CN114369570A - 一种用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂及其应用，属于血细胞改造领域。所述的用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂，为在红细胞表面氨基催化下形成二氧化硅和/或二氧化钛的试剂。本发明所述屏蔽红细胞表面抗原的方法中矿化液与红细胞经生物矿化形成的二氧化硅或二氧化钛纳米屏蔽层给红细胞提供了保护环境，有效地降低了红细胞本身抗原与血液中抗体的结合，从而降低免疫原性，不影响红细胞体内循环时间。
Description
技术领域
本发明涉及血细胞改造领域，具体而言，涉及一种用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂及其应用。
背景技术
现代医学，输血是重要的医疗手段。然而与其相关的血液制品却面临着一些问题，如：血液资源不足且分配不均衡；血液制品具有病毒感染的风险；存在异型血型输血限制。开发人造血是解决以上限制的有效策略。实际上，现今谈论的人造血远不能达到全血替代的作用，而是从运输氧气的载体——红细胞入手，对其进行替代。通常，人们把血型简单划分为A型、B型、AB型或O型。这种ABO血型系统，实际上是依据红细胞表面的抗原对血型进行划分。此外，红细胞表面的抗原远不止以上几种。随着对血液的持续研究，截至2016年，科学家已经发现了346种红细胞抗原和与之相对应的36种血型系统。那么输血的关键在于血型匹配，一旦血型不匹配，将会引起严重的免疫反应，威胁人体生命。血型匹配的实质是使红细胞表面抗原不与受血者体内抗体发生反应，屏蔽红细胞表面抗原是消除血型限制即实现“万能血”的有效方式。目前有三种技术手段：(1)采用化学屏蔽法在红细胞表面叠加屏蔽层，掩盖抗原表位；(2)使用生物酶降解或转换红细胞表面的抗原表位；(3)通过基因编辑对原始红细胞进行改造。以上三种方法各有利弊，其中化学屏蔽法更为简便、快捷，适用于大规模制备“万能血”，应对各种急性输血、手术中输血、器官灌注、器官移植等。
目前，化学屏蔽法是实现“万能血”的手段之一，采用化学屏蔽法制备“万能血”所采用的化学物质和技术手段不尽相同，各有优缺点。比如Huang等(ACSAppl.Mater.Interfaces 2020,12,22426-22432)采用表位印迹法，制备了与红细胞血抗原具有高度亲和性的分子印迹纳米凝胶(MIgel)，以此屏蔽红细胞表面抗原，避免血型错配引起红细胞凝集，经修饰的红细胞在体外能维持其基本结构和生理功能，具有缓解血液供应不足现状的应用潜力。
Christian Grandfils等(Biomacromolecules 2012,13,1172-1180)通过阳离子聚合物2-二甲基丙烯酸乙酯在带负电荷的红细胞细胞膜上静电自组装形成抗原屏蔽层，考察了聚合物分子量及其聚乙二醇共聚物结构对红细胞生物功能和抗原屏蔽能力的影响，可以实现抗原表位的部分遮掩。
Ruikang Tang等(Chem.Sci.,2014,5,3463–3468)利用聚多巴胺来保护红细胞上的抗原表位，体外和体内研究证实，该方法可以防止凝血反应，而不影响红细胞的结构、功能和活力等，有望应用于输血实践。
屏蔽层材料的性质和结构特征是影响“万能血”效果的关键因素，但是现有的技术中屏蔽层材料主要采用聚多巴胺、2-二甲基丙烯酸乙酯、金属有机框架纳米粒子等，生物相容性欠佳，效果不理想，红细胞表面抗原屏蔽效果有限，会引起一定的免疫、溶血反应等，导致现有技术仍存在红细胞表面抗原无法完全屏蔽以及红细胞生理功能无法充分保留的缺陷，因此开发新的技术路线制备能够屏蔽表面抗原的红细胞意义重大。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂，以实现红细胞表面抗原屏蔽而制备交叉输血无免疫反应的红细胞。
本发明的第二个目的在于提供上述用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂在屏蔽红细胞表面抗原中的应用。硅基类或钛基改性矿化试剂水解形成硅羟基或钛羟基，在红细胞表面氨基催化下发生缩合反应，产生二氧化硅或二氧化钛，在单个红细胞表面形成抗原屏蔽层，达到对红细胞表面抗原屏蔽，降低免疫原性，同时保留红细胞原本的生物结构和生理活性，消除交叉配血限制的目的，实现不同血型之间交叉输血无排斥反应的目标。
本发明的最后一个目的在于提供一种屏蔽红细胞表面抗原的方法。本发明所述的屏蔽红细胞表面抗原的方法具有血液原料来源广、生物安全性高、低成本规模化制备等特点，从而极大缓解现有血液制品供应不足和费用高昂等问题。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
一种用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂，为在红细胞表面氨基催化下形成二氧化硅和/或二氧化肽的试剂。
所述的在红细胞表面氨基催化下形成二氧化硅的试剂优选包括但不限于甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯(TEOS)、四甲氧基硅烷(TMOS)、双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、氯三乙氧基硅烷(TECS)、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷中的至少一种；更优选为正硅酸四乙酯(TEOS)、四甲氧基硅烷(TMOS)和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中的至少一种。
所述的在红细胞表面氨基催化下形成二氧化肽的试剂优选包括但不限于四异丙基钛酸酯、钛酸甲酯、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯和钛酸四丙酯中的至少一种；更优选为钛酸四乙酯、钛酸四丁酯和钛酸四丙酯中的至少一种。
上述用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂在屏蔽红细胞表面抗原中的应用。
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂与生理盐水混合，制成矿化液；
(2)将矿化液与红细胞共孵育，离心，洗涤，得到矿化后的红细胞；
(3)将矿化后的红细胞分散，即得屏蔽表面抗原的红细胞。
步骤(1)中，所述的生理盐水为0.9％NaCl水溶液。
步骤(1)中，所述的矿化液中，用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂的浓度优选为2～100mM；进一步优选为3～50mM；更进一步优选为5～10mM。
步骤(2)中所述的红细胞优选为血液中的红细胞；进一步优选为人或哺乳动物血液中的红细胞；更优选为人、小鼠、大鼠、新西兰兔或猪的血液中的红细胞。
步骤(2)中所述的红细胞可以通过购买得到，也可以通过如下方法制备得到：将血液离心分离纯化，去除白细胞、血小板及血浆成分，洗涤，即得。
步骤(2)中所述的矿化液与红细胞优选按体积比1:100～1000计算；更优选按体积比1:200～500计算。
步骤(2)中所述的红细胞的数量优选为0.5×109～1.5×109个/mL；更优选为1×109个/mL。
步骤(2)中，所述的共孵育的温度优选为4～37℃；更优选为4℃。
步骤(2)中，所述的共孵育的时间优选为10～1440min；进一步优选为15～720min；更进一步优选为30～240min；更优选为1～2h。
步骤(2)中，所述的共孵育的pH优选为2～7；进一步优选为3～5；更优选为4～5。
在上述共孵育条件下矿化液中的用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂经生物矿化在红细胞表面形成二氧化硅或二氧化钛纳米层。
步骤(2)中，所述的离心的条件优选为：3000rpm离心5～30min；更优选为：3000rpm离心10～15min。
步骤(2)中，所述的洗涤的试剂优选为0.9％NaCl水溶液或磷酸缓冲液；更优选为10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液。
步骤(3)中所述的分散的试剂优选为磷酸缓冲液；更优选为10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂经生物矿化能够在红细胞表面形成二氧化硅或二氧化钛纳米层，该纳米层具有屏蔽红细胞表面的抗原作用。而且，形成的二氧化硅或二氧化钛纳米粒子具有尺寸和形状高度可控、毒性低、生物相容性好、生理条件稳定和生物安全性高等优点，适用于临床应用。
(2)本发明的红细胞经矿化前后微观形貌无显著差异，其生理功能未受影响，与普通红细胞水平一致；代谢物2,3-DPG含量大于90％、ATP含量大于95％。
(3)本发明所述屏蔽红细胞表面抗原的方法中矿化液与红细胞经生物矿化形成的二氧化硅或二氧化钛纳米屏蔽层给红细胞提供了保护环境，有效地降低了红细胞本身抗原与血液中抗体的结合，从而降低免疫原性，不影响红细胞体内循环时间。
(4)本发明所采取的方法操作简单，可重复性好，无需贵重仪器设备，经济效益高。
附图说明
图1为实施例1红细胞血型为A型的人红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞的扫描电镜图；其中，(a)为实施例1红细胞血型为A型的人红细胞的扫描电镜结果图；(b)为实施例1红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞的扫描电镜结果图。
图2为人红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞凝集反应光学显微镜图；其中，(a)为血清抗体A试剂与红细胞血型为A型的人红细胞的凝集反应结果图；(b)为抗体B试剂与红细胞血型为B型的人红细胞的凝集反应结果图；(c)为抗体Rh+试剂与红细胞血型为Rh+型的人红细胞的凝集反应结果图；(d)为血清抗体A试剂与红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞的凝集反应结果图；(e)为抗体B试剂与红细胞血型为B型的屏蔽表面抗原的红细胞的凝集反应结果图；(f)为抗体Rh+试剂与红细胞血型为Rh+型的屏蔽表面抗原的红细胞的凝集反应结果图。
图3为实施例2的小鼠红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞回输进Babl/c小鼠体内后的荧光检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将TMOS与0.9％NaCl水溶液混合，作为矿化液，其中矿化液中TMOS的浓度为10mM；
(2)将1×109个/mL的人红细胞(红细胞血型分别为A型、B型、Rh+型)悬液与步骤(1)的矿化液按体积比(mL:mL)1:200于4℃、pH＝4条件下共孵育2h，3000rpm离心10min并用10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤，去除残留液体，得到矿化后的红细胞；其中，1×109个/mL的人红细胞悬液的制备方法为：将人血液经梯度离心(先于3000rpm离心15min，再于3000rpm离心10min)分离纯化，去除白细胞，血小板和血浆成分，之后用10mM、pH＝7.4PBS缓冲液反复洗涤，得到1×109个/mL的人红细胞悬液；
(3)将矿化后的红细胞分散在10mM、pH＝7.4磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞(红细胞血型分别为A型、B型、Rh+型)。置于4℃保存。
实施例2：
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将TEOS与0.9％NaCl水溶液混合，作为矿化液，其中矿化液中TEOS的浓度为5mM；
(2)将1×109个/mL的Babl/c小鼠红细胞悬液与步骤(1)的矿化液按体积比(mL:mL)1:400于4℃、pH＝5条件下共孵育2h，3000rpm离心15min并用10mM、pH＝7.4磷酸缓冲液洗涤，去除残留液体，得到矿化后的红细胞；其中，1×109个/mL的小鼠红细胞悬液的制备方法为：将小鼠(购于华南理工大学实验动物中心)血液经梯度离心(先于3000rpm离心15min，再于3000rpm离心10min)分离纯化，去除白细胞，血小板和血浆成分，之后用10mM PBS、pH＝7.4缓冲液反复洗涤，得到1×109个/mL的小鼠红细胞悬液；
(3)将矿化后的红细胞分散在10mM、pH＝7.4磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞。置于4℃保存。
实施例3：
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将钛酸四乙酯与0.9％NaCl水溶液混合，作为矿化液，其中矿化液中钛酸四乙酯的浓度为5mM；
(2)将1×109个/mL的新西兰兔红细胞悬液与步骤(1)的矿化液按体积比(mL:mL)1:500于4℃、pH＝4.5条件下共孵育1h，3000rpm离心10min并用10mM、pH＝7.4磷酸缓冲液洗涤，去除残留液体，得到矿化后的红细胞；其中，1×109个/mL的新西兰兔红细胞悬液的制备方法为：将新西兰兔(购于华南理工大学实验动物中心)血液经梯度离心(先于3000rpm离心15min，再于3000rpm离心10min)分离纯化，去除白细胞，血小板和血浆成分，之后用10mM、pH＝7.4PBS缓冲液反复洗涤，得到1×109个/mL的新西兰兔红细胞悬液；
(3)将矿化后的红细胞分散在10mM、pH＝7.4磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞，置于4℃保存。
对比例1：无矿化试剂的对比例
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液与0.9％NaCl水溶液按体积比(mL:mL)1:200于4℃、pH＝4条件下共孵育2h，3000rpm离心10min并用10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤，得到洗涤后的红细胞；其中，1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液的制备方法同实施例1；
(2)洗涤后的红细胞分散在磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞。置于4℃保存。
对比例2：未洗涤完全矿化液的对比例
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将TMOS与0.9％NaCl水溶液混合，作为矿化液，其中矿化液中TMOS的浓度为10mM；
(2)将1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液与步骤(1)的矿化液按体积比(mL:mL)1:200于4℃、pH＝4条件下共孵育2h，得到矿化后的红细胞孵育液；其中，1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液的制备方法同实施例1；
(3)将矿化后的红细胞孵育液分散在磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞。置于4℃保存。
对比例3：共孵育条件的对比例
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将TMOS与0.9％NaCl水溶液混合，作为矿化液，其中矿化液中TMOS的浓度为10mM；
(2)将1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液与步骤(1)的矿化液按体积比(mL:mL)1:200于45℃、pH＝4条件下共孵育2h，3000rpm离心10min并用10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤，去除残留液体，得到矿化后的红细胞；其中，1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液的制备方法同实施例1；
(3)将矿化后的红细胞分散在磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞。置于4℃保存。
对比例4：共孵育条件的对比例
一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，包括如下步骤：
(1)将TMOS与0.9％NaCl水溶液混合，作为矿化液，其中矿化液中TMOS的浓度为10mM；
(2)将1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液与步骤(1)的矿化液按体积比(mL:mL)1:200于0℃、pH＝4条件下共孵育2h，3000rpm离心10min并用10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液洗涤，去除残留液体，得到矿化后的红细胞；其中，1×109个/mL血型为A型的人红细胞悬液的制备方法同实施例1；
(3)将矿化后的红细胞分散在磷酸缓冲液中，即得屏蔽表面抗原的红细胞。置于4℃保存。
性能测试：
1)对实施例1的人红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞进行扫描电镜观察。
将实施例1红细胞血型为A型的人红细胞和红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞用无水乙醇逐级脱水，最后分散在无水乙醇中滴在铝箔纸上干燥，使用扫描电子显微镜观察细胞形貌。
结果如图1所示。从图1看出：实施例1红细胞血型为A型的的人红细胞表面光滑双凹型明显，红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞能够保持红细胞的双凹型但其表面粗糙，可观察到明显的二氧化硅附着层。
2)对实施例1中红细胞血型分别为A型、B型、Rh+型的人红细胞、红细胞血型分别为A型、B型、Rh+型的屏蔽表面抗原的红细胞分别与血清抗体(血清抗体A试剂、抗体B试剂、抗体Rh+试剂)进行凝集反应实验，具体操作如下：将血清抗体A试剂(即抗A抗B血型定型试剂(单克隆抗体)，购于上海桥星贸易有限公司)、抗体B试剂(即抗A抗B血型定型试剂(单克隆抗体)，购于上海桥星贸易有限公司)、抗体Rh+试剂(即RhD血型定型试剂(单克隆抗体IgM)，购于苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司)分别加入同血型的人红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞中，按体积比1:1混匀，静置20min，然后光学显微镜下观察凝集反应。
结果如图2所示，从图2可以看出：血清抗体A试剂与红细胞血型为A型的人红细胞发生了明显的凝集反应，抗体B试剂与红细胞血型为B型的人红细胞发生了明显的凝集反应，抗体Rh+试剂与红细胞血型为Rh+型的人红细胞发生了明显的凝集反应；而血清抗体A试剂与红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞未发生明显的凝集反应，抗体B试剂与红细胞血型为B型的屏蔽表面抗原的红细胞未发生明显的凝集反应，抗体Rh试剂与红细胞血型为Rh+型的屏蔽表面抗原的红细胞未发生明显的凝集反应。说明经本发明屏蔽红细胞表面抗原的方法处理后，得到的屏蔽表面抗原的红细胞具有良好的抗原屏蔽效果。
3)分别对实施例2的小鼠红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞用细胞膜染色试剂DIR进行染色，然后以1×108个/150μL红细胞的量回输进Babl/c小鼠体内，每三天通过尾静脉抽取20μL血液，使用荧光分光光度计进行体内循环检测。
结果如图3所示，从图3可以看出，实施例2的小鼠红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞在体内循环时长基本一致，表明屏蔽表面抗原的红细胞具有和正常红细胞一样的体内循环周期及运输氧气的能力。
红细胞膜弹性脆性实验：
实验原理：溶血率测试，将保存后的红细胞在3000rpm条件下，离心5min，以酶标仪测吸光度(540nm)。用公式：
来计算保存血样的溶血率。
实验步骤如下：
取13个管进行编号，用超纯水配制共13个不同浓度的NaCl溶液各2mL，其中NaCl溶液中NaCl的质量浓度分别为0％，0.1％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.45％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，每管各加入实施例1红细胞血型为A型的人红细胞和红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞1×107个，静置1h，取上清液，用酶标仪测定其540nm处的吸光值，以红细胞中血红蛋白释放量为评价指标。
结果发现，红细胞血型为A型的人红细胞和红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞的细胞膜弹性及脆性无显著差异。
4)分别向1×107个实施例1的红细胞血型为A型的人红细胞、实施例1红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4的屏蔽表面抗原的红细胞中加入2mL不同质量浓度的氯化钠溶液(0％，0.1％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.45％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％)，用酶标仪在450nm测定不同浓度的氯化钠溶液处理后屏蔽表面抗原的红细胞的溶血率。
表1：实施例1的红细胞血型为A型的人红细胞、实施例1红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4的屏蔽表面抗原的红细胞经不同浓度氯化钠溶液处理后红细胞的溶血率
结果如表1所示，从表1可以看出：对比例2-3的屏蔽表面抗原的红细胞经低浓度(0％～0.9％)氯化钠溶液处理后，屏蔽表面抗原的红细胞的溶血率明显上升，红细胞膜脆性明显增加，细胞弹性减弱，而实施例1的红细胞血型为A型的人红细胞、实施例1红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3的屏蔽表面抗原的红细胞经过本发明所述屏蔽红细胞表面抗原的方法处理后得到的屏蔽表面抗原的红细胞在不同浓度(0％～0.9％)氯化钠溶液中的溶血率基本一致，表明矿化试剂处理前后红细胞的细胞膜弹性没有受到影响。
5)用酶标仪测定实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞中的2,3-DPG含量。2,3-DPG与脱氧血红蛋白结合，使脱氧血红蛋白的空间构象稳定，从而降低血红蛋白对O2的亲合力，促使O2和血红蛋白解离，是行使红细胞功能的关键物质。
红细胞2,3-DPG含量检测：
使用2,3-DPG ElISA试剂盒(购于上海拜力科技有限公司)按照其说明书进行检测，实验原理：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗2,3-DPG抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗2,3-DPG抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的2,3-DPG呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
操作步骤如下：
(1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μL，标准孔加标准品共六个浓度：3200nmol/L、1600nmol/L、800nmol/L、400nmol/L、200nmol/L、0nmol/L各50μL，待测样品孔先加样品稀释液40μL再分别加入样品：实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞悬液，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
(2)加酶：每孔加入酶标试剂100μL，除空白孔；
(3)温育：封板膜封板后置37℃温育60min；
(4)洗涤：弃去孔内液体甩干，用洗涤液400μL/每孔，洗板3次，静置30s弃去，如此重复五次，甩干；
(5)显色：每孔加检测溶液A 50μL，再加入检测液B 50μL，酶标板避光37℃反应15min；
(6)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；
(7)测定：用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，以标准物的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，其线性回归方程为y＝0.0005x+0.1343，R2＝0.9922，其结果如表2所示。
结果如表2所示。
表2：实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞中的2,3-DPG含量
实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞与未处理的人红细胞、实施例2得到的屏蔽表面抗原的红细胞与未处理的小鼠红细胞，和实施例3得到的屏蔽表面抗原的红细胞与未处理的新西兰兔红细胞中的2,3-DPG含量并没有显著差别，均大于95％，说明矿化作用对红细胞中2,3-DPG含量并无显著影响。对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞与未经处理的人红细胞相比，对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞中2,3-DPG含量显著下降，均小于50％，说明对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞均受到不同程度的损伤，不能维持脱氧血红蛋白构象，不能够正常行使运输氧气的功能。
6)用酶标仪测定实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞中的ATP含量。
红细胞ATP含量检测：
1.样品准备：
96孔板、红细胞100μL、实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞悬液各100μL，10mM、pH＝7.4PBS缓冲液。
2.检测试剂的准备
a.室温融解冻存的CellTiter-LumiTM发光法检测试剂(来源于CellTiter-LumiTM发光法细胞活力检测试剂盒，购于上海雅吉生物科技有限公司)。
b.按照96孔板每孔100μL的量，取适量CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，平衡至室温；
3.细胞活力检测：
a.使用96孔板进行检测，每孔分别加入红细胞100μL、屏蔽表面抗原的红细胞100μL，同时设置10mM、pH＝7.4PBS缓冲液作为阴性对照。
b.96孔板每孔加入100μL CellTiter-LumiTM发光法检测试剂；
c.室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解；
d.室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定；
e.使用酶标仪进行化学发光检测，设置每孔的检测时间为1秒；
f.根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞的相对活力。其结果如表3所示。
表3：实施例1的红细胞血型为A型的屏蔽表面抗原的红细胞、实施例2-3和对比例1-4得到的屏蔽表面抗原的红细胞及其对应的未处理的红细胞中ATP含量
ATP含量对于维持红细胞膜的双凹形状至关重要，结果如表3所示。实施例1中血型为A型的未处理的人红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞，实施例2中未处理的小鼠红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞，实施例3中未处理的兔红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞中的ATP含量相比并没有显著变化，均大于99％，说明矿化液处理红细胞后不改变红细胞基本结构，能正常行使细胞功能；对比例2-4中未处理的人红细胞和屏蔽表面抗原的红细胞中的ATP含量均显著小于50％，说明对比例得到的屏蔽表面抗原的红细胞不能维持红细胞基本的双凹型，不能够正常行使红细胞运输氧气及形变的功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂，其特征在于，为在红细胞表面氨基催化下形成二氧化硅和/或二氧化肽的试剂。
2.根据权利要求1所述的用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂，其特征在于，所述的在红细胞表面氨基催化下形成二氧化硅的试剂包括但不限于甲基三甲氧基硅烷、甲基二乙氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、正硅酸四乙酯、四甲氧基硅烷、双(三甲基硅烷基)乙酰胺、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-巯丙基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、氯三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、环己基甲基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷、三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷中的至少一种；
所述的在红细胞表面氨基催化下形成二氧化肽的试剂包括但不限于四异丙基钛酸酯、钛酸甲酯、钛酸四乙酯、钛酸四丁酯和钛酸四丙酯中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂，其特征在于，所述的在红细胞表面氨基催化下形成二氧化硅的试剂为正硅酸四乙酯、四甲氧基硅烷和3-氨基丙基三乙氧基硅烷中的至少一种；
所述的在红细胞表面氨基催化下形成二氧化肽的试剂为钛酸四乙酯、钛酸四丁酯和钛酸四丙酯中的至少一种。
4.权利要求1～3任一所述的用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂在屏蔽红细胞表面抗原中的应用。
5.一种屏蔽红细胞表面抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂与生理盐水混合，制成矿化液；
(2)将矿化液与红细胞共孵育，离心，洗涤，得到矿化后的红细胞；
(3)将矿化后的红细胞分散，即得屏蔽表面抗原的红细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述的共孵育的温度为4～37℃；
步骤(2)中，所述的洗涤的试剂为0.9％NaCl水溶液或磷酸缓冲液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述的共孵育的温度为4℃；
所述的洗涤的试剂为10mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的矿化液与红细胞按体积比1:100～1000计算。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤(2)中，所述的共孵育的时间为10～1440min；
步骤(2)中，所述的共孵育的pH为2～7。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的矿化液中，用于屏蔽红细胞表面抗原的矿化试剂的浓度为2～100mM；
步骤(2)中所述的红细胞为血液中的红细胞；
步骤(2)中，所述的离心的条件为：3000rpm离心5～30min；
步骤(3)中所述的分散的试剂为磷酸缓冲液。
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