，Na2HPO4 0.5~1.0g/L，KCl 0.1~0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~1.0 g/L，配制时将上述成分溶于水中，调整pH为6.5~7.2。
4.一种利用权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株与Fe3+协同治理高浓度Cr6+污染废水的方法，其特征在于，将权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株采用如权利要求2所述的方法进行富集培养后制得菌悬液，将含Fe3+试剂和菌悬液加入至含有培养基成分的高浓度Cr6 +污染废水中；
其中，该培养基配方为：葡萄糖2.0~4.0 g/L，棉籽饼粉3.0~5.0 g/L，Na2HPO4 0.5~1.0g/L，KCl 0.1~0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~1.0 g/L，配制时将上述成分溶于水中，调整pH为6.5~7.2。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，菌悬液接种量为5~15 v/v%，Cr6+污染废水浓度为1~3000 mg/L，水体pH值为3~9。
6.一种利用权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株与Fe3+协同治理高浓度Cr6+污染土壤的方法，其特征在于，将权利要求1所述的芬氏纤维微菌属菌株采用如权利要求2所述的方法进行富集培养后制得菌悬液，将含Fe3+试剂和菌悬液加入至高浓度Cr6+污染土壤，并加入培养基；
其中，该培养基配方为：葡萄糖2.0~4.0 g/L，棉籽饼粉3.0~5.0 g/L，Na2HPO4 0.5~1.0g/L，KCl 0.1~0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~1.0 g/L，配制时将上述成分溶于水中，调整pH为6.5~7.2。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，菌液接种量为5~20 v/v%，Cr6+污染土壤浓度为50~3000 mg/kg，土壤与溶液的质量体积比为1:1-5，水体pH值为3~9。
8.如权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述的含Fe3+试剂为FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)2中的一种或多种，Fe3+浓度为0.5~8 g/L。
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