CN114425079A - 一种核酸疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸疫苗及其制备方法和应用。本发明涉及的核酸疫苗包括核酸分子和DNA纳米结构，其中DNA纳米结构包括支架分子和互补链分子，其作为一种载体，与核酸分子通过碱基互补配对原则结合。这种核酸疫苗的制备方法为：将支架分子与互补链分子混合，折叠形成DNA纳米结构；将DNA纳米结构与核酸分子混合，杂交形成稳定的双链结构。这种核酸疫苗中的DNA纳米结构能够稳定核酸分子，保护核酸分子不被核酸酶攻击，提高核酸疫苗的储存、运输的便利性，解决核酸疫苗在广泛投入使用时存在的实际问题。因此，本发明所述的核酸疫苗可用于制备治疗新型冠状病毒肺炎的疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核酸疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。由于核酸疫苗的生产过程与编码的抗原无关，因此基于相同核酸的不同疫苗可以利用相同的生产和纯化方法，极大地减少了疫苗生产的成本和时间；此外，核酸疫苗可以快速生成。凭借上述优点及全球流行的新型冠状病毒肺炎，核酸疫苗越来越受到广泛的关注，尤其是RNA疫苗，其不会像DNA疫苗有整合入人类基因组的风险，RNA疫苗可在转染进入人体细胞后直接在细胞内翻译抗原蛋白，不会影响细胞基因组本身，具有充分的安全性。
核酸疫苗进入人体后被顺利递送到细胞内是其发挥作用的基本保障，这一过程存在一定的挑战性。首先，核酸极有可能在进入细胞之前被核酸酶降解；其次，核酸的分子量较大，且带负电荷，没有载体几乎不可能进入细胞。因此，核酸疫苗通常需要借助载体递送进入细胞。
迄今为止，许多不同的药物递送系统，包括天然系统(如病毒)，仿生系统(如红细胞模拟物)，有机合成材料系统(如脂质体和阳离子树枝状聚合物)以及无机合成材料系统(如金纳米颗粒)等，绕过了药物分子的物理化学限制和屏障，增加了载药能力，延长了人体循环时间，提高了细胞摄取效率。但这些药物载体有一定局限性，例如，莫德纳(MODERNA)公司研发的mRNA-1273疫苗以脂质体为载体，可以在2℃～8℃保持活性30天，但因为RNA不稳定，疫苗注射入体内后在复杂的血液环境中可被各种RNA酶攻击而降解，从而失去效果。
DNA分子是天然的遗传物质，具有极佳的生物相容性和生物可降解性。通过碱基互补配对原则，双链DNA分子可以折叠成纳米级的稳定结构，即DNA折纸纳米结构。DNA折纸纳米结构具有可预测且可控的分子间相互作用，便捷的官能团修饰及强大的可设计性和灵活性等优点；另外，DNA折纸纳米结构可通过自组装反应，得到从一维到三维的精确控制。因此，DNA折纸纳米结构有望成为一种优选的体内药物递送载体。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种核酸疫苗，这种核酸疫苗以DNA纳米结构作为递送载体，能够稳定核酸分子，不仅使核酸分子可在2℃～8℃下稳定储藏、运输，而且使其在体内胞外环境中不易受核酸酶的降解，为其进入细胞时的完整性提供保障，解决核酸疫苗在广泛投入使用时存在的实际问题。
本发明还提出一种上述核酸疫苗的制备方法。
本发明还提出上述核酸疫苗的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种核酸疫苗，包括核酸分子和DNA纳米结构，所述DNA纳米结构作为一种载体，与所述核酸分子结合。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
1.相比于商业化的脂质体载体，本发明提出的核酸疫苗是以DNA纳米结构作为载体，DNA纳米结构可以与不同序列、不同长度的核酸分子结合形成稳定的双链结构，极大提高核酸分子的稳定性。
2.相比常规方法中通过引入单一位点碱基突变来提高核酸分子的稳定性，本发明提供的DNA纳米结构本身具有极高的稳定性，可以很大程度抵抗核酸酶的攻击，且不会影响核酸疫苗的药效。
3.本发明中的DNA纳米结构可以通过自组装折叠成不同的三维结构，提供多种与核酸分子结合的可能性，从而可制作不同的目的核酸疫苗。
4.DNA是生物体内天然存在的大分子，因此DNA纳米结构极高的生物利用度，可以显著提高核酸疫苗的药效。
5.相比于无机纳米颗粒载体、高分子纳米颗粒载体，DNA纳米结构作为载体，具有更高的生物安全性，在治疗完成后可在细胞内完全降解，不会给生物体带来任何额外代谢负担。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA纳米结构与所述核酸分子通过碱基互补配对原则结合。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包括编码特定抗原蛋白的RNA分子。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA纳米结构可以与任意长度、任意序列的所述核酸分子结合。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA纳米结构包括支架分子和互补链分子。
在本发明的一些实施方式中，所述支架分子为单链DNA分子，碱基数为500～10000。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述支架分子的碱基数为7000～8000。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述支架分子选自噬菌体基因组DNA。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述支架分子选自单链噬菌体基因组DNA。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述支架分子选自M13噬菌体基因组DNA，
噬菌体基因组DNA或fd噬菌体基因组DNA中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述支架分子选自M13噬菌体基因组DNA。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述支架分子选自M13mp18噬菌体基因组DNA。
在本发明的一些实施方式中，所述互补链分子包括单链DNA分子，碱基数为20～60。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述互补链分子的碱基数为25～55。
在本发明的一些实施方式中，所述互补链分子是通过特定算法，根据所需折叠的目标结构设计而成。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸疫苗的储藏温度为-20℃～4℃，储藏时间为1～3个月。
根据本发明的再一个方面，提出了所述核酸疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
S1：将支架分子与互补链分子混合，折叠形成DNA纳米结构；
S2：将步骤S1所述的DNA纳米结构与核酸分子混合，杂交形成稳定的双链结构。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
1.支架分子的获取方式简单，且能大量获取，成本低廉，适合大规模生成。
2.支架分子与互补链分子混合后，可以自组装折叠成不同的三维结构(即DNA纳米结构)，提供多种与核酸分子结合的可能性，从而可制作不同的目的核酸疫苗。
3.DNA纳米结构可以与不同序列、不同长度的核酸分子结合形成稳定的双链结构，极大提高核酸分子的稳定性。
在本发明的一些实施方式中，所述支架分子通过提取噬菌体基因组DNA获得。
在本发明的一些实施方式中，所述噬菌体由宿主细菌培养获得。
在本发明的一些实施方式中，所述互补链分子通过商业化DNA合成制得。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述支架分子与所述互补链分子混合后进行反应，反应温度为25℃～92℃。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述支架分子与所述互补链分子混合后进行反应，反应时间为24h～240h。
在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述支架分子与所述互补链分子混合后进行反应，还需加入镁离子，所述镁离子的浓度为2mM～40mM。
在本发明的一些实施方式中，步骤S2中所述的核酸分子通过特定序列的DNA模板复制或体外转录制得。
在本发明的一些实施方式中，所述特定序列的DNA模板以质粒为载体，通过大肠杆菌大规模培养后，提纯质粒，再利用限制性内切酶酶切制得。
在本发明的一些实施方式中，所述支架分子的核苷酸序列固定不变，所述互补链分子有多条，通过设计，每条都与所述支架分子的某几段互补，自然地与所述支架分子形成三维结构。
在本发明的一些实施方式中，在所述三维结构中，所述核酸分子可以与所述支架分子结合，也可以与所述互补链分子结合，杂交形成所述稳定的双链结构；如果是与所述互补链分子结合，可以对所述互补链分子进行改造，改造后的互补链分子有与所述核酸分子互补结合的序列。
根据本发明的第三个方面，提出了所述核酸疫苗在制备治疗新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1和对比例1制备的RNA疫苗，在4℃条件下其mRNA稳定性的对比图；
图2为本发明实施例1和对比例1制备的RNA疫苗，在25℃条件下其mRNA稳定性的对比图；
图3为本发明实施例1和对比例1制备的RNA疫苗作用于细胞后，相应血管紧张素转换酶2受体结合结构域蛋白的生成量变化的对比图；
图4为本发明实施例1和对比例1制备的RNA疫苗在有RNA酶(Rnase)存在的条件下，mRNA活性的对比图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，离心、培养等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的材料或者方法包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的材料或者方法可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
在本发明的实施例中，选用M13mp18噬菌体基因组DNA作为支架分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1(aatgctactactattagtagaattgatgccaccttttcagctcgcgccccaaatgaaaatatagctaaacaggttattgaccatttgcgaaatgtatctaatggtcaaactaaatctactcgttcgcagaattgggaatcaactgttatatggaatgaaacttccagacaccgtactttagttgcatatttaaaacatgttgagctacagcattatattcagcaattaagctctaagccatccgcaaaaatgacctcttatcaaaaggagcaattaaaggtactctctaatcctgacctgttggagtttgcttccggtctggttcgctttgaagctcgaattaaaacgcgatatttgaagtctttcgggcttcctcttaatctttttgatgcaatccgctttgcttctgactataatagtcagggtaaagacctgatttttgatttatggtcattctcgttttctgaactgtttaaagcatttgagggggattcaatgaatatttatgacgattccgcagtattggacgctatccagtctaaacattttactattaccccctctggcaaaacttcttttgcaaaagcctctcgctattttggtttttatcgtcgtctggtaaacgagggttatgatagtgttgctcttactatgcctcgtaattccttttggcgttatgtatctgcattagttgaatgtggtattcctaaatctcaactgatgaatctttctacctgtaataatgttgttccgttagttcgttttattaacgtagatttttcttcccaacgtcctgactggtataatgagccagttcttaaaatcgcataaggtaattcacaatgattaaagttgaaattaaaccatctcaagcccaatttactactcgttctggtgtttctcgtcagggcaagccttattcactgaatgagcagctttgttacgttgatttgggtaatgaatatccggttcttgtcaagattactcttgatgaaggtcagccagcctatgcgcctggtctgtacaccgttcatctgtcctctttcaaagttggtcagttcggttcccttatgattgaccgtctgcgcctcgttccggctaagtaacatggagcaggtcgcggatttcgacacaatttatcaggcgatgatacaaatctccgttgtactttgtttcgcgcttggtataatcgctgggggtcaaagatgagtgttttagtgtattcttttgcctctttcgttttaggttggtgccttcgtagtggcattacgtattttacccgtttaatggaaacttcctcatgaaaaagtctttagtcctcaaagcctctgtagccgttgctaccctcgttccgatgctgtctttcgctgctgagggtgacgatcccgcaaaagcggcctttaactccctgcaagcctcagcgaccgaatatatcggttatgcgtgggcgatggttgttgtcattgtcggcgcaactatcggtatcaagctgtttaagaaattcacctcgaaagcaagctgataaaccgatacaattaaaggctccttttggagccttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattcctttagttgttcctttctattctcactccgctgaaactgttgaaagttgtttagcaaaatcccatacagaaaattcatttactaacgtctggaaagacgacaaaactttagatcgttacgctaactatgagggctgtctgtggaatgctacaggcgttgtagtttgtactggtgacgaaactcagtgttacggtacatgggttcctattgggcttgctatccctgaaaatgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggttctgagggtggcggtactaaacctcctgagtacggtgatacacctattccgggctatacttatatcaaccctctcgacggcacttatccgcctggtactgagcaaaaccccgctaatcctaatccttctcttgaggagtctcagcctcttaatactttcatgtttcagaataataggttccgaaataggcagggggcattaactgtttatacgggcactgttactcaaggcactgaccccgttaaaacttattaccagtacactcctgtatcatcaaaagccatgtatgacgcttactggaacggtaaattcagagactgcgctttccattctggctttaatgaggatttatttgtttgtgaatatcaaggccaatcgtctgacctgcctcaacctcctgtcaatgctggcggcggctctggtggtggttctggtggcggctctgagggtggtggctctgagggtggcggttctgagggtggcggctctgagggaggcggttccggtggtggctctggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctctggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttggcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtcttaatcatgccagttcttttgggtattccgttattattgcgtttcctcggtttccttctggtaactttgttcggctatctgcttacttttcttaaaaagggcttcggtaagatagctattgctatttcattgtttcttgctcttattattgggcttaactcaattcttgtgggttatctctctgatattagcgctcaattaccctctgactttgttcagggtgttcagttaattctcccgtctaatgcgcttccctgtttttatgttattctctctgtaaaggctgctattttcatttttgacgttaaacaaaaaatcgtttcttatttggattgggataaataatatggctgtttattttgtaactggcaaattaggctctggaaagacgctcgttagcgttggtaagattcaggataaaattgtagctgggtgcaaaatagcaactaatcttgatttaaggcttcaaaacctcccgcaagtcgggaggttcgctaaaacgcctcgcgttcttagaataccggataagccttctatatctgatttgcttgctattgggcgcggtaatgattcctacgatgaaaataaaaacggcttgcttgttctcgatgagtgcggtacttggtttaatacccgttcttggaatgataaggaaagacagccgattattgattggtttctacatgctcgtaaattaggatgggatattatttttcttgttcaggacttatctattgttgataaacaggcgcgttctgcattagctgaacatgttgtttattgtcgtcgtctggacagaattactttaccttttgtcggtactttatattctcttattactggctcgaaaatgcctctgcctaaattacatgttggcgttgttaaatatggcgattctcaattaagccctactgttgagcgttggctttatactggtaagaatttgtataacgcatatgatactaaacaggctttttctagtaattatgattccggtgtttattcttatttaacgccttatttatcacacggtcggtatttcaaaccattaaatttaggtcagaagatgaaattaactaaaatatatttgaaaaagttttctcgcgttctttgtcttgcgattggatttgcatcagcatttacatatagttatataacccaacctaagccggaggttaaaaaggtagtctctcagacctatgattttgataaattcactattgactcttctcagcgtcttaatctaagctatcgctatgttttcaaggattctaagggaaaattaattaatagcgacgatttacagaagcaaggttattcactcacatatattgatttatgtactgtttccattaaaaaaggtaattcaaatgaaattgttaaatgtaattaattttgttttcttgatgtttgtttcatcatcttcttttgctcaggtaattgaaatgaataattcgcctctgcgcgattttgtaacttggtattcaaagcaatcaggcgaatccgttattgtttctcccgatgtaaaaggtactgttactgtatattcatctgacgttaaacctgaaaatctacgcaatttctttatttctgttttacgtgcaaataattttgatatggtaggttctaacccttccattattcagaagtataatccaaacaatcaggattatattgatgaattgccatcatctgataatcaggaatatgatgataattccgctccttctggtggtttctttgttccgcaaaatgataatgttactcaaacttttaaaattaataacgttcgggcaaaggatttaatacgagttgtcgaattgtttgtaaagtctaatacttctaaatcctcaaatgtattatctattgacggctctaatctattagttgttagtgctcctaaagatattttagataaccttcctcaattcctttcaactgttgatttgccaactgaccagatattgattgagggtttgatatttgaggttcagcaaggtgatgctttagatttttcatttgctgctggctctcagcgtggcactgttgcaggcggtgttaatactgaccgcctcacctctgttttatcttctgctggtggttcgttcggtatttttaatggcgatgttttagggctatcagttcgcgcattaaagactaatagccattcaaaaatattgtctgtgccacgtattcttacgctttcaggtcagaagggttctatctctgttggccagaatgtcccttttattactggtcgtgtgactggtgaatctgccaatgtaaataatccatttcagacgattgagcgtcaaaatgtaggtatttccatgagcgtttttcctgttgcaatggctggcggtaatattgttctggatattaccagcaaggccgatagtttgagttcttctactcaggcaagtgatgttattactaatcaaagaagtattgctacaacggttaatttgcgtgatggacagactcttttactcggtggcctcactgattataaaaacacttctcaggattctggcgtaccgttcctgtctaaaatccctttaatcggcctcctgtttagctcccgctctgattctaacgaggaaagcacgttatacgtgctcgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaatgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttaaatatttgcttatacaatcttcctgtttttggggcttttctgattatcaaccggggtacatatgattgacatgctagttttacgattaccgttcatcgattctcttgtttgctccagactctcaggcaatgacctgatagcctttgtagatctctcaaaaatagctaccctctccggcattaatttatcagctagaacggttgaatatcatattgatggtgatttgactgtctccggcctttctcacccttttgaatctttacctacacattactcaggcattgcatttaaaatatatgaggttctaaaaatttttatccttgcgttgaaataaaggcttctcccgcaaaagtattacagggtcataatgtttttggtacaaccgatttagctttatgctctgaggctttattgcttaattttgctaattctttgccttgcctgtatgatttattggatgtt)。
在本发明的实施例中，与支架分子结合的全部互补链分子的核苷酸序列为SEQ IDNO:2～SEQ ID NO:121，如表1所示。
表1
在本发明的实施例中，mRNA体外转录所需的DNA模板序列为SEQ ID NO:122(taatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgccaccatgaagaccatcatcgccctgagctacatcttctgcctggtgttcgccactaatctttgtccgttcggtgaggtttttaacgcgacaaggttcgctagtgtatatgcttggaaccgaaagagaatctccaattgcgtagctgattactccgttctctataacagtgcgtccttttcaacctttaagtgttacggcgtttctccaacgaagctgaatgatctctgttttacgaacgtgtatgctgactctttcgttatacggggggacgaagtgagacagatagcaccaggtcagactgggaagatagcggattacaactataagttgcccgatgattttacggggtgcgtaatcgcatggaactcaaacaacctcgactccaaagtaggtggtaattataattacttgtatcgcctgtttcgaaagagcaatttgaagccttttgagcgggatatttcaaccgaaatttaccaagcaggcagtacgccatgtaacggagtagagggatttaattgctactttcctcttcaatcttatggctttcaaccaacaaacggagtggggtatcaaccttatagagtggtagtattgtcctttgagctcctccacgccccggctacagtttgtgggcccaaaaagggatccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga)。
实施例1
本实施例制备了一种血管紧张素转换酶2受体结合结构域RNA疫苗，具体过程为：
(1)制备支架分子：取带有F’质粒的大肠杆菌的一个单菌落接种5mL加富培养基，37℃温和振荡培养12h；随后取0.1mL培养物接种5mL的2xYT培养基(SIGMA aldrich，Y2377)，37℃剧烈振荡培养2h，培养结束后加入45mL的2xYT培养基稀释培养物，再加入1mL的M13mp18噬菌体悬液感染大肠杆菌培养物，37℃温和振荡培养5h～8h。培养完成后，将培养液转移至无菌离心管中，16000rpm室温离心10min～15min，将上清液转移至一个新的离心管中，即得噬菌体悬液。使用20％的聚乙二醇溶液对噬菌体悬液沉淀，冰上孵育30min，随后于4℃下6000rpm离心20min，所得沉淀即为噬菌体病毒颗粒；使用碱性裂解液对噬菌体病毒颗粒于冰上裂解15min，裂解完成后使用乙酸钠溶液中和、稀释至50mL，4℃下6000rpm离心20min，将上清液转移至一个新的离心管中，加入1倍于上清液体积的无水乙醇，冰水孵育30min，再次于4℃下6000rpm离心20min，所得沉淀即为M13mp18噬菌体基因组DNA(支架分子)。
(2)制备DNA纳米结构：取TAE溶液(由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成)作为制备DNA纳米结构的缓冲液，分别配制10nM步骤(1)中制备的支架分子溶液，以及100nM互补链分子溶液(即以上列出的120条核苷酸序列：SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:121，这些核苷酸序列通过商业化合成，且这些互补链分子以相同的物质的量浓度与支架分子混合)，将上述溶液加入微量离心管中，总体积100μL，混匀，置于PCR热循环仪中，设置温度和时间，使上述反应体系从95℃经25h逐步降至室温。在此退火过程中，DNA分子即可完成互补杂交，折叠成设计的三维纳米结构。
(3)制备mRNA分子：从核酸载体制备公司(AddGene)订购含T7启动子的针对mRNA序列的质粒载体(pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc)，并通过PCR制备DNA模板(见SEQ ID NO:122中序列agacccaagctggctagcgc)；配制转录反应体系：2μL DNA模板溶液，2μL T7转录酶，8μL核糖核苷酸(NTP)混合液及8μL体外转录缓冲液；将上述反应体系于37℃下进行2h～4h，即得血管紧张素转换酶2受体结合结构域mRNA产物。
由于此mRNA产物要与含24号互补链分子(SEQ ID NO:25)的一段DNA纳米结构杂交，因此需对24号互补链分子进行改造，将与mRNA分子互补的序列连接到24号互补链分子后，才能实现mRNA分子与DNA纳米结构的结合。具体见SEQ ID NO:123(24号分子：atcggaacgagggtagagcagcgaaccgat)和SEQ ID NO:124(24号分子改变后：atcggaacgagggtagagcagcgaaccgatttttttttctgggttcgaccgatcgcg，在原序列后加了ttttttttctgggttcgaccgatcgcg，其中tctgggttcgaccgatcgcg为与mRNA分子互补的序列)。
(4)DNA纳米结构与mRNA分子结合：将步骤(2)制备的DNA纳米结构与步骤(3)制备的血管紧张素转换酶2受体结合结构域mRNA分子按物质的量的浓度比为1：5混合，使用PCR热循环仪将溶液从42℃经过4h逐步降温至室温，在此退火过程中，mRNA分子即可与DNA纳米结构上延伸出来的单链DNA部分完成互补杂交，进而形成稳定的双链结构，稳定mRNA。
对比例1
本对比例制备了一种血管紧张素转换酶2受体结合结构域RNA疫苗，与实施例1的区别在于，本对比例只制备了mRNA分子，没有与DNA纳米结构结合，具体过程为：
从核酸载体制备公司(AddGene)订购含T7启动子的针对mRNA序列的质粒载体(pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc)，并通过PCR制备DNA模板(见SEQ ID NO:122中序列agacccaagctggctagcgc)；配制转录反应体系：2μL DNA模板溶液，2μL T7转录酶，8μL核糖核苷酸(NTP)混合液及8μL体外转录缓冲液；将上述反应体系于37℃下进行2h～4h，即得血管紧张素转换酶2受体结合结构域mRNA产物。
试验例
1.测试了实施例1和对比例1制备的疫苗中mRNA分子的稳定性。
通过逆转录-扩增(RT-PCR)方法进行测试，具体方法如下：
逆转录：配制20μL的反应体系，其中mRNA样品溶液2μL，逆转录酶(突变的莫罗尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶，GeneCopoeia)1μL，10mM脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合液1μL，固定引物1μL，体外逆转录缓冲液15μL；将上述反应体系混合后于42℃下孵育30min，反应完成后将体系加热到85℃失活逆转录酶；
PCR：配制50μL的反应体系，其中逆转录产物2μL，正、反向引物各1μL，DNA聚合酶25μL，PCR扩增反应缓冲液21μL；将上述反应体系混合后置于PCR热循环仪中，经标准PCR热循环30轮后，通过琼脂糖凝胶电泳观察成像。
(1)测试实施例1和对比例1制备的RNA疫苗在4℃条件下储藏一定时间后其mRNA分子的稳定性，测试结果如图1所示。图1中，以每组mRNA的初始活性作为100％，对比例1(没有DNA纳米结构作为载体)制备的RNA疫苗在4℃条件下储藏易于降解，在储藏一周后mRNA分子的活性下降至60％左右，而实施例1(DNA纳米结构作为载体)制备的疫苗中mRNA活性在一周后能维持在90％以上；对比例1制备的RNA疫苗在储藏两周后mRNA分子的活性已无法测定，而实施例1制备的疫苗中mRNA分子的活性在30d时依然能维持在90％以上。
(2)测试实施例1和对比例1制备的RNA疫苗在25℃条件下储藏一定时间后其mRNA分子的稳定性，测试结果如图2所示。图2中，以每组mRNA的初始活性作为100％，对比例1制备的RNA疫苗在25℃条件下储藏易于降解，在储藏一周后mRNA分子的活性下降至15％左右，而实施例1制备的疫苗中mRNA活性在一周后能维持在85％以上。
2.测试了实施例1和对比例1制备的疫苗作用于细胞后，相应血管紧张素转换酶2受体结合结构域蛋白的生成量变化。
具体方法：
培养细胞：将人肾脏细胞系HEK-293T使用补充有10％胎牛血清及1％青霉素-链霉素的DMEM混合培养基(Thermo Fisher Scientific)培养，在37℃，含5％CO2的培养箱中培养72h；
取实施例1和对比例1制备的疫苗(mRNA浓度为2μg/mL)以Lipofactamine2000试剂(赛默飞)转染HEK-293T细胞，将转染后的细胞培养48h后，提取细胞中的蛋白并用蛋白质印记法(Western blotting)检测0h～48h血管紧张素转换酶2受体结合结构域蛋白的生成量，结果如图3所示。
图3中，以实施例1(有DNA纳米结构作为载体)中疫苗作用细胞48h后的蛋白生成量作为100％进行评价对比，对比例1(没有DNA纳米结构作载体)制备的疫苗作用细胞48h后仅产生75％左右的蛋白。
以上表明本发明涉及的DNA纳米结构不仅能明显提升核酸疫苗的稳定性，还可以使其对细胞的作用增强，可能是因为在细胞外抵御核酸酶攻击的作用增强。
3.测试了实施例1和对比例1制备的疫苗对RNA酶的抵御作用。
具体方法：
配制10μL的反应体系，包括实施例1(含mRNA约800ng)或对比例1制备的疫苗(含mRNA约800ng)，RnaseA(全金式，GE101)。根据RnaseA浓度的不同，可配制多个反应体系，37℃孵育40min，之后根据1中的逆转录-扩增(RT-PCR)方法检测mRNA的活性，结果如图4所示。
图4中，16U/L的RnaseA可使对比例1中的mRNA的活性下降至接近50％，而实施例1中即使400U/L的RnaseA也只能使mRNA的活性下降至75％左右。表明实施例1中的mRNA在DNA纳米结构的保护下对RnaseA的抗性，为对比例1中mRNA对RnaseA抗性的25倍以上。
以上测试表明，本发明涉及的核酸疫苗，有DNA纳米结构的保护，既能维持存储活性，与莫德纳公司研发的mRNA-1273疫苗的存储活性相媲美；又能抵抗核酸酶的攻击，优于mRNA-1273疫苗对核酸酶的抗性，具有较好的稳定性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市儿童医院；深圳大学
<120> 一种核酸疫苗及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7247
<212> DNA
<213> 噬菌体（Bacteriophage）
<400> 1
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240
tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540
aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500
attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560
ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtt gttcctttct 1620
attctcactc cgctgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680
ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740
tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800
gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860
ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920
ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980
accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040
agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100
aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160
atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220
atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280
ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340
gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400
attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460
aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520
ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctctgg 2580
tgattttgct ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt gacggtgata attcaccttt 2640
aatgaataat ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa tcggttgaat gtcgcccttt 2700
tgtctttggc gctggtaaac catatgaatt ttctattgat tgtgacaaaa taaacttatt 2760
ccgtggtgtc tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt atgtatgtat tttctacgtt 2820
tgctaacata ctgcgtaata aggagtctta atcatgccag ttcttttggg tattccgtta 2880
ttattgcgtt tcctcggttt ccttctggta actttgttcg gctatctgct tacttttctt 2940
aaaaagggct tcggtaagat agctattgct atttcattgt ttcttgctct tattattggg 3000
cttaactcaa ttcttgtggg ttatctctct gatattagcg ctcaattacc ctctgacttt 3060
gttcagggtg ttcagttaat tctcccgtct aatgcgcttc cctgttttta tgttattctc 3120
tctgtaaagg ctgctatttt catttttgac gttaaacaaa aaatcgtttc ttatttggat 3180
tgggataaat aatatggctg tttattttgt aactggcaaa ttaggctctg gaaagacgct 3240
cgttagcgtt ggtaagattc aggataaaat tgtagctggg tgcaaaatag caactaatct 3300
tgatttaagg cttcaaaacc tcccgcaagt cgggaggttc gctaaaacgc ctcgcgttct 3360
tagaataccg gataagcctt ctatatctga tttgcttgct attgggcgcg gtaatgattc 3420
ctacgatgaa aataaaaacg gcttgcttgt tctcgatgag tgcggtactt ggtttaatac 3480
ccgttcttgg aatgataagg aaagacagcc gattattgat tggtttctac atgctcgtaa 3540
attaggatgg gatattattt ttcttgttca ggacttatct attgttgata aacaggcgcg 3600
ttctgcatta gctgaacatg ttgtttattg tcgtcgtctg gacagaatta ctttaccttt 3660
tgtcggtact ttatattctc ttattactgg ctcgaaaatg cctctgccta aattacatgt 3720
tggcgttgtt aaatatggcg attctcaatt aagccctact gttgagcgtt ggctttatac 3780
tggtaagaat ttgtataacg catatgatac taaacaggct ttttctagta attatgattc 3840
cggtgtttat tcttatttaa cgccttattt atcacacggt cggtatttca aaccattaaa 3900
tttaggtcag aagatgaaat taactaaaat atatttgaaa aagttttctc gcgttctttg 3960
tcttgcgatt ggatttgcat cagcatttac atatagttat ataacccaac ctaagccgga 4020
ggttaaaaag gtagtctctc agacctatga ttttgataaa ttcactattg actcttctca 4080
gcgtcttaat ctaagctatc gctatgtttt caaggattct aagggaaaat taattaatag 4140
cgacgattta cagaagcaag gttattcact cacatatatt gatttatgta ctgtttccat 4200
taaaaaaggt aattcaaatg aaattgttaa atgtaattaa ttttgttttc ttgatgtttg 4260
tttcatcatc ttcttttgct caggtaattg aaatgaataa ttcgcctctg cgcgattttg 4320
taacttggta ttcaaagcaa tcaggcgaat ccgttattgt ttctcccgat gtaaaaggta 4380
ctgttactgt atattcatct gacgttaaac ctgaaaatct acgcaatttc tttatttctg 4440
ttttacgtgc aaataatttt gatatggtag gttctaaccc ttccattatt cagaagtata 4500
atccaaacaa tcaggattat attgatgaat tgccatcatc tgataatcag gaatatgatg 4560
ataattccgc tccttctggt ggtttctttg ttccgcaaaa tgataatgtt actcaaactt 4620
ttaaaattaa taacgttcgg gcaaaggatt taatacgagt tgtcgaattg tttgtaaagt 4680
ctaatacttc taaatcctca aatgtattat ctattgacgg ctctaatcta ttagttgtta 4740
gtgctcctaa agatatttta gataaccttc ctcaattcct ttcaactgtt gatttgccaa 4800
ctgaccagat attgattgag ggtttgatat ttgaggttca gcaaggtgat gctttagatt 4860
tttcatttgc tgctggctct cagcgtggca ctgttgcagg cggtgttaat actgaccgcc 4920
tcacctctgt tttatcttct gctggtggtt cgttcggtat ttttaatggc gatgttttag 4980
ggctatcagt tcgcgcatta aagactaata gccattcaaa aatattgtct gtgccacgta 5040
ttcttacgct ttcaggtcag aagggttcta tctctgttgg ccagaatgtc ccttttatta 5100
ctggtcgtgt gactggtgaa tctgccaatg taaataatcc atttcagacg attgagcgtc 5160
aaaatgtagg tatttccatg agcgtttttc ctgttgcaat ggctggcggt aatattgttc 5220
tggatattac cagcaaggcc gatagtttga gttcttctac tcaggcaagt gatgttatta 5280
ctaatcaaag aagtattgct acaacggtta atttgcgtga tggacagact cttttactcg 5340
gtggcctcac tgattataaa aacacttctc aggattctgg cgtaccgttc ctgtctaaaa 5400
tccctttaat cggcctcctg tttagctccc gctctgattc taacgaggaa agcacgttat 5460
acgtgctcgt caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 5520
gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 5580
gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 5640
gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 5700
ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 5760
ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 5820
atctcgggct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggaacc accatcaaac 5880
aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc 5940
aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg 6000
cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 6060
gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 6120
actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 6180
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacga attcgagctc 6240
ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggcac tggccgtcgt 6300
tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 6360
tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 6420
gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgctt tgcctggttt ccggcaccag aagcggtgcc 6480
ggaaagctgg ctggagtgcg atcttcctga ggccgatact gtcgtcgtcc cctcaaactg 6540
gcagatgcac ggttacgatg cgcccatcta caccaacgtg acctatccca ttacggtcaa 6600
tccgccgttt gttcccacgg agaatccgac gggttgttac tcgctcacat ttaatgttga 6660
tgaaagctgg ctacaggaag gccagacgcg aattattttt gatggcgttc ctattggtta 6720
aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaat gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca 6780
atttaaatat ttgcttatac aatcttcctg tttttggggc ttttctgatt atcaaccggg 6840
gtacatatga ttgacatgct agttttacga ttaccgttca tcgattctct tgtttgctcc 6900
agactctcag gcaatgacct gatagccttt gtagatctct caaaaatagc taccctctcc 6960
ggcattaatt tatcagctag aacggttgaa tatcatattg atggtgattt gactgtctcc 7020
ggcctttctc acccttttga atctttacct acacattact caggcattgc atttaaaata 7080
tatgaggttc taaaaatttt tatccttgcg ttgaaataaa ggcttctccc gcaaaagtat 7140
tacagggtca taatgttttt ggtacaaccg atttagcttt atgctctgag gctttattgc 7200
ttaattttgc taattctttg ccttgcctgt atgatttatt ggatgtt 7247
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taaatattga cggaaaattg aggttgtcac 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgaacaaag ttaccaaaaa gtataagccc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaatcggcc aacgcggtgc cagaatgagt 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatcgtaaaa ctagcaagaa tcggggtagc 30
Claims (10)
1.一种核酸疫苗，其特征在于，包括核酸分子和DNA纳米结构，所述DNA纳米结构作为一种载体，与所述核酸分子结合。
2.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于，所述DNA纳米结构与所述核酸分子通过碱基互补配对原则结合。
3.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于，所述核酸分子包括编码特定抗原蛋白的RNA分子。
4.根据权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于，所述DNA纳米结构包括支架分子和互补链分子。
5.根据权利要求4所述的核酸疫苗，其特征在于，所述支架分子为单链DNA分子，碱基数为500～10000，优选7000～8000。
6.根据权利要求4所述的核酸疫苗，其特征在于，所述互补链分子包括单链DNA分子，碱基数为20～60，优选25～55。
7.权利要求1～6任一项所述的核酸疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将支架分子与互补链分子混合，折叠形成DNA纳米结构；
S2：将步骤S1所述的DNA纳米结构与核酸分子混合，杂交形成稳定的双链结构。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述支架分子与所述互补链分子混合后进行反应，反应温度为25℃～92℃，反应时间为24h～240h。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述支架分子与所述互补链分子混合后进行反应，还需加入镁离子，所述镁离子的浓度为2mM～40mM。
10.权利要求1～6任一项所述核酸疫苗或按照权利要求7～9任一项所述制备方法制得的核酸疫苗在制备治疗新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
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| US20190240340A1 (en) * | 2016-07-20 | 2019-08-08 | Guild Biosciences | Functionalized nucleic acid nanostructures for rna delivery |
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-
2022
- 2022-01-24 CN CN202210083383.8A patent/CN114425079A/zh active Pending
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