CN114437210A - 一种用于制备抗水稻ago16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用 - Google Patents
一种用于制备抗水稻ago16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于制备抗水稻AGO16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种多肽在制备抗水稻AGO16蛋白的抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述应用获得的抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然水稻AGO16发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可用于免疫印迹和免疫沉淀。本发明抗体也可用于分析AGO16蛋白结合sRNA的特征，为进一步解析AGO16蛋白的生物学功能提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于制备抗水稻AGO16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用。
背景技术
基因沉默是真核生物中一种高保守、序列特异的基因表达调控方式。根据作用靶标，可将其分为两类：以RNA为靶标，使其降解或抑制蛋白翻译，称为转录后水平基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)；以染色质为靶标，使其DNA或组蛋白甲基化从而抑制RNA转录的起始，称为转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)。
基因沉默中最重要的组成部分是小分子RNA(small RNA，sRNA)和Argonaute(AGO)蛋白，各类sRNA通过与AGO蛋白结合，进而形成RNA沉默复合物(RNA-Induced SilencingComplexes，RISCs)，并遵循碱基互补配对原则识别靶标位点。AGO作为RISCs的关键组成部分，对小分子RNA的招募和发挥作用必不可少。AGO蛋白大约有100kDa，主要具有三个结构域：PAZ、Mid和PIWI。PAZ结构域可以特异识别并结合小分子单链RNA3’端核苷酸；Mid结构域有一个深穴，特异结合磷酸化的5’末端来固定RNA；PIWI结构具有外切酶活性，可以切割RNA底物，是AGO蛋白剪切催化的活性中心。植物AGO蛋白根据其序列同源性可分为三个亚家族：AGO1亚家族、AGO7亚家族和AGO4亚家族。
AGO16属于AGO4蛋白亚家族，可作为RISCs的核心组分参与转录水平基因沉默：RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNAmethylation，RdDM)。但目前并没有用于检测AGO16的产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备抗水稻AGO16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用。本发明提供的多肽制备得到的抗水稻AGO16蛋白抗体能够实现水稻AGO16蛋白的检测，可用于分析与AGO16结合的sRNA，进一步解析AGO16生物学功能，也可用于分析AGO16互作蛋白，深入解析RISCs组分。
本发明提供了一种多肽在制备抗水稻AGO16蛋白的抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的是，所述多肽包括修饰后的多肽，所述修饰包括N端修饰或载体蛋白修饰。
优选的是，所述N端修饰为在多肽N端增加一个半胱氨酸残基。
优选的是，所述载体蛋白修饰为将多肽与载体蛋白进行偶联，所述载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白。
本发明还提供了一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的偶联复合物，所述偶联复合物由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽与载体蛋白偶联获得。
优选的是，所述载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白。
本发明还提供了一种抗水稻AGO16蛋白的抗体的制备方法，包括以下步骤：合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，将所述多肽进行N端修饰，得到氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的N端修饰多肽，将所述N端修饰多肽与载体蛋白交联，免疫动物，取免疫的动物的血制备抗血清，对血清进行分离纯化，得到抗体。
本发明还提供了基于上述技术方案所述的多肽或上述技术方案所述的偶联复合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的抗水稻AGO16蛋白的抗体。
本发明还提供了上述技术方案所述抗水稻AGO16蛋白的抗体在制备解析AGO16蛋白和/或AGO16蛋白的互作蛋白的生物学功能的试剂或检测水稻AGO16蛋白的试剂中的应用。
本发明提供了一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的多肽及制备方法和应用。本发明所述应用获得的抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然水稻AGO16发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可以用于免疫印迹和免疫沉淀。本发明抗体可用于分析AGO16蛋白结合sRNA的特征，为进一步解析AGO16蛋白的生物学功能提供依据。
附图说明
图1为本发明提供的Westernblot图；
图2为本发明提供的免疫沉淀后Westernblot图；
图3为本发明提供的AGO16蛋白结合sRNA的长度分析结果图；
图4为本发明提供的AGO16蛋白结合sRNA 5’核苷酸碱基偏好性分析结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种多肽在制备抗水稻AGO16蛋白的抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：AAKIGEIVQVHNDNPVKR。本发明所述多肽为AGO16蛋白第2～19位18个氨基酸。本发明所述多肽制备的抗AGO16抗体可在免疫印迹(Western blot)及免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)中特异识别水稻中的AGO16蛋白。
在本发明中，所述多肽优选包括修饰后的多肽，所述修饰优选包括N端修饰或载体蛋白修饰。将多肽与载体蛋白偶联后，能够增强多肽的抗原性。在本发明中，所述N端修饰优选为在多肽N端增加一个半胱氨酸残基。在本发明中，所述载体蛋白修饰优选为将多肽与载体蛋白进行偶联，所述载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白(KLH)。在本发明中，所述偶联优选为通过交联剂将所述多肽的巯基与载体蛋白的氨基共价交联。在本发明中，所述交联剂优选包括Sulfo-SMCC。
本发明还提供了一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：CAAKIGEIVQVHNDNPVKR。
本发明还提供了一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的偶联复合物，所述偶联复合物由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽与载体蛋白偶联获得。在本发明中，所述载体蛋白优选包括匙孔血蓝蛋白。
本发明还提供了一种抗水稻AGO16蛋白的抗体的制备方法，包括以下步骤：合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，将所述多肽进行N端修饰，得到氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的N端修饰多肽，将所述N端修饰多肽与载体蛋白交联，免疫动物，取免疫的动物的血制备抗血清，对血清进行分离纯化，得到抗体。
本发明合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，将所述多肽进行N端修饰，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的N端修饰多肽。本发明对多肽的合成方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固相多肽合成(SolidPhase Peptide Synthesis，SPPS)方法进行合成即可，合成后，优选采用质谱进行多肽的鉴定。本发明对所述N端修饰的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规多肽N端修饰方法即可。
得到N端修饰多肽后，本发明将所述N端修饰多肽与载体蛋白交联，免疫动物，取免疫的动物的血制备抗血清，对血清进行分离纯化，得到抗体。本发明对免疫动物的操作以及抗血清的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规免疫方法即可。本发明优选将N端修饰多肽与载体蛋白交联的偶联物(交联肽)与免疫佐剂混合乳化后，在兔背部通过多点皮下注射，并经二次以上加强免疫，血清的效价高。具体的，本发明优选将N端修饰多肽与载体蛋白交联的偶联物与完全弗氏佐剂混合乳化，对日本大耳白兔进行多点皮下注射免疫；之后，将N端修饰多肽与载体蛋白交联的偶联物与不完全弗氏佐剂混合乳化，以两周为周期，反复加强免疫。五次免疫结束后取血检测抗体效价。本发明对所述纯化的方法没有特殊限定，具体的，本发明优选采用抗原亲和纯化方法获得目标抗体，经过亲和纯化后，本发明可以从抗血清中获得高纯度的AGO16抗体。本发明得到所述抗体(AGO16抗体)后，优选使用以下步骤进行鉴定：
步骤一：免疫印迹：将所获得的AGO16抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，确认该抗体能够与变性后的水稻AGO16蛋白相互作用，可用于免疫印迹实验。
步骤二：免疫沉淀：将所获得的AGO16抗体作为免疫沉淀抗体，在水稻叶片裂解液中进行标准的免疫沉淀，再通过如步骤一所示的免疫印迹确认该抗体能够与水稻中AGO16蛋白相互作用，可用于免疫沉淀实验。
本发明还提供了基于上述技术方案所述的多肽或上述技术方案所述的偶联复合物或上述技术方案所述制备方法制备得到的抗水稻AGO16蛋白的抗体。
本发明还提供了上述技术方案所述抗水稻AGO16蛋白的抗体在制备解析AGO16蛋白和/或AGO16蛋白的互作蛋白的生物学功能的试剂或检测水稻AGO16蛋白的试剂中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种用于制备抗水稻AGO16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
本发明以AGO16蛋白第2～19位18个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列如SEQID NO.1所示。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列如SEQ ID NO.2所示。
多肽合成和偶联
采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙腈，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3M NaOH调pH值到7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB，pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ulPBS(pH7.3)溶解2mg交联多肽，把0.2倍体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中，调pH值到7.3，室温振摇4h，-70℃冷冻后，用冻干机冻干24h后备用，即得到偶联后多肽。
实施例2
多肽免疫和抗血清制备
将交联好的KLH-多肽700μg溶于700μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，加入等体积完全弗氏佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月，体重1.75～2.25kg的健康日本大耳白兔进行背部皮内注射免疫，至少要注射20点以上。首次免疫11天后，将350μg多肽溶于350μl磷酸缓冲液(0.01MPBS)中，与等量的不完全弗氏佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射15点以上。加强免疫2周后，进行重复加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫，共四次加强免疫。最后一次免疫结束12天后，采用耳缘静脉微量取血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价，血清效价达到1:60000以上，采用心脏取血，标准方法获得抗血清。
用此种多肽免疫方式可高效获得抗血清。
实施例3
抗体亲和纯化
抗体的亲和纯化主要包含亲和层析柱的制备与抗血清纯化。
亲和层析柱的制备方法如下：
1.用2ml偶联缓冲液溶解10mg氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的AGO16多肽。
2.取2ml Sulfolink couping gel于层析柱中，将步骤1中的多肽加入层析柱于旋转培养器上旋转2～3h。
抗血清纯化步骤如下：
1.将层析柱静置在层析架上30min，连接恒流泵。
2.用40ml 1*PBS、30ml 1*Gly、30ml 1*PBS流速2.0m/s将柱子内环境平衡到中性。
3.在实施例2获得的抗血清样品中加入1/204M氯化钠，流速1.3～1.6m/s，过平衡后的层析柱两遍。
4.过柱后，用40mlWashbuffer清洗层析柱。
5.加入1*Gly流速0.5～0.7m/s进行收样，收集8管，每管2ml共收集16ml。
6.收集完之后，加入过量的酸将抗体洗脱干净，再用1*PBS平衡到中性。
7.将收集的抗体放入透析袋中，混匀之后取30ul左右用于抗体浓度测定，其余放入1*PBS 50％甘油中透析浓缩过夜，将透析浓缩好的抗体放入灭菌的5ml冻存管中，-20℃保存。
通过此实施例的抗体亲和纯化，可以成功得到抗AGO16抗体。
实施例4
免疫印迹法鉴定抗体
免疫印迹鉴定法主要包含蛋白提取、变性、电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显影，具体步骤如下：
1.蛋白提取：用装有钢珠的2ml离心管取野生型日本晴(WT)及本实验室通过CRISPR cas9技术及农杆菌侵染水稻愈伤法获得的ago16突变体(不能正常表达AGO16蛋白)水稻叶片(约0.2g)后立即置于液氮中，用研磨机将其研磨成粉末后立即加入200ul现配的含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，并充分混匀。在冰上静置20min使其充分裂解后，用12000rpm、4℃条件离心20min，取上清即为蛋白提取液。
2.蛋白变性：在蛋白提取液中加入1/5体积的5*蛋白变性loadingbuffer，混匀后置于100℃金属浴中10min，使其变性。将变性后的样品12000rpm、4℃条件离心1min后置于冰上备用。
3.蛋白电泳：按照标准方法配制8％SDS-PAGE凝胶，将15μlWT与ago16变性蛋白提取液及5μl Marker依次加样，恒压80V(约30min)，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换120V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60min)时终止电泳。
4.转膜：采用电转膜方法恒流200mA电转60min转膜至甲醛预处理过的PVDF膜。
5.封闭：用5％脱脂牛奶对转好的PVDF膜进行2h封闭。
6.一抗杂交：将封闭好的PVDF膜从72KDa处切成两块，分别以实施例3获得的抗AGO16与Actin抗体作为一抗。AGO16抗体以1：800的比例稀释，Actin抗体以1：10000的比例稀释至5％脱脂牛奶中分别与上述切好的PVDF膜4℃杂交过夜。
7.一抗杂交后清洗：将上述一抗杂交后的膜置于PBST溶液中进行清洗，每次10min，共清洗三次。
8.二抗杂交：将清洗后的膜用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1.5h。
9.二抗后清洗：具体操作同步骤7。
10.显影：采用ECL显色法进行显色并拍照记录结果。结果如图1所示，在Actin亮度一致的情况下，日本晴中可以杂出约100kDa大小的条带，而ago16突变体中则没有，证明本发明制备的AGO16抗体可以识别变性后的AGO16蛋白。
实施例5
免疫沉淀法鉴定抗体
免疫沉淀具体步骤如下：
1.蛋白提取：取野生型日本晴(WT)及ago16突变体水稻叶片约1g后立即置于液氮中，用研磨机将其研磨成粉末后立即加入1ml现配的含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液充分混匀。在冰上静置20min后，用12000rpm、4℃条件离心20min，取上清即为蛋白提取液。
2.去除非特异性结合蛋白：在1ml蛋白提取液中加入30μl ProteinA Agarose，4℃低速翻转1h。然后3000rpm、4℃条件离心7min，取上清。
3.抗体孵育:将上述去除非特异性结合蛋白的上清液与实施例3获得的AGO16抗体4℃孵育，孵育比例为1:100，孵育时间为2h。
4.ProteinAAgarose与抗体孵育：在与抗体孵育好的蛋白提取液中加入ProteinAAgarose继续4℃孵育1h。
5.清洗免疫沉淀复合物：将上述孵育完成的蛋白提取液3000rpm、4℃条件离心7min去上清，加入细胞裂解液500μl，混匀后翻转10min，重复3次。
6.免疫沉淀复合物变性：在清洗后的免疫沉淀复合物中加入30μl 5*蛋白变性loadingbuffer，混匀后置于100℃金属浴中10min，使其变性。将变性后的样品12000rpm、4℃条件离心1min后置于冰上备用。
7.免疫印迹鉴定免疫沉淀复合物：操作同实施例4中的步骤3～10。其显影结果如图2所示，AGO16多克隆抗体仅在日本晴中免疫沉淀到AGO16蛋白，ago16突变体中未免疫沉淀到AGO16蛋白，证明本发明制备的AGO16抗体可以特异性识别水稻内的AGO16蛋白。
实施例6
AGO16结合sRNA的分析
取野生型日本晴(WT)发育中期的穗约5g进行如实施例5所示的免疫沉淀，获得AGO16蛋白复合体。对获得的AGO16蛋白复合体进行sRNA提取并建库测序，并将未进行免疫沉淀的野生型日本晴(WT)直接提取的sRNA作为对照(Total)，获得对照(Total)与AGO16结合sRNA的原始数据。
首先分析AGO16结合sRNA的长度特征。其分析结果如图3所示，对照(Total)中的分析结果显示水稻中sRNA分布以21-nt sRNA与24-nt sRNA为主，而AGO16的分析结果显示AGO16以结合24-nt sRNA为主。
之前的研究表明各AGO蛋白对sRNA的结合具有5’核苷酸碱基偏好性，接着本发明对AGO16蛋白结合的24-nt sRNA的5’核苷酸碱基偏好性进行分析。其分析结果如图4所示，对照(Total)中的分析结果显示水稻中24-nt sRNA5’核苷酸碱基为A的约占50％，其余24-nt sRNA5’核苷酸碱基大致均匀分布，而AGO16的分析结果显示AGO16更偏好结合5’核苷酸碱基为A的24-nt sRNA，比例高达97％。
结合以上所有实施例，本发明证明氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽通过免疫可以获得效价高、亲和力强、特异性好的AGO16抗体，可与天然水稻AGO16发生特异性结合反应；此AGO16抗体可用于免疫印迹鉴定AGO16蛋白与免疫沉淀AGO16蛋白继而分析AGO16蛋白结合sRNA的特征，得出AGO16以结合5’核苷酸碱基为A的24-nt sRNA为主的结论。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海南浙江大学研究院
<120> 一种用于制备抗水稻AGO16蛋白抗体的多肽及制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ala Lys Ile Gly Glu Ile Val Gln Val His Asn Asp Asn Pro Val
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Cys Ala Ala Lys Ile Gly Glu Ile Val Gln Val His Asn Asp Asn Pro
1 5 10 15
Val Lys Arg
Claims (10)
1.一种多肽在制备抗水稻AGO16蛋白的抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽包括修饰后的多肽，所述修饰包括N端修饰或载体蛋白修饰。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述N端修饰为在多肽N端增加一个半胱氨酸残基。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体蛋白修饰为将多肽与载体蛋白进行偶联，所述载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白。
5.一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种用于制备抗水稻AGO16蛋白的抗体的偶联复合物，其特征在于，所述偶联复合物由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽与载体蛋白偶联获得。
7.根据权利要求6所述的偶联复合物，其特征在于，所述载体蛋白包括匙孔血蓝蛋白。
8.一种抗水稻AGO16蛋白的抗体的制备方法，包括以下步骤：合成氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的多肽，将所述多肽进行N端修饰，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的N端修饰多肽，将所述N端修饰多肽与载体蛋白交联，免疫动物，取免疫的动物的血制备抗血清，对血清进行分离纯化，得到抗体。
9.基于权利要求5所述的多肽或权利要求6所述的偶联复合物或权利要求8所述制备方法制备得到的抗水稻AGO16蛋白的抗体。
10.权利要求9所述抗水稻AGO16蛋白的抗体在制备解析AGO16蛋白和/或AGO16蛋白的互作蛋白的生物学功能的试剂或检测水稻AGO16蛋白的试剂中的应用。
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| CN101928334A (zh) * | 2009-05-08 | 2010-12-29 | 北京奥维亚生物技术有限公司 | 一种鼠Ehf多肽及其抗体制备方法 |
| CN108148126A (zh) * | 2016-12-05 | 2018-06-12 | 天津奥维亚生物技术有限公司 | 一种人c21orf13多肽及其抗体制备方法 |
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2022
- 2022-02-25 CN CN202210175297.XA patent/CN114437210B/zh active Active
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