CN114395521A - 一种空心磁性磷酸钙细胞微载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种空心磁性磷酸钙细胞微载体及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：向钙盐溶液中加入有机模板剂，得改性钙盐溶液，将改性钙盐溶液和磷酸盐溶液混合，得乳浊液，依次向乳浊液中加入尿素和盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行水热反应，冷却后收集沉淀、洗涤，制得磷酸钙微球；将磷酸钙粉体加水溶解，得磷酸钙溶液，然后向其中加入四氧化三铁粉末，超声分散处理，最后水热反应，制得。该磁性磷酸钙微球可用作细胞微载体用于骨微组织构建，同时有利于微组织的高效组装，可有效解决现有支架材料存在的细胞分布不均匀的问题。
Description
技术领域
本发明属于医疗材料技术领域，具体涉及一种空心磁性磷酸钙细胞微载体及其制备方法。
背景技术
近年来，自下而上的组织工程方法逐渐兴起，即从微纳米尺度上进行模块组织结构与功能的仿生设计，通过制备微载体与细胞复合，构建模块化组织，再进一步组装实现大块组织的功能重建。微载体一方面作为细胞生长的载体，能够加速细胞扩增，从而减少来源于病人的细胞数量；另一方面，微载体的表面结构、硬度及化学性质等对细胞表型均有重要影响。因此，根据不同组织的结构特点，选择适用于模块单元组装成型的生物材料是自下而上组织工程研究面临的主要问题。磷酸钙作为人体硬组织的主要无机成分，因具有良好的生物相容性和生物活性，被广泛应用于骨缺损修复，而具有纳米结构的磷酸钙微球在药物释放、功能吸附和骨缺损填充等领域具有广阔的应用前景。但是却极少研究开发针对硬组织修复的磷酸钙微载体材料。影响自下而上组织工程构建的另一个主要问题是如何将具有特定结构的模块单元组装成为宏观组织工程复合体。鉴于磁性颗粒在外界磁场作用下，能够实现颗粒在空间的准确定位和高效富集，制备磁性磷酸钙微载体，有望实现对模块单元的高效组装。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种空心磁性磷酸钙细胞微载体及其制备方法，该空心磁性磷酸钙细胞微载体可有效解决现有支架材料存在的细胞分布不均匀的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)向钙盐溶液中加入有机模板剂，得改性钙盐溶液，将改性钙盐溶液和磷酸盐溶液混合，得乳浊液，依次向乳浊液中加入尿素和盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行水热处理，冷却后收集沉淀、洗涤，制得磷酸钙微球；
(2)将步骤(1)中的磷酸钙粉体和四氧化三铁粉末超声分散于水中，然后进行水热反应，制得。
进一步地，步骤(1)中钙盐为氯化钙，磷酸盐为磷酸氢二钠，有机模板剂为EDTA、植酸或环己烷六羧酸。
进一步地，步骤(1)尿素添加量等于钙盐的使用量，有机模板剂在钙盐溶液中的浓度为16-18g/L。
进一步地，步骤(1)中体系于160-200℃条件下反应4-7h。
进一步地，步骤(2)中磷酸钙粉体与四氧化三铁的质量比为0.9-1.0:0.04-0.06。
进一步地，步骤(2)中于160-200℃条件下反应20-28h。
进一步地，步骤(2)四氧化三铁粉末通过如下方法制得：将二价铁盐和三价铁盐溶解于水中，得含铁溶液，于含铁溶液表层滴加无毒有机溶剂，然后调节含铁溶液pH值为碱性，再对溶液进行水热处理，冷却后收集沉淀、洗涤、干燥，得四氧化三铁粉体。
进一步地，无毒有机溶剂为松节油。
进一步地，二价铁盐和三价铁盐分别为FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O，含铁溶液中二价铁离子与三价铁离子的摩尔比为1:1.5-2。
进一步地，调节含铁溶液pH值为10-11，然后于110-130℃条件下反应18-24h，制得。
本发明所产生的有益效果为：
本申请中使用EDTA作为形貌调控剂，可用来改变磷酸钙的形貌，使之形成空心球形结构，该球形结构形貌均匀，且该空心微球结构材料具有低密度、高比表面的特性，而其内部的空心部分可用于容纳药物分子，可以产生基于微观包裹效应的性质；该磷酸钙微球表面存在大量棒状纳米结构，棒状纳米结构之间形成沟槽，沟槽结构可引导细胞沿沟槽方向铺展，使细胞呈圆形铺展，棒状纳米结构有利于纤连蛋白吸附剂成骨细胞粘附、增殖。本申请中的纳米球形磷酸钙微球更有利于骨髓间充质干细胞的成骨分化。
本申请中制得的磁性磷酸钙微球无细胞毒性、无副作用，其磁性强，与细胞共培养时，能在磁场条件下组装汇聚构建模块化组织，通过本申请中的方法，能够在细胞水平上对构建的组织进行空间上的精确控制，实现细胞的均匀分布，有效调控细胞的生长微环境。
本申请中的磷酸钙和四氧化三铁经过超声处理后，使得磷酸钙材料具有一定的磁性，经过高温反应后，使得磷酸钙表面的磷酸根吸附四氧化三铁纳米粒子，四氧化三铁纳米粒子与钙离子通过化学键结合生成纳米晶簇，使得形成的结构更稳定，产生的磁性不随时间而消退。
附图说明
图1为本申请中球形空心磷酸钙细胞微载体的电镜图；
图2为对比例1中制得的磷酸钙细胞微载体的电镜图；
图3为本申请中磷酸钙细胞微载体和四氧化三铁复合粉末超声前后的磁性对比照片；
图4为本申请中磷酸钙细胞微载体的毒性试验统计图；
图5为磷酸钙细胞微载体和细胞共培养过程中的显微照片；
图6为磷酸钙细胞微载体和细胞共培养过程中的照片；
图7为磷酸钙细胞微载体和细胞共培养后的照片；
图8为磷酸钙细胞微载体和细胞共培养后的荧光染色图；
图9为磷酸钙细胞微载体和细胞共培养后的激光共聚焦图片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种空心磁性磷酸钙细胞微载体，其制备方法包括以下步骤：
(1)将1g氯化钙溶解于30ml去离子水中，制得氯化钙溶液，向氯化钙溶液中加入0.5gEDTA，得改性钙盐溶液；将1.6g Na2HPO4·6H2O溶解于30ml去离子水中，得磷酸盐溶液，将改性钙盐溶液和磷酸盐溶液混合搅拌15min，得乳浊液，向乳浊液中加入1g尿素，搅拌10min，然后继续加入盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行升温至180℃反应6h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，烘干，制得磷酸钙微球；
(2)将0.93g步骤(1)中的磷酸钙粉体加40ml去离子水溶解，振荡超声5min，得磷酸钙溶液，然后向其中加入0.05g四氧化三铁粉末，超声处理30min，最后升温至180℃反应24h，收集沉淀，烘干，制得。
其中，四氧化三铁的制备方法如下：将1mmol FeCl2·4H2O和1.7mmol FeCl3·6H2O溶解于40ml去离子水中，得含铁溶液，于含铁溶液表层滴加8ml松节油，然后调节含铁溶液pH值为11，再对溶液进行升温至120℃反应20h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，干燥，得四氧化三铁粉体。
实施例2
一种空心磁性磷酸钙细胞微载体，其制备方法包括以下步骤：
(1)将1g氯化钙溶解于30ml去离子水中，制得氯化钙溶液，向氯化钙溶液中加入0.5gEDTA，得改性钙盐溶液；将1.6g Na2HPO4·6H2O溶解于30ml去离子水中，得磷酸盐溶液，将改性钙盐溶液和磷酸盐溶液混合搅拌15min，得乳浊液，向乳浊液中加入1g尿素，搅拌10min，然后继续加入盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行升温至160℃反应7h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，烘干，制得磷酸钙微球；
(2)将0.93g步骤(1)中的磷酸钙粉体加40ml去离子水溶解，振荡超声5min，得磷酸钙溶液，然后向其中加入0.04g四氧化三铁粉末，超声处理30min，最后升温至170℃反应26h，收集沉淀，烘干，制得。
其中，四氧化三铁的制备方法如下：将1mmol FeCl2·4H2O和2mmol FeCl3·6H2O溶解于40ml去离子水中，得含铁溶液，于含铁溶液表层滴加8ml松节油，然后调节含铁溶液pH值为10，再对溶液进行升温至110℃反应18h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，干燥，得四氧化三铁粉体。
实施例3
一种空心磁性磷酸钙细胞微载体，其制备方法包括以下步骤：
(1)将1g氯化钙溶解于30ml去离子水中，制得氯化钙溶液，向氯化钙溶液中加入0.5gEDTA，得改性钙盐溶液；将1.6g Na2HPO4·6H2O溶解于30ml去离子水中，得磷酸盐溶液，将改性钙盐溶液和磷酸盐溶液混合搅拌15min，得乳浊液，向乳浊液中加入1.2g尿素，搅拌10min，然后继续加入盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行升温至200℃反应4h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，烘干，制得磷酸钙微球；
(2)将0.93g步骤(1)中的磷酸钙粉体加40ml去离子水溶解，振荡超声5min，得磷酸钙溶液，然后向其中加入0.06g四氧化三铁粉末，超声处理30min，最后升温至200℃反应20h，收集沉淀，烘干，制得。
其中，四氧化三铁的制备方法如下：将1mmol FeCl2·4H2O和1.5mmol FeCl3·6H2O溶解于40ml去离子水中，得含铁溶液，于含铁溶液表层滴加8ml松节油，然后调节含铁溶液pH值为11，再对溶液进行升温至130℃反应24h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，干燥，得四氧化三铁粉体。
对比例1
一种磁性磷酸钙材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)将1g氯化钙溶解于30ml去离子水中，制得氯化钙溶液；将1.6g Na2HPO4·6H2O溶解于30ml去离子水中，得磷酸盐溶液，将钙盐溶液和磷酸盐溶液混合搅拌15min，得乳浊液，向乳浊液中加入1g尿素，搅拌10min，然后继续加入盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行升温至180℃反应6h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，烘干，制得磷酸钙材料；
(2)将0.93g步骤(1)中的磷酸钙粉体加40ml去离子水溶解，振荡超声5min，得磷酸钙溶液，然后向其中加入0.05g四氧化三铁粉末，超声处理30min，最后升温至180℃反应24h，收集沉淀，烘干，制得。
其中，四氧化三铁的制备方法如下：将1mmol FeCl2·4H2O和1.7mmol FeCl3·6H2O溶解于40ml去离子水中，得含铁溶液，于含铁溶液表层滴加8ml松节油，然后调节含铁溶液pH值为11，再对溶液进行升温至120℃反应20h，冷却后收集沉淀、分别用去离子水和无水乙醇各洗涤3次，干燥，得四氧化三铁粉体。
试验例
一、将实施例1中的制备方法为基础，调整磷酸钙粉体与四氧化三铁的质量比为1:0.15，1:0.05，1:0.038，1:0，别标记为高剂量组、中剂量组、低剂量组和空白组，然后分别将制得的载体加入培养基中，于37℃条件下振荡培养三天，然后用0.2μm过滤器将培养基进行消毒，然后将骨髓间充质干细胞进行传代后，制成悬浮细胞，然后以7000个细胞/孔的密度将细胞接种于96孔板中，分别于培养1d、2d、3d后进行CCK8毒性试验，每组进行6个平行试验，具体实验结果见图4。
二、将制得的磁性微载体与间充质干细胞共培养。培养板为96孔板。首先配置2％W/v琼脂糖溶液，每孔加入琼脂糖溶液40μl，待琼脂糖溶液冷却后，将细胞和微载体分散在培养基中，按每孔8*10^3接种，观察细胞状态，具体结果见图5-9。
通过附图1可以看出，本申请中制得的磁性磷酸钙微球为空心球形结构，且磷酸钙微球的表面含有若干棒状结构，棒状结构之间形成大量沟槽结构。
图2为对比例1中制得的磷酸钙材料的电镜图，通过结构可以看出，未滴加EDTA的磷酸钙材料为针棒状，无法形成空心球形结构。
通过图3可以看出，图3中左图中左侧瓶子内为未经过超声处理的磷酸钙和四氧化三铁粉体，图3左图右侧瓶子内为经过超声处理的磷酸钙和四氧化三铁粉体，在图3中两个瓶子之间放入磁铁，具体结果见图3右图，通过图3右图可以看出左侧瓶子内的粉体不具磁性，而右侧的瓶子内的粉体具有一定磁性。
通过图4可以看出，培养的3天时间内，高剂量组的OD值均低于中剂量组、低剂量组和空白组，而低剂量组在培养第三天时，OD值明显高于高剂量组，证明该剂量下，细胞毒性最低。
通过图5可以看出，明亮的为细胞，可见细胞围绕微载体生长，没有微载体的部分细胞几乎没有生长。
通过图6和图7可以看出，培养一段时间后，细胞会优先与微载体结合，细胞外基质相互联结，最后形成细胞-微载体结构单元，随后可利用微载体的磁学性能对结构单元进行组装，以形成更大尺度的微组织模块。
通过图8和图9可以看出，荧光下可见细胞与微载体形成较复杂的三维结构，且细胞活性较好。
Claims (10)
1.一种空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向钙盐溶液中加入有机模板剂，得改性钙盐溶液，将改性钙盐溶液和磷酸盐溶液混合，得乳浊液，依次向乳浊液中加入尿素和盐酸，调节乳浊液为透明溶液，然后对体系进行水热处理，冷却后收集沉淀、洗涤，制得磷酸钙微球；
(2)将步骤(1)中的磷酸钙粉体和四氧化三铁粉末超声分散于水中，然后进行水热反应，制得。
2.如权利要求1所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中钙盐为氯化钙，磷酸盐为磷酸氢二钠，有机模板剂为EDTA、植酸或环己烷六羧酸。
3.如权利要求1所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)尿素添加量等于钙盐的使用量，有机模板剂在钙盐溶液中的浓度为16-18g/L。
4.如权利要求1所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中体系于160-200℃条件下反应4-7h。
5.如权利要求1所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中磷酸钙粉体与四氧化三铁的质量比为0.9-1.0:0.04-0.06。
6.如权利要求1所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中于160-200℃条件下反应20-28h。
7.如权利要求1所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)四氧化三铁粉末通过如下方法制得：将二价铁盐和三价铁盐溶解于水中，得含铁溶液，于含铁溶液表层滴加无毒有机溶剂，然后调节含铁溶液pH值为碱性，再对溶液进行水热处理，冷却后收集沉淀、洗涤、干燥，得四氧化三铁粉体。
8.如权利要求7所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，二价铁盐和三价铁盐分别为FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O，含铁溶液中二价铁离子与三价铁离子的摩尔比为1:1.5-2。
9.如权利要求7所述的空心磁性磷酸钙细胞微载体的制备方法，其特征在于，调节含铁溶液pH值为10-11，然后于110-130℃条件下反应18-24h，制得。
10.一种空心磁性磷酸钙细胞微载体，其特征在于，采用权利要求1-9中任一项所述的制备方法制得。
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