CN114384128B

CN114384128B - 一种聚合氨基酸修饰传感电极及甾体激素的电化学检测方法

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Publication number: CN114384128B
Application number: CN202111447337.3A
Authority: CN
Inventors: 傅强; 崔霞; 罗智敏; 陈国宁; 王璐; 常春
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114384128A

Abstract

本发明公开了一种聚合氨基酸修饰传感电极及甾体激素的电化学检测方法。以L‑半胱氨酸为聚合单体，在裸电极表面通过电化学聚合制备修饰层，从而获得聚合氨基酸修饰传感电极。本发明制备的聚合氨基酸修饰传感电极对孕激素、雄性激素和肾上腺皮质激素中结构不同的甾体激素类物质具有不同的还原响应，从而对这些不同种类的甾体激素均具有识别作用，且不受常见共存物的干扰，可以用于水样中孕激素、雄性激素和肾上腺皮质激素的快速检测。

Description

一种聚合氨基酸修饰传感电极及甾体激素的电化学检测方法

技术领域

本发明属于分析传感检测领域，涉及一种聚合氨基酸修饰传感电极的制备及利用其在复杂环境样品中同时测定三大类甾体激素(孕激素、雄性激素和肾上腺皮质激素)含量的方法。

背景技术

甾体激素是一系列具有环戊烷并多氢菲母核的脂肪烃类化合物，根据母核的具体结构存在的差异，环戊烷并多氢菲母核可以分为孕甾烷母核、雌甾烷母核、雄甾烷母核等。甾体激素在维持生命、机体发展、性功能调节、免疫调节等方面有明确的作用，具有重要的医药价值。依据甾体激素的药理作用可以将其分为雌激素、孕激素、雄激素和肾上腺皮质激素。然而，由于甾体激素不易降解，且生物活性较强，一旦进入环境将会严重影响生态和机体健康，甚至引起雌性化、发育缺陷、生殖障碍乃至群体灭绝等一系列问题。因此，为了促进生态健康和环境的可持续发展，对环境中不同种类的甾体激素进行快速、实时、有效的检查十分必要。

目前，甾体激素类物质的常用检测方法为液相色谱-质谱联用法、酶联免疫法、电化学检测、电化学发光和衍生化法等。电化学检测方法由于简便快速、有望实现在线等特点，在环境分析中受到越来越多的关注。但是，作为脂肪烃类化合物，甾体激素类物质氧化还原能力较弱，且缺乏活性基团，故无法实现对该类物质的直接检测，严重阻碍了甾体激素类物质环境检测传感元件的开发。目前已经报道的电化学检测方法，多采用DNA适配体、生物酶以及人工抗体等对其进行识别，通过引入的探针信号间接检测甾体激素的含量。然而DNA适配体、酶、抗体等生物活性物质价格昂贵，对检测环境要求较高、极易失活，且间接检测的方法极易出现假阳性结果，因此并不适用于复杂环境样品的检测。另外，中国专利CN107505309A公开了一种检测环境中甾体类激素的光学生物传感器的制备方法，其利用共价偶联技术，将能够与甾体激素发生特异性结合反应的亲和素修饰的dsDNA包被于石英光纤底端，提高传感器的传感膜对甾体激素的识别作用，可用于环境水体中雄性激素(例如睾丸酮)的快速检测。但该传感器的有效检测依赖于dsDNA的活性，其在复杂基质中极易失活，同时该传感器不能用于其他甾体激素类物质的检测，无法满足实际环境样品中多种甾体激素共存的检测需求。

分子印迹技术可以在实现对特定目标分子特异性识别的基础上，改善物理和化学稳定性。但是，由于识别的特异性，客观上导致了采用特定模板分子制备的分子印迹聚合物修饰层无法用于富集其他相似结构的分子，因此不适于对复杂环境样品中多种共存的甾体激素的同时检测(例如中国专利CN102539493A中尽管改善了通过循环伏安法所得分子印迹膜的导电性，但仅能检测所采用的模板分子17β-雌二醇)。

聚合物修饰改性是赋予电极新功能的重要方法。例如利用接枝分子在外加电压的作用下，在传感电极表面通过氧化还原聚合形成表面修饰层，可以改善传感电极的理化性质，赋予传感电极特定的功能。但目前尚未见到通过电聚合(电化学聚合)表面修饰，获得能够同时快速识别不同种类的甾体激素的传感电极的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有电化学检测方法的缺点，提供一种聚合氨基酸修饰传感电极及甾体激素的电化学检测方法，可以从复杂环境样品直接检测出所含有的不同种类的甾体激素。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种聚合氨基酸修饰传感电极，包括裸电极以及设置在裸电极表面上的聚合氨基酸修饰层。

优选的，所述裸电极选自玻碳电极、金电极或丝网印刷电极等表面不具有上述聚合氨基酸修饰层的电极。

优选的，所述聚合氨基酸修饰层是以L-半胱氨酸、谷胱甘肽等携带巯基的氨基酸中的任意一种为聚合单体，并通过电聚合将相应氨基酸的聚合物负载于裸电极表面而制成的。

优选的，所述裸电极(作为基底)在修饰(负载氨基酸的聚合物)前进行表面打磨。

优选的，所述电聚合采用循环伏安法实现。

优选的，所述聚合氨基酸修饰层富含磺酸基，或者聚合氨基酸修饰层含有磺酸基和可进一步氧化为磺酸基的巯基。

上述聚合氨基酸修饰传感电极的制备方法，包括以下步骤：

1)制备氨基酸聚合单体溶液；

2)电聚合

以氨基酸聚合单体溶液为电解液，并通过施加电压在裸电极表面制备聚合氨基酸修饰层，得到聚合氨基酸修饰传感电极。

优选的，所述步骤1中，氨基酸聚合单体溶液在中性或偏碱性条件下制备，可以提供中性、碱性聚合条件，有利于氨基酸携带的巯基形成氧化中间体，从而促进巯基的完全氧化。

优选的，所述步骤1具体包括以下步骤：将10～20mg聚合单体加入10mL 0.01～0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0～9.64)中，聚合单体选自L-半胱氨酸或谷胱甘肽等携带巯基的氨基酸中的任意一种，然后在20～30℃下超声处理0.5～2min，得到透明澄清的溶液，即氨基酸聚合单体溶液。

优选的，所述步骤2中，聚合氨基酸修饰层的制备方法为循环伏安法。

优选的，所述步骤2具体包括以下步骤：将玻碳电极、金电极或丝网印刷电极打磨至镜面(铁氰化钾氧化还原电位差小于90mV)得到工作电极，将工作电极置于上述氨基酸聚合单体溶液中，然后在20～30℃下采用循环伏安法，并在起始电位≤-0.8V、终止电位≥+2.2V的条件下(据此形成氨基酸循环伏安氧化聚合的电位区间，例如-0.8V～+2.2V)连续扫描20～30循环，得到聚合氨基酸修饰传感电极。

一种甾体激素的电化学检测方法，包括以下步骤：

采用循环伏安法施加电压，并利用上述聚合氨基酸修饰传感电极对样品中甾体激素的还原响应进行检测，然后依照不同甾体激素在还原峰电位上的差异，确定样品中所含有的甾体激素的种类。

优选的，所述还原响应的检测方法具体包括以下步骤：将在上述氨基酸聚合单体溶液中经过循环伏安法连续扫描后的工作电极置于pH 3.0～9.0的缓冲溶液中，然后在20～30℃下采用循环伏安法，并在起始电位≤-2.0V、终止电位>+0.8V的条件下(据此形成进一步使氨基酸聚合物完全氧化的电位区间，例如-2.0V～+1.2V)进行对应氧化电位区间的扫描；然后将在上述缓冲溶液中经过循环伏安法扫描后的工作电极置于含有同样缓冲溶液的样品稀释液中(即pH 3.0～9.0的缓冲溶液为样品稀释液的组分之一)，然后在20～30℃下采用循环伏安法，并在起始电位>+0.8V、终止电位≤-2.0V的条件下进行对应还原电位区间的扫描。

或者，所述还原响应的检测方法具体包括以下步骤：将在上述氨基酸聚合单体溶液中经过循环伏安法连续扫描后的工作电极置于含有同样缓冲溶液的样品稀释液中(即pH3.0～9.0的缓冲溶液为样品稀释液的组分之一)，然后在20～30℃下采用循环伏安法，并在起始电位≤-2.0V、终止电位>+0.8V的条件下进行扫描(例如通过扫描1个循环进行先氧化后还原的连续过程)。

优选的，所述缓冲溶液选自0.01～0.1mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。

优选的，所述样品稀释液中甾体激素的浓度≤500μmol·L^-1。

优选的，所述甾体激素的电化学检测方法还包括以下步骤：根据甾体激素溶液(溶剂为上述缓冲溶液)的浓度与检测的还原峰电流的关系，计算样品中对应甾体激素的含量。

优选的，所述样品中含有的甾体激素选自甾体母核中含Δ4-3-酮基的甾体激素中的一种或多种。

优选的，所述样品中含有的甾体激素选自孕激素、雄性激素、肾上腺皮质激素中的一种或多种。

优选的，所述样品的来源包括不同市售甾体激素药品以及工业生产废水。

本发明的有益效果体现在：

本发明提出的聚合氨基酸修饰传感电极，利用其表面的氨基酸聚合物修饰层可以促进甾体激素在传感电极表面的直接还原(产生还原响应)，且不同种类的甾体激素间互相不受影响，通过对不同甾体激素的特异性识别，以及在较宽的pH范围内对不同甾体激素进行直接检测，从而实现对复杂环境样品中不同甾体激素(例如孕激素、雄性激素、肾上腺皮质激素)的同时测定，且操作简单、方便快速。同时，该传感电极制备方法简单。

附图说明

图1为玻碳电极(A)、L-半胱氨酸滴涂修饰电极(B)和电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极(C、D)的扫描电镜图。

图2为不同修饰电极对孕酮、氢化可的松和地塞米松的还原响应数值(响应信号)。

图3为利用循环伏安法进行扫描的结果(含聚合L-半胱氨酸修饰电极对不同甾体激素类物质的还原响应)。

图4A-1～图4A-38为聚合L-半胱氨酸修饰电极对38种不同物质的还原响应(在pH4.0的CBS中)。

图4B-1～图4B-38为聚合L-半胱氨酸修饰电极对38种不同物质的还原响应(在pH8.0的CBS中)。

图5为用于孕酮(A)、氢化可的松(B)和地塞米松(C)含量测定的标准曲线。

图6为聚合L-半胱氨酸修饰电极的抗干扰(A、C)和耐用性(B、D)实验结果。

图7A为聚合L-半胱氨酸修饰电极同时测定氢化可的松和地塞米松的实验结果之一。

图7B为聚合L-半胱氨酸修饰电极同时测定氢化可的松和地塞米松的实验结果之二。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)聚合氨基酸修饰传感电极的制备

实例1

1)L-半胱氨酸聚合单体溶液的制备

将L-半胱氨酸12.2mg分散于10mL 0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中；在室温下超声1min，得到透明澄清的L-半胱氨酸聚合单体溶液。

2)聚合L-半胱氨酸修饰电极的制备

将玻碳电极(GCE)在氧化铝悬浮液上抛光至镜面，在5mmol·L^-1铁氰化钾溶液中，以抛光后的玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，测定铁氰化钾在抛光后的玻碳电极表面的氧化还原电位差；重复这一步骤(具体涉及上述抛光和氧化还原电位差测定)，直至铁氰化钾在玻碳电极表面的氧化还原电位差小于90mV，得到抛光好的玻碳电极。

将抛光好的玻碳电极放置于上述L-半胱氨酸聚合单体溶液中，在-0.8V～+2.2V的电位区间内，以抛光好的玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，采用循环伏安法连续扫描20个循环(扫描速率：100mV·s^-1)，从而将聚合L-半胱氨酸修饰在裸电极(玻碳电极)表面，即得到聚合L-半胱氨酸修饰电极。该电极表面携带大量磺酸基和可进一步氧化为磺酸基的巯基；在使用过程中，仅需再扫描一个循环(先氧化后还原)，其中氧化过程进一步氧化所制备电极表面的巯基，还原过程为检测甾体激素过程。

参见图1(A)，修饰前的裸电极表面平整光滑；参见图1(B)，L-半胱氨酸溶液滴涂在裸电极表面并晾干后，所得L-半胱氨酸滴涂修饰电极表面可见粗糙的山丘样凸起；参见图1(C)，经电聚合后(氧化起主要作用)，上述聚合L-半胱氨酸修饰电极表面呈现规则的花朵样结构；参见图1(D)，经进一步放大后，可见呈规则有序状排列的聚合物，表明聚合L-半胱氨酸成功修饰在裸电极表面，且电聚合形成的聚合物作为电极表面修饰层与直接滴涂形成的电极表面修饰层的形貌完全不同。

实例2

将打磨好的玻碳电极放置于上述L-半胱氨酸聚合单体溶液中，在-0.8V～+2.2V的电位区间内，以打磨好的玻碳电极为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，采用循环伏安法连续扫描20个循环(扫描速率：100mV·s^-1)；再置于0.1mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液(pH 8.0)中，在-2.0V～+1.2V电位区间内，采用循环伏安法扫描0.5个循环(扫描速率：100mV·s^-1)，即对实例1制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极进行氧化，此时得到的聚合L-半胱氨酸修饰电极表面携带更多的磺酸基，更有利于与甾体激素类物质的结合。

(二)聚合氨基酸修饰传感电极对不同甾体激素(孕酮、氢化可的松、地塞米松)的直接响应

分别选择孕酮(P4)、氢化可的松(HC)和地塞米松(DXM)作为待测对象，在含100μmol·L^-1待测对象的柠檬酸盐缓冲液(CBS，0.1mol·L^-1，pH4.0、8.0)中，以聚合L-半胱氨酸修饰电极(实例1)为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，采用循环伏安法，在-2.0V～+1.2V电位区间内施加外加电压进行1个循环的扫描(扫描速率：100mV·s^-1)，从而在氧化电位区间将聚合L-半胱氨酸修饰电极表面剩余的巯基进一步氧化后，在还原电位区间直接检测待测对象的还原响应。

参见图2，相比于裸电极和L-半胱氨酸滴涂修饰电极(L-Cys/GCE)，聚合L-半胱氨酸修饰电极(P-L-Cys/GCE)对不同的待测对象(不同的甾体激素)均有明显响应，响应信号(还原峰电流值)远远高于裸电极和L-半胱氨酸滴涂修饰电极。并且在酸性和碱性条件下，聚合L-半胱氨酸修饰电极均存在明显响应，不同甾体激素的还原响应的强度不同。这表明经电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极存在更多的作用位点可以和甾体激素结合，且与不同的甾体激素的相互作用存在差异。

参见图3(A)，与空白溶剂(pH 4.0的0.1mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液)相比，经电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极在100μmol·L^-1孕酮(P4)中，于-1.26V和-1.70V处显示出两个还原峰；在100μmol·L^-1的地塞米松(DXM)中，于-1.13V处显示出一个还原峰；在100μmol·L^-1的氢化可的松(HC)中，于-1.26V处显示出一个还原峰。这表明在酸性条件下，经电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极对三种甾体激素的还原响应存在明显差异，且对孕酮的还原响应最强。

参见图3(B)，与空白溶剂(pH 8.0的0.1mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液)相比，经电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极在100μmol·L^-1的孕酮(P4)中，于-1.66V处显示出一个还原峰；在100μmol·L^-1的地塞米松(DXM)中，于-1.45V处显示出一个还原峰；在100μmol·L^-1的氢化可的松(HC)中，于-1.63V处显示出一个还原峰。这表明在碱性条件下，经电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极对三种结构不同的目标物(三种甾体激素)仍然存在还原响应，但还原峰位均向左移动，且地塞米松和氢化可的松的还原响应明显强于酸性条件下的响应信号。

以上结果表明，在pH 4.0～8.0的范围内，经电聚合制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极对孕酮、氢化可的松和地塞米松均存在明显的还原响应，且还原峰电位和还原峰电流存在明显差异；在酸性条件下，孕酮的还原响应最佳，而碱性条件下，地塞米松的还原响应最佳。

由图3还可以看出，甾体激素的响应信号仅出现在还原过程，聚合L-半胱氨酸修饰电极本身的响应信号(参见0.6V处的峰)出现在氧化过程，通过比照确定为磺酸基。

(三)聚合氨基酸修饰传感电极对不同甾体激素类物质和非甾体激素类物质的还原响应

选择38种不同种类的待测物质(孕激素、雌激素、雄性激素、肾上腺皮质激素、甾体结构类似物和非结构类似物)进一步对所制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极的电化学检测性能进行普适性考察。将不同的待测物质用适应的溶剂配制成10mmol·L^-1的溶液备用。测定时，分别用pH 4.0和pH 8.0的0.1mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液稀释100倍，以聚合L-半胱氨酸修饰电极(实例1)为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，采用循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)先进行氧化，后在还原电位区间直接对待测物质进行检测。

检测结果参见表1，甾体母核中A环含有Δ4-3-酮基的激素类物质，在还原电位区间均存在明显的还原响应，其中母核结构一致者，主还原峰电位基本一致(携带不同的取代基，也会出现微小的其他还原响应)；而甾体母核中不含Δ4-3-酮基的物质，则无还原响应；非甾体类物质均无还原响应。这表明所制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极可以特异性识别甾体母核中A环含Δ4-3-酮基的甾体激素。

表1.不同物质的还原响应

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(四)不同市售甾体激素药品中甾体激素的含量电化学直接测定

4.1标准曲线建立

(1)孕酮含量检测

在10mL含有不同浓度(10～100μM)孕酮的溶液(溶剂包括pH＝4.0、0.1M柠檬酸盐缓冲液)中，以制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极(实例1)为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，组成三电极体系，并在浸入上述溶液中后通过循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)对工作电极进行氧化后，在还原区间对目标物(孕酮)进行还原响应检测。然后以孕酮的浓度为横坐标，检测得到的相应浓度下的还原峰电流值为纵坐标，根据孕酮浓度与还原峰电流间的关系建立标准曲线，结果参见图5(A)。

(2)氢化可的松含量检测

在10mL含有不同浓度(1～100μM)氢化可的松的溶液(溶剂包括pH＝8.0、0.1M柠檬酸盐缓冲液)中，以制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极(实例1)为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，组成三电极体系，并在浸入上述溶液中后通过循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)对工作电极进行氧化后，在还原区间对目标物(氢化可的松)进行还原响应检测。然后以氢化可的松的浓度为横坐标，检测得到的相应浓度下的还原峰电流值为纵坐标，根据氢化可的松浓度与还原峰电流的关系建立标准曲线，结果参见图5(B)。

(3)地塞米松含量检测

在10mL含有不同浓度(0.1～100μM)地塞米松的溶液(溶剂包括pH＝8.0、0.1M柠檬酸盐缓冲液)中，以制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极(实例1)为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极，组成三电极体系，并在浸入上述溶液中后通过循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)对工作电极进行氧化后，在还原区间对目标物(地塞米松)进行还原响应检测。然后以地塞米松的浓度为横坐标，检测得到的相应浓度下的还原峰电流值为纵坐标，根据地塞米松浓度与还原峰电流的关系建立标准曲线，结果参见图5(C)。

4.2市售甾体激素药物(黄体酮胶囊、氢化可的松注射液、醋酸地塞米松片)检测方法

黄体酮(孕酮)测定实例：取黄体酮胶囊一粒，将胶囊内容物溶于少量甲醇中，并定容至100mL，备用。取配制好的黄体酮甲醇溶液50μL，加入至950μL的柠檬酸盐缓冲液(0.1mol·L^-1，pH 4.0)中，混合均匀。将聚合L-半胱氨酸修饰电极、Ag/AgCl和铂丝组成的三电极体系浸入所得混合溶液中后进行循环伏安法检测(条件参照4.1(1))，利用测得的黄体酮的还原峰电流值(依据图4A-1中的黄体酮特异的还原峰电位所对应电流值确定)，及所建立的标准曲线计算黄体酮胶囊中黄体酮的含量(结果参见表2)。

氢化可的松测定实例：取氢化可的松注射液一支，将注射液溶于少量无水乙醇中，并定容至100mL，备用。取配制好的氢化可的松甲醇溶液50μL，加入至950μL的柠檬酸盐缓冲液(0.1mol·L^-1，pH 8.0)中，混合均匀。将聚合L-半胱氨酸修饰电极、Ag/AgCl和铂丝组成的三电极体系浸入所得混合溶液中后进行循环伏安法检测(条件参照4.1(2))，利用测得的氢化可的松的还原峰电流值(依据图4B-9中的氢化可的松的还原峰电位所对应电流值确定)，及所建立的标准曲线计算氢化可的松注射液中氢化可的松的含量(结果参见表2)。

地塞米松测定实例：取醋酸地塞米松片10片，用研钵轻轻研碎后溶于少量甲醇中，并定容至100mL，备用。取配制好的醋酸地塞米松甲醇溶液50μL，加入至950μL的柠檬酸盐缓冲液(0.1mol·L^-1，pH 8.0)中，混合均匀。将聚合L-半胱氨酸修饰电极、Ag/AgCl和铂丝组成的三电极体系浸入所得混合溶液中后进行循环伏安法检测(条件参照4.1(3))，利用测得的地塞米松的还原峰电流值(依据图4B-17中的氢化可的松的还原峰电位所对应电流值确定)，及所建立的标准曲线计算醋酸地塞米松片中地塞米松的含量(结果参见表2)。

表2.不同市售甾体激素药品中孕酮、地塞米松和氢化可的松的含量测定(n＝3)

注：表中a、b是指分别根据黄体酮的两个特异性的还原峰电位所对应电流值进行检测的结果

4.3准确性、专属性与独立性的评价

以高效液相色谱法(HPLC)对上述各混合溶液分别进行检测，以此来考察4.2所得结果的准确性。如表2所示，参照高效液相色谱法检测的结果，可以得出本发明利用聚合L-半胱氨酸修饰电极建立的甾体激素直接检测方法的结果准确、可靠。

为了考察本发明所建立的甾体激素直接检测方法在测定甾体激素时的专属性，选择氯化钠(记为b)、硫酸铵(记为c)、氯化钾(记为d)、葡萄糖(记为e)、蔗糖(记为f)、PVP-30(记为g)、硫酸镁(记为h)、硝酸锌(记为i)、氧化钙(记为j)为干扰物进行实验。实验具体操作为：以100μM的甾体激素(氢化可的松、地塞米松)为参照物(记为a)，然后分别配制10mM干扰物溶液，将其加入至甾体激素的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH＝8.0)中，同时，将所有干扰物混合在一起加入甾体激素的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH＝8.0)中(记为k)，保持甾体激素浓度:干扰物浓度＝1:100，采用前述三电极体系，利用循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)进行检测，依据所得还原峰电流值考察干扰物对甾体激素测定的影响。结果如图6A(氢化可的松)、图6C(地塞米松)所示，当干扰物的浓度高于待测物质100倍时，测得还原峰电流值变化<5％，这表明本发明所建立的甾体激素直接检测方法具有良好的专属性。

为了考察本发明所建立的甾体激素直接检测方法在测定不同甾体激素时的独立性，在同一反应池(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH＝8.0)中同时加入不同浓度的氢化可的松和地塞米松进行测定考察：(1)固定氢化可的松的浓度不变(100μmol·L^-1)，改变地塞米松的浓度(从20μmol·L^-1到80μmol·L^-1)，采用循环伏安法检测(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)还原响应，结果如图7A所示，氢化可的松和地塞米松的还原峰(指还原响应)同时出现，且与单独测定的还原峰电位一致，氢化可的松的存在并不影响地塞米松的还原及检测，随着地塞米松浓度的增加，氢化可的松的还原峰电流值不变，而地塞米松的还原峰电流值逐渐增加。(2)固定地塞米松的浓度不变(60μmol·L^-1)，改变氢化可的松的浓度(从10μmol·L^-1到80μmol·L^-1)，采用循环伏安法检测(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)还原响应，结果如图7B所示，氢化可的松和地塞米松的还原峰仍同时出现，且与单独测定的还原峰电位一致，地塞米松的存在并不影响氢化可的松的还原及检测，随着氢化可的松浓度的增加，地塞米松的还原峰电流值不变，而氢化可的松的还原峰电流值逐渐增加。以上结果表明本发明所建立的甾体激素直接检测方法对于不同的甾体激素的检测具有独立性，不同的甾体激素在同时测定时互不干扰。

(五)工业废水中不同甾体激素的含量测定

5.1工业废水中甾体激素的检测方法

将采集到的工业废水用0.1mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.0、8.0)稀释100倍后，以制备的聚合L-半胱氨酸修饰电极(实例1)为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝为对电极组成三电极体系，采用循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)检测还原响应，将所检测到的还原峰电位，与已知甾体激素在相同条件下测得的还原峰电位进行对比，确定工业废水中所含甾体激素的种类，随后用所建立的相应的标准曲线分别读取工业废水中不同甾体激素的含量。

5.2准确度和精密度

实验具体操作如下：分别取高、中、低(40μmol·L^-1、30μmol·L^-1、20μmol·L^-1)三个浓度的氢化可的松和地塞米松，分别加入至工业废水中，每一浓度配制3份，依据循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)检测所得还原峰电流值，结合所绘制的标准曲线，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。实验结果如表3所示，在加标浓度下，回收率在94.69％～103.07％之间，精密度值均小于2.87％，这表明本发明所建立的甾体激素直接检测方法的准确度和精密度良好，可以用于在实际样品中检测不同的甾体激素及其含量，在测定甾体激素的电化学传感器件制造中应用价值巨大。

表3.工业废水中加标地塞米松和氢化可的松的含量测定(n＝3)

5.3稳定性

实验中选择氢化可的松和地塞米松两种母核结构不同的甾体激素为目标物，采用循环伏安法(电位区间：-2.0～+1.2V，扫描速率：100mV·s^-1，扫描循环：1个循环)检测同一配制好的目标物溶液，连续检测12次。结果参见图6B、图6D，连续12次测定同一目标物溶液(图6B为氢化可的松，图6D为地塞米松)所得还原峰电流值相差不大，这表明本发明所建立的甾体激素直接检测方法稳定性良好。

Claims

1.一种甾体激素的电化学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

通过施加电压并利用聚合氨基酸修饰传感电极对样品中甾体激素的还原响应进行检测，然后依照不同甾体激素在还原峰电位上的差异，确定样品中所含有的甾体激素的种类；所述聚合氨基酸修饰传感电极包括裸电极以及设置在裸电极上的聚合氨基酸修饰层，所述聚合氨基酸修饰层是以L-半胱氨酸为聚合单体，并通过电聚合在中性或偏碱性聚合条件下将相应氨基酸的聚合物负载于裸电极表面而制成的，该聚合氨基酸修饰层富含磺酸基，或者含有磺酸基和可氧化为磺酸基的巯基，所述样品中含有的甾体激素选自母核中含Δ4-3-酮基的甾体激素中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述一种甾体激素的电化学检测方法，其特征在于：所述还原响应的检测方法具体包括以下步骤：将在氨基酸聚合单体溶液中经过循环伏安法连续扫描后的工作电极置于pH 3.0～9.0的缓冲溶液中，采用循环伏安法并在起始电位≤-2.0V、终止电位>+0.8V的条件下进行对应氧化电位区间的扫描；然后将在所述缓冲溶液中经过循环伏安法扫描后的工作电极置于含有pH 3.0～9.0的缓冲溶液的样品稀释液中，采用循环伏安法并在起始电位>+0.8V、终止电位≤-2.0V的条件下进行对应还原电位区间的扫描；

或者，将在氨基酸聚合单体溶液中经过循环伏安法连续扫描后的工作电极置于含有pH3.0～9.0的缓冲溶液的样品稀释液中，采用循环伏安法并在起始电位≤-2.0V、终止电位>+0.8V的条件下进行扫描。