CN114391095A - 适用于即时(poc)诊断测试绝对嗜中性粒细胞功能(anf)的即时(poc)测量的全血和体液中吞噬性白细胞的基于氧化酶的化学发光测定 - Google Patents

适用于即时(poc)诊断测试绝对嗜中性粒细胞功能(anf)的即时(poc)测量的全血和体液中吞噬性白细胞的基于氧化酶的化学发光测定 Download PDF

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Abstract

用于估计动物体液中吞噬细胞数量的方法包括刺激吞噬细胞的NADPH氧化酶活性；以及使用能够测量光的仪器通过化学发光底物的发射的化学发光来定量所述化学发光底物的还原性脱氧。吞噬细胞的NADPH氧化酶活性优选由能够激活吞噬细胞的呼吸爆发的免疫或化学物质刺激。吞噬细胞的NADPH氧化酶活性优选通过溶液中的或被涂覆到吞噬细胞接触的表面上的刺激物来刺激。该刺激物优选为佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)。所述动物优选为人，所述体液优选为血液和/或脊髓液。吞噬细胞优选为嗜中性粒细胞，并且化学发光底物优选为光泽精(N,N′‑二甲基‑9,9′‑双吖啶鎓二硝酸盐)。还提供了基于该估计方法的治疗方法。

Description

适用于即时(POC)诊断测试绝对嗜中性粒细胞功能(ANF)的即 时(POC)测量的全血和体液中吞噬性白细胞的基于氧化酶的 化学发光测定
技术领域
方法以适用于即时(point-of-care)诊断测试的方式定量血液和体液中吞噬性白细胞(基本上是嗜中性粒细胞，但也包括单核细胞和嗜酸性粒细胞)的存在。可进行绝对嗜中性粒细胞计数(Absolute neutrophil counts，ANC)以评估通常与化疗相关联或作为炎症的量度的髓细胞生成抑制。本文公开的方法可以基于呼吸爆发代谢的激活和测量化学发光探针的还原性双加氧(reductive dioxygenation)来定量吞噬细胞。
技术背景
自动血液分析仪是用于测量全血中白细胞、红细胞和血小板的成熟仪器。血液中的白细胞组分在形态和功能上与红细胞和血小板不同。阻抗、光散射以及酶促和抗原性差异是通过自动血液学计数和区分白细胞的基础。这些仪器非常复杂，本身不适合用于即时(point-of-care，POC)测定法的开发。
吞噬细胞代谢的激活(即“呼吸爆发”)的特征在于单磷酸己糖支路(hexosemonophosphate shunt)(戊糖途径)的脱氢酶大量增加葡萄糖代谢，以及非线粒体O2消耗成比例增加(Sbarra和Karnovsky 1959)。这两种活性都反映了NADPH氧化酶(NADPH:O2氧化还原酶)(一种血液吞噬细胞共有的酶)的激活(Rossi，Romeo等人1972)。吞噬细胞NADPH氧化酶的激活驱动易燃的双加氧反应，该反应产生天然的化学发光作为能量产物(Allen等人，1972)。天然白细胞化学发光依赖于O2，并与单磷酸己糖支路脱氢酶活性成正比。NADPH氧化酶的激活导致HO2、O2 -和H2O2的生成。生成的H2O2作为MPO(H2O2:卤化物氧化还原酶)将氯化物氧化成次氯酸盐(OCl-)的底物，并与添加的H2O2发生二次化学反应，产生单线态分子氧(1O2*)(Allen,Yevich等人1974,Allen 1979)。分离的MPO的依赖于卤化物的加卤酶活性也产生作为能量产物的天然化学发光(Allen 1975，Allen 1975)。
化学发光量子产率，即每次氧化事件所发射的光子的比率，取决于生成的氧合剂(oxygenating agent)的类型和数量，以及被氧合的底物的性质和量子效率。天然底物的氧合作用与相对较低的化学发光量子产率相关联，并且该产率随着氧合底物的性质而变化。引入高量子产率化学发光底物(chemiluminigenic substrate，CLS)克服了灵敏度和底物变化性的问题。添加环状酰肼类，例如鲁米诺，将吞噬细胞发光的产率提高了一千倍以上(Allen和Loose 1976)。吖啶鎓盐诸如光泽精也大大提高白细胞发光产率(Allen 1981,Allen 1982)。
环状酰肼和吖啶鎓化学发光可以通过在碱性条件下暴露于H2O2而化学引发(Albrecht 1928,Totter 1964)。然而，这些底物在生理环境的弱酸性至中性的pH条件下不会产生CL。依赖于鲁米诺和光泽精的吞噬细胞CL活性测量不同的氧合途径(Allen 1982,Allen 1986)。鲁米诺CL是由双加氧作用引起的，产生电子激发的氨基苯甲酸盐/酯(即鲁米诺+O2→氨基苯甲酸盐/酯+N2+光子)。在吞噬性白细胞中，这种活性与MPO密切相关。鲁米诺CL是由非还原的简单双加氧产生的。在MPO阴性白细胞中观察到少量的鲁米诺CL，但MPO阳性白细胞产生超过100倍的发光强度(Allen 1986，Merrill，Bretthauer等人1996,Allen2019)。
吞噬细胞NADPH氧化酶催化O2一价还原为HO2。在中性环境中，HO2离解产生O2 -和H+，O2 -和HO2不成比例地产生H2O2。在酸性至中性条件下，二价阳离子光泽精(N,N'-二甲基-9,9’双吖啶鎓和双-N-甲基吖啶鎓)可以经历一次电子还原，产生一价阳离子基团，即光泽精++++e-→光泽精+，并且该基团可以与O2 -反应，产生二氧杂环丁烷(dioxetane)中间体，并最终产生两个N-甲基吖啶酮和光子，即光泽精++O2 -→光泽精-O2→2N-甲基吖啶酮+光子(Allen1981，Allen 2019)。
发明内容
本发明人令人惊奇地发现，通过使用化学发光方法直接测量稀释的全血和体液诸如脊髓液中存在的受刺激的吞噬细胞的功能活性，可以省去吞噬性白细胞的阻抗和流式细胞术测量所需的复杂仪器。每体积血液或体液中的吞噬细胞是通过测量化学发光底物的受刺激的NADPH氧化酶依赖性还原性双加氧作用来测定的。引入对吞噬细胞NADPH氧化酶的激活最佳的刺激，诸如PMA，导致还原性脱氧活性的产生。
所得的光泽精的还原性双加氧产生CL，所述CL可通过使用光度计测量发射的光来定量。这种发光与每体积血液或体液中吞噬细胞/嗜中性粒细胞的代谢活性成比例。这种绝对嗜中性粒细胞功能(absolute neutrophil function，ANF)测定与绝对嗜中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)成正比，并且适用于评估患者在炎症/感染或化疗相关骨髓抑制方面的临床状态。与常规ANC相比，这种基于功能的分析提供了替代的并且可以说是优越的测定法。ANF方法的技术要求适用于即时测试(point-of-care testing)。如本文实施例中所述，ANF测定允许在静脉穿刺后最初的16小时间隔期间定量评估血液中的嗜中性粒细胞数量(ANC)和功能。
在下面的详细描述和附图中描述了附加的特征和有利方面，根据所述详细描述和附图，所述特征和有利方面将变得显而易见。
附图说明
图1示出了以每秒的相对光单位(RLU/秒)表示的本文公开的实验实施例中的化学发光强度(速度)相对于以分钟表示的时间绘制的图。测试了前两名入组受试者(001号受试者(圆圈)和002号受试者(菱形))的0.25μL等体积的血液。当在含有光泽精(N,N′-二甲基-9,9′-双吖啶鎓二硝酸盐)作为化学发光探针的平衡盐介质中混合等量的0.25μL血液与0.5nmol PMA时，发生CL的激活。测量一式三份进行，平均速度由较大的开口标记显示，标准偏差由小点表示)。
图2示出了以累积相对光单位(RLU)表示的本文公开的实验实施例中的积分化学发光相对于以分钟表示的时间绘制的图。积分CL测量值(RLU)由图1所示的强度测量值计算而来。
图3A、B、C和D是在本文公开的实验实施例中，积分光泽精依赖性CL活性分别对比白细胞、吞噬细胞(嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞)、嗜中性粒细胞和淋巴细胞计数的图。横坐标描述了每0.25μL血液的细胞计数，相对于以PMA刺激的光泽精CL衡量的氧化酶依赖性还原性双加氧活性作图。对于每个图都显示了利用决定系数(R2)的线性回归分析。白细胞计数是针对每0.25μL所测试的血液。DBSS表示培养基是N,N′-二甲基-9,9′-双吖啶鎓二硝酸盐(光泽精)平衡盐溶液。静脉穿刺后的血龄从1小时到16小时不等。
图4A、B、C和D是在本文公开的实验实施例中，积分鲁米诺依赖性CL活性分别相对于白细胞、吞噬细胞(嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞)、嗜中性粒细胞和淋巴细胞计数的图。横坐标描述每0.25μL血液中的细胞计数；纵坐标描述了以PMA刺激的鲁米诺CL测量的氧化酶驱动的MPO依赖性(非还原)双加氧活性。除化学发光探针，即LBSS(鲁米诺平衡盐溶液)外，各条件是如针对图3A至D所描述的。
图5A和B是来自本文公开的实验实施例的CL活性图。图5A是每个嗜中性粒细胞的积分鲁米诺依赖性CL活性相对于以小时为单位的静脉穿刺后血龄的图。图5B是每个嗜中性粒细胞的积分光泽精依赖性CL活性相对于以小时为单位的静脉穿刺后血龄的图。用于积分的测试间隔为28.9分钟。
图6A和B是来自本文公开的实验实施例的CL活性图。图6A是针对036号和037号受试者的每个嗜中性粒细胞的积分鲁米诺依赖性CL活性相对于静脉穿刺后血龄的图。图6B是针对036号和037号受试者而言，每个嗜中性粒细胞的积分光泽精依赖性CL活性相对于静脉穿刺后血龄的图。内部集成测试时间为28.9分钟。
具体实施方式
一般实施方案
本公开提供了用于估计动物的体液中吞噬细胞数量的方法，该方法包括：刺激吞噬细胞的NADPH氧化酶活性；以及使用能够测量光的仪器通过化学发光底物的发射的化学发光来定量化学发光底物的还原性脱氧作用。
在一个实施方案中，所述吞噬细胞的NADPH氧化酶活性由能够激活吞噬细胞呼吸爆发的免疫或化学物质刺激。
在一个实施方案中，所述吞噬细胞的NADPH氧化酶活性由溶液中或者被包被到吞噬细胞接触的表面的刺激物刺激。刺激物可以是佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristate acetate，PMA)。
在一个实施方案中，所述动物是人。
在一个实施方案中，所述体液是血液。
在一个实施方案中，所述体液是脊髓液。脊髓液可被稀释至1/100，以减少红细胞化学发光吸光度。
在一个实施方案中，所述吞噬细胞是嗜中性粒细胞。
在一个实施方案中，所述化学发光底物是光泽精(N,N′-二甲基-9,9′-双吖啶鎓二硝酸盐)。光泽精可以在溶液中或被涂覆在吞噬细胞接触的表面上。
在一个实施方案中，该方法包括稀释体液以减少红细胞化学发光吸光度。
在一个实施方案中，该方法包括将血液稀释至多达约1/500，以减少红细胞化学发光吸光度。
在一个实施方案中，该方法包括将血液稀释至多大约1/1000，以减少红细胞化学发光吸光度。
在一个实施方案中，该方法包括使用凝集素从体液中聚集或除去红细胞，以促进化学发光检测。
在一个实施方案中，发射的化学发光由便携式或手持式光度计测量。在一个实施方案中，组件是预制的，以便于即时测试。
在一个实施方案中，该方法还包括使用吞噬细胞的估计数量来确定绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)。该方法还可包括使用ANC评估动物的髓细胞生成抑制，例如，髓细胞生成抑制与化疗相关联或者是炎症或感染的度量。在这方面，炎症或感染通常会增加髓细胞生成活性，但响应于感染的嗜中性粒细胞消耗实际上会减少嗜中性粒细胞计数。该方法还可包括基于髓细胞生成抑制的评估来治疗动物。
在另一个实施方案中，提供了用于估计髓细胞生成刺激的方法。该方法包括：使用能够测量光的仪器测量动物的化学激活的血液嗜中性粒细胞的非还原性双加氧驱动的髓过氧化物酶(鲁米诺CL)活性和还原性脱氧(光泽精CL)活性；以及计算鲁米诺CL活性与光泽精CL活性的比率。
优选实施方案
本文公开的绝对嗜中性粒细胞功能(absolute neutrophil function，ANF)测定法包括灵敏的化学发光探针法，其用于测定稀释的全血或体液诸如脊髓液中功能性吞噬细胞，即嗜中性粒细胞以及少量单核细胞和嗜酸性粒细胞的数量。具体而言，通过引入光泽精作为化学发光探针并测量受刺激的NADPH氧化酶还原性双加氧活性的化学发光产物来定量吞噬细胞功能。
该方法需要不到一滴的全血或体液。将少量样本在平衡盐溶液中稀释。将稀释的样品引入到含有能够激活吞噬细胞NADPH氧化酶依赖性呼吸爆发代谢的化学刺激物的环境中，所述化学刺激物是诸如佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，其能够激活吞噬细胞NADPH氧化酶依赖性呼吸爆发代谢，以及易受还原性双加氧作用影响的化学发光探针，例如光泽精(N,N′-二甲基-9,9′-双吖啶鎓二硝酸盐)。这种接触激活对光泽精的吞噬细胞NADPH氧化酶依赖性还原性双加氧作用，产生可通过光度测定法检测和定量的化学发光。化学发光探针(诸如鲁米诺)测量吞噬细胞的非还原(简单)双加氧反应，尤其是髓过氧化物酶(MPO)催化的那些反应。
在正常的髓细胞生成条件下，非还原性双加氧作用的测量接近存在的嗜中性粒细胞的数量。炎症刺激和g-CSF治疗扩大了骨髓的早幼粒细胞库，并可导致每个嗜中性粒细胞的MPO含量增加几倍。非还原性的双加氧活性反映了每个吞噬细胞的MPO含量，并反映了每个吞噬细胞的特定MPO含量。光泽精的NADPH氧化酶依赖性还原性双加氧作用不依赖于MPO，因此，与标本中功能性吞噬细胞的数量成正比。基于光泽精的ANF系统通过测量受刺激的吞噬细胞还原性双加氧作用来定量吞噬细胞的存在。在缺乏遗传因素例如慢性肉芽肿性疾病或获得性嗜中性粒细胞异常的情况下，NADPH氧化酶还原性双加氧活性的依赖于光泽精的测量不依赖于MPO，并且非常接近标本的嗜中性粒细胞计数。ANC确定了标本中存在的嗜中性粒细胞的数量。基于定量样本中嗜中性粒细胞的功能性存在，ANF测定提供了更多临床相关信息。ANF测定被证明可以定量反映静脉穿刺后最初16小时间隔内的全血ANC，并适用于即时测试。
虽然每个吞噬细胞的NADPH氧化酶活性相对恒定，但是每个吞噬细胞的髓过氧化物酶(MPO)活性随着髓细胞生成刺激的状态变化而变化。MPO和阳离子蛋白酶是在早幼粒细胞发育期合成并储存在嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中的溶酶体酶(Bainton 1999)。每个吞噬细胞的MPO浓度取决于髓细胞生成刺激的程度，即由集落刺激因子(生理性或重组G-CSF或GM-CSF)激活的程度，以及嗜中性粒细胞发育的髓细胞期有丝分裂的数量(Allen，Stevens等人1997)。例如，髓细胞期中的每次分裂将每个嗜中性粒细胞的髓过氧化物酶稀释一半。NADPH氧化酶的组分是在髓细胞发育期合成的，并且是呼吸爆发代谢所必需的。因此，就髓细胞生成活性的变化而言，每个吞噬细胞的NADPH氧化酶活性相对恒定。在各种炎症或骨髓细胞生成刺激或抑制条件下，每个吞噬细胞的特异性NADPH氧化酶活性保持相对恒定。
因此，受刺激的氧化酶活性非常接近吞噬细胞计数，尤其是嗜中性粒细胞计数。这种活性的测量非常接近每体积血液或体液的绝对嗜中性粒细胞计数。引入光泽精作为化学发光探针允许灵敏地定量吞噬细胞NADPH氧化酶的还原性双加氧活性(Allen 1981，Allen1982，Allen 1986)。简单或非还原性双加氧作用是在底物中掺入O2的反应，例如鲁米诺+O2→氨基苯甲酸盐/酯+N2+光子(Allen和Loose 1976)。还原性双加氧作用是其中掺入了O2加两个还原等效物(2个电子+2个质子)的反应，例如光泽精+2个电子+2个质子→2个N-甲基吖啶酮+光子。
光泽精的NADPH氧化酶依赖性的还原性双加氧作用提供了绝对嗜中性粒细胞功能(ANF)的量度，所述量度非常接近绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)。除了提供与ANC一致的信息以外，受刺激的嗜中性粒细胞氧化酶活性的光泽精化学发光(CL)测量还提供了有用的临床信息，并可应用于使用手持式光度计的即时(point-of-care，POC)测试。
嗜中性粒细胞的基于活性的测量提供了额外的信息。ANC定量嗜中性粒细胞的物理存在，但不定量嗜中性粒细胞的功能。因此，不检测与吞噬细胞功能受损相关的疾患，例如慢性肉芽肿性疾病或治疗对嗜中性粒细胞功能的任何毒性作用。驱动还原性双加氧活性的呼吸爆发活性的功能测量定量嗜中性粒细胞的杀微生物能力。以此类推，酶的抗原性检测不能提供关于其功能的信息。酶可以以抗原形式存在，但为非功能性的。酶的功能习惯测量提供了更完整和临床上有用的信息；即酶存在并且起作用。
当受刺激的嗜中性粒细胞通过测量光泽精的还原性双加氧作用来定量时，CL反应与嗜中性粒细胞计数相关。当通过测量鲁米诺的非还原性双加氧作用来定量刺激的嗜中性粒细胞时，CL反应显示与嗜中性粒细胞计数的相关性更小。化学发光探针，诸如鲁米诺，测量非还原性双加氧作用或双加氧活性，特别是由MPO催化的那些(Allen 2019)。在正常髓细胞生成条件下，每个嗜中性粒细胞的MPO含量是稳定的，鲁米诺双加氧活性大致接近存在的嗜中性粒细胞的数量。然而，在与髓细胞生成活性增加相关联的临床情况(例如，g-CSF治疗和炎症刺激)下，骨髓的早幼粒细胞库扩大，并且骨髓的髓细胞库中有丝分裂减少。MPO仅在早幼粒细胞发育期中合成。炎症刺激或利用G-CSF的治疗刺激和扩大早幼粒细胞库，并减少髓细库中的分裂数量。因此，在髓细胞发育期，含MPO的嗜苯胺蓝颗粒不会被有丝分裂稀释。在这种刺激的髓细胞生成条件下合成的嗜中性粒细胞显示每一个嗜中性粒细胞的MPO增加了几倍(Allen等人，1997)。
本文公开的ANF方法是高度灵敏的，并且可以在少于1微升的稀释全血上进行。如下面实施例所示，用于定量血液或体液中吞噬细胞的ANF化学发光技术提供了相当于ANC的功能性等价值。这种光泽精CL方法在技术上是灵活的，适用于使用便携式或手持式光度计进行测量的即时测试(POCT)。对POCT的接受和需求继续增加(Asha，Chan等人2013,Schilling 2014)。无手持POCT方法可用于ANC(POCT)。
实施例
以下非限制性实施例提供了支持本文公开的概念的科学数据。
所测试的人血液样本由当地临床测试实验室提供。获得了具有静脉穿刺时间、受试者年龄(以年为单位)、性别和自动血液分析仪((Advia 120,Siemens AG)打印输出的被隐去身份的(De-identified)血液样本。订购全血细胞计数和关于受试者的医疗状况的信息的原因和尚不清楚。
将血液样本在测试前保持在环境温度(22±8℃)下。以一式三份对58份血液样本中的每一份进行了测试。最初测试时，血液的平均(平均(mean))静脉穿刺后血龄加标准偏差(SD)是4.1±1.1小时，静脉穿刺后中位血龄为4.1小时。
约6小时后再次测试样本；平均静脉穿刺后血龄加SD是10.8±2.0小时，中位值为10.4小时。在静脉穿刺后的晚些时候也对血液进行了测试，以试图建立关于样本静脉穿刺后血龄的可接受限度。
在静脉穿刺后最初的16小时内获得了可接受地可再现的嗜中性粒细胞功能活性，因此，将组合静脉穿刺平均值(平均值)加SD为7.4小时±3.8和中位值为10.4小时用于分析。受试者包括23名男性和35名女性。年龄范围为21至99岁，平均年龄为69.4岁，SD为17.5，中位年龄为70.5岁。总共进行了116次测量。
所采用的介质包括稀释介质(DM)、鲁米诺平衡盐溶液(LBSS)和光泽精(二甲基二吖啶鎓二硝酸盐)平衡盐溶液(DBSS)。DM包含：5mM 3-(N-吗啉)丙烷磺酸盐(MOPS)-缓冲的平衡盐溶液(139mEq/L Na+,5.0mEq/L K+,132mEq/L Cl-,0.8mM HnPO4；pH 7.2；290±5mOsmol/kg)和<0.06个内毒素单位(EU)/mL的内毒素。LBSS包含：5mM MOPS-缓冲盐溶液，其中含139mEq/L Na+,5.0mEq/L K+,1.3mMCa2+,0.9mM Mg2+,142mEq/L Cl-,0.8mM HnPO4，外加0.15mM鲁米诺(5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮)和5.5mM D-葡萄糖；pH 7.2；290±5mOsmol/kg)和<0.06EU/mL的内毒素。DBSS包含：5mM MOPS-缓冲盐溶液，其中含139mEq/LNa+,5.0mEq/L K+,1.3mM Ca2+,0.9mM Mg2+,142mEq/L Cl-,0.8mM HnPO4，外加0.2mM光泽精(N,N′-二甲基-9,9′-二吖啶鎓二硝酸盐；又名双-N-甲基吖啶鎓硝酸酯)和5.5mM D-葡萄糖；pH 7.2；290±5mOsmol/kg)和<0.06EU/mL的内毒素。
图1示出了相对于测试的前两名受试者的测试时间间隔绘制的，表示为在29分钟间隔内测量的相对光单位(RLU/秒)的化学发光强度(速度)的曲线图。乙二胺四乙酸钾(K3EDTA)-抗凝的全血样本最初用DM稀释，并在1/1200的终稀释度进行测试。测试以一式三份进行。每次测试使用0.25μL等效体积的血液。吞噬细胞呼吸爆发代谢的激活是在将稀释的血液添加到微孔板孔中时开始的，所述微孔板孔涂覆有0.5纳摩尔(nmol)佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(即，刺激物)并含有具有化学发光探针(即光泽精或鲁米诺)的平衡盐溶液。每个孔的终体积为300μL。
使用Orion II微孔板光度计(Titertek Berthold)在37℃的温度下以2分37秒的间隔进行测量。例如，001号和002号受试者的绝对白细胞计数(白细胞计数；WBC)分别为2475/0.25μL血液和350/0.25μL血液，并且001号和002号受试者的绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)分别为1,525/0.25μL和178/0.25μL。001号和002号受试者的血液样本的静脉穿刺后血龄分别为5小时40分钟和2小时49分钟。
对于每个受试者，在28.9分钟的时间间隔内进行了12次化学发光(CL)强度测量。如图1中所描绘的，CL活性以强度即速度来测量，表示为每秒的相对光单位(RLU/秒)。因此，绘制的数据说明了CL强度(速度)相对于时间的变化。重要的是要认识到CL测量是速度(速率)测量，而大多数技术测量产物的积累或底物的耗竭，即积分值。
对于一些比较来说，可以适当地将CL表示为在选定的测试时间间隔内的累积RLU值(即，积分或求和值)。可通过对在测试间隔内RLU/秒曲线下面积求总来将CL速度(RLU/秒)值转换为以RLU值表示的积分CL。
图2呈现了以测量时间间隔内累积的总的或积分的RLU表示的图1的CL数据。当将CL与其它积分值(诸如在所测试的血液体积中存在的嗜中性粒细胞的数量)相关联时，CL的积分表达可能是优选的。
为了进行比较，将积分CL值的回归分析相对于如图3A、B、C和D中所示的所测试的血液样本中存在的白细胞类型进行绘图。如图3A所示，光泽精发光与总的白细胞计数存在一定的相关性，即R2＝0.6782。血液中的大部分白细胞是吞噬细胞，这些吞噬细胞大部分是嗜中性粒细胞。光泽精CL与吞噬细胞和嗜中性粒细胞计数的相关性较好，即R2分别为0.8336和0.8336。光泽精CL与淋巴细胞计数无相关性，即R2＝0.0053。
鲁米诺CL是简单(非还原性的)双加氧活性的产物。关于吞噬细胞，鲁米诺测量氧化酶驱动的MPO活性或嗜酸性粒细胞过氧化物酶活性。光泽精测量氧化酶依赖性吞噬细胞还原性双加氧活性，其CL活性不依赖于卤过氧化物酶。当目标是定量血液或体液中存在的吞噬细胞的数量时，将吞噬细胞氧化酶活性测量为光泽精CL具有优于鲁米诺CL的有利方面。吞噬细胞NADPH氧化酶比活性，即每个吞噬细胞/嗜中性粒细胞的氧化酶活性，是相对恒定的，并且与每个嗜中性粒细胞的MPO浓度变化无关。MPO/嗜中性粒细胞相对于髓细胞生成的髓细胞期中的有丝分裂数量而变化。粒细胞集落形成因子(G-CSF)的炎症性或治疗性增加扩大了合成MPO的早幼粒细胞库，并降低了髓细胞库的有丝分裂活性。每个髓细胞分裂将每个嗜中性粒细胞的MPO减少一半。因此，刺激和扩大早幼粒细胞库并减少髓细胞库中的分裂数量导致具有增加的MPO的更大的嗜中性粒细胞(Allen，Stevens等人1997)。
被激活的吞噬细胞NADPH氧化酶活性负责还原性双加氧活性，并被测量为光泽精CL活性。这种相同的氧化酶活性驱动依赖于卤过氧化物酶的简单(非还原性)双加氧活性。吞噬细胞鲁米诺依赖性CL活性反映了卤过氧化物酶活性，尤其是MPO活性。图4A、B、C和D的图形和回归分析表明，不同于与嗜中性粒细胞计数相关的嗜中性粒细胞特异性氧化酶活性，MPO依赖性的鲁米诺CL更易变。每个嗜中性粒细胞的鲁米诺CL随宿主炎症状态以及随G-CSF或GM-CSF治疗而变化(Allen，Stevens等人1997)。简单(非还原性)双加氧活性与还原性双加氧活性之间的差异可以通过将图4A至D的积分鲁米诺CL回归分析与图3A至D的积分光泽精CL回归分析进行比较来理解。注意，与相对于存在的嗜中性粒细胞绘制的简单(非还原性)双加氧作用(鲁米诺CL)与吞噬细胞/嗜中性粒细胞的相关性(R2＝0.7282)相比，相对于嗜中性粒细胞绘制的还原性双加氧作用(光泽精CL)显示出更大的与吞噬细胞/嗜中性粒细胞的相关性，即R2＝0.8336。与光泽精CL一样，鲁米诺CL与淋巴细胞计数没有相关性，即R2＝0.0020。
在图4B和C中，注意吞噬细胞/嗜中性粒细胞计数最高的两个受试者(两个最右上方的图点)也显示出氧化酶驱动的MPO高比活性。高嗜中性粒细胞计数和MPO高比活性提示G-CSF-刺激的髓细胞生成通常是对免疫生理刺激或治疗干预的反应(Allen，Stevens等人1997)。
如图5A和B所示，每个嗜中性粒细胞的积分鲁米诺和光泽精CL(即比活性/嗜中性粒细胞)相对于静脉穿刺后血龄的图显示，通过使用鲁米诺或光泽精作为化学发光探针，在静脉穿刺后最初16小时间隔期间，每个嗜中性粒细胞的CL活性保持相对恒定。在这个初始阶段之后，嗜中性粒细胞氧化酶和氧化酶驱动的MPO活性呈指数下降。如前所述，在不考虑静脉穿刺后血龄的情况下，鲁米诺CL活性比光泽精CL活性显示出更大的差异。每个嗜中性粒细胞测量的复合鲁米诺和光泽精CL活性的R2值分别为0.3434和0.6005。针对鲁米诺CL观察到的较低R2与前述每个嗜中性粒细胞的MPO变化一致。
无论是测量嗜中性粒细胞氧化酶还是氧化酶驱动的髓过氧化物酶活性，静脉穿刺后的功能寿命基本相同。如图6A和B中对于036号和037号个体受试者所示的，相对于血液嗜中性粒细胞的静脉穿刺后血龄，每个嗜中性粒细胞的氧化酶驱动的MPO活性(即，鲁米诺CL)和每个嗜中性粒细胞的氧化酶活性(即，光泽精CL)都显示指数下降。提供驱动NADPH氧化酶和NADPH氧化酶驱动的MPO活性的还原性等效物(reducing equivalent)的单磷酸己糖支路酶的功能易受年龄相关功能丧失的影响。
当将每个个体受试者的指数关系平均在一起时，20名在60小时内进行四次完整测量的受试者的鲁米诺CL与静脉穿刺后血龄的关系为y＝59780e-0.026X，其中R2±StdDev＝0.9426±0.0619。24名在60小时内进行四次完整测量的受试者的光泽精CL与静脉穿刺后血龄的关系为y＝55404e-0.024X，其中R2±StdDev＝0.9038±0.0938。
总之，对吞噬细胞，特别是嗜中性粒细胞NADPH氧化酶活性的化学发光探测可用于测量血液和体液中的嗜中性粒细胞。每个嗜中性粒细胞的氧化酶功能最好使用光泽精(DBSS:N,N′-二甲基-9,9′-双吖啶鎓二硝酸盐(光泽精)平衡盐溶液)作为化学发光探针来测量。这种光泽精CL与亚微升量的被测全血或体液中吞噬细胞/嗜中性粒细胞的数量相关。在静脉穿刺后最初16小时内，EDTA抗凝的血液中吞噬细胞的功能活性保持得相对良好。在这一初始阶段后，嗜中性粒细胞功能能力(使用光泽精CL测量为氧化酶活性或使用鲁米诺CL测量为氧化酶驱动的MPO活性)随静脉穿刺后血龄呈指数下降。
鲁米诺CL测量每嗜中性粒细胞的NADPH氧化酶驱动的MPO活性。每个嗜中性粒细胞的MPO含量是可变的，并且取决于髓细胞生成刺激的状态。细胞大小、嗜天青颗粒含量和每嗜中性粒细胞的MPO在免疫生成G-CSF或G-CSF治疗性治疗后增加(Allen,Stevens等人1997,Allen,Dale等人2000)。因此，氧化酶驱动的MPO(鲁米诺CL)活性与氧化酶(光泽精CL)活性的比率提供了关于嗜中性粒细胞髓细胞生成的治疗或免疫生理刺激的有用信息。
定义
如本文中所用，“约”、“大致”和“大体上”被理解为指数值范围内的值，例如参考数值的-10％至+10％的范围，优选参考数值的-5％至+5％，更优选参考数值的-1％至+1％，最优选参考数值的-0.1％至+0.1％内的数值。
此外，本文中的所有数值范围应该理解为包括该范围内的所有整数、整数部分或分数部分。此外，这些数值范围应被解释为支持了涉及该范围内的任何数值或数值亚组的权利要求。例如，公开1至10应该被解释为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。
如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式包括复数。因此，“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该”通常包括各项的复数。例如，提及“一种(a)刺激物”或“该/所述刺激物”包括多种这样的刺激物。在“X和/或Y”的上下文中使用的术语“和/或”应该被解释为“X”或“Y”或“X和Y”。类似地，“X或Y中的至少一种”应该被解释为“X”或“Y”或“X和Y两者”。
类似地，词语“包括”、“包含”和“含有”应被解释为包含性的，而不是排他性的。同样，术语“包括(include)”、“具有”和“或”都应该被解释为包含性的，除非上下文中明确禁止这样的理解。然而，本公开提供的实施方案可能缺少本文中未具体公开的任何元素。因此，使用术语“包括(comprising)”定义的实施方案的公开内容也是“基本上由公开的组分组成”和“由公开的组分组成”的实施方案的公开内容。
当在本文中使用时，术语“实例”，特别是在后面有术语列表时，仅仅是示例性和说明性的，不应该被认为是排他性的或全面的。除非另外明确指出，否则本文公开的任何实施方案可以与本文公开的任何其它实施方案组合。
“动物”包括但不限于哺乳动物，其包括但不限于啮齿动物、水生哺乳动物、家养动物诸如狗和猫、农场动物诸如绵羊、猪、母牛和马以及人。当使用“动物”、“哺乳动物”或其复数形式时，这些术语也适用于任何能够表现出或打算表现出段落所述效果的动物。如本文中所用，术语“患者”应理解为包括动物，例如哺乳动物，优选接受或打算接受治疗的人，治疗是如本文中所定义的。虽然术语“个体”和“患者”在本文中经常用于指代人，但本公开不限于此。
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Claims (22)

1.一种用于估计动物的体液中吞噬细胞数量的方法，所述方法包括：
刺激所述吞噬细胞的NADPH氧化酶活性；以及
使用能够测量光的仪器，通过化学发光底物的发射的化学发光来定量所述化学发光底物的所产生的还原性脱氧。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述吞噬细胞的所述NADPH氧化酶活性由能够激活所述吞噬细胞的呼吸爆发的免疫或化学物质刺激。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述吞噬细胞的NADPH氧化酶活性由溶液中的刺激物刺激，或者被涂覆到所述吞噬细胞接触的表面。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述刺激物是佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述动物是人。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述体液是血液。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述体液是脊髓液。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述吞噬细胞是嗜中性粒细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述化学发光底物是光泽精(N,N′-二甲基-9,9′-双吖啶鎓二硝酸盐)。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述光泽精存在于溶液中或者被涂覆至吞噬细胞接触的表面上。
11.如权利要求1所述的方法，其包括稀释所述体液以减少化学发光的红细胞吸光度。
12.如权利要求6所述的方法，其包括将所述血液稀释至约1/500，以减少化学发光的红细胞吸光度。
13.如权利要求6所述的方法，其包括将所述血液稀释至约1/1000，以减少化学发光的红细胞吸光度。
14.如权利要求7所述的方法，其包括将所述脊髓液稀释至1/100，以减少化学发光的红细胞吸光度。
15.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其包括使用凝集素从所述体液中聚集或除去红细胞，以促进化学发光检测。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述发射的化学发光由便携式或手持式光度计测量。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述组件是预制的，以便于即时测试。
18.如权利要求1所述的方法，其还包括使用吞噬细胞的估计数量来确定绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)。
19.如权利要求18所述的方法，其还包括使用所述ANC来评估所述动物中的骨细胞生成抑制。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述髓细胞生成抑制与化疗有关或者是炎症或感染的度量。
21.如权利要求20所述的方法，其还包括基于髓细胞生成抑制的评估治疗所述动物。
22.一种用于估计髓细胞生成刺激的方法，所述方法包括：
使用能够测量光的仪器测量动物的化学活化的血液嗜中性粒细胞的非还原性双加氧驱动的髓过氧化物酶(鲁米诺CL)活性和还原性脱氧(光泽精CL)活性；以及
计算鲁米诺CL活性与光泽精CL活性的比率。
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