CN114380894B - 一种改善认知功能障碍的十八肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种改善认知功能障碍的十八肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白技术领域，公开了一种改善认知功能障碍的牡蛎十八肽及其制备方法与应用。该十八肽通过抑制细胞内NO及ROS的生成，抑制NF‑κB P65的磷酸化和IκB的降解，降低细胞内氧化应激及慢性增长性炎症；通过激活ERK‑CREB信号通路和抑制凋亡通路，促进神经细胞的增殖与分化，改善突触功能，干预细胞衰老，抑制凋亡，从而发挥神经细胞保护作用，进而改善衰老诱发的认知功能障碍。

Description

一种改善认知功能障碍的十八肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于蛋白技术领域，具体涉及一种改善认知功能障碍的十八肽及其制备方法与应用。
背景技术
人体衰老是一种复杂的自然现象，常伴随一系列健康问题，认知功能衰退是其显著特征之一。大脑老化与行为缺陷、记忆丧失和认知功能障碍有关。认知功能障碍可见于患有轻度认知障碍(MCI)的老年患者，以及早期阿尔茨海默病患者(AD)。在大于65岁的老年人群中有15％～20％的人患有轻度认知障碍，而32％的轻度认知障碍患者在5年内会发展为阿尔茨海默病。随着近年人口老龄化情况的日益严重，患老年认知功能障碍的患者日益增多，探索具有预防、改善因机体衰老引起的以学习记忆衰退为主要表现的认知功能障碍的活性物质已成为解决当前全球范围老龄化问题的研究热点。
牡蛎肉质鲜美，营养丰富，是卫生部第一批批准的药食同源的保健食品之一。目前，牡蛎主要以鲜食为主，深加工产品目前较多为蚝干、蚝油，附加值普遍较低，其营养价值和药用价值没有被充分开发利用。随着近年牡蛎产量的增加，探究其生物活性，延伸其精深加工对提高其附加值意义重大。现有研究表明：牡蛎具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、降血压、醒酒护肝、抗疲劳、降血糖和降血脂、调节机体免疫力、抗肿瘤、抗光老化等生物活性功效。目前未见牡蛎及其相关产物改善老年认知功能障碍的研究报道。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种具有改善老年认知功能障碍的十八肽。
本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的十八肽的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于包含本发明第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的十八肽的制备方法。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的十八肽、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种具有改善老年认知功能障碍的十八肽，所述十八肽的氨基酸序列为：
a)IAFIMDESNVLDSGFLER(SEQ ID NO.10)；或
b)SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的修饰、取代或缺失后且功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明的第二个方面，提供提供编码本发明第一方面的十八肽的核酸分子。
本发明的第三个方面，提供包含本发明第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
优选地，所述转基因细胞不包含繁殖材料。
本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的十八肽的制备方法，为(a)～(c)中任一种：
(a)以牡蛎为原料提取得到；(b)采用液相或固相合成法合成；(c)培养本发明第三方面的转基因细胞得到。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的十八肽、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞的应用。
(d)～(f)中任一种在(g)～(m)中任一种中的应用；
(d)本发明第一方面的十八肽；(e)本发明第二方面的核酸分子；(f)本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞；(g)制备改善认知功能障碍的产品；(h)制备抗炎产品；(i)制备抑制ROS生成的产品；(j)制备抑制NO生成的产品；(k)制备NF-κB炎症信号通路抑制剂；(l)制备抗衰老产品；(m)制备ERK-CREB信号通路激活剂；
所述产品为药品或试剂。
优选地，所述认知功能障碍为老年认知功能障碍。
优选地，所述NF-κB炎症信号通路抑制剂具有(n)和/或(p)的功能：
(n)降低P65磷酸化水平；(p)提升IκB表达量。
优选地，所述ERK-CREB信号通路激活剂具有(q)～(v)中至少一种功能：
(q)提升CREB表达量；(r)提升ERK表达量；(s)提升BCL-2表达量；(t)提升CREB磷酸化水平；(u)提升ERK磷酸化水平；(v)降低BAX表达量。
本发明的第六个方面，提供一种产品，包含：(d)～(f)中的至少一种；
(d)本发明第一方面的十八肽；(e)本发明第二方面的核酸分子；(f)本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞；
所述产品为药品或试剂。
优选地，所述产品具有(w1)～(w7)中任一种功能：
(w1)改善认知功能障碍；(w2)抗炎；(w3)抑制ROS生成；(w4)抑制NO生成；(w5)抑制NF-κB炎症信号通路；(w6)抗衰老；(w7)激活ERK-CREB信号通路。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了一种具有改善老年认知功能障碍的十八肽，该十八肽通过抑制细胞内NO及ROS的生成，抑制NF-κB P65的磷酸化和IκB的降解，降低细胞内氧化应激及慢性增长性炎症；通过激活ERK-CREB信号通路和抑制凋亡通路，促进神经细胞的增殖与分化，改善突触功能，干预细胞衰老，抑制凋亡，从而发挥神经细胞保护作用，进而改善衰老诱发的认知功能障碍。
附图说明
图1是实施例1中UF2的离子交换层析分离色谱图。
图2是实施例1中P1—P6的凝胶层析分离色谱图：其中，UV表示紫外吸光值，cond表示电导，conc表示浓度。
图3是实施例1中P1—P6对BV2细胞活力影响的结果图：其中，*表示与CT组相比，P<0.05。
图4是实施例1中P1—P6对LPS诱导的BV2细胞活力影响的结果图：其中，#表示与CT组相比，P<0.05；*表示与MD组相比，P<0.05；**表示与MD组相比，P<0.01；***表示与MD组相比，P<0.001。
图5是实施例1中P1—P6对LPS诱导的BV2细胞释放NO水平的影响图：其中，#表示与CT组相比，P<0.05；*表示与MD组相比，P<0.05；**表示与MD组相比，P<0.01；***表示与MD组相比，P<0.001。
图6是实施例1中P2、P3、P4、P6的半制备分离色谱图。
图7是实施例1中半制备纯化组分对BV2细胞活力的影响图：其中，A是实施例1中P2、P3半制备纯化组分对BV2细胞活力的影响图；B是实施例1中P4、P6半制备纯化组分对BV2细胞活力的影响图；***表示与CT组相比，P<0.001。
图8是实施例1中半制备纯化组分对LPS激活的BV2细胞NO释放水平的影响图：其中，A是实施例1中P2、P3半制备纯化组分对LPS激活的BV2细胞NO释放水平的影响图；B是实施例1中P4、P6半制备纯化组分对LPS激活的BV2细胞NO释放水平的影响图；其中，#表示与CT组相比，P<0.05；*表示与MD组相比，P<0.05。
图9是实施例1中半制备纯化组分P3-3、P4-3对BV2细胞活力的影响图：***表示与CT组相比，P<0.001。
图10是实施例1中半制备纯化组分P3-3、P4-3对LPS激活的BV2细胞NO释放水平的影响图：柱上标记不同的大写字母代表差异极显著，即P<0.01；不同的小写字母代表差异显著，即P<0.05。
图11是实施例1中P4-3分析液相色谱图。
图12是实施例1中P4-3总离子源图。
图13是实施例1中合成的18肽的RP-HPLC图谱。
图14是实施例1中合成的18肽的一级质谱图。
图15是实施例1中合成的18肽的二级质谱图。
图16是实施例1中纯化的18肽的二级质谱图。
图17是实施例2中合成肽对BV2细胞活力的影响图：PT1-1、PT1-2、PT1-3、PT1-4、PT1-5分别代表浓度为1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL的5肽；PT2-1、PT2-2、PT2-3、PT2-4、PT2-5分别代表浓度为1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL的18肽。
图18是实施例3中合成肽对LPS诱导的BV2细胞分泌NO的影响图：PT1-1、PT1-2、PT1-3、PT1-4、PT1-5分别代表浓度为1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL的5肽；PT2-1、PT2-2、PT2-3、PT2-4、PT2-5分别代表浓度为1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL的18肽。
图19是实施例4中合成肽对LPS诱导的BV2细胞内ROS产生的影响的荧光图：5-3、5-4、5-5分别代表浓度为0.1，0.05，0.01μg/mL的5肽；18 -3、18-4、18-5分别代表浓度为0.1，0.05，0.01μg/mL的18肽。
图20是实施例4中合成肽对LPS诱导的BV2细胞内ROS产生的影响的统计结果图：其中，###表示与CT组相比，P<0.001；*表示与MD组相比，P<0.05；***表示与MD组相比，P<0.001。
图21是实施例6中合成肽对SH-SY5Y细胞活力的影响图。
图22是实施例6中D-gal对SH-SY5Y细胞活力的影响图：***表示与CT组相比，P<0.001。
图23是实施例6中合成肽对D-gal诱导老化的SH-SY5Y细胞的影响图：其中，###表示与CT组相比，P<0.001；***表示与MD组相比，P<0.001。
图24是合成肽对D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞β-半乳糖苷酶表达的影响图：其中，5-3、5-4、5-5分别代表浓度为0.1，0.05，0.01μg/mL的5肽；18 -3、18-4、18-5分别代表浓度为0.1，0.05，0.01μg/mL的18肽。
图25是合成肽对SH-SY5Y细胞CREB、ERK、BAX和BCL-2表达水平影响的Westernblotting图。
图26是合成肽对SH-SY5Y细胞CREB、ERK、BAX和BCL-2表达水平影响的统计结果图：其中，A是合成肽对SH-SY5Y细胞p-CREB/β-actin的相对比值的影响图；B是合成肽对SH-SY5Y细胞T-CREB/β-actin的相对比值的影响图；C是合成肽对SH-SY5Y细胞p-ERK1/2/p65的相对比值的影响图；D是合成肽对SH-SY5Y细胞T-ERK1/2/β-actin的相对比值的影响图；E是合成肽对SH-SY5Y细胞的BAX/β-actin相对比值的影响图；F是合成肽对SH-SY5Y细胞BCL-2/p65的相对比值的影响图；G是合成肽对SH-SY5Y细胞BAX/BCL-2的相对比值的影响图；其中，#表示与CT组相比，P<0.05；##表示与CT组相比，P<0.01；###表示与CT组相比，P<0.001；*表示与MD组相比，P<0.05；**表示与MD组相比，P<0.01；***表示与MD组相比，P<0.001。
图27是合成肽对BV2细胞NF-κB(P65)、IκB表达量的影响的Western blotting图。
图28是合成肽对BV2细胞NF-κB(P65)、IκB表达量的影响的统计结果图：其中，A是合成肽对BV2细胞p-p65/β-actin的相对比值的影响图；B是合成肽对BV2细胞p65/β-actin的相对比值的影响图；C是合成肽对BV2细胞p-p65/p65的相对比值的影响图；D是合成肽对BV2细胞IκBα/β-actin的相对比值的影响图；其中，#表示与CT组相比，P<0.05；*表示与MD组相比，P<0.05；**表示与MD组相比，P<0.01；***表示与MD组相比，P<0.001。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中采用的材料与试剂如下：牡蛎购于广东省湛江市东风市场；超滤膜(8、5、3kDa)以及无菌滤膜(0.22μM)购自德国密理博公司；氢氧化钠、盐酸、三甲基氨基甲烷购于广东光华科技股份有限公司；Q Sepharose TM Fast Flow树脂、Sephadex G-25购于美国GE公司；75％乙醇购于沈阳惠民洗消剂制造有限公司；色谱纯乙腈购于美国Fisher公司；三氟乙酸购于英国阿拉丁公司；BV2细胞株、SH-SY 5Y细胞株购于上海中科院；中性蛋白酶(30000U/g)购置广西南宁庞博生物工程有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购于美国gibico公司；DCFHDA(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate)、Hoechst33342购于北京索莱宝科技有限公司；96孔细胞培养板购于美国Thermo fisher公司；CCK8试剂盒购于日本同仁化学研究所；NO试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE聚丙烯酰胺预制胶(15％)、电泳缓冲液、转膜缓冲液、WB封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、WB洗涤液、上样缓冲液和10-170kDa彩色预染Marker等试剂购自碧云天生物技术有限公司；化学发光液购自文渊阁生物技术有限公司；p-p65、p65、IκBα、p-CREB、CREB、p-ERK1/2、ERK1/2、BAX、BCL-2、actin兔源IgG单克隆抗体、山羊抗鼠IgG二抗均购于江苏亲科生物研究中心有限公司(Affinity Biosciences)。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1改善认知功能障碍的牡蛎活性肽的制备
1、牡蛎蛋白酶解产物(Oyster protein enzymatic hydrolysate，OPEH)的制备：牡蛎自然解冻后按1:3(w/v)的比例加水后用高速均质机在冰浴上匀浆5min，用0.1mol/L的NaOH调节pH至12.0，4℃恒温搅拌3h后，经4℃10000r/min离心20min，取上清液用0.1mol/L的HCL调pH至4.8，再次在4℃10000r/min离心20min，取沉淀加水(1:3(w/v))，调pH至7.0，按酶和底物比(E/S)2：100加入中性蛋白酶，50℃酶解4h后100℃灭酶10min，离心(10000r/min，20min)所得的上清液，即为牡蛎蛋白酶解产物。
OPEH的超滤组分的制备：在冰浴条件下，将OPEH用8kDa超滤膜超滤，被8kDa超滤膜截留的组分为>8kDa超滤组分(UF1)，透过超滤膜的组分用5kDa超滤膜继续超滤，被5kDa超滤膜截留的组分为5～8kDa超滤组分(UF2)，透过超滤膜的组分用3kDa超滤膜继续超滤，被3kDa超滤膜截留的组分为3～5kDa超滤组分(UF3)，透过超滤膜的组分为<3kDa超滤组分(UF4)。收集各超滤组分旋蒸浓缩，冷冻干燥后放置于-80℃冰箱保存备用。
超滤组分的功效活性采用老年斑马鱼行为学进行评价。4超滤组分均能不同程度提高老年斑马鱼认知功能，其中UF2的功效表现最强，喂食UF2一个月后可显著提高老年斑马鱼进入T迷宫食物放置区的成功率，降低老年斑马鱼的潜伏期，并提高老年斑马鱼在T迷宫右臂的游动路程及时间，具有显著改善老年斑马鱼认知功能障碍的功效。
2、采用QFF阴离子交换层析对UF2进行样品分离QFF离子交换树脂用20％的乙醇溶胀24h后进行装柱，规格为2.6cm×15cm。以0.5M Tris-NaCL溶液对样品进行梯度洗脱，流速为6mL/min。上样量为2mL，280nm处监测吸光值。以最优的缓冲溶液pH为10.5及上样体积35mL进行样品分离。结果如图1所示，获得六个主要的吸收峰P1—P6，样品命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6。将收集到各吸收峰的pH值调至中性后进行真空冷冻干燥，低温保存备用。
3、采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析对步骤2得到P1—P6进行脱盐处理
Sephadex G25葡聚糖凝胶用20％的乙醇溶胀24h后进行装柱，规格为2.6cm×15cm。去离子水作为流脱液，流速6mL/min。将P1—P6用去离子水配制成上样液，复溶到刚好溶解，上样量为5mL。根据仪器电导示意图，收集先于盐流脱出来的峰(图2)，真空冷冻干燥，得到脱盐后的P1—P6。
从-80℃冰箱取出BV2细胞冻存管，迅速放入37℃温水中摇晃解冻，持续1min左右，至其完全融化。在无菌操作台上将细胞悬液移至15mL的离心管，并加入4mL完全培养基(10％ FBS+DMEM高糖培养基)，1000rpm/min离心5min。吸弃上清液后用基础培养基(DMEM高糖培养基)洗细胞2次后加5～7mL完全培养基，轻轻混悬沉淀细胞，再将其移到细胞培养瓶，二氧化碳培养箱培养。培养条件：5％ CO2、95％空气，37℃饱和湿度。1天更换一次培养基，2天进行一次传代，选取对数生长期状态优良的细胞进行试实验。
以1×104/孔的数量将BV2细胞铺板(96孔板)过夜，待细胞贴壁，更换完全培养基后加入样品(脱盐后的P1—P6，终浓度分别为1、10、100、1000μg/mL)，设置正常对照组(不加样品，CT组)，每组5个复孔。二氧化碳培养箱培养24h后，加入CCK8试剂，再置于培养箱中培养2h。酶标仪450nm处测定OD值，以正常对照组吸光度的平均值为100％，计算出细胞活力，以此判断不同浓度的待测样品是否安全无毒害。
细胞存活率(％)＝(Ai/A0)×100；其中：Ai表示加入样品后OD值；A0表示正常对照组OD值。
结果如图3所示：不同浓度的P1—P6处理后，BV2细胞活力与CT组相比均无显著性差异，即脱盐后的P1—P6对BV2细胞没有毒副作用，部分样品浓度下，BV2细胞活力出现一定程度的升高，表明其对BV2细胞具有一定的营养作用。
以1×104/孔的数量将BV2细胞铺板(96孔板)过夜，待细胞贴壁，更换完全培养基后加入样品(脱盐后的P1—P6，终浓度分别为1、10、100、1000μg/mL)，设置正常对照组(不加样品，CT组)，LPS刺激组(加入终浓度为100ng/mL LPS，MD组)、样品与LPS共处理组，每组5个复孔。样品与LPS共处理组加入样品后，摇匀，二氧化碳培养箱培养10h后，除正常对照组外各组加入LPS(终浓度为100ng/mL)进行炎性活化，二氧化碳培养箱培养24h后，加入CCK8试剂，再置于培养箱中培养2h。酶标仪450nm处测定OD值，以正常对照组吸光度的平均值为100％，对照LPS刺激组的OD比值，计算出细胞抗炎活力。
细胞抗炎活力/％＝(Ai/A0)×100；其中：Ai表示加入不同浓度样品后450nm处的吸光度值；A0正常对照组在450nm处的平均吸光度值。
结果如图4所示：添加LPS后BV2细胞活力显著增高，表明炎症模型建立成功；加入不同浓度的P1—P6，BV2细胞活力均有不同程度的下降，其中P2和P4在1～1000μg/mL的浓度下均可以显著降低(P<0.01)由LPS刺激引起的升高的BV2细胞活力，而P3和P6在10～1000μg/mL的浓度下可以显著抑制(P<0.05)由LPS刺激引起的BV2细胞活力的升高，其中P4在1～100μg/mL的浓度下均呈现极显著性作用(P<0.001)，具有最好的抗LPS刺激BV2细胞炎症活性的作用。
采用Griess法测定各样品(脱盐后的P1—P6，终浓度分别为1、10、100、1000μg/mL)对经LPS诱导的BV2细胞中NO的含量的影响。以3×104/孔的数量将BV2细胞铺板(96孔板)过夜，待细胞贴壁，更换无血清的基础培养基，设置正常对照组(CT组)，LPS刺激组(加入终浓度为100ng/mL的LPS，MD组)、样品与LPS共处理组，每组5个复孔。样品与LPS共处理组加入样品后，摇匀，二氧化碳培养箱培养10h后，除正常对照组外各组加入LPS(终浓度为100ng/mL)进行炎性活化，二氧化碳培养箱培养24h后，按照说明书Griess法检测NO的含量，540nm处测定吸光值，计算出各组细胞的NO含量。
结果如图5所示：BV2细胞经LPS刺激后生成大量的NO，表明建模成功；添加脱盐后的P1—P6(浓度1～1000μg/mL)的处理后，由LPS刺激的BV2细胞生成的NO含量呈不同程度的降低，其中P1与P2组分在100、1000μg/mL两个浓度下能显著抑制LPS刺激的BV2细胞NO的生成(P<0.01)，P5组分在10、100、1000μg/mL三个浓度下能显著抑制LPS刺激的BV2细胞NO的生成(P<0.01)，而P3、P4、P6组分在1、10、100、1000μg/mL四个浓度下均能显著抑制LPS刺激的BV2细胞NO的释放水平(P<0.05)。结合P1—P6对LPS诱导的BV2细胞活力的抑制作用及抑制NO的生成作用，确定对P2、P3、P4、P6四个组分作进一步纯化。
4、采用制备色谱层析对P2、P3、P4、P6四个组分进行纯化
色谱仪：QuikswP50D制备液相色谱；柱类型及规格：C18柱(Xterra MS 5μM，4.6×250mm)；色谱条件：进样量：100μL；样品浓度：50mg/mL；柱温：25℃；流动相：A：V(水)：V(三氟乙酸)＝2000：0.1；B：纯乙腈；洗脱条件：0～20min，97％～77％流动相A，3％～23％流动相B，20～30min，77％～97％流动相A，23％～3％流动相B；流速：1.5mL/min；检测波长：220nm、280nm。
经半制备色谱纯化后，P2组分分离得到6个组分(P2-1、P2-2、P2-3、P2-4、P2-5、P2-6)，P3组分分离得到6个组分(P3-1、P3-2、P3-3、P3-4、P3-5、P3-6)，P4组分分离得到7个组分(P4-1、P4-2、P4-3、P4-4、P4-5、P4-6、P4-7)，P6分离得到2个组分(P6-1、P6-2)(图6，图6中左侧纵坐标为紫外吸光值；右侧纵坐标为溶剂百分比)。按0.1ug/mL的浓度添加此21个组分作用BV2细胞(方法同步骤3)，结果如图7所示：经21个组分处理后，细胞活力与CT组(对照组)相比均无显著性差异，即上述21个组分对BV2细胞没有毒副作用。同时测定上述21个组分对LPS刺激的BV2细胞生成的NO的含量的影响(组分的终浓度为0.1μg/mL，方法同步骤3)，结果如图8所示：P3-3、P4-2、P4-3、P4-4 4个纯化组分能显著抑制NO生成(P<0.05)，从这四个组分中选出P3-3和P4-3进行更大浓度范围(1～0.0001μg/mL)下抗炎活性的比较，结果如图9、10所示，P3-3和P4-3对BV2细胞没有毒副作用，P4-3的抗炎活性强于P3-3，确定对P4-3的氨基酸序列作质谱鉴定，进行质谱鉴定前利用液相色谱了解P4-3的纯度，结果如图11所示：可见到一个主峰和极少的杂峰，说明纯化所得的P4-3的纯度非常高，可用作质谱鉴定。
5、采用液质联用对P4-3中的多肽进行鉴定
(1)LC-20AD岛津高效液相色谱
先把P4-3冷冻真空抽干，用25mM浓度碳酸氢铵50μL超声溶解。10000g离心5min取上清进行上机。将肽段液通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行分离。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱两部分。分离程序如下：先以8μL/min的流速进样4min；然后以300nL/min的流速梯度洗涤40min，洗涤梯度为buffer B(含0.1％FA(甲酸)的95％CAN(乙腈))从2％上升到35％；再从35％到80％线性洗提5min。最后用80％的buffer B洗柱4min，buffer A(含0.1％FA的5％CAN)洗柱1min。
(2)飞行质谱
经过液相分离的肽段进入到串联ESI质谱仪：Q-EXACTIVE(ThermoFisherScientific,San Jose,CA)。一级质谱分辨率设置为70000(质荷比/半峰宽)。用碰撞能量为27的HCD(High energe Collision Dissociation)模式对肽段进行筛选，二级碎片在Orbi中检测，分辨率为17500。每个峰强度超过20000的一级母离子打15个二级谱图，对目标峰进行DDA(数据依赖性采集)全谱扫描。动态排除设定为：15s相同的母离子打二级不会超过2次。离子源电压设置为1.6kV。AGC(Automatic gain control)通过orbi来实现，其设置为：对orbi内控制聚集量在1e5到3e6之间的离子进行二级扫描鉴定。扫描的质荷比范围为350～2000Da。通过NCBI总署旗下的Ostreidae数据库对所获得的离子磁片进行信息搜索。
结果如图12所示：从P4-3中鉴定出14个潜在活性肽，肽序列结果如表1。
表1P4-3鉴定出的肽序列
6、活性肽的筛选
神经保护肽的氨基酸组成会影响其神经保护能力，已有研究发现含疏水性氨基酸的活性肽由于疏水性使肽能够渗透到细胞中，到达特定目标而起针对性保护；芳香族氨基酸会够影响多肽的神经保护能力，另外Glu(E)通过高亲和转运系统通过血脑屏障后，起神经保护作用，天冬氨酸可增强海马长时程，因此分析质谱鉴定所得的14条活性肽所含的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸，结合G l u、Asp的含量，确定对其中8条活性肽进行分子对接，同时由于肽13在质谱检测过程中出现的频率最高，而肽14是目前检测到的序列较大的活性肽，因此将对这两条肽同时进行分子对接的研究。
CREB是真核生物细胞核内十分重要的转录因子，是神经营养因子BDNF的上游蛋白，CREB发生活化后可激活其下游蛋白BDNF的表达，对改善认知功能障碍的功效作用起到重要影响。将鉴定出来的活性肽与CREB进行分子对接。从RCSB Protein Data Bank(http://www.rcsb.org)下载CREB(PDB编号:5CFW，分辨率：的X-ray晶体结构)。利用Discoverstudio 4.1Visualizer对多肽进行了三维结构设计和能量最小化，采用ZDOCK3.0.2程序进行多肽-蛋白对接。蛋白质与肽的分子对接是根据肽的氨基酸组成、肽链长度等结构特征，以及分子电荷、残基疏水性和侧链等物化特征，对肽的活性进行预测。
各活性肽与CREB对接的打分如表2所示。由于已有研究发现，活性肽在分子对接中结合力越大，分子量越小，其功效活性越强，因此我们对10个活性肽中氨基酸数量接近的肽与CREB的结合力及其分子量进行比值分析，以推测各活性肽相对结合力的大小。5～10个氨基酸组成的活性肽中分子对接结合力与肽分子量比值最高的是5肽(IDYER)，比值为1.168，而18～19个氨基酸组成的活性肽中分子对接结合力与肽分子量比值最高的是18肽(IAFIMDESNVLDSGFLER)，38～62个氨基酸组成的活性肽中分子对接结合力与肽分子量比值显著低于其余8个活性肽。根据活性肽分子对接结合力与其分子量比值的结果推测5肽(IDYER)和18肽(IAFIMDESNVLDSGFLER)具有较好的激活CREB的活性，有利于改善认功能障碍，确定选择5肽和18肽进行后续人工合成。
表2活性肽与CREB分子对接打分表
通过NCBI总署旗下的Ostreidae数据库对18肽的牡蛎蛋白来源进行搜索，IAFIMDESNVLDSGFLER来源于牡蛎中的胞质动力蛋白1重链类同型X1(蛋白编号：XP_022333004.1)。通过质谱信号强度可见UF2的信号强度为4.04×109，18肽的信号强度为1.35×106，18肽的丰度相对较高，为3.34×10-3。
7、多肽的合成与纯度鉴定
采用固相法合成多肽IDYER(由江苏强耀生物技术有限公司协助完成)。然后进行多肽身份验证，具体如下：
(1)液相色谱法
色谱仪：LC-20AD岛津高效液相色谱；柱类型及规格：C18柱(Xterra MS 5μM，4.6*250mm)；色谱条件：进样量：20μL；样品浓度：50μg/mL；柱温：25℃；流动相：A：V(水)：V(三氟乙酸)＝2000：0.1；B：纯乙腈；洗脱条件：0～20min，97％～77％流动相A，3％～23％流动相B；20～30min，77％～97％流动相A，23％～3％流动相B；流速：1.5mL/min；检测波长：220nm。
(2)液质联用
方法同步骤5。
结果如图13所示：合成的18肽(IAFIMDESNVLDSGFLER)经HPLC分析，其色谱图基线平整，合成肽色谱峰为主要色谱峰，肽纯度均达98％以上；一级质谱图显示18肽的离子碎片为1029.01(图14)，与纯化所得的活性肽离子碎片完全一致。进一步利用ESI-MS/MS质谱对合成的两个活性进行二级质谱鉴定，合成18肽的二级质谱肽(图15)与纯化18肽(图16)的二级质谱图一致，由此确定合成的活性肽与来自UF2半制备色谱P4-3的生物活性肽(18肽(IAFIMDESNVLDSGFLER)是一致的。
实施例2合成肽对BV2细胞活力的影响
测定五个不同浓度(1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL)的18肽对BV2细胞活力的影响(方法同实施例1步骤3)，结果如图17所示：添加1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL五个不同浓度的18肽后，BV2细胞活力与CT组相比均无显著性差异，对BV2细胞没有毒副作用。
实施例3合成肽对LPS诱导的BV2细胞分泌NO的影响
测定五个不同浓度(1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL)的18肽对经LPS诱导的BV2细胞中NO的含量的影响(方法同实施例1步骤3)，结果如图18所示：18肽的五个浓度(1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL)均能极显著降低LPS刺激的BV2细胞生成的NO含量(P<0.001)，具有显著抑制LPS刺激BV2细胞NO的生成作用。
实施例4合成肽对LPS诱导的BV2细胞内ROS产生的影响
选择三个低浓度的18肽(0.1，0.05，0.01μg/mL)对LPS诱导的BV2细胞内ROS产生的影响进行研究。用活性氧检测试剂盒检测BV2细胞内ROS的生成。
在24孔荧光酶标板接种BV2细胞(1×105个细胞/孔)后置于培养箱中，待4h细胞贴壁更换培养基后，设置正常对照组(CT组)、LPS刺激组(0.5μg/mL LPS，MD组)、样品与LPS共处理组，每组3个复孔。往样品与LPS组里加入不同浓度的合成18肽作用12h后，除正常对照组外各组加入LPS(终浓度为0.5μg/mL)刺激，24h后，弃去旧培养基，加入DCFHDA使其终浓度为20μM，置于细胞培养箱内避光孵育25min，吸弃DCFHDA后用DMEM培养基清洗孔板三次直至细胞外部培养基不再显示绿色荧光，使用DM2000 LED倒置显微镜进行荧光拍照记录24孔板中DCF的荧光信号。结果如图19所示：BV2细胞经LPS刺激后，细胞内出现大量的绿色荧光，而加入18肽处理后BV2细胞内的绿色荧光均明显减弱，B V 2细胞内的绿色荧光接近C T组。
另外在96孔荧光酶标板接种BV2细胞(5×105个细胞/孔)后置于培养箱中，待4h细胞贴壁更换培养基后加药，设置正常对照组、LPS刺激组(0.5μg/mL LPS)、样品与LPS共处理组，每组5个复孔。往样品组里加入不同浓度的18肽作用12h后，除正常对照组外各组加入LPS(终浓度为0.5μg/mL)刺激，24h后，弃去旧培养基，每孔加入DCFH 20μL使其终浓度为20μM，培养箱中避光孵育25min后，用DMEM洗涤细胞3次，然后每孔加入用DMEM稀释好的Hoechst33342 50μL并孵育15min,吸弃Hoechst 33342后用DMEM洗涤细胞3次，使用酶标仪测量DCFH和Hoechst 33342的荧光信号强度。DCFH的激发波长和发射波长分别为485nm和535nm，Hoechst 33342的激发波长和发射波长分别为350nm和460nm。所测定得到的DCFH荧光值除以Hoechst 33342的荧光值比值即是BV2细胞产生ROS的含量。结果如图20所示：BV2细胞经LPS刺激后，ROS升高极显著；18肽处理后BV2内的ROS荧光值均显著低于模型组，显示18肽能显著抑制LPS激活的BV2细胞内ROS的生成(P<0.05)。
实施例5合成肽对NF-κB(P65)、P-P65、IκBα表达水平的影响
(1)细胞准备
将生长至80％丰度的BV2细胞接种于直径为6cm的培养皿中，每皿细胞数量为2.5×106/个，放置于CO2细胞培养箱中培养6h后，吸弃培养皿上清液后更换无血清的基础培养基，样品与LPS共处理组加入10μL三个不同浓度的18肽使其终浓度为0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL，置于CO2细胞培养箱中培养10h后，除正常对照组外各组加入10μL LPS使其终浓度为0.5μg/mL进行炎性活化，二氧化碳培养箱培养24h后，取出吸弃细胞培养皿上的细胞培养液，收集细胞。
(2)样品裂解
吸弃细胞培养上清液的培养皿每皿加入350μL裂解液，震荡器震荡10s，放冰里面20s，然后又震荡10s，再放冰面20s，反复4次后，12000r/min 4℃离心10min，取上清液测蛋白含量，然后用提前预冷的PBS将样品蛋白浓度调一致后置于-80℃保存备用。
(3)电泳前蛋白样品的准备
将已调整好蛋白浓度的样品按照4:1加入蛋白上样缓冲液，在水浴锅中沸水浴5min，使蛋白充分变性。
(4)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
将15％SDS-PAGE聚丙烯预制胶按照要求安装在电泳槽，加入适合体积的提前预冷电泳液，样品以20μg总蛋白为标准加入到预制胶的点样孔，其中第一个点样孔加入5μL的Marker。采用120V恒压电泳，时间约1.5h，观察到溴酚蓝离玻璃板还剩1cm的时候停止电泳。
(5)转膜
电泳结束后，取出预制胶玻璃板，根据marker所示，利用切胶板小心切下含目的条带的胶，置于预冷的转膜液中平衡约15min。根据胶的长度和宽度，准备比目的胶略大的PVDF膜。用WB膜活化液先活化PVDF膜大约15s后，转入预冷的转膜液中平衡5min，转膜所需的其他材料也同时在预冷转膜液中平衡5min以上。按黑色筛板-海绵-滤纸-凝胶-PVD膜-滤纸-海绵-白色筛板的顺序装好转膜夹，将气泡赶尽后装入电转槽中。倒入预冷电转液，插入电极，采用恒流250mA恒流转膜，根据分子量大小确定具体目标蛋白的转膜时间。
(6)蛋白质印迹
转膜结束后，将PVDF膜浸泡在封闭液中，于室温下在脱色摇床上缓慢摇2h封闭非特异蛋白的吸附。封闭完成后，将PDVF膜置于已稀释好的一抗(p-p65、p65、IκBα、actin兔源IgG单克隆抗体)溶液中，4℃孵育过夜。将一抗回收后，PDVF膜用WB洗膜液在脱色摇床上洗涤3次，每次10min。洗涤完成后加入已稀释好的二抗(山羊抗鼠IgG二抗)溶液，室温孵育2h，用WB洗膜液在脱色摇床上洗涤3次，每次10min。轻吸干表面水分后，准备拍照。
(7)电泳条带拍照
将事先配制好的化学发光液(按照说明书试剂A和试剂B按照1:1混合均匀)滴加于PDVF膜加上，采用电化学发光成像仪，按照仪器操作要求拍照成像，最后使用化学成像仪上自带的图片处理软件对WB结果进行灰度分析。
结果如图27、28所示：LPS刺激后的BV2细胞P65磷酸化水平显著性升高(P<0.05)，而IκBα的表达量下降，意味着LPS激活了IKK复合体，IκBα发生磷酸化使得IκBα降解增多，IκBα与NF-κB/P65发生解离并使P65发生活化；加入18肽处理后，BV2细胞内的P65磷酸化水平极显著降低(P<0.001)，并能抑制IκBα的降解，使得IκBα的含量显著升高，具有显著的抑制炎症的作用。
实施例6合成肽对D-gal诱导细胞衰老的改善作用
从-80℃冰箱取出SH-SY5Y细胞冻存管，迅速放入37℃温水中摇晃解冻，持续1min左右，至其完全融化。在无菌操作台上将细胞悬液移至15mL的离心管，并加入4mL完全培养基(DMEM/F-121:1培养基+15％胎牛血清+1％的青霉素/链霉素双抗)，1000r/min离心5min。吸弃上清液后用DMEM/F-12 1:1培养基洗细胞2次后加5～7mL完全培养基，轻轻混悬沉淀细胞，再将其移到细胞培养瓶，二氧化碳培养箱培养。培养条件：5％ CO2、95％空气，37℃饱和湿度。2天更换一次培养基，细胞密度长至约80％丰度时进行细胞传代或后续细胞实验。
以1×104/孔的数量将SH-SY5Y细胞铺板在96孔板中，同时设备空白对照孔(后期不加待测物干预)，每组5个复孔，置于CO2细胞培养箱中培养24h后，加入用完全培养基配制的不同浓度的待测物100μL，空白对照孔(CT组)加入100μL的完全培养基。待测物为D-gal(D-半乳糖，终浓度为25mM、50mM、100mM、200mM、400mM)、18肽(18肽的终浓度为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL)，细胞继续置于CO2细胞培养箱中培养48h，取出后加入CCK8试剂，再置于培养箱中培养2h。酶标仪450nm处测定OD值，以正常对照组吸光度的平均值为100％，计算出细胞活力，以此判断不同浓度的待测样品是否安全无毒害。
细胞存活率/％＝(Ai/A0)×100；其中：Ai表示加入待测物后OD值；A0表示正常对照组OD值。
结果如图21、22所示：不同浓度的18肽处理后，SH-SY5Y细胞活力与CT组相比均无显著性差异，对SH-SY5Y细胞没有毒副作用；而不同浓度的D-gal对SH-SY5Y细胞活力的影响结果显示200和400mM的D-gal会引起细胞存活率的显著降低，其中200mM的D-gal诱导后细胞存活率与CT组相比呈显著性降低(P＜0.05)，并且细胞数量相对较高，故选择200mM的D-gal进行诱导SH-SY5Y细胞建立细胞衰老模型。考察五个不同浓度(1.0，0.5，0.1，0.05，0.01μg/mL)的18肽对200mM的D-gal诱导老化后的SH-SY5Y细胞干预的有效浓度，结果如图23所示：518肽在5个浓度下均可以有效干预(抑制)D-gal诱导的老化，因此选择3个低浓度(0.1，0.05，0.01μg/mL)的样品进行后续实验。
将0.5mL细胞浓度为5×104/mL的SH-SY5Y细胞接种于24孔板中，设置空白对照组(CT组)、D-gal模型组(MD组)和D-gal+合成肽组，每组3个复孔，置于CO2细胞培养箱中培养24h后，吸弃培养板上清液后，D-gal模型组和D-gal+合成肽组均加入0.5mL用完全培养基配制的200mM D-gal，空白对照组更换同样体积的完全培养基，置于CO2细胞培养箱中继续培养48h后，D-gal+合成肽加入用完全培养基配制的三个不同浓度的18肽使其终浓度为0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL，干预48h后，取出吸弃细胞培养板上的细胞培养液，用DMEM/F-12 1:1培养基洗涤1次，按500μL/孔的体积加β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。吸出细胞固定液，加入DMEM/F-12 1:1培养基洗涤3次，每次3min；洗涤完成后每孔加入0.5mL染色工作液，用保鲜膜封住孔板后放置于空气摇床37℃孵育10-12h。取出使用DM2000 LED倒置显微镜观察，拍照，在光学显微镜下观察到的染成蓝色的细胞即为表达β-半乳糖苷酶的阳性细胞。结果如图24所示：利用D-gal诱导细胞衰老后细胞核固缩，胞浆出现空泡化，细胞间隙增大，染蓝色的SA-β-Gal阳性细胞明显增多，而利用18肽处理后，细胞形态结构与CT组接近，染蓝色的SA-β-Gal阳性细胞明显减少，说明18肽可有效干预(抑制)D-gal诱导的细胞衰老。
实施例7合成肽对ERK-CREB信号通路的影响
(1)细胞准备
将生长至80％丰度的SH-SY5Y细胞接种于直径为6cm的培养皿中，每皿细胞数量为2.5×106/个，放置于CO2培养箱中培养24h后，吸弃培养板上清后，D-gal模型组和D-gal+合成肽组均加入0.5mL用完全培养基配制的200mM D-gal，空白对照组更换同样体积的完全培养基，置于CO2细胞培养箱中继续培养48h，D-gal+合成肽组加入用完全培养基配制的三个不同浓度的18肽使其终浓度为0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL干预48h后，取出吸弃细胞培养板上的细胞培养液，准备收集细胞。
(2)样品裂解(3)电泳前蛋白样品的准备(4)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5)转膜
(2)、(3)、(4)、(5)方法同实施例5。
(6)蛋白质印迹
方法同实施例5，区别仅在于：一抗为p-CREB、CREB、p-ERK1/2、ERK1/2、BAX、BCL-2、actin兔源IgG单克隆抗体。
(7)电泳条带拍照
方法同实施例5。
结果如图25、26所示：经D-gal诱导衰老的SH-SY5Y细胞内的CREB和ERK的磷酸化水平呈现极显著下降，说明D-gal诱导细胞衰老后明显抑制了CREB和ERK的磷酸化，而添加18肽处理后，可显著改善D-gal诱导细胞衰老产生的CREB和ERK磷酸化抑制(P<0.05)。经D-gal诱导细胞衰老后，伴随着SH-SY5Y细胞内的CREB和ERK的磷酸化水平下降，细胞内的促凋亡因子BAX的表达量显著升高(P<0.05)，而抗凋亡因子BCL-2的表达量极显著下降(P<0.001)，BAX/BCL-2比值极显著升高，反映出D-gal诱导细胞衰老后导致部分SH-SY5Y细胞发生凋亡，即D-gal诱导细胞衰老抑制了ERK-CREB信号通路，并激活了凋亡通路。添加18肽处理后，可上调CREB、ERK及BCL-2的表达量(P<0.05)，提高CREB和ERK的磷酸化水平(P<0.05)，并下调BAX的表达量，表明18肽可激活ERK-CREB信号通路，并抑制凋亡信号通路，具有改善突触可塑性，提高神经细胞的增殖、分化和存活能力，从而可改善老年认知功障碍的功效作用。
综上所述，合成肽18肽通过抑制细胞内NO及ROS的生成，抑制NF-κB P65的磷酸化和IκB的降解，降低细胞内氧化应激及慢性增长性炎症；18肽通过激活ERK-CREB信号通路和抑制凋亡通路，促进神经细胞的增殖与分化，改善突触功能，干预细胞衰老，抑制凋亡，从而发挥神经细胞保护作用，进而改善衰老诱发的认知功能障碍。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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<211> 9
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 4
Leu Asp Val Asp Lys Leu Asn Ser Arg
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 5
Ile Glu Asp Tyr Glu Pro Asn Pro Arg
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 6
Leu Ser Lys Glu Glu Ile Glu Glu Ala Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 7
Lys Asp Thr Glu Glu Leu Glu Asn Ser Ile Ser Pro Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 8
Leu Gln Glu Lys Glu Glu Glu Phe Asp Asn Thr Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 9
Leu Ala Leu Glu Thr Thr Val Leu Val Glu Ser Tyr Thr Leu Pro Asp
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 10
Ile Ala Phe Ile Met Asp Glu Ser Asn Val Leu Asp Ser Gly Phe Leu
1 5 10 15
Glu Arg
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 11
Pro His Ser Val Met Asn Ala Leu Ser Ser Val Lys Glu Arg Ser Asn
1 5 10 15
Glu Leu Lys
<210> 12
<211> 22
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 12
His His Ile Phe Ile Gln Tyr Arg Thr Gly Asn Ile Ala Trp Asn Ala
1 5 10 15
Ser Asn Ala Phe Ala Gly
20
<210> 13
<211> 38
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 13
Gly Ile Leu Gly Tyr Thr Glu His Gln Val Val Ser Ser Asp Phe Asn
1 5 10 15
Ser Asp Thr His Ser Ser Thr Phe Asp Ala Gly Ala Gly Ile Ala Leu
20 25 30
Asn Asp His Phe Val Lys
35
<210> 14
<211> 62
<212> PRT
<213> ostrea gigas tnunb
<400> 14
Pro Ala Asn Ala Ala Val Asn Leu Ala Asp Thr Tyr Ser Asp Ile Ser
1 5 10 15
Pro Ala Ser Asn Ser Pro Asn Ser Gly Val Asn Leu Ala Lys Thr Tyr
20 25 30
Thr Ala Ile Ser Pro Pro Glu Ser Pro Val Asn Leu Ala Asn Arg Val
35 40 45
Asp Ile Gly Ser Gln Ala Glu Tyr Leu Thr Thr Asn Thr Asn
50 55 60

Claims (3)

1.十八肽在制备抗炎产品中的应用；
所述十八肽的氨基酸序列为：IAFIMDESNVLDSGFLER；
所述产品为药品或试剂。
2.编码十八肽的核酸分子在制备抗炎产品中的应用；
所述十八肽的氨基酸序列为：IAFIMDESNVLDSGFLER；
所述产品为药品或试剂。
3.包含编码十八肽的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞在制备抗炎产品中的应用；
所述十八肽的氨基酸序列为：IAFIMDESNVLDSGFLER；
所述产品为药品或试剂。
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