CN114380895B - 一种治疗慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽thp及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽THP及其应用。一种显著挽救慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽THP，序列如SEQ ID NO.1所示。我们发现ATP5O降低是可能是磷脂代谢异常的重要原因。接下来我们发现去酰化酶HDAC2‑S424磷酸化水平的升高是导致ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低的关键原因。最后我们用竞争性多肽THP下调p‑HDAC2，成功挽救了ATP5O水平并纠正了异常的磷脂代谢，可见多肽THP为治疗慢性应激女性的磷脂代谢异常提供新的方案。

Description

一种治疗慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽THP及其应用
技术领域
本发明属于医学领域，具体涉及一种显著挽救慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽THP及其应用。
背景技术
应激，包括急性和慢性形式，影响着全世界约2.75亿人，占人口的4％，其中62％是妇女。尽管慢性应激(CS)的直接影响很小，但它们可以累积，持续的负慢性应激会对身体功能的各个方面造成重大损害，包括心血管(4)、神经元(5)、免疫(6)、内分泌(7)、肠道微生物群(8)和代谢。值得注意的是，脂类中的磷脂是构成细胞膜及各种细胞器膜的主要成分，也参与总多生物学过程包括细胞增殖、凋亡、细胞器膜融合、氧化磷酸化、线粒体合成和自噬。已有研究表明，在慢性应激下，脂质代谢紊乱。例如,慢性应激大鼠的海马脂代谢组显示有益的磷脂类如磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PA)和磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)显著降低，而有害的磷脂类如LPE(lysophosphatidylethanolamine)及LPC(lysophosphatidylcholine)显著增加。目前缓解慢性应激的药物多是调节神经的西药，因此除具有毒副作用外，也不能缓解磷脂代谢的异常。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种显著挽救慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽THP。
本发明的另一目的是提供该多肽的应用。
本发明的又一目的是提供筛选慢性应激导致的磷脂代谢异常的治疗药物的靶点。
一种多肽THP，序列如SEQ ID NO.1所示。该多肽能够显著挽救慢性应激导致的磷脂代谢异常。
本发明所述的多肽THP在制备治疗慢性应激异常的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的多肽THP在在制备挽救慢性应激导致的磷脂代谢异常的药物中的应用。
对慢性应激女性口服给与THP，6mg/Kg，每日一次，持续四周。然后取血清测ATP5O水平、进行定量脂代谢组测定或进行脂代谢关键酶STA5TA的blot来确定挽救是否成功。
上调ATP合成酶亚基ATP5O巴豆酰化水平的物质在制备治疗慢性应激异常的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的上调ATP合成酶亚基ATP5O巴豆酰化水平的物质为SEQ ID NO.1所示多肽。
下调去酰化酶HDAC2-S424磷酸化水平的物质在制备治疗慢性应激异常的药物中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的下调去酰化酶HDAC2-S424磷酸化水平的物质为SEQ ID NO.1所示多肽。
ATP合成酶亚基ATP5O作为靶点在筛选治疗慢性应激异常的药物中的应用，其特征在于筛选上调ATP合成酶亚基ATP5O巴豆酰化水平的物质作为治疗慢性应激异常的候选药物。
去酰化酶HDAC2-S424作为靶点在筛选治疗慢性应激异常的药物中的应用，其特征在于筛选下调去酰化酶HDAC2-S424磷酸化水平的物质作为治疗慢性应激异常的候选药物。
有益效果：
我们在一项研究中发现慢性应激小鼠有益磷脂类如PA、PC及PI显著降低，而有害磷脂类如LPA及LPC显著增加，而且我们发现ATP合成酶亚基ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低，胞质ATP水平也显著降低。而进一步我们发现ATP5O降低是可能是磷脂代谢异常的重要原因。接下来我们发现去酰化酶HDAC2-S424磷酸化水平的升高是导致ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低的关键原因。最后我们用一个竞争性多肽THP下调p-HDAC2，成功挽救了ATP5O水平并纠正了异常的磷脂代谢。由此我们认为该多肽可能是一个新型的能通过特异靶向p-HDAC2而挽救慢性应激磷脂代谢异常的小分子多肽，为治疗慢性应激女性的磷脂代谢异常提供新的方案。
附图说明：
图1.慢性应激小鼠ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平的下调是磷脂代谢物下调的主要原因A-D.慢性应激小鼠血清ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低。E.慢性应激小鼠血清定量广靶代谢组显示有益的磷脂类PE&PC&PA显著降低，而有害的LPE&LPC显著升高。F-H.人类高应激评分女性血清定量脂代谢组显示有益的磷脂类PE&PC&PA显著降低，而有害的LPE&LPC显著升高，与慢性应激小鼠中磷脂变化趋势一致。I-L.我们用一个ATP5O巴豆酰化竞争性多肽处理小鼠使血清中ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低。M和N.ATP5O巴豆酰化竞争性多肽处理小鼠使其血清中的代谢关键酶STAT5A水平也显著降低。O.ATP5O巴豆酰化竞争性多肽处理小鼠使其血清有益的磷脂类PE&PC&PA显著降低。
图2.慢性应激小鼠HDAC-S424磷酸化水平的增加是ATP5O-K51巴豆酰化及总蛋白水平降低的关键原因。
A-C.卵巢定量磷酸化组显示差异磷酸化蛋白与多个代谢通路相关，其中包括多个去乙酰化酶HDAC2-S424、Kat7-S102及CREBBP-S2361&S2363。D和E.针对HDAC2-S424特异磷酸化位点的竞争性多肽使ATP5O蛋白水平显著升高，而针对Kat7-S102及CREBBP-S2361&S2363磷酸化位点的竞争性多肽对ATP5O蛋白水平没有影响，提示p-HDAC2-S424对ATP5O有较好的特异性。F-I.Co-IP显示ATP5O与其他ATP合成酶亚基(如ATP5A1和ATP5B)相比与HDAC2有显著的相互作用。J-L.剂量依赖性去巴豆酰化显示，逐渐升高HDAC2-WT，而ATP5O-WT量不变，ATP5O巴豆酰化水平显著降低，而逐渐升高HDAC2-S424A的不影响ATP5O巴豆酰化水平。M-Q.剂量依赖性去巴豆酰化显示，同时逐渐升高HDAC2-WT及ATP5O-WT，ATP5O巴豆酰化水平及ATP5O水平均显著增加，细胞ATP水平及代谢关键酶水平也显著增加，提示ATP5O水平是细胞质ATP水平及代谢酶水平的关键影响因素。R-U.Blot显示，相比仅转染ATP5O-WT，同时转染固定量的HDAC2-WT和ATP5O-WT显著降低了ATP5O巴豆酰化水平，而用MG132抑制蛋白酶体活性，ATP5O巴豆酰化水平被恢复。同时，ATP5O泛素化水平显著降低。V.ATP5O水平巴豆酰化、泛素化与HDAC2水平及ATP5O总蛋白水平关系的模式图。总之，以上结果显示K51巴豆酰化ATP5O相比总ATP5O不易被泛素化降解。
图3.用THP调低慢性应激小鼠中HDAC-S424的磷酸化水平显著挽救异常的磷脂代谢。A-C.Blot显示注射穿膜肽TAT融合的HDAC磷酸化竞争性多肽THP显著降低了慢性应激小鼠p-HDAC2水平，同时ATP5O巴豆酰化水平和总蛋白水平也显著升高，而应激小鼠的生仔数显著增加。D-F.定量脂代谢组显示，THP处理使应激小鼠有益的磷脂类如PC&PE&PA增加，而有害的磷脂类LPC&LPE&LPA显著降低。G和H.Blot显示，THP处理使应激小鼠中显著降低的代谢关键酶STAT5A显著升高。
图4.序列对比显示人和小鼠的THP序列完全相同
人和小鼠HDAC2的氨基酸序列对比显示，THP序列(红框标记)完全相同。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
动物/个体样本纳入、实验分组、数据收集和数据分析方法详见附1方法1.19；各种抗体信息详见附1方法1.2；ATP5O-K51巴豆酰化特异抗体和HDAC2-S424磷酸化特异抗体的制备见附1方法1.13；统计分析方法详见附1方法1.20。
实施例1
用western blot(方法详见附1方法1.14)检测慢性应激造模(方法详见附1方法1.1)小鼠血清的ATP5O总蛋白水平、巴豆酰化水平及量化,发现慢性应激小鼠卵巢ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低(图1A-D)；用质谱进行对照和慢性应激小鼠血清的定量广靶代谢组(方法详见附1方法1.10)及差异代谢物的热图分析(方法详见附1方法1.12),结果显示慢性应激小鼠血清中有益的磷脂类PE&PC&PA显著降低，而有害的LPE&LPC显著升高(图1E)。用质谱进行对照女性(焦虑评分<7；评分方法详见附1方法1.7)、有焦虑倾向女性(7<焦虑评分<14)和焦虑女性血清的定量广靶代谢组及差异代谢物的热图分析，人类高应激评分女性血清定量脂代谢组显示有益的磷脂类PE&PC&PA显著降低，而有害的LPE&LPC显著升高，与慢性应激小鼠中磷脂变化趋势一致(图1F-H)；用western blot检测对照与焦虑女性血清的ATP5O总蛋白水平；量化所有女性血清的ATP5O总蛋白水平及与焦虑评分的相关性；用western blot检测对照及ATP5O巴豆酰化竞争性多肽TAC(方法详见附1方法1.15)处理小鼠血清的ATP5O总蛋白水平、巴豆酰化水平及量化；用western blot检测对照及TAC处理小鼠血清的代谢相关酶STAT5A的水平及量化；结果显示：用TAC处理可显著下调ATP5O-K51巴豆酰化水平、ATP5O总蛋白水平及脂代谢关键酶STAT5A的水平(图1I-N)；用质谱进行对照和TAC处理小鼠血清的定量脂代谢组测定及差异代谢物的热图分析，结果显示TAC处理也显著下调了有益的磷脂类PE&PC&PA的水平(图1O)。以上结果说明ATP5O-K51巴豆酰化水平及总蛋白水平下调是慢性应激小鼠血清磷脂代谢异常的关键原因。
实施例2
用质谱进行定量磷酸化组测定(方法详见附1方法1.9)，对差异磷酸化位点进行热图和KEGG信号通路分析；用western blot检测对照组和针对HDAC2-S424的竞争性多肽THP、针对Kat7-S102的竞争性多肽TKP及针对CREBBP-S2361&S2363的竞争性多肽TCP(方法详见附1方法1.15)分别处理小鼠的实验组的血清ATP5O水平及量化，我们发现p-HDAC2-S424的上调是ATP5O巴豆酰化及总蛋白水平显著降低的关键原因(图2A-E)；用Co-IP(方法详见附1方法1.18)及western blot验证HDAC2分别与ATP5A1(G)、ATP5B(H)或ATP5O间的相互作用，结果显示：与ATP合成酶其他亚基相比，HDAC2和ATP5O有显著强的结合(图2F-I)。用westernblot在293T细胞上检验，转染定量的ATP5O-WT质粒，同时转染逐渐增加的HDAC2-WT或HDAC2-S424A突变体质粒(质粒转染方法详见附1方法1.6)质粒突变方法详见附1方法1.5)，检测ATP5O的巴豆酰化及总蛋白水平及量化，结果显示HDAC2水平与ATP5O巴豆酰化水平及ATP水平呈负相关(图2J-L)。用western blot在293T细胞上检验，转染逐渐增加量的ATP5O-WT质粒，同时转染逐渐增加的HDAC2-WT质粒，检测ATP5O的巴豆酰化、胞内ATP水平(ATP检测详见附1方法1.17)及量化；用western blot在293T细胞上检验，转染逐渐增加量的ATP5O-WT质粒，同时转染逐渐增加的HDAC2-WT质粒，检测代谢关键酶Fam126A和STAT5A的蛋白水平及量化；结果显示升高HDAC2水平的同时升高ATP5O则可对抗高HDAC2水平导致的ATP5O巴豆酰化水平、ATP水平及磷脂代谢相关酶的降低(图2M-Q)。用wester blot在293T细胞上检验，同时转染HDAC2-WT及ATP5O-WT质粒，抑制或不抑制蛋白酶体的活性，检测ATP5O的巴豆酰化水平；转染及实验设计同转染HDAC2-WT及ATP5O-WT质粒，但先用ATP5O抗体做IP，然后用Ub46抗体进行western blot和量化；结果显示ATP5O巴豆酰化是较为稳定的形式，不易被泛素-蛋白酶体系统降解(图2R-U)。ATP5O水平巴豆酰化、泛素化与HDAC2水平及ATP5O总蛋白水平关系的模式图见图2V。K51巴豆酰化ATP5O相比总ATP5O不易被泛素化降解。
实施例3
接下来我们推测，既然ATP5O巴豆酰化水平及总蛋白水平的降低与磷脂代谢异常密切相关，而p-HDAC2升高又能导致ATP5O巴豆酰化水平及总蛋白水平的降低，我们设想用HDAC2磷酸化抑制性多肽THP校正应激小鼠HDAC2的高磷酸化能显著挽救应激小鼠异常的磷脂代谢。
用western blot验证HDAC2磷酸化抑制性多肽处理后ATP5O巴豆酰化水平及总蛋白水平及量化。实验结果显示，THP腹腔注射可显著下调p-HDAC2水平，同时ATP5O巴豆酰化水平及总蛋白水平显著上调(图3A和3B)。
对control组、慢性应激组及慢性应激+THP注射组进行生殖力鉴定，结果显示THP腹腔注射也可挽救应激小鼠的生殖力降低(图3C)。接着，对control组、慢性应激组及慢性应激+THP注射组小鼠血清进行定量脂代谢测定并对典型差异-挽救磷脂代谢物作图，结果显示THP腹腔注射可显著挽救应激小鼠的磷脂代谢异常(图3D-F)。最后，用western blot验证control组、慢性应激组及慢性应激+THP注射组代谢关键酶的水平，结果显示THP腹腔注射也可挽救应激导致的脂代谢关键酶STAT5A的显著降低(图3G和3H)。
实施例4
对慢性应激女性口服或肌肉注射6mg/Kg THP，每日一次，持续4周。结束时可以取血清进行ATP5O blot，如果ATP5O水平显著升高，则说明治疗成功。
附1.实验方法
1.1、动物模型
本研究中的动物实验程序均由南京医科大学(NJMU)机构动物关爱和使用委员会(IACUC)批准，批准号为IACUC-2005003。所有小鼠均在ACF(核心动物部)的标准化无特定病原体(SPF)条件下饲养。如需获得卵巢或其他组织，首先用CO2麻醉小鼠，然后通过颈椎脱位法处死。
制作慢性应激(CS)模型雌性小鼠时，用不锈钢圆柱体(长15cm，直径2.5cm)(一个圆柱体对应一只小鼠)，将雌鼠在圆筒中禁锢6小时/每天，然后解禁放回标准笼子中。每天上午9点开始处理。
对于所有生殖力测定，使用10只对照和10只慢性应激ICR雌鼠。用于交配的野生雄鼠根据随机分配表每月在笼间轮换，交配开始于2月龄。
1.2、抗体
一抗：
鼠单克隆GAPDH抗体(货号：30201ES60；上海翊圣生物,上海,中国)；
鼠单克隆β-Actin抗体(货号：A5316-100；Sigma，MS，美国)；
鼠单克隆β-Tubulin抗体(货号：sc-5274；Santa Cruz，TX，美国)；
鼠单克隆alpha Tubulin抗体(Acetyl Lys40)(货号：bsm-33235M；Bioss，北京，中国)；
鼠单克隆泛巴豆酰化修饰抗体(货号：PTM-502；杭州景杰生物，杭州，中国)；
鼠单克隆泛乙酰化修饰抗体(货号：PTM-101；杭州景杰生物，杭州，中国)；
兔多克隆泛丙二酰化抗体(货号：PTM-901；杭州景杰生物，杭州，中国)；
鼠单克隆泛苯甲酰化修饰抗体(货号：PTM-762；杭州景杰生物，杭州，中国)；
鼠单克隆泛羟基丁酰化修饰抗体(货号：PTM-802；杭州景杰生物，杭州，中国)；
兔多克隆泛乳酸化修饰抗体(货号：PTM-1401；杭州景杰生物，杭州，中国)；
兔多克隆泛琥珀酰化修饰抗体(货号：PTM-401；杭州景杰生物，杭州，中国)；
兔多克隆Transferrin抗体(货号：17435-1-ap；Proteintech，Chicago，美国)；
兔多克隆ATP5O抗体(货号：D126152；上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆ATP5A1抗体(货号：D154243；上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆ATPB抗体(货号：A5286；Selleckchem，上海，中国)；
鼠单克隆COX4L1抗体(货号：D190618；上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆AKT(Ab-129)抗体(货号：D151616-0100；上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆磷酸化AKT(Ser473)抗体(货号：4060，Cell Signaling Technology)；
兔多克隆磷酸化RPS6(Ser235/236)抗体，(货号：D155178；上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆STAT5A抗体(货号：D220085；上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆FAM126A抗体(货号：bs-11554R；Bioss，北京，中国)；
兔多克隆PTDSS1抗体(货号：BS-19583R；Bioss，北京，中国)；
兔多克隆HDAC2抗体(货号：12922-3-ap，Proteintech，芝加哥，美国)；
鼠单克隆strep II标签抗体(货号：YFMA0054，上海翼飞雪生物，南京，中国)；
鼠单克隆flag标签抗体(货号：D190828，上海生工生物，上海，中国)；
兔多克隆巴豆酰化ATP5O(K51)抗体由武汉普健生物公司针对抗原多肽“ASK(crotonyl)EKKLDQVEKELLC”制备并纯化；兔多克隆磷酸化HDAC2(S424)抗体由钟鼎生物公司针对抗原多肽“SDS(phospho)EDEGEGGRRC”制备并纯化。
二抗：
辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG和羊抗鼠IgG购自诺唯赞生物(南京，江苏，中国)。Cy2偶联驴抗兔IgG(货号：711-225-152)、Cy2偶联驴抗小鼠IgG(货号：I715-225-150)和Rhodamine(TRITC)偶联驴抗兔IgG(货号：711-025-152)购自Jackson ImmunoResearchLaboratory(West Grove，PA，美国)。
1.3、Corticosterone水平ellisa检测
肾上腺酮elisa试剂盒购自cayman公司(美国，货号：501320)。根据试剂盒操作手册，操作步骤简述如下：首先，用超纯水提前稀释试剂盒中Elisa缓冲液浓储和洗涤液浓储并配好肾上腺酮Elisa标准品，标准品浓度梯度分别为50ng/ml、20ng/ml、8ng/ml、3.2ng/ml、1.28ng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.08ng/ml，标准品使用缓冲液稀释。同时用6mlellisa缓冲液稀释肾上腺酮乙酰胆碱酯酶示踪剂(CORT AChE Tracer)和肾上腺酮抗血清(Corticosterone ELISA Antiserum)。接下来，向每个96孔酶标板中各孔将肾上腺酮标准品(或血清样品)、肾上腺酮乙酰胆碱酯酶示踪剂及抗肾上腺酮血清依次加入标准品孔(或血清样品测定孔)，塑封膜封酶标板并4℃孵育过夜。第二天早上，吸出各测定孔中液体并用wash buffer重复洗五次。配制新鲜的Ellman试剂(Ellman试剂不稳定，现用现配)。每个孔中加入Ellman试剂200ul，用塑封膜封酶标板，在避光条件下使用恒温微孔震荡仪震动120分钟。最后，将酶标板在酶标仪上读数。波长设定为412nm。根据酶标仪对标准品的读数绘制标准曲线并换算每个血清样本对应的肾上腺酮浓度。
1.4、质粒构建
对于图3D和图3E中的ATP5O表达质粒，用高保真反转录酶SSRT VI(ThermoFisher，美国)由小鼠mRNA反转录得到cDNA，然后用高保真DNA聚合酶(诺唯赞生物)扩增所有待克隆构建的基因片段，然后用高保真限制性内切酶(NEB)消化、纯化并插入连接到pcDNA3.1+。在构建中ATP5O(WT或突变体)与EGFP-strepII融合，这样可使用strepII标签抗体进行快速检测外源表达蛋白。
1.5、DNA定点突变
对于图2中的ATP5O-K51A失活型突变体(不能发生巴豆酰化，图中简写为ATP5O-toA)及HDAC2失活型突变体(不能发生磷酸化，图中简写为HDAC2-toA)，采用南京诺唯赞公司的Mut Express-II Fast Mutagenesis Kit V2，以野生型质粒为模板进行构建，简言之，设计一对引物，这对引物有15个碱基的互补区，但K51突变位点对应的三个碱基不同。然后用试剂盒中的高保真DNA聚合酶
Figure GDA0003828894550000091
Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增整个质粒、用限制性内切酶DpnI消化野生模板、用重组酶
Figure GDA0003828894550000092
II进行重组获得突变体质粒。最后将突变产物转化到感受态细胞中送公司测序确定突变成功。
1.6、质粒转染
用碧云天生物(北京)的Lipo6000TM转染试剂(货号C0526)对293T细胞系进行转染。以24孔板为例，每孔铺细胞至密度60％，约10小时后(细胞状态完全恢复)开始转染操作。每个孔转染先分别设两个组份管，一管加1μl lipo6000和25μl无血清DMEM；另一管加500ng质粒DNA及25μl无血清DMEM。将两管用枪头温和混匀，室温静置5分钟。接着，将两组份混合到一管中温和混匀，然后分滴散加于细胞孔中并轻微混匀。4-6小时后换液(培养液为10％FBS+DMEM)，约10小时后通过荧光判断质粒表达情况并开始下一步实验。
1.7、人类受试者问卷调查和分析
所有与人类相关的问卷调查和分析均由南京医科大学附属江苏省人民医院人类医学伦理委员会(HMEC)批准，批准号为2019-SR-227。
为了对女性受试者的应激水平进行评分，我们使用汉密尔顿焦虑评定量表(HARC)，每个受试者由两位独立的心理学家进行评估，最终得分是两位心理学家的平均得分。
受试者血清用于定量脂质组和生化指标测定。
1.8、非标定量巴豆酰化组学
对照和慢性应激组均重复两次，每个重复约包括60个2月龄雌鼠的卵巢(共约300毫克)，样本被送往杭州景杰有限公司(中国浙江杭州)进行质谱鉴定。程序简述如下：卵巢首先被裂解，上清液被胰蛋白酶消化成肽段。肽段通过巴豆酰化树脂富集(景杰公司，目录号PTM503)，然后将肽段组分置于NSI源中，然后在Q ExactiveTM Plus质谱仪(Thermo)中进行串联质谱(MS/MS)并在线耦合到UPLC以进行蛋白质组学肽段鉴定。对产生的MS/MS数据使用Maxquant搜索引擎(v.1.5.2.8)鉴定到的肽段(定量总蛋白组)或巴豆酰化位点(定量巴豆酰化组)。定量总蛋白数据用于标准化定量巴豆酰化数据。
1.9、TMT标记定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学
对照和慢性应激组均重复两次，每个重复约包括60个2月龄雌鼠的卵巢(共约300毫克)，样本被送往杭州景杰有限公司(中国浙江杭州)进行质谱鉴定。程序简述如下：卵巢首先被裂解，上清液被胰蛋白酶消化成肽段。然后，根据TMT试剂盒(Thermo Fisher)操作指南，分别用TMT6-126、127、128和129对来自每个样本的肽段进行同位素标记。接下来，使用Thermo Betasil C18柱通过高pH反相高效液相色谱法分离TMT标记的裂解肽段，然后将肽段组分置于NSI源中，然后在Q ExactiveTM Plus质谱仪(Thermo)中进行串联质谱(MS/MS)并在线耦合到UPLC以进行蛋白质组学肽段鉴定。对产生的MS/MS数据使用Maxquant搜索引擎(v.1.5.2.8)鉴定到的肽段(蛋白组组)或磷酸化位点(磷酸化组)。对于磷酸化蛋白质组学，用IMAC微球富集磷酸化肽段。
1.10、无标记定量代谢组学
代谢组学均由武汉迈威生物技术有限公司(中国湖北武汉)完成。对人女性血清或雌鼠血清的代谢组学进行5至12次重复。利用覆盖各种代谢物的全谱代谢组学初步筛选对照组和CS雌性小鼠之间存在的显著差异代谢物。我们发现差异代谢物中脂类占比最大，因此，之后用脂代谢组测定对照组与ATP5O巴豆酰化抑制组之间血清的脂代谢物差异、慢性应激组与HDAC2磷酸化抑制之间的差异以及人对照组女性与中等应激评分女性及高应激评分女性之间的差异。
分析样品提取物使用LC-ESI-MS/MS系统(UPLC，ExionLC AD′https：//sciex.com.cn/；MS，
Figure GDA0003828894550000101
系统，https：//sciex.com/)分析。在LC/MS实验中用三重TOF质谱仪基于IDA(信息相关基础)获得MS/MS质谱。在此模式下，采集软件(TripleTOF 6600，ABSCIEX)根据预选标准采集和触发MS/MS光谱采集过程中对全扫描测量MS数据进行持续评估。在每个循环中，在30V的碰撞能量(CE)下进行代谢物碎裂(12MS/MS事件，每个事件的产物离子累积时间为50毫秒)，选择强度大于100的12个前体离子。ESI源条件设置如下：离子源气体1为50Psi，离子源气体2为50Psi，幕帘气体为25Psi，源温度500℃，离子喷射电压浮动(ISVF)5500V或-4500V，分别处于正模式或负模式。
1.11、主成分分析(PCA)
主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是一种多维数据统计分析方法，通过正交变换将一组可能存在相关性的变量转换为一组线性不相关的变量，转换后的这组变量叫主成分。通过将原始数据压缩成n个主成分来描述原始数据集的特征，PC1表示能描述多维数据矩阵中最明显的特征，PC2表示除PC1之外的所能描述数据矩阵中最显著的特征，PC3……PCn以此类推。PCA用R软件(www.r-project.org/)的内置统计prcomp函数，设置prcomp函数参数scale＝True，表示对代谢组数据进行unit variance scaling(UV)标准化。PCA结果显示各组之间代谢组分离趋势，提示样品组间代谢组是否存在差异。
1.12、热图
对代谢组数据进行标准化处理，设定差异倍数和p值后筛选出差异代谢物，对差异代谢物在所有样品中的表达量进行聚类热图分析，并使用R程序中R包heatmaply，ComplexHeatmap绘制聚类热图。
1.13、ATP5O-K51巴豆酰化特异抗体、HDAC2-S424磷酸化特异抗体制备
ATP5O-K51巴豆酰化特异抗体对应的ATP5O巴豆酰化多肽ASK(crotonyl)EKKLDQVEKELLC由上海波泰(BioTech)公司合成，然后交给由武汉普健公司注射四只兔子进行三轮免疫，共三个月。之后取兔子血清，用结合巴豆酰化多肽ASK(crotonyl)EKKLDQVEKELLC的树脂进行巴豆酰化抗体纯化，然后用对应的非巴豆酰化多肽ASKEKKLDQVEKELLC(由上海波泰合成)结合树脂与巴豆酰化抗体孵育去除非巴豆酰化抗体，得到最终的ATP5O-K51巴豆酰化特异抗体。
HDAC2-S424磷酸化特异抗体对应的HDAC2磷酸化多肽SDS(phospho)EDEGEGGRRC由上海波泰(BioTech)公司合成，然后交给由南京钟鼎公司注射四只兔子进行三轮免疫，共三个月。之后取兔子血清，用结合磷酸化多肽SDS(phospho)EDEGEGGRRC的树脂进行磷酸化抗体纯化，然后用对应的非磷酸化多肽SDSEDEGEGGRRC(由上海波泰合成)结合树脂与巴豆酰化抗体孵育去除非磷酸化抗体，得到最终的HDAC2-S424磷酸化特异抗体。
1.14、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和western blot
将细胞或组织样本在SDS样品缓冲液中煮沸4分钟，冰上冷却，12000rpm转速离心4分钟后取上清，用4％积层胶和12.5％分离胶在120伏下电泳分离蛋白质2.5h，然后在100伏下电泳转印到硝酸纤维素膜上(需2.5h)。转印好的膜在TBS(20mmTris，137mmNaCl，pH7.4)中洗涤三次(每次10分)后，用含有5％脱脂奶粉的TBST(含0.1％tween-20的TBS)缓冲液中室温封闭1小时，然后用一抗(稀释在含5％脱脂奶粉的TBST中培养1：1000)孵育膜过夜(4℃)。在TBST中洗涤三次(每次10分钟)后，在室温下用HRP(辣根过氧化物酶)偶联的山羊抗鼠IgG二抗(1：3000稀释于TBST/5％脱脂奶粉)孵育膜1小时。膜在TBST中洗涤三次(每次10分钟)后，加增强化学发光试剂(ECL)到膜上显色，在化学发光成像仪上收集信号。1.15、竞争性多肽与动物注射
对于所有竞争性肽，细胞穿透肽TAT序列CYGRKKRQRRR与蛋白质特异性序列融合，由上海波泰生物公司合成。
为了抑制内源ATP5O在K51的巴豆酰化，序列为CYGRKKRRQRRRATALYSAASKEKKL，命名为TAC(TAT融合ATP5O巴豆酰化序列)。
为了抑制内源性HDAC2在S424的磷酸化，序列为CYGRKKRRQRRRSDSEDEGEGGRR，命名为THP(TAT融合HDAC2磷酸化序列)。
为了抑制内源性KAT7在S102的磷酸化，序列为CYGRKKRRQRRRSSGSETEQVVDF，命名为TKP(TAT融合KAT7磷酸化序列)。
为了抑制内源性CREBBP在S2361和S2363的磷酸化，序列为CYGRKKRRQRRRQSQPPHSSPSPR，命名为TCP(TAT融合CREBBP磷酸化序列)。
将每种肽溶解在含有10％二甲基亚砜(西格玛)的无菌超纯水中配成5mg/ml的浓储液。小鼠注射时，用0.9％的NaCl溶液将浓储肽稀释至0.5mg/ml最终浓度，注射剂量为6mg/Kg。对照仅注射TAT多肽。
1.16、体内HDAC2依赖性ATP5O去巴豆酰化
对于图2J-L中的实验，将固定量(0.25μg)的ATP5O-WT质粒(在pcDNA3.1中)或ATP5O-K51A质粒与递增量的HDAC2-WT质粒转染到293T细胞中，并将细胞培养3天以表达外源蛋白。然后裂解细胞并进行western blot检测ATP5O巴豆酰化水平。
对于图2M-Q中的实验，转染同时递增量(0、0.25、0.5和1μg)的ATP5O-WT质粒和HDAC2-WT质粒到293T细胞中，检测ATP5O巴豆酰化水平(2M和2N)、细胞内ATP水平(2O)及磷脂代谢关键酶Fam126A、STAT5A的水平(2P和2O)。
对于图2R和2S中的分析，进行了三种不同的转染(仅0.25μg ATP5O WT strepII质粒、0.25μg ATP5O WT strepII+0.25μg HDAC2WT Flag质粒和0.25μg两种质粒+MG132)。
1.17、线粒体染色和ATP测定
对于线粒体染色，卵母细胞在含有100nM Mito Tracker(Cat#：M7521，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和10μg/ml Hochest 33342(Sigma)的Hepes中培养30分钟。使用Andor Revolution转盘式激光共聚焦工作站拍摄图像。
对于ATP测量，首先用100μl ATP裂解液(Cat#：S0026，Beyotime)在冰上裂解卵母细胞。然后用酶标仪Synergy2(BioTek，Winooski，VT，USA)检测样本ATP水平。
1.18、免疫共沉淀
首先将2.5μg未免疫兔IgG(作为对照)、兔抗HDAC2抗体、兔抗ATP5O抗体、兔抗ATP5A1抗体或兔抗ATP5B抗体在250μl免疫沉淀(IP)缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，10mMEDTA，1mM EGTA，150mM NaCl，0.05％Triton X-100，0.05％Nonidet P-40，1mM PMSF，1:100蛋白酶抑制剂和1:500磷酸酶抑制剂)中、4℃下与30μl蛋白A/G微珠(中国上海Yeasen)偶联4小时。同时，将400个卵母细胞在250μl IP缓冲液中超声裂解，然后用30μl蛋白A/G微珠在4℃下预清洗4小时。接下来，蛋白A/G偶联兔IgG或特异性抗体在4℃下与预清洗的卵母细胞裂解液上清一起孵育过夜。最后，用250μl IP缓冲液洗涤三次(每次10分钟)后，将所得带有结合免疫复合物的珠子进行SDS-PAGE和western blot。
1.19、动物/个体样本纳入、实验分组、数据收集和数据分析
任何选定的卵母细胞必须具有正常质量(来自有腔卵泡的成熟卵母细胞、正常直径、透明带和卵母细胞膜之间的紧密连接等)。任何选定的雌性老鼠必须身体健康(正常体重、正常进食、正常活动等)。任何质量差或不健康的卵母细胞或小鼠将被排除在外。
对于所有的实验分组、数据收集和数据分析，我们都试图遵循盲选原则。数据收集、数据分析和数据输入(excel文件)由不同的作者完成。
对于所有其他实验分组和数据收集，必须清楚标记对照或处理过的样品。但在图像拍摄、卵泡计数或强度量化过程中，每个样本的组标签都被一个黑色胶带覆盖，并重新标记为数字或字母。实验过程结束后，除去黑色胶带，第一作者之一可以很容易地找到分析数据和样本信息之间的相关性，并将数据输入到相应的原始excel文件中。
在实验操作之前，在一个独立重复或组中的个体(卵母细胞、卵巢或小鼠)都是通过随机和盲选法选择和分配。对于独立重复的数据收集，随机选择每个数据点。
1.20、统计分析
对western blot或DNA凝胶的所有统计图均来自三个独立重复，血液生化指标的所有统计图均来自五个独立重复。图中的每个点代表一个重复。如果一组中所有随机收集的单个数据点的标准误差明显小于平均值，则相应的样本量是适当且可信的。数据以平均值±SEM表示。两组之间的统计比较采用Excel的Student’s t-test。进行多重比较时采用Kruskal-Wallis的one-way nonparametric ANOVA。P<0.05被认为具有统计学意义。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种显著挽救慢性应激导致的磷脂代谢异常的多肽THP及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ser Asp Ser Glu
1 5 10 15
Asp Glu Gly Glu Gly Gly Arg Arg
20

Claims (2)

1.一种多肽THP，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的多肽THP在制备治疗慢性应激导致的磷脂代谢异常的药物中的应用。
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CN114213518A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 北京大学 调控糖脂代谢的Tmem52蛋白、编码基因、sgRNA及其应用

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