CN114432486A - 复合型组织粘合剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合型组织粘合剂及其在止血、杀菌、促进伤口愈合等方面的应用，所述粘合剂包括组分A和组分B，组分A包括：甲基丙烯酸酐化明胶、十二醛改性壳聚糖、聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维、光敏交联剂以及水；组分B为氨基交联剂的水溶液，在使用时将A组分与B组分混合，注射在伤口上，并用紫外光或蓝光照射即可。本发明的组织粘合剂在使用时直接以液态的形式注射到创伤部位，通过光照射即可原位形成与皮肤强度相当的凝胶结构，同时具有止血、杀菌、促进伤口愈合的作用。

Description

复合型组织粘合剂及其应用
技术领域
本发明涉及组织粘合剂技术领域，具体涉及一种复合型组织粘合剂及其在止血、杀菌、促进伤口愈合等方面的应用。
背景技术
组织粘合剂(tissue adhesive)主要用于替代外科手术的缝合及活组织的接合，组织粘合剂依据组成成分可分为三大类：天然粘合剂、合成粘合剂和半合成粘合剂。其中，作为半合成粘合剂的代表“明胶-间苯二酚-甲醛(GRF)粘合剂”主要由两种溶液组成：明胶-间苯二酚溶液及甲醛-戊二醛溶液。甲醛、戊二醛不仅与明胶及间苯二酚反应，也可与组织中的氨基基团反应，从而在凝胶与组织之间产生粘合。虽然GRF粘合剂有极强的粘合强度，但体内降解性差，组织学染色观察发现GRF粘合剂使用后会出现纤维细胞过度增殖的现象，并且不能加速愈合伤口，甚至延误伤口愈合。且GRF类粘合剂止血凝血能力差，不具有抗菌功能，若伤口没有消毒处理过，组织粘合后会造成严重的伤口感染，危害患者生命。此外，GRF内的甲醛及间苯二酚的诱变性及潜在致癌性自应用以来就受到普遍争议。
组织创伤后的大量出血和伤口感染是造成人员伤亡的主要危险因素，因此，迫切需要能够闭合伤口并有效控制出血和感染的急救用品。现有的组织粘合剂可以粘附到组织表面并实现快速伤口闭合，但是它们中大多数仅具有有限的止血和抗菌能力，使其不适合用作急救组织粘合剂。在目前的研究中，组织粘合剂均为胶类或固体类，缺乏诱导细胞粘附和浸润的条件，进而不具有或具有较差的促进伤口愈合的能力；并且针对降解性较差的粘合剂，反而会抑制伤口愈合。
组织粘合剂的力学强度与伤口周边组织强度的匹配是至关重要的，粘合剂硬度与周围组织的不匹配，会导致伤口处炎症反应以及各种并发症的发生，而植入物与周围组织硬度的匹配会促使细胞进行各种修复行为，因此对于普通皮肤创伤、皮肤加骨或软骨损伤等多种类型的伤口，具有可控调节的力学强度对组织粘合剂是至关重要的。
此外，在用组织粘合剂对伤口进行急性处理后，往往会有些异物碎片残留在伤口内，因此为将异物取出往往会进行再次手术，如果取下粘合剂或者对周边组织动刀，将对患者造成二次伤害；如果组织粘合剂拥有自愈合功能，手术即可在粘合剂上进行，随后组织粘合剂自行愈合不会对患者造成任何伤害。
为解决上述问题，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合型组织粘合剂，以解决快速止血、杀菌、促进伤口自愈合等方面的问题。为此，本发明提供如下技术方案。
一方面，本发明提供一种复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，以重量份计，所述组分A包括：甲基丙烯酸酐化明胶5～10份、十二醛改性壳聚糖5～20份、聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维5～20份、光敏交联剂1～5份、以及水余量，各组分之和为100份；所述组分B为氨基交联剂的水溶液。
优选地，所述复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，以重量份计，所述组分A包括：甲基丙烯酸酐化明胶5～10份、十二醛改性壳聚糖10～20份、聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维10～20份、光敏交联剂1～5份、以及水余量，各组分之和为100份；所述组分B为氨基交联剂的水溶液。
在本发明中，所述氨基交联剂为可以与氨基发生交联反应的交联剂。
甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶原材料。该材料具有优异的生物相容性，且可由光激发交联反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。
进一步地，所述组分A与组分B的质量比为(1:10)～(10:1)，优选为(1:2)～(2:1)。
进一步地，所述光敏交联剂能引发甲基丙烯酸基团发生自由基聚合，选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)；所述氨基交联剂为四臂聚乙二醇醛基，所述氨基交联剂的水溶液的质量浓度为0.01～0.1g/mL，优选为0.01～0.05 g/mL。
所述四臂聚乙二醇醛基的结构式为：
Figure BDA0002758307490000021
进一步地，所述甲基丙烯酸酐化明胶中甲基丙烯酸酐的接枝度为60～80％。
所述接枝度表示甲基丙烯酸酐化明胶主链上已被接枝的接枝点数占所有可被接枝的接枝点总数的比例。
进一步地，所述聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维的长度为50～100μm。
本发明提供甲基丙烯酸酐化明胶的制备方法，包括以下步骤：
将明胶加入到缓冲溶液中，加热搅拌至溶液澄清，滴加甲基丙烯酸酐，继续搅拌，使甲基丙烯酸酐和明胶进行反应，反应结束，所得反应混合物经透析、冷冻干燥处理后即得。
进一步地，所述缓冲溶液为磷酸盐溶液(PBS)。
进一步地，所述加热温度为25～70℃，优选为45～55℃。
进一步地，所述甲基丙烯酸酐的滴加速率为0.4～0.6mL/min。
进一步地，所述反应时间为2～4h。
进一步地，所述反应结束的具体操作包括：向反应体系中加入40℃的PBS溶液并持续搅拌，所述加入的PBS溶液的体积至少为反应体系溶液体积的4倍。
进一步地，所述冷冻干燥时间为2～3天，冷冻干燥温度为-20～-10℃。
进一步地，所述甲基丙烯酸酐的体积与明胶的质量比为(0.5～1)mL：1g。
本发明提供十二醛改性壳聚糖(CSD)的制备方法，包括以下步骤：
在室温下，将壳聚糖溶解在乙酸中，并用乙醇进行稀释，加入NaOH调节pH至5～6，加入十二醛和过量的氰基硼氢化钠，搅拌，使十二醛与壳聚糖反应，反应结束后，调节溶液pH为中性，经乙醇沉淀与真空干燥后即得。
进一步地，所述反应的时间为23～25h。
进一步地，所述壳聚糖为脱乙酰度≥85％的壳聚糖。壳聚糖具有良好的生物相容性、黏附性、降解性、抑菌性和可塑性，可促进伤口愈合和组织再生。
进一步地，所述壳聚糖与十二醛的质量比为(1:1)～(10:1)，优选为(5:1)～(10:1)。
本发明提供聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶(PCL/GelMA)混纺的纳米短纤维的制备方法，包括以下步骤：
配置聚己内酯(PCL)与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的混合纺丝液，利用静电纺丝技术得到混纺纳米纤维膜，随后将该混纺纳米纤维膜在破壁机中击碎得到混纺的纳米短纤维。
进一步地，所述聚己内酯与所述甲基丙烯酸酐化明胶的质量比为(0.2:1)～(5:1)，优选(0.5:1)～(1:1)。
进一步地，所述纳米纤维膜在破壁机中击碎时间为10～30min。
PCL拥有良好的生物相容性和机械性能，可以增强组织粘合剂的力学强度。采用纳米短纤维是为了诱导细胞迁移粘附，从而加速愈合伤口。
进一步地，所述组分A在使用前避光，防止光敏交联剂失活。光敏交联剂为光引发剂，在光照条件下会与明胶上的甲基丙烯酸酐基团(MA)发生自由基聚合反应，使其交联。
另一方面，本发明提供上述复合型组织粘合剂在止血、杀菌、促进伤口愈合方面的应用。
具体使用方法是：将A组分与B组分混合，注射在伤口上，并用紫外光或蓝光照射20～40s。
进一步地，当光敏交联剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮时，使用紫外光照射，紫外光波长为360～380nm；当交联剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂时，使用蓝光照射，蓝光波长为405nm。
本发明的有益效果在于：
(1)体系中引入的光敏交联剂在光照条件下，可以使明胶上的甲基丙烯酸酐基团(MA)发生交联，通过控制光照时间即可控制交联反应程度，进而控制组织粘合剂的力学强度，更好的匹配受伤周围组织的力学强度，扩大应用范围。
(2)氨基交联剂四臂聚乙二醇醛基中的部分醛基可以与GelMA、CSD中的氨基发生交联，剩余醛基可与受伤组织上的氨基结合，形成强有力的Schiff base键从而粘合组织。并且通过控制光敏交联剂的光照时间和/或氨基交联剂的含量可以控制交联度，进而控制组织粘合剂的降解时长。
(3)体系中引入十二醛改性壳聚糖，壳聚糖拥有优异的抗菌性能，十二烷基基团可锚定红细胞加速凝血。
(4)PCL/GelMA混纺的纳米短纤维可以为细胞提供粘附位点，加速周边伤口组织处的细胞浸润、迁移到组织粘合剂中，并在组织粘合剂中快速增殖和分化，加速组织粘合剂降解的同时促进伤口愈合，降解结束后即形成新皮肤，且纳米短纤维的复合提高了组织粘合剂的力学性能。
(5)本发明的组织粘合剂在使用时直接以液态的形式注射到创伤部位，通过光照射即可原位形成与皮肤强度相当的凝胶结构。凝胶结构在形成的过程中与伤口周边组织发生键合紧紧粘合在一起，且凝胶溶胀吸收伤口处流出的大量血液，快速止血，壳聚糖破坏细菌的膜结构，高效杀菌。
(6)本发明的组织粘合剂具有自愈合功能，所有成分均为可降解成分，拓展了其应用范围及应用前景，并且如需进行二次手术可直接在形成的凝胶上进行，避免造成二次伤害，因为粘合剂内部具有游离醛基和氨基，断开后数分钟后会再次形成Schiff base键。
术语定义
除特殊说明外，本发明中所述“水”均指“去离子水”。
除非明确地说明与此相反，否则，本发明引用的所有范围包括端值。
本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减，并且N-10％到N+10％之间的范围也被公开。
除非另外说明，应当应用本发明所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和1994年第75版《化学和物理手册》一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry",Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和"March's Advanced Organic Chemistry"by Michael B.Smith and JerryMarch,John Wiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本发明。
除非另行定义，否则本发明所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。尽管与本发明所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明实施方案的实施或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献均以全文引用方式并入本发明，除非引用具体段落。如发生矛盾，以本说明书及其所包括的定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是例示性的，并不旨在进行限制。
具体实施方式
以下所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明实施例使用的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)、十二醛改性壳聚糖(CSD)、聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶(PCL/GelMA)混纺的纳米短纤维的制备方法如下。
1、制备甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)：
将1.0g明胶投入装有10.0mL PBS溶液的三口烧瓶中并加热到50℃持续搅拌1h。当形成淡黄色澄清溶液后将0.8mL的甲基丙烯酸酐以0.5mL/min的滴加速率缓慢滴入搅拌的溶液中，反应3h，随后在搅拌条件下向溶液中加入50mL温度为40℃的PBS溶液中止反应并继续搅拌15min。将所得溶液在40℃下用蒸馏水透析一周(透析袋的截留分子量为12000-14000Da)。透析处理后溶液冷冻干燥3天，最终得到白色泡沫样的产品，将其保存在-20℃下备用。
2、制备十二醛改性壳聚糖(CSD)：
在室温下，将4g脱乙酰壳聚糖溶解在220mL乙酸(0.2M)中，并用150mL乙醇稀释，然后使用1M的NaOH将pH调节至5.1，加入在乙醇中制备的10mL十二醛溶液(0.05g/mL)。然后加入过量的氰基硼氢化钠，在室温下持续反应24h。反应结束时，使用1M的NaOH将pH调节至7.0。通过加入过量的乙醇使产物从溶液中沉淀出来，用乙醇彻底洗涤以除去未反应的十二醛和氰基硼氢化钠后，将沉淀物在室温下真空干燥备用。
3、制备聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶(PCL/GelMA)混纺的纳米短纤维：
将50.0mg PCL和70.0mg上述1中制备的GelMA混合溶解在2.0mL的六氟异丙醇(HFIP)中，随后将配置好的溶液倒入注射器中，注射器放入到静电纺丝机的推进器后，针头连接至未开启高压的高压电源，用包裹有铝箔的滚筒作为纳米纤维接收装置。不锈钢针到收集器的距离设置为12cm，环境湿度为40％RH。在静电纺丝过程中，保持电压为10kV和流速1.0mL/h不变，得到纳米纤维膜。将制备好的纳米纤维膜在真空干燥箱中室温干燥过夜，以去除纳米纤维膜中残留的HFIP。随后，将纳米纤维膜与适量乙醇放入破壁机中，控制击碎时间为20min，得到长度为50～100μm的纳米短纤维，随后冷冻干燥去除乙醇备用。
实施例1
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、CSD、PCL/GelMA混纺的纳米短纤维、光敏交联剂I2959以及水以10:5:10:1:74的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
实施例2
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、CSD、PCL/GelMA混纺的纳米短纤维、光敏交联剂I2959以及水以10:10:10:1:69的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
实施例3
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、CSD、PCL/GelMA混纺的纳米短纤维、光敏交联剂I2959以及水以5:20:10:1:64的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
实施例4
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、CSD、PCL/GelMA混纺的纳米短纤维、光敏交联剂I2959以及水以10:10:5:5:70的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
实施例5
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、CSD、PCL/GelMA混纺的纳米短纤维、光敏交联剂I2959以及水以10:10:20:1:59的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
实施例6
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为2:1。
所述组分A与组分B同实施例2。
实施例7
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:2。
所述组分A与组分B同实施例2。
实施例8
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
所述组分A同实施例2，所述组分B为0.05g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液。
对比例1
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、PCL/GelMA混纺的纳米短纤维、光敏交联剂I2959以及水以10:10:1:79的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
对比例2
于本实施例中提供的复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，所述组分A与组分B的质量比为1:1。
将GelMA、CSD、光敏交联剂I2959以及水以10:10:1:79的质量比在避光条件下搅拌均匀，得到组分A。配置0.02g/mL的四臂聚乙二醇醛基水溶液，得到组分B。
性能测试与评价
将上述实施例和对比例中得到的组分A和组分B分别进行混合，得到混合液，对混合液进行止血时间、抗菌性、力学性能和粘合力测试，测试结果见表1。
(1)止血时间
取混合液注射到小鼠的伤口处，紫外光(365nm)照射30s，观察止血时间，从注射开始计时。
(2)抗菌性
取混合液注射到直径为1cm的圆形模具中，紫外光(365nm)照射30s后成型脱模，随后放入含1x105个S.aureus的培养皿(d＝5cm)中，每隔2h通过检测600nm波长处的OD值来对培养基内细菌进行计数。
(3)力学性能
取混合液注射到直径为1cm的圆形模具中，紫外光(365nm)照射30s后成型脱模，随后进行压缩模量测试。
(4)粘合力
取混合液注射到两片长方形(3cm x 2cm)的猪皮间，紫外光(365nm)照射30s后利用万能拉伸测试仪测量组织粘合剂的粘合力。
表1
编号 止血时间(秒) OD值 压缩模量(MPa) 粘合力(KPa)
实施例1 30 0.97 48.3 5.325
实施例2 10 0.17 60.5 5.634
实施例3 8 0.15 64.1 5.423
实施例4 12 0.21 57.4 5.667
实施例5 11 0.19 110.7 5.744
实施例6 8 0.25 75.3 3.234
实施例7 12 0.16 80.3 5.946
实施例8 11 0.19 70.6 6.718
对比例1 385 2.51 40.1 4.857
对比例2 12 0.27 34.3 3.937
由表1可知，本发明提供的复合型组合粘合剂的止血性能、抗菌性能、力学性能以及粘合力优于对比例。对比例1中未添加CSD，止血时间为385s，血液基本不会自行发生凝固，且抗菌效果较差，说明壳聚糖在体系中起到止血与抗菌的作用，其中十二烷基基团可锚定红细胞加速凝血。对比例2中未添加PCL/GelMA混纺的纳米短纤维，组织粘合剂的压缩模量较差，说明PCL/GelMA混纺的纳米短纤维能提高组织粘合剂力学性能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (11)

1.一种复合型组织粘合剂，包括组分A和组分B，其特征在于，以重量份计，所述组分A包括：甲基丙烯酸酐化明胶5～10份、十二醛改性壳聚糖5～20份、聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维5～20份、光敏交联剂1～5份、以及水余量，各组分之和为100份；所述组分B为氨基交联剂的水溶液。
2.根据权利要求1所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述组分A与组分B的质量比为(1:10)～(10:1)。
3.根据权利要求1所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述光敏交联剂选自2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂；所述氨基交联剂为四臂聚乙二醇醛基，所述氨基交联剂的水溶液的质量浓度为0.01～0.1g/mL。
4.根据权利要求1所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐化明胶中甲基丙烯酸酐的接枝度为60～80％；
优选地，所述聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维的长度为50～100μm。
5.根据权利要求1所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述十二醛改性壳聚糖的制备方法包括：在室温下，将壳聚糖溶解在乙酸中，并用乙醇进行稀释，加入NaOH调节pH至5～6，加入十二醛和过量的氰基硼氢化钠，搅拌，使十二醛与壳聚糖反应，反应结束后，调节溶液pH为中性，经乙醇沉淀与真空干燥后即得。
6.根据权利要求5所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述反应的时间为23～25h，所述壳聚糖为脱乙酰度≥85％的壳聚糖，所述壳聚糖与十二醛的质量比为(1:1)～(10:1)。
7.根据权利要求1所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述聚己内酯/甲基丙烯酸酐化明胶混纺的纳米短纤维的制备方法包括：配置聚己内酯(PCL)与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)的混合纺丝液，利用静电纺丝技术得到混纺纳米纤维膜，随后将该混纺纳米纤维膜在破壁机中击碎得到混纺的纳米短纤维。
8.根据权利要求7所述的复合型组织粘合剂，其特征在于，所述聚己内酯与所述甲基丙烯酸酐化明胶的质量比为(0.2:1)～(5:1)，所述纳米纤维膜在破壁机中击碎时间为10～30min。
9.权利要求1～8任一项所述的复合型组织粘合剂在止血、杀菌、促进伤口愈合方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在使用时，将A组分与B组分混合，均匀填充在伤口上，并用紫外光或蓝光照射20～40s。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，当光敏交联剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮时，使用紫外光照射，紫外光波长为360～380nm；当光敏交联剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂时，使用蓝光照射，蓝光波长为405nm。
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