CN114349880A - 一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及绿茶加工领域，尤其涉及一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用，包括如下制备方法：取干燥的崂山绿茶茶叶，在最佳提取条件下进行水提醇沉、减压浓缩得到崂山绿茶粗多糖；将崂山绿茶粗多糖溶于水后，依次进行脱色、脱蛋白、透析、减压浓缩等步骤得到崂山绿茶精制多糖；将崂山绿茶精制多糖进行第一柱层析分离，以蒸馏水和NaCl溶液作为流动相进行洗脱，得到产物GTPS3；取GTPS3进行第二柱层析分离，以NH4HCO3作为流动相进行洗脱，得到新型果胶多糖GTPS3‑1。借此，本发明可以在崂山绿茶中提取出无毒无害，能够抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用的果胶多糖。

Description

一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及绿茶加工领域，尤其涉及一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用。
背景技术
茶叶为山茶科植物的芽叶，茶叶具有清凉，解毒，止渴，利尿，消疲提神，消脂去腻，清心怡神，延年益寿等药理功效。随着医药科技的进步，对茶叶成分的药用价值进行了深入的研究，发现茶叶中约含500多种成分，具有药用价值的有250多种。茶多糖就是从茶叶中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的多糖复合物，是茶叶中继茶多酚之后发现的又一重要的生理活性物质。自1986年日本报道了茶叶多糖具有降血糖作用以来，陆续发现茶叶多糖抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节等多种生物活性，从而使茶多糖的研究开发成为了当前研究的热点。崂山绿茶就是山茶科植物中的一种。
炎症作为免疫系统的第一防御反应，是抵抗损伤、感染和压力的天然防御机制，具有保护和修复受损组织的能力。但是，过度的炎症反应会增加患心血管疾病、肝炎和癌症的风险。比如，2019年新冠病毒发生时，引起患者器官衰竭甚至死亡的重要原因就是过度的炎症反应，即“细胞因子风暴”。相比于副作用高发的化学药物，茶多糖这种无毒且高效的天然产物是作为抗炎药物的更好选择。
目前，在绿茶中提取果胶多糖的方法，大多制备方法简便粗糙，且提取出的果胶多糖抗炎效果差。
如何才能在崂山绿茶中提取出具有高效抗炎效果的果胶多糖，成为一个需要突破的技术问题。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用，其可以在崂山绿茶中提取出无毒无害，能够抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用的果胶多糖。
为了实现上述目的，本发明提供一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用，所述新型果胶多糖结构如下所示：
Figure BDA0003504092210000021
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，包括如下步骤：
A、取干燥的崂山绿茶茶叶，在预定提取条件下进行水提醇沉、减压浓缩得到崂山绿茶粗多糖；
B、将所述崂山绿茶粗多糖溶于水后，依次进行脱色、脱蛋白、透析、减压浓缩得到崂山绿茶精制多糖；
C、将所述崂山绿茶精制多糖进行第一柱层析分离，以蒸馏水和NaCl溶液作为流动相进行洗脱，得到产物GTPS3；
D、取所述GTPS3进行第二柱层析分离，以NH4HCO3作为流动相进行洗脱，得到新型果胶多糖GTPS3-1。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，所述预定提取条件为：液料比10:1-20:1mL/g、提取时间2.2-2.8h、提取温度90-95℃。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，所述第一柱层析分离的层析柱为DEAE Sepharose Fast Flow column(10cm×9cm)。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，所述第一柱层析分离的洗脱速度为4-6mL/min、10mL/管。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，所述第二柱层析分离的层析柱为Sephacryl S-300 column(2.5cm×90cm)。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，所述NH4HCO3的浓度为0.1-0.2mol/L。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，所述第二柱层析分离的洗脱速度为0.4-0.6mL/min、5mL/管。
根据本发明的从崂山绿茶中提取果胶多糖的方法及应用，应用于细胞炎症损伤保护。
本发明的目的在于提供一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用，在崂山绿茶中提取崂山绿茶粗多糖，将崂山绿茶粗多糖精制后再进行两步柱层析分离，得到纯化的GTPS3-1；GTPS3-1不仅无毒无害，还可以抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用。综上所述，本发明的有益效果是：可以在崂山绿茶中提取出无毒无害，能够抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用的果胶多糖。。
附图说明
图1为液料比与提取时间交互作用对崂山绿茶粗多糖含量影响的响应面图；
图2为液料比与提取温度交互作用对崂山绿茶粗多糖含量影响的响应面图；
图3为提取时间与提取温度交互作用对崂山绿茶粗多糖含量影响的响应面图；
图4为液料比与提取时间交互作用对崂山绿茶粗多糖含量影响的等高线图；
图5为液料比与提取温度交互作用对崂山绿茶粗多糖含量影响的等高线图；
图6为提取时间与提取温度交互作用对崂山绿茶粗多糖含量影响的等高线图；
图7为GTPS3-1的DEAE Sepharose Fast Flow column洗脱图；
图8为GTPS3-1的Sephacryl S-300 column洗脱图；
图9为GTPS3-1的分子量标准曲线；
图10为GTPS3-1的紫外谱图；
图11为GTPS3-1的红外谱图；
图12为GTPS3-1的1H-NMR谱图；
图13为GTPS3-1的13C-NMR谱图；
图14为GTPS3-1的核磁共振COSY谱图；
图15为GTPS3-1的核磁共振HMQC谱图；
图16为GTPS3-1的核磁共振HMBC谱图；
图17为GTPS3-1的三螺旋构象分析；
图18为GTPS3-1的扫描电镜图像；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖，新型果胶多糖(简称为GTPS3-1)含有不同组分的半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)和阿拉伯糖(Ara)，具有高效的抗炎效果，其结构如下：
Figure BDA0003504092210000051
本发明还提供一种制备上述新型果胶多糖GTPS3-1的方法，包括如下实验步骤：
一、可行性实验
步骤一单因素实验
将干茶叶0.8-1.5g与蒸馏水以液料比10:1-30:1mL/g的范围混合，加热至55-95℃，搅拌1-3h。在8400-8500rpm下离心15-25min以收集上清液，将沉淀与蒸馏水混合以重复上述操作1-5次，得到崂山绿茶粗多糖。
选取液料比范围10:1-20:1、提取时间范围2-3h、提取温度范围75-95℃进入响应面实验。
步骤二响应面实验
参见图1-3，在单因素实验的基础上，以崂山绿茶粗多糖含量为响应值，使用响应面优化，得到三因素三水平的优化模型(参见表1)。对响应面实验设计的数据(参见表2)进行拟合，得二次多项回归模型方程为：
Y＝27.99-0.72A+2.02B+3.77C-1.94AB+1.16AC-3.07BC-0.96A2-2.22B2-1.62C2
参见表3，模型极显著(P<0.0001)，失拟项不显著(P＝0.5937>0.05)，说明模型建立成功，可用该模型对真实情况进行预测。R2、R2 adj.、响应值的变异系数CV为2.91％，说明该实验操作可信度高。时间(B)、温度(C)对崂山绿茶粗多糖含量影响极显著，液料比(A)对粗多糖含量影响显著。AB、BC的交互作用极显著，AC的交互作用显著。BC的响应面最陡，其对应的等高线图(参见图4-6)的椭圆形扁平程度也最大，说明BC的交互作用最明显。其次是AB，最后是AC。
通过响应面设计得到水提崂山绿茶粗多糖的最佳参数范围为：液料比10:1-20:1mL/g、提取时间2.2-2.8h、提取温度90-95℃，多糖含量预测值为28-35％。为了实验的可操作性，以液料比12:1-16:1mL/g、提取时间2.3-2.7h、提取温度92-95℃条件进行3-5次验证实验，崂山绿茶多糖平均多糖含量为30.7±0.36％，说明优化的提取工艺具有可行性，适用于崂山绿茶粗多糖的提取。
表1响应面的实验因素与水平
Figure BDA0003504092210000061
表2响应面实验设计与结果
Figure BDA0003504092210000062
Figure BDA0003504092210000071
表3二次模型的方差分析
Figure BDA0003504092210000072
二、提取实验
步骤一崂山绿茶粗多糖的提取
取干燥的崂山绿茶茶叶480-520g，根据最佳提取条件(通过响应面设计得到的水提崂山绿茶粗多糖的最佳条件，即液料比10:1-20:1mL/g、提取时间2.2-2.8h、提取温度90-95℃)水提醇沉后，减压浓缩得到崂山绿茶粗多糖22-26g。
步骤二崂山绿茶粗多糖的精制
将步骤一中所得的崂山绿茶粗多糖溶于水后，依次进行脱色、脱蛋白、透析、减压浓缩得到崂山绿茶精制多糖。由于多糖化合物的脱色、脱蛋白、透析、减压浓缩等过程为现有技术，例如公开号为CN111560081A的专利中详细介绍了牛蒡茶多糖的提取及纯化方法中水提醇沉、脱蛋白等过程，因此，多糖化合物的脱色、脱蛋白、透析、减压浓缩为现有技术，本发明不再赘述。
参见图7，将精制多糖上样于DEAE Sepharose Fast Flow column(10cm×9cm)，依次以蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L)作为流动相进行洗脱，以4-6mL/min、10mL/管的速度进行洗脱得到六个组分，其中0.3mol/L NaCl洗脱组分含量较多且峰型单一对称记为GTPS3，进行下一步纯化。
参见图8，取上述GTPS3，上样于Sephacryl S-300 column(2.5cm×90cm)，以0.1-0.2mol/L NH4HCO3作为流动相进行洗脱，以0.4-0.6mL/min、5mL/管的速度进行洗脱，得到峰型单一且对称的组分记为GTPS3-1(以下简称GTPS3-1)。
上述10cm×9cm、2.5cm×90cm均表示层析柱DEAE Sepharose Fast Flow column、Sephacryl S-300 column的规格(直径×填料高度)。
为了验证本发明制备的GTPS3-1的理化表征，本发明对多糖GTPS3-1的结构进行鉴定，对甲基化产物进行分析，对核磁共振谱以及形态特征进行分析。
三、理化表征
1、干燥的GTPS3-1中包含74-75％的糖、51-52％的糖醛酸和0.3-0.5％的蛋白，可以初步推断GTPS3-1为酸性多糖。
100μLGTPS3-1水溶液(4.8-5.2mg/mL)上样于Shodex OHpak SB-804 HQ，以Na2SO4溶液(0.1mol/L)作为流动相，经HPGPC检测在12.757min时出现一个对称的单峰，参见图9，根据标准曲线Y＝-0.4194X+9.7661，R2＝0.9995，计算出GTPS3-1的分子量是26.05KDa(参见表4)，可以进一步推断出GTPS3-1为均一的酸性多糖。
5mg干燥的GTPS3-1经过TFA水解、PMP衍生化后上样于Diamonsil C18 column，以磷酸盐缓冲液和乙腈(83:17，v/v)作为流动相，经HPLC检测发现四种单糖(参见表5)：半乳糖醛酸(47.66％)、半乳糖(25.25％)、鼠李糖(16.99％)和阿拉伯糖(10.10％)。在果胶多糖结构中，半乳糖醛酸和鼠李糖构成HG和RG-1的主链，含量较高的半乳糖和少量的阿拉伯糖组成阿拉伯半乳聚糖(I和/或II型)侧链，因此，可以推断GTPS3-1为均一的果胶型多糖。
2、结构鉴定
参见图10，紫外-可见光谱(200-400nm)中在260nm和280nm处未见明显吸收峰，说明GTPS3-1没有蛋白和核酸。
参见图11，红外光谱(4000-400cm-1)中，在3450cm-1处有一个强而大的吸收峰，说明发生了“O–H”(氢氧键)伸缩振动，“C–H”(碳氢键)的弯曲振动发生在2930cm-1处；在1741cm-1、1643cm-1和1442cm-1处有特征吸收峰，说明GTPS3-1中有糖醛酸的存在；在1103cm-1和1020cm-1处有吸收峰，说明GTPS3-1中含有吡喃环。
3、甲基化分析(参见表6)
GTPS3-1中含有11种甲基化产物分别是2，3，4-Me3-Galp，3，4-Me2-Rhap，2-Me-Araf，2，4-Me2-Rhap，2，3，4，6-Me4-Galp，2，6-Me2-Galp，2，3，6-Me3-Galp，2，3-Me2-Araf，3-Me-Rhap，2，3，4-Me3-Rhap和2，3，5-Me3-Araf(6.2:5.5:1.2:1.7:2.9:4.9:168.5:3.0:1.2:1.0:3.6)，连接方式分别是→3)-Galp-(1→，→2)-Rhap-(1→，→3，5)-Araf-(1→，→3)-Rhap-(1→，GalpA-(1→，→3，4)-Galp-(1→，→4)-GalpA-(1→，→5)-Araf-(1→，→2，4)-Rhap-(1→，Rhap-(1→和Araf-(1→，其中，→4)-GalpA-(1→聚合是GTPS3-1主链中的同型半乳糖醛酸聚糖(HG)结构域；→2)-Rhap-(1→，→2,4)-Rhap-(1→和→4)-GalpA-(1→交替连接构成GTPS3-1主链中的鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG-1)结构域。→3,4)-Galp-(1→和→3)-Galp-(1→,→3,5)-Araf-(1→,→5)-Araf-(1→,Araf-(1→是连接在RG-1结构的阿拉伯半乳聚糖侧链。→3)-Rhap-(1→和Rhap-(1→也是连接在RG-1结构的侧链部分。
4、核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、HMQC、HMBC、COSY)鉴定GTPS3-1的结构(参见表7)。
参见图12-16，GTPS3-1质子和碳信号位移分别是δH1.0-6.0ppm和δC10-180ppm和多糖的标志性化学位移一致。另外，3-D-Galp-1的端基氢位移是4.48ppm(<4.9ppm)，应该归属于β-构型；2-L-Rhap-1，3，5-L-Araf-1，3-L-Rhap-1，D-GalpA-1，3，4-D-Galp-1，4-D-GalpA-1，5-L-Araf-1，2，4-L-Rhap-1，L-Rhap-1和D-Araf-1的端基氢位移分别是4.88，5.70，4.94，5.02，5.09，5.01，5.72，4.86，4.96 and 5.71ppm(≥4.9ppm)，应该归属于α-构型。根据δH1.19，1.22，1.25ppm和δC16.08，16.48，16.97，17.37ppm可以推断出鼠李糖中“–CH3”的存在。δC175.67ppm附近可以推断出半乳糖醛酸的“C＝O”(羰基)的存在。
4-D-GalpA-1的端基氢和碳信号是5.01/99.04，属于GTPS3-1主链中的HG结构，α-D-GalpA-1的端基氢和碳信号是5.02/98.92，是GTPS3-1主链中的端基；2-α-L-Rhap-1和2，4-α-L-Rhap-1的端基氢和碳信号分别是4.88/99.18和4.86/99.20，与4-D-GalpA-1构成了GTPS3-1主链中的RG-1结构；3，4-D-Galp-1和3-D-Galp-1的端基氢和碳信号分别是5.09/98.79和4.48/104.91，3，5-L-Araf-1的C1-C5的信号分别是106.19，70.76，77.37，77.76和77.78，5-L-Araf-1的C1-C5的信号分别是106.58，71.30，67.70，63.85和77.76，α-L-Araf-1的C1-C5的信号分别是106.98，71.25，67.66，72.04和68.39，属于连接于RG-1结构的阿拉伯半乳聚糖侧链；3-Rhap-1的C1-C6的信号分别是99.15，78.05，70.37，68.15，52.30和16.97，α-L-Rhap-1的C1-C6的信号分别是99.22，53.09，68.76，77.89，67.11和17.37，也是连接于RG-1结构的侧链部分。
5、形态特征分析
参见图17，根据刚果红实验结果显示，GTPS3-1和刚果红的复合物的最大吸收波长与刚果红相比未见有明显的红移(<500nm)，说明GTS3-1不存在三螺旋结构。
参见图18，根据扫描电镜图像结果显示，在500倍的放大倍数下，GTPS3-1呈表面光滑且不规则的碎片状；在5000倍的放大倍数下，GTPS3-1呈扁平、光滑、致密块状结构。这基本符合果胶多糖的表面形态特点。
有上述理化特性可知，GTPS3-1为扁平、光滑、致密块状结构的均一果胶型多糖。
表4 GTPS3-1的得率和化学组成
Figure BDA0003504092210000111
表5 GTPS3-1的单糖组成
Figure BDA0003504092210000112
Figure BDA0003504092210000121
摩尔比a：显示果胶分子的主要结构特性；HG＝GalA–Rha；RG-I＝2Rha+Ara+Gal；R1＝GalA/(Rha+Ara+Gal)，果胶的线性；R2＝Rha/GalA，RG对果胶种群的贡献；R3＝(Gal+Ara)/Rha，连接于RG-I的侧链的长度。
表6 GTPS3-1的甲基化分析
Figure BDA0003504092210000122
表7 GTPS3-1的糖基残基化学位移
Figure BDA0003504092210000123
Figure BDA0003504092210000131
为了验证本发明制备的多糖GTPS3-1的药用价值，本发明将制备的多糖GTPS3-1进行抗炎实验，并测定NO和炎症因子等指标。
崂山绿茶果胶多糖GTPS3-1体外LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症损伤保护作用研究
实验方法如下：
步骤一MTT比色法测定细胞活力
将小鼠RAW264.7细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为5×104个/孔，每孔100μL，温度37℃，5％CO2条件下培养过夜后，设置正常组、GTPS3-1干预组(12.5、25、50、100、200μg/mL)。干预组加入不同浓度的GTPS3-1(12.5-200μg/mL)，每组设5个复孔，考察加入药物后对细胞活力的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mL MTT 10μL，在温度37℃，5％CO2条件下继续孵育，4h后终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡15min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔光度值。
步骤二MTT比色法测定细胞增殖能力
将小鼠RAW264.7细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为5×104个/孔，每孔100μL，温度37℃，5％CO2条件下培养过夜后，设置正常组、模型组(1μg/mL LPS)、阳性药物组(12.5μg/mL DEX)、GTPS3-1干预组(12.5、25、50μg/mL)。除正常组以外，其他组加入LPS或者LPS+DEX/GTPS3-1，每组设5个复孔，考察加入LPS和药物后对细胞增殖的影响。上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mLMTT10μL，在温度37℃，5％CO2条件下继续孵育，4h后终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡15min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔光度值。
步骤三NO的测定
按照步骤二中的实验分组和细胞培养方法，加入药物和LPS培养24h后收集上清液。收集上清液后，按照NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作。
1、填装三支试管(空白管、标准管、测定管)，以下液体单位均为(mL)。
空白管：0.1mL双蒸水、0.4mL混合试剂；
标准管：0.1mL100μmol/L标准品应用液、0.4mL混合试剂；
测定管：0.1mL样本、0.4mL混合试剂。
2、将空白管、标准管、测定管分别混匀，并将空白管、标准管、测定管37℃准确水浴60分钟。
3、在空白管、标准管、测定管内分别加入0.2mL试剂三、0.1mL试剂四。
4、将空白管、标准管、测定管分别充分旋涡混匀30秒，室温静置40分钟，3500～4000转/分，离心10分钟，取上清显色。
计算公式：NO含量(μmol/L)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(100μmol/L)×样品测试前稀释倍数。
步骤四肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的测定
实验分组与细胞培养方法同NO，收集上清液后，按照TNF-αElisa试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作程序操作。
a、使用前先将试剂盒在室温下平衡半小时。
b、空白孔：不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。
c、标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μL，然后加入生物素抗原工作液50μL。
d、零孔：加入标准品/样品稀释液50μL，然后加入生物素抗原工作液50μL。
e、样品孔：加入样品50μL，然后加入生物素抗原工作液50μL。
f、轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
g、洗涤后，加入50μL亲和素-HRP到零孔、标准孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。
h、显色：再次洗涤后，每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL酶标板覆膜，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
i、终止：每孔加入终止液50μL。
j、测定：以空白孔调零，450nm波长测定各孔的吸光度。
k、计算：使用ELISAcalc软件根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，拟合模型选用logistic曲线(四参数)。
步骤五白介素-6(IL-6)的测定
实验分组与细胞培养方法同TNF-α，收集上清液后，按照IL-6Elisa试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作程序操作(同TNF-α操作程序类似)。
结果表明：GTPS3-1可以抑制由LPS诱导RAW264.7细胞引起的NO和炎症因子(TNF-α和IL-6)的释放且呈浓度依赖性，表明GTPS3-1对经LPS诱导RAW264.7细胞引起的炎症损伤具有一定的保护作用。
由上述GTPS3-1的理化表征和应用可知，从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖GTPS3-1无毒无害，可以抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用。
本发明提供了一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖及其制备方法和应用，在崂山绿茶中提取崂山绿茶粗多糖，将崂山绿茶粗多糖精制后再进行两步柱层析分离，得到纯化的GTPS3-1；GTPS3-1不仅无毒无害，还可以抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用。综上所述，本发明的有益效果是：可以在崂山绿茶中提取出无毒无害，能够抑制炎症因子，具有良好的抗炎作用的果胶多糖。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种从崂山绿茶中提取的新型果胶多糖，其特征在于，所述新型果胶多糖结构如下所示：
Figure FDA0003504092200000011
2.制备如权利要求1所述的果胶多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、取干燥的崂山绿茶茶叶，在预定提取条件下进行水提醇沉、减压浓缩得到崂山绿茶粗多糖；
B、将所述崂山绿茶粗多糖溶于水后，依次进行脱色、脱蛋白、透析、减压浓缩得到崂山绿茶精制多糖；
C、将所述崂山绿茶精制多糖进行第一柱层析分离，以蒸馏水和NaCl溶液作为流动相进行洗脱，得到产物GTPS3；
D、取所述GTPS3进行第二柱层析分离，以NH4HCO3作为流动相进行洗脱，得到新型果胶多糖GTPS3-1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述预定提取条件为：液料比10:1-20:1mL/g、提取时间2.2-2.8h、提取温度90-95℃。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一柱层析分离的层析柱为DEAESepharose Fast Flow column(10cm×9cm)。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一柱层析分离的洗脱速度为4-6mL/min、10mL/管。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第二柱层析分离的层析柱为Sephacryl S-300column(2.5cm×90cm)。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述NH4HCO3的浓度为0.1-0.2mol/L。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第二柱层析分离的洗脱速度为0.4-0.6mL/min、5mL/管。
9.根据权利要求1所述的新型果胶多糖，其特征在于，应用于细胞炎症损伤保护。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101461430A (zh) * 2007-12-18 2009-06-24 王春霞 美容降脂减肥茶饮
CN111602728A (zh) * 2020-06-17 2020-09-01 中国海洋大学 一种富含茶多糖茶饼的制备工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101461430A (zh) * 2007-12-18 2009-06-24 王春霞 美容降脂减肥茶饮
CN111602728A (zh) * 2020-06-17 2020-09-01 中国海洋大学 一种富含茶多糖茶饼的制备工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李雷: ""茶叶多糖食品功能性研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 工程科技I辑》 *
杨晓萍主编: "《茶叶深加工与综合利用（第1版）》", 31 March 2019, 中国轻工业出版社 *

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