CN114381454A - 以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途，公开该层析填料在纯化mRNA工艺中的用途，纯化的工艺包括：a.制样；b.上样；c.洗杂；d.洗脱；e.在位清洗。本发明采用上述填料的纯化方法能实现mRNA的有效捕获、除杂和洗脱，简化后续纯化步骤并最大限度地提高下游纯化整体生产效率，适合工业放大生产。此外，环形RNA序列中如果有Poly(A)结构，该柱层析法也适用。

Description

以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途
技术领域
本发明涉及层析填料的用途，特别涉及以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料的用途。
背景技术
mRNA疫苗在疫苗有效性上遥遥领先传统技术疫苗，这直接促使mRNA技术在疾病预防和治疗领域的快速发展，包括传染病疫苗领域、肿瘤免疫治疗相关领域、单抗药物和其它蛋白类药物替代领域。基于mRNA的疾病预防和治疗，简单来讲就是化学修饰后的mRNA分子进入细胞后，利用细胞自身的蛋白合成机制进行翻译表达，生成疾病预防和治疗所需的目的蛋白。mRNA最大的优势在于其不进入细胞核，不改变基因组，只有瞬时活性，能通过生理代谢降解，因此，mRNA治疗被称为“开启你体内的药厂”。加上mRNA的生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，使得mRNA药物具有很大优势。
图1所示为mRNA的通式结构，其3′端修饰的Poly(A)尾巴对于mRNA的稳定性非常重要，同时，此Poly(A)尾巴为mRNA的纯化提供了有效的途径。将一定长度的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷(Oligo(dT))键合到固相载体上，可以利用T-A之间的碱基配对原理捕获修饰有Poly(A)尾巴的mRNA，其它杂质则流穿。然而，mRNA相关行业也是近两年才快速成长起来，如何获得大量可用于临床的mRNA产品依然是一个很大的挑战。
本发明采用赛分科技研发生产的基于Oligo(dT)的亲和填料，开发了一套用于纯化mRNA的柱层析法工艺，在简化纯化步骤的同时，避免了使用有毒试剂，提高了纯度和收率，可用于mRNA产品的放大生产。
此外，环形RNA(circular RNA，endless RNA，eRNA)近年来受到了越来越多的关注，相比于mRNA，环形RNA具有稳定性好和制备简单的优势。环形RNA在制备过程中可省去加帽、加尾和修饰这三个步骤，操作上相对更容易。如果在设计环形RNA时，在碱基序列中加入Poly(A)结构，同样可以使用Oligo(dT)的亲和填料进行纯化。
发明内容
mRNA疫苗在疫苗有效性上遥遥领先传统技术疫苗，这直接促使mRNA技术在疾病预防和治疗领域的快速发展，包括传染病疫苗领域、肿瘤免疫治疗相关领域、单抗药物和其它蛋白类药物替代领域。基于mRNA的疾病预防和治疗，简单来讲就是化学修饰后的mRNA分子进入细胞后，利用细胞自身的蛋白合成机制进行翻译表达，生成疾病预防和治疗所需的目的蛋白。mRNA最大的优势在于其不进入细胞核，不改变基因组，只有瞬时活性，能通过生理代谢降解，因此，mRNA治疗被称为“开启你体内的药厂”。加上mRNA的生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，使得mRNA药物具有很大优势。
图1所示为mRNA的通式结构，其3′端修饰的Poly(A)尾巴对于mRNA的稳定性非常重要，同时，此Poly(A)尾巴为mRNA的纯化提供了有效的途径。将一定长度的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷(Oligo(dT))键合到固相载体上，可以利用T-A之间的碱基配对原理捕获修饰有Poly(A)尾巴的mRNA，其它杂质则流穿。然而，mRNA相关行业也是近两年才快速成长起来，如何获得大量可用于临床的mRNA产品依然是一个很大的挑战。
本发明采用赛分科技研发生产的基于Oligo(dT)的亲和填料，开发了一套用于纯化mRNA的柱层析法工艺，在简化纯化步骤的同时，避免了使用有毒试剂，提高了纯度和收率，可用于mRNA产品的放大生产。
此外，环形RNA(circular RNA，endless RNA，eRNA)近年来受到了越来越多的关注，相比于mRNA，环形RNA具有稳定性好和制备简单的优势。环形RNA在制备过程中可省去加帽、加尾和修饰这三个步骤，操作上相对更容易。如果在设计环形RNA时，在碱基序列中加入Poly(A)结构，同样可以使用Oligo(dT)的亲和填料进行纯化。
附图说明
图1为mRNA结构通式；
图2为采用实施例1的纯化方法对mRNA分离纯化图谱；
图3为采用实施例1的纯化方法对mRNA分离分析检测图谱；
图4为采用实施例2的纯化方法对mRNA分离纯化图谱；
图5为采用实施例2的纯化方法对mRNA分离分析检测图谱；
图6为采用实施例7的纯化方法对mRNA分离纯化图谱；
图7为采用实施例7的纯化方法对mRNA分离分析检测图谱；
图8为采用实施例8的mRNA特异性结合实验；
图9为采用实施例9的mRNA特异性结合实验。
具体实施方式
实施例1
本实施例采用赛分科技研发生产的Monomix dT20亲和填料1mL预装柱(填料规格为30m，
Figure BDA0003435403430000021
预装柱货号为283030950-70025)，上样样品为2.0mg的mRNA(约1000nt，浓度0.2mg/mL)；平衡缓冲液为100mM Tris+500mM NaCl，pH 7.5；线性流速为87cm/h；CIP：0.1MNaOH的水溶液。
纯化过程：以缓冲液平衡层析柱；提前将层析柱置于柱温箱中预热到50℃，2mg的mRNA溶解于含有500mM NaCl的制样缓冲液中(1∶3体积比混合)，上样。以缓冲液20mM Tris+200mM NaCl，pH 7.5冲洗柱子，线性流速为87cm/h；提前将层析柱置于柱温箱中预热到65℃，在260nm紫外光下，以洗脱液10mM Tris，pH 7.5洗脱样品，并记录其峰面积；然后以CIP缓冲液(0.1M NaOH的水溶液)冲洗柱子，如图2。使用完色谱柱后，将其保存在20％乙醇水溶液中，4℃条件保存。检测所用的分析柱SRT SEC-1000，5μm，7.8x300mm(PN：215950-7830)由苏州赛分科技有限公司提供，检测结果如图3。
实验结果表明，Monomix dT20层析柱采用此纯化方法具有如下特点：
1)可以在50℃条件下，通过Oligo(dT)捕获带有Poly(A)尾巴的mRNA，通过提高温度，破坏Poly(A)尾巴与Oligo(dT)的亲和结合，达到了分离mRNA的效果。
2)使用此纯化方法，mRNA的回收率＞75％，其纯度＞95％。
3)以0.1M NaOH水溶液作为CIP的溶液，对色谱柱进行消毒和再生，以进行下一轮纯化。
表1mRNA纯化分离操作条件
Figure BDA0003435403430000031
Figure BDA0003435403430000041
实施例2
本实施例采用赛分科技研发生产的Monomix dT20亲和填料1mL预装柱(填料规格为30m，
Figure BDA0003435403430000043
预装柱货号为283030950-70025)，上样样品为0.5mg的mRNA(约4000nt，浓度0.2mg/mL)；平衡缓冲液为10mM Tris+400mM NaCl，pH 7.5；线性流速为87cm/h；CIP：0.1MNaOH的水溶液。
纯化过程：以缓冲液平衡层析柱；0.5mg的mRNA上样溶解于(1∶8混合)平衡缓冲液中，65℃，反应10min，迅速放置冰上冷却10min。以上述缓冲液冲柱子，流速为87cm/h；在260nm紫外光下，收集洗脱样品，并记录其峰面积；然后以CIP缓冲液(0.1M NaOH的水溶液)冲洗柱子，如图4。使用完色谱柱后，将其保存在20％乙醇水溶液中，4℃条件保存。检测所用的分析柱SRT SEC-1000，5μm，7.8x300mm(PN：215950-7830)由苏州赛分科技有限公司提供，检测结果如图5。
实验结果表明，Monomix dT20层析柱采用此纯化方法具有如下特点：
1)通过将mRNA短暂加热至65℃-70℃，然后立即在冰上冷却，破坏其二级结构。低盐缓冲液(或水)在室温条件下破坏mRNA中Poly(A)尾巴与Oligo(dT)之间的氢键，将mRNA洗脱下来，达到了分离mRNA的效果。
2)使用此纯化方法，mRNA的回收率＞50％，其纯度＞95％。
3)以0.1M NaOH水溶液作为CIP的溶液，对色谱柱进行消毒和再生，以进行下一轮纯化。
表2mRNA纯化分离操作条件
Figure BDA0003435403430000042
Figure BDA0003435403430000051
实施例3
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例2基本相同，区别仅在于将缓冲液10mM Tris缓冲体系+400mM NaCl，pH 7.4替换为10mM Tris缓冲体系+800mM NaCl，pH 7.4。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞65％，其纯度＞95％。
实施例4
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例3基本相同，区别仅在于将缓冲液10mM Tris缓冲体系+800mM NaCl，pH 7.4替换为10mM Tris缓冲体系+1.2M NaCl，pH7.4。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞85％，其纯度＞95％。
实施例5
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例4基本相同，区别仅在于将上样量0.5mg替换为1.25mg；
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞80％，其纯度＞95％。
实施例6
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例4基本相同，区别仅在于将缓冲液10mM Tris缓冲体系+1.2M NaCl，pH 7.4替换为10mM Tris缓冲体系+1.6M NaCl，pH7.4。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞90％，其纯度＞95％。
实施例7
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例6基本相同，区别仅在于将上样量0.5mg替换为2.0mg；纯化结果如图6，检测结果如图7。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞80％，其纯度＞95％。
实施例8
mRNA特异性结合实验，实施方法与实施例1相同。结论：纯化实验中收集到的流穿组分(没有保留)在同一根Monomix dT20亲和色谱柱子上面重新进样，还会流穿，如图8所示。
实施例9
mRNA特异性结合实验.实施方法与实施例1相同。结论：纯化实验中收集到的保留组分在同一根Monomix dT20亲和色谱柱子上面重新进样，还会保留，如图9所示。
实施例10
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例6基本相同，区别仅在于将约4000nt的mRNA样品替换为约1500nt的mRNA样品。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞87％，其纯度＞95％。
实施例11
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例6基本相同，区别仅在于将约4000nt的mRNA样品替换为约3000nt的mRNA样品。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞75％，其纯度＞95％。
实施例12
本实施例提供一种用于纯化环形RNA的柱层析法，与实施例2基本相同，区别仅在于样品为环形RNA。该环形RNA长度约2000nt，其碱基序列中含有50个碱基A构成的Poly(A)结构，首尾相接成一个闭环，杂质主要为核酸酶、核苷酸原料等。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞65％，其纯度＞90％。
实施例13
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例1基本相同，区别仅在于将Monomix dT20亲和填料替换为Monomix dT15亲和填料(dT配基的长度从20变为15)。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞70％，其纯度＞95％。
实施例14
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例2基本相同，区别仅在于将Monomix dT20亲和填料替换为Monomix dT30亲和填料(dT配基的长度从20变为30)。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞60％，其纯度＞95％。
实施例15
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例5基本相同，区别在于将Monomix dT20亲和填料填装在赛分科技生产的Generik FPLC玻璃柱管中(货号为202000-1015-AA)，填装高度为6.4cm，柱体积为5.0mL，并将上样量由0.5mg提高至6.25mg。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞60％，其纯度＞95％。
实施例16
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例5基本相同，区别在于将Monomix dT20亲和填料填装在不锈钢柱管中，规格为7.8x300mm柱体积为14.3mL，填料粒径由30μm变为60μm，并将上样量由0.5mg提高至18mg。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞60％，其纯度＞95％。
实施例17
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例2基本相同，区别仅在于将Monomix dT20亲和填料替换为Proteomix dT20(PS-DVB基质，规格为20m，
Figure BDA0003435403430000071
)亲和填料。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞80％，其纯度＞95％。
实施例18
本实施例提供一种用于纯化mRNA的柱层析法，与实施例2基本相同，区别仅在于将Monomix dT20亲和填料替换为Agarosix dT20(琼脂糖基质，规格为45m)亲和填料。
使用此纯化方法，mRNA的回收率＞75％，其纯度＞95％。

Claims (10)

1.一种以Oligo(dT)为亲和配基的层析填料在纯化mRNA工艺中的用途。
2.根根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述层析填料结构如下：
SP-R-Oligo dT
其中，SP为基础介质，Oligo(dT)为亲和配基，R为基础介质偶联Oligo(dT)的间隔臂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述基础介质为琼脂糖微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或硅胶微球中的一种；所述Oligo dT为具有10到30个碱基的多聚脱氧胸腺嘧啶，且在5’端修饰有氨基；所述间隔臂R的两端都具有环氧基、一端与介质偶联，另一端与Oligo(dT)末端的氨基偶联，中间具有任意化学结构。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述层析填料的制备方法包括：
(1)将基础介质活化，得到表面修饰有大量环氧基或醛基的活化介质；
(2)将Oligo(dT)偶联至活化介质上；
(3)将多余醛基或环氧基封闭处理，得到Oligo dT亲和介质。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：纯化mRNA工艺包括：
a.制样，有两种方法：法a1，将mRNA溶解于制样缓冲液中；a2，将mRNA溶解于制样缓冲液中，加热，然后立即在冰上冷却；
b.上样，有两种方法：b1，用柱温箱加热层析柱，随后上样，b2，mRNA在室温下上样；
c.洗杂：使用高盐洗涤缓冲液洗去杂质；
d.洗脱，有两种方法：d1，加热层析柱，破坏mRNA中Poly(A)尾巴与层析介质表面上Oligo(dT)碱基之间的氢键；d2，低盐缓冲液或水破坏mRNA中Poly(A)尾巴与层析介质表面上Oligo(dT)碱基之间的氢键；
e.在位清洗：对色谱柱进行消毒并再生色谱柱，以进行下一轮纯化。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：mRNA带有Poly(A)尾巴，Poly(A)尾巴可以通过DNA质粒翻译形成或者通过加尾酶添加；所述纯化方法的mRNA长度≥500nt，或≥750nt，或≥1000nt，或≥1250nt；mRNA一般为线形或环形RNA；环形RNA带有mRNA，Poly(A)，核酶组分，首尾相行成一个闭环；mRNA上样量≥0.2mg/mL。
7.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：层析填料表面的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷Oligo(dT)配基长度为10-30。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：步骤a1中的制样缓冲液为PBS、Tris、HEPES、Tricine、硼酸盐、柠檬酸盐或氨基酸缓冲液；上述制样缓冲液中的盐为NaCl或KCl；盐浓度为0.1M-2.0M；制样缓冲液的pH为6.5-8.0；mRNA和制样缓冲液的混合体积比为1∶1-1∶8；步骤a2中mRNA样品加热温度为40-70℃；步骤b1中加热温度为40-70℃；步骤b1中线性流速为30-600cm/h；步骤c中线性流速为30-600cm/h；步骤d1中加热温度为40-80℃；步骤e1中NaOH浓度为0.05M-0.2M。
9.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：层析柱可以是制备柱、半制备柱、高效液相色谱柱、UPLC柱、UHPLC柱、FPLC柱、重力柱或一次性柱；所述层析柱可用于连续或非连续色谱中的单柱或多柱模式；层析柱的长度从0.1mm到2m不等，层析柱的内径从6.6mm到1m不等；层析柱的外壳材料可以是不锈钢的、PEEK、玻璃或硼硅酸盐玻璃。
10.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述层析填料是无孔的或有孔的，粒径为5m-150m；基础介质是单分散、多分散聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)、琼脂糖或硅胶，粒径为5m-150m。
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