CN114344480A - 多肽的新用途、抗菌凝胶材料及局部药物递送系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及抗菌肽的新用途、以及抗菌肽和氧化多糖所制备而成的水凝胶。本发明要解决的技术问题是目前外用抗生素治疗容易引起致病菌耐药以及普通抗生素对于多药耐药菌治疗效果不佳的技术问题。解决技术问题的技术方案是提供了一种抗菌肽与氧化多糖所制备成的凝胶材料，同时可以装载抗生素或其他生物治疗活性成分。本发明的水凝胶本身就拥有良好的抑制常见致病菌或多药耐药菌的能力，同时可以促进伤口处成纤维细胞的迁移；加入抗生素后可以起到良好的共同作用，在治疗多药耐药菌时可以大幅减少抗生素的用量，同时延缓细菌的耐药进程，具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及多肽的新用途、抗菌肽与多糖制备的抗菌水凝胶材料以及局部药物递送系统。
背景技术
急性皮肤外伤通常在8到12周内会愈合，但是如果伤口部位受到感染就会延长愈合以及治疗时间，尤其是感染了缺乏有效治疗手段的多药耐药菌(multidrug-resistant(MDR)bacteria)。多药耐药菌由于其可以在伤口表面形成由胞外聚合物组成的生物膜，导致其对抗生素产生耐药性，且难以被常规手段清除，容易反复感染。理论上讲最理想的治疗伤口感染的方式是局部给予抗生素治疗，因为这样可以提高局部药物浓度，避免全身药物过敏反应以及其他毒副作用。但是很少有抗生素可以外用，这主要是由于局部使用抗生素会导致超敏反应，重复感染，细菌耐药等情况。
抗菌肽是一类拥有广谱抗菌能力的天然抗菌物质，与抗生素的原理不同，阳离子抗菌肽主要通过自身阳离子附带的正电荷与细菌外膜接触，从而扰乱其膜结构导致其死亡。这一抗菌机制使细菌难以对其产生耐药性，同时可以与抗生素联合使用，起到一定的协同作用。
水凝胶是近年来研究的一种理想的外伤敷料，柔软的凝胶结构可以保护伤口免受机械损伤，其吸水溶胀性质可以吸收伤口处的渗出液，良好的生物相容性使其可以不阻碍伤口皮肤的恢复。同时，水凝胶的网格结构还可以用来装载其他药物或生物活性成分以帮助伤口愈合。
发明内容
本发明要解决的技术问题是局部使用抗生素容易产生耐药菌，导致抗生素应用范围狭窄。
本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种抗菌肽与氧化多糖制备而成的凝胶材料。所述的抗菌凝胶材料是由抗菌肽和多糖为主要原料制备的；所述的抗菌肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.4)，或为在其序列基础上进行1、2或3个插入、缺失或者替换突变的多肽。进一步的，所述的多糖为氧化多糖。更进一步的，所述氧化多糖为部分或全部羟基氧化为醛基的多糖。
其中，所使用的多糖为富含邻位羟基的多糖。其中，所述氧化为醛基的羟基大部分或全部为邻位羟基。
进一步的，所述的富含邻位羟基的多糖为：葡聚糖、普鲁兰多糖、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠或硫酸软骨素中的至少一种。
优选的，所述的多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或甲基纤维素钠中的至少一种。
更优选的，所述的多糖的分子量为1万～10万道尔顿。
其中，所述的抗菌肽与多糖之间的质量比例为:抗菌肽：多糖＝0.2～0.8:1。
其中，上述凝胶材料中所述的多糖的氧化程度在30％～75％之间。氧化程度一般是指氧化了的糖单元摩尔数占总的糖单元摩尔数的比例。氧化了的糖单元可以通过测出多糖含有的醛基数目从而计算得出。优选的，所述的多糖的氧化程度在40％～65％之间。
其中，上述的水凝胶通过直接混合阳离子多肽以及氧化多糖溶液交联固化得到。其中，可在室温下交联固化。
进一步的，上述溶液的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的pH＝7.4。
其中，上述的凝胶材料是由以下方法制成：多肽和多糖在溶液中自组装为水凝胶材料。
进一步的，上述方法具体包括以下步骤：
a、称取抗菌肽溶于溶剂中；
溶剂可以为水、磷酸盐缓冲液或氯化钠溶液中的至少一种
b、称取氧化多糖溶于溶剂中；
c、将步骤a和b得到的溶液在室温下混合，静置至形成凝胶；
或者，由以下方法制成：
a、称取阳离子多肽和氧化多糖，混合均匀；
b、向步骤a中的固体混合物中添加溶剂得到溶液，静置至形成凝胶。
其中，上述方法还包括将凝胶进行冷冻干燥或者在-80℃～0℃的温度下冷冻再重新融化的步骤。
其中，上述凝胶材料中所述的多肽氨基酸序列为下表中的任意一条：
| 氨基酸序列 | 序列编号 |
| VQWRIRVCVIRA | SEQ ID No.1 |
| VQWRIRIAVIRA | SEQ ID No.2 |
| VQLRIRVCVIRR | SEQ ID No.3 |
| VQWRIRVAVIRK | SEQ ID No.4 |
| VQLRIRVCVIRK | SEQ ID No.5 |
| VQWRIRIAVIRK | SEQ ID No.6 |
| VQWRIRVCVIRR | SEQ ID No.7 |
| VQWRIRICVIRA | SEQ ID No.8 |
| VQWRIRVAVIRA | SEQ ID No.9 |
| VQWRIRIAVIRR | SEQ ID No.10 |
| VQWRIRICVIRR | SEQ ID No.11 |
| VQWRIRVAVIRR | SEQ ID No.12 |
| VQWRIRICVIRK | SEQ ID No.13 |
| VQWRIRVCVIRK | SEQ ID No.14 |
| VQLRIRVAVIRR | SEQ ID No.15 |
| VQLRIRVAVIRK | SEQ ID No.16 |
。
其中，上述凝胶材料中的多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
进一步的，上述凝胶材料中所述的多肽VQWRIRVAVIRK的碳端进行了酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
进一步的，上述，其特征在于所述多肽结构为:
本发明同时还提供了上述的凝胶材料在制备药物递送系统中的作用。
本发明同时还提供由上述的凝胶材料装载药物制备成的药物递送系统。
其中，上述药物递送系统中所述的药物为小分子药物、或蛋白多肽类药物中的一种或几种；或者，所述的药物为装载有小分子药物、或蛋白多肽类药物中的一种或几种的纳米粒。
其中，上述药物递送系统中所述的小分子药物为抗生素。
其中，上述药物递送系统中所述的抗生素为β内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、喹诺酮类抗生素或磺胺类抗生素中的至少一种。
其中，上述药物递送系统中所述的抗生素为头孢他啶、万古霉素、亚胺培南或美罗培南中的至少一种。
其中，上述药物递送系统中所述的的蛋白多肽类药物为细胞生长因子或免疫细胞趋化因子中的至少一种。
其中，上述药物递送系统中所述的抗菌肽与小分子药物按质量比0.1～1000：1作为原料制备而成。进一步的，抗菌肽与小分子药物的质量比1～600：1
其中，上述药物递送系统中所述的药物递送系统与装载有小分子药物、或蛋白多肽类药物中的一种或几种的纳米粒按质量比：0.1～10：1为原料制备而成。进一步的，药物递送系统与装载有小分子药物、或蛋白多肽类药物中的一种或几种的纳米粒按质量比1～10：1为原料制备而成
其中，上述药物递送系统中所述抗菌肽与蛋白多肽类药物按质量比0.1～10：1为原料制备而成。进一步的，抗菌肽与蛋白多肽类药物质量比为1～10：1。
其中，上述药物递送系统是由氧化多糖溶液、递送的药物溶液以及阳离子多肽溶液混合后交联固化制得。
其中，上述药物递送系统为局部药物递送系统。
本发明还提供了上述的药物递送系统为主要成分制备得到的药物制剂。进一步的，所述的药物制剂的剂型为应用于皮肤和/或粘膜表面的凝胶剂、乳膏、软膏、膜剂或喷雾剂。
本发明也提供了制备上述的药物递送系统和上述的药物制剂的方法
本发明也提供了上述的药物递送系统和上述的药物制剂在制备治疗和/或预防伤口细菌或耐药菌感染、糖尿病足溃疡、伤口感染，或促进伤口愈合或皮肤修复的产品中的用途。
本发明也提供了上述的药物递送系统和上述的药物制剂在制备能激活细胞中Akt蛋白磷酸化活性的产品或能促进成纤维细胞迁移的产品中的用途。进一步的，所述产品为药品、消毒用品或化妆品中的至少一种。
同时，本发明的另一个方面提供了多肽，或多肽的衍生物，或多肽的化学修饰产物在如下任一项中的应用：
a、制备促进皮肤修复的产品；或促进皮肤修复；
b、制备促进伤口愈合的产品；或促进伤口愈合；
c、制备预防和/或治疗糖尿病足溃疡的产品；或预防和/或治疗糖尿病足溃疡；
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK，或为在其序列基础上进行1、2、3或4个插入、缺失或者替换突变的多肽。
本发明也提供了多肽、或多肽的衍生物、或多肽的化学修饰产物在如下任一项中的应用：
a、制备能激活细胞中Akt蛋白磷酸化活性的产品；或激活细胞中Akt蛋白磷酸化活性；
b、制备能促进成纤维细胞迁移的产品；或促进成纤维细胞迁移。
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK，或为在其序列基础上进行1、2或3个插入、缺失或者替换突变的多肽。
其中，上述的应用中所述的多肽的氨基酸序列为下表中的任意一条：
| 氨基酸序列 | 序列编号 |
| VQWRIRVCVIRA | SEQ ID No.1 |
| VQWRIRIAVIRA | SEQ ID No.2 |
| VQLRIRVCVIRR | SEQ ID No.3 |
| VQWRIRVAVIRK | SEQ ID No.4 |
| VQLRIRVCVIRK | SEQ ID No.5 |
| VQWRIRIAVIRK | SEQ ID No.6 |
| VQWRIRVCVIRR | SEQ ID No.7 |
| VQWRIRICVIRA | SEQ ID No.8 |
| VQWRIRVAVIRA | SEQ ID No.9 |
| VQWRIRIAVIRR | SEQ ID No.10 |
| VQWRIRICVIRR | SEQ ID No.11 |
| VQWRIRVAVIRR | SEQ ID No.12 |
| VQWRIRICVIRK | SEQ ID No.13 |
| VQWRIRVCVIRK | SEQ ID No.14 |
| VQLRIRVAVIRR | SEQ ID No.15 |
| VQLRIRVAVIRK | SEQ ID No.16 |
。
其中，上述多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
其中，上述产品为药品、消毒用品或化妆品中的至少一种。
其中，上述产品的剂型为应用于皮肤和/或粘膜表面的凝胶剂、乳膏、软膏、膜剂或喷雾剂。
其中，上述多肽VQWRIRVAVIRK的碳端进行酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
进一步的，上述多肽结构为:
本发明的有益效果在于：本发明使用的VQWRIRVAVIRK多肽可以与氧化后的多糖交联制备得到抗菌水凝胶，该抗菌水凝胶还可以装载其他药物。其可以有效的治疗伤口感染并加速伤口愈合，尤其是可以对多药耐药菌起到良好的治疗作用，同时可以与抗生素等其他药物联合使用起到协同作用，既能在保证安全的情况下提高治疗效果，又能克服抗生素外用易导致细菌耐药性的缺陷。此外，除了出色的抑菌效果，本发明所使用的多肽还可以起到组织修复肽的功能，具有促进伤口愈合、组织修复等功能，在一个实例中发现可能是通过激活AKT蛋白磷酸化的方式达到上述功效。在本发明的一个实例中，使用头孢他啶作为模型药物装载于水凝胶内部，用来治疗头孢他啶耐药菌感染的普通和I型糖尿病小鼠的全层皮肤损伤模型均得到了良好的疗效。通过对给药治疗后的皮肤进行匀浆涂板计数菌落数可以看到伤口处细菌有明显的降低，通过组织切片观察可以看到伤口处皮肤愈合进程快于对照组，且愈合模式符合无疤痕修的特征，III型胶原附着量以及M2巨噬细胞的数量都高于对照组。同时本发明凝胶材料制备方式简单，所需用到的原辅料少，不易引入容易过敏或生物相容性差的成分，生物安全性好，具有很好的应用前景。
附图说明
图1.葡聚糖氧化的化学反应式，DP7结构以及DP7与氧化葡聚糖反应示意图。
图2.葡聚糖，氧化葡聚糖，DP7-ODEX水凝胶以及CAZ-DP7-ODEX的红外光谱表征结果。
图3.不同DP7含量的DP7-ODEX水凝胶网格SEM照片以及水凝胶孔径大小统计。
图4.不同浓度DP7-ODEX水凝胶流变仪表征，a，b，c分别为DP7浓度为1％，2％，3％的DP7-ODEX水凝胶测得的流变数据结果。
图5.不同DP7浓度的水凝胶成胶时间。
图6.头孢他啶从CAZ-DP7-ODEX凝胶中在不同pH条件下释放速率。
图7.DP7-ODEX水凝胶在不同pH条件下的溶蚀曲线。
图8.DP7-ODEX,CMCS-ODEX,TAT-ODEX水凝胶对不同种类细菌的抑菌能力对比，柱状图每组内表示的菌种从左至右依次为PAO1，K12，25923。
图9.不同DP7浓度(1％，2％，3％，wt％)的DP7-ODEX水凝胶对不同细菌的抑制能力，每块平板内分区分别代表，1％DP7浓度(1％)，2％DP7浓度(2％)，3％DP7浓度(3％),对照组(NS)。
图10.头孢他啶浓度为1/4MIC时头孢他啶溶液，DP7-ODEX水凝胶以及CAZ-DP7-ODEX水凝胶对3种铜绿假单胞菌头孢他啶耐药菌的抑制能力,柱状图每组内从左至右分别代表对照组(Control)，头孢他啶组(CAZ)，DP7-ODEX水凝胶组，CAZ-DP7-ODEX水凝胶组。
图11.头孢他啶浓度为1/4MIC时头孢他啶溶液，DP7-ODEX水凝胶以及CAZ-DP7-ODEX水凝胶对3种铜绿假单胞菌头孢他啶耐药菌生物膜的抑制能力，柱状图每组内从左至右分别代表对照组(Control)，头孢他啶组(CAZ)，DP7-ODEX水凝胶组，CAZ-DP7-ODEX水凝胶组。
图12.头孢他啶浓度为50ug/ml时头孢他啶琼脂凝胶(agar)，DP7-ODEX水凝胶以及CAZ-DP7-ODEX水凝胶体内抑菌实验(给药3天后取样计数)A.各组小鼠染菌并给药3天后伤口照片bar＝0.5cm B.组织匀浆涂板后LB平板上菌落生长的照片C.对培养皿上菌落计数的统计结果。
图13.正常小鼠感染铜绿假单胞菌CQ941后的体内外伤修复实验。A为不同时间点小鼠背部伤口照片bar＝0.5cm；B.为对伤口形状变化的追踪描绘；C为对伤口面积的统计，柱状图每组内从左至右分别代表对照组(Control)，头孢他啶组(CAZ)，DP7-ODEX水凝胶组(DP7)，CAZ-DP7-ODEX水凝胶组(DP7+CAZ)。
图14.对不同时间点取样的伤口组织进行的病理切片A为3，7，14天时小鼠背部伤口HE染色以及第14天时伤口组织的masson染色图片bar＝100μm；B为Masson染色图片中蓝色胶原面积的统计；C为给药7天后伤口组织进行CD31免疫组化染色，箭头部分指示的是新生血管bar＝50μm；D为第3天时对伤口组织进行iNOs(标记M1巨噬细胞)，CD206(标记M2巨噬细胞)免疫荧光染色bar＝50μm；E为给药3天后对伤口组织进行免疫荧光染色标记I型胶原以及III型胶原bar＝100μm。
图15.I型糖尿病小鼠感染铜绿假单胞菌CQ941后的外伤修复实验。A为不同时间点各组小鼠伤口照片bar＝0.2cm B.对伤口面积的统计结果；B的柱状图每组内从左至右分别代表对照组(Control)，头孢他啶组(CAZ)，DP7-ODEX水凝胶组(DP7)，CAZ-DP7-ODEX水凝胶组(DP7+CAZ)。
图16.DP7以及DP7-ODEX水凝胶对于成纤维细胞迁移的促进作用A.细胞划痕实验结果bar＝100μm B.细胞划痕实验中划痕面积统计，柱状图组内从左至右分别为对照组，DP7组，DP7-ODEX水凝胶组C.Transwell细胞迁移实验照片bar＝100μm D.迁移到transwell背面的细胞数目统计E.Westernblot结果。
具体实施方式
本发明创造性地设计了一种由抗菌肽和氧化多糖通过希夫碱交联而成的水凝胶。用于治疗多药耐药菌感染的伤口。本发明偶然发现，DP系列多肽能与使用高碘酸钠氧化的多糖进行化学交联形成希夫碱从而自组装成为凝胶。而且该凝胶是pH敏感的，在偏酸性(小于等于6)的pH条件下，会加速多肽与氧化葡聚糖之间的共价键断裂从而使水凝胶降解，加速内部药物释放。
由于细菌的生长会导致其生长环境的pH偏酸性，因此感染的伤口可以加速这种水凝胶的分解，从而释放出具有杀菌作用的活性多肽。本发明进一步地体哦提供了在pH敏感性水凝胶内部装入其他药物的技术方案，尤其是可以装入与抗菌肽有协同作用的抗生素，这样既可以避免一次性释放过多药物引起局部不良反应，同时可以利用作为其骨架成分的抗菌肽增强耐药菌对抗生素的敏感性，大大减小抗生素的用量，这样不仅可以在不影响疗效的情况下减小不良反应，又可以大大减缓细菌对抗生素的耐药进程。同时，部分抗菌肽除了抗菌能力，还可以作为一种伤口修复肽，通过促进成纤维细胞迁移，调节伤口炎症反应等方式促进伤口组织的愈合。
本发明中使用的氧化的多糖是由高碘酸钠和/或双氧水等与富含邻位羟基的多糖进行氧化反应制备得到。
其中，上述的富含邻位羟基的多糖可以是葡聚糖、普鲁兰多糖、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素等。
一个典型的多糖的氧化反应由高碘酸钠与上述富含邻位羟基多糖按质量比0.3～1：1在纯水中进行，室温反应4～6小时，反应结束后添加过量乙二醇终止反应，再经过透析除杂并利用冷冻干燥或旋蒸的方式得到产物。
本发明中使用的抗菌肽主要为DP系列多肽，尤其是DP7多肽，其能直接与上述氧化的多糖在溶液中自组装成为凝胶，不需要其他的辅助试剂或其他的反应步骤，并且生成的凝胶具有pH敏感性。具有这一特异现象的原因可能是DP7溶解于具有一定离子强度的水溶液(如生理盐水、磷酸缓冲液或PBS等溶剂)中时，游离的氨基可以充分暴露出来与氧化多糖上的醛基在室温下自发进行反应生成pH敏感的希夫碱(C＝N)。
本发明提供的上述凝胶材料在可用于制备药物递送系统。常用的制备方法是将氧化多糖溶液、递送的药物溶液以及阳离子多肽溶液混合后交联固化制得水凝胶材料。制备得到的凝胶材料可以进一步的进行冷冻干燥处理或者在-80℃～0℃的温度下冷冻再重新融化。冷冻后再重新融化的水凝胶可具有更高的强度。
同时，本发明还发现，DP7系列的多肽还可以起到组织修复肽的功能，具有促进伤口愈合、组织修复、促进成纤维细胞迁移等功能，通过实验发现主要是通过激活AKT蛋白磷酸化的方式达到上述功效。具体而言，在发现DP7-ODEX水凝胶在具有好的治疗伤口感染效果外，还具有出人意料的的促进伤口愈合和皮肤修复的作用，本发明探究了出现这一现象的原因。经过文献研究以及实验发现，葡聚糖本身对伤口愈合及组织修复的促进作用有限，单独使用不足以达到如此出色的愈合效果以及无疤痕修复作用。
本发明通过实验发现DP7以及DP7-ODEX水凝胶具有很强的促进成纤维细胞迁移的作用，而成纤维细胞的迁移与增殖也被证明对于加速伤口愈合起着至关重要的作用。还通过Westernblot实验发现DP7多肽可以激活成纤维细胞中AKT蛋白磷酸化(p-AKT)，而之前有研究报道了p-AKT蛋白对于成纤维细胞的迁移和增殖有着明显的促进作用。早期伤口愈合容易受到多种因素的影响(例如除成纤维细胞的迁移和增殖外，还容易细菌感染或组织损伤释放出促炎因子导致炎症)，从而成为伤口愈合中最大的限速步骤。而DP7多肽既具有促进成纤维细胞迁移从而促进伤口愈合和皮肤修复的作用，又具有较好的抗菌作用，故使伤口可以快速跨过这一阶段，从而可大大缩短伤口愈合和皮肤修复的整体过程所需的时间。
以下通过对实施例的具体描述对本发明进行进一步的说明。
实施例材料与试剂
抗菌肽DP7(碳端进行酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2),葡聚糖(分子量50kDa)(上海源叶生物科技有限公司)，高碘酸钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，乙二醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，头孢他啶(大连美仑生物技术有限公司)。
使用的细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923(ATCC，American type culture collection，美国模式培养物保藏中心)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO、大肠杆菌(Escherichia coli)K12，铜绿假单胞菌临床分离株PAO1 CQ184,CQ884,CQ926,CQ941(重庆中医药医院)。
实施例一氧化葡聚糖(ODEX)的制备与表征
取0.8552g高碘酸钠溶解于8ml超纯水内，葡聚糖1g溶解于10ml超纯水内。将高碘酸钠在搅拌下缓慢滴加进入葡聚糖溶液中。之后室温避光搅拌混合液4h。4h反应结束后加入5ml乙二醇并搅拌5分钟以中和过量高碘酸钠。之后将反应液装入透析袋内(截留分子量14kDa)在超纯水中透析48h。透析结束后使用冷冻干燥法获得氧化后的葡聚糖。氧化葡聚糖的结构表征通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)得到。氧化程度通过盐酸羟胺比色法滴定得到。
通过FTIR结果可以看到在1731cm-1处与氧化前相比氧化葡聚糖出现了羰基的震动吸收峰表明葡聚糖成功被氧化。图2中的结果同时标注出了O-H振动峰(3000～3700cm-1)，C-H振动峰(2900～3000cm-1)以及α-1，6-糖苷键的振动峰(1015cm-1)。
然后使用盐酸羟胺比色法计算氧化葡聚糖的氧化程度。葡聚糖的氧化程度是指先测出氧化葡聚糖含有的醛基数目，从而计算出氧化了的葡萄糖单元，用氧化了的葡萄糖单元摩尔数除以总的葡萄糖单元摩尔数即为氧化程度。具体为将10.85g盐酸羟胺溶解于25ml超纯水内，并向其中添加0.7％(w/v)的甲基橙，再调节pH至4.0。之后取100mg氧化葡聚糖溶解于25ml盐酸羟胺溶液内，室温搅拌2h。之后使用0.1N的氢氧化钠溶液对其进行滴定，直到溶液颜色由橙变黄。滴定终点的pH值为4.3接近甲基橙理论变色点4.4，氢氧化钠消耗体积为8ml，经过以下公式计算得到制得的氧化葡聚糖的氧化程度为62％。
氧化程度的计算公式为：
盐酸羟胺滴定反应式
氧化葡聚糖–(CHO)n+nH2N–OH·HCl＝氧化葡聚糖–(CH＝N-OH)n+H2O+nHCl
HCl+NaOH＝NaCl+H2O
实施例二、水凝胶的制备与表征
1、DP7-ODEX水凝胶的制备
称取适量抗菌肽DP7(VQWRIRVAVIRK)粉末溶于PBS形成6％(wt％，100μl水(乘以密度约为100μg)中含有6μg DP7)的溶液，再取适量氧化葡聚糖溶于PBS形成10％(wt％)的溶液。将等体积的DP7溶液与氧化葡聚糖的溶液室温混合并静置5分钟交联固化后便得到DP7-ODEX水凝胶(终浓度DP7 3％,ODEX 5％)。
2、装载头孢他啶(CAZ)的水凝胶(CAZ-DP7-ODEX)的制备
先使用PBS将适量CAZ溶解，再将DP7加入CAZ溶液内制备成含有头孢他啶的，6％(wt％)DP7的溶液，再将含有头孢他啶的DP7溶液等体积与ODEX溶液(10％，wt％)混合，室温静置5分钟即可得到CAZ-DP7-ODEX水凝胶。
3、DP7-ODEX凝胶和CAZ-DP7-ODEX凝胶的表征
制得的DP7-ODEX水凝胶的结构利用扫描电镜观察，具体方法为将制备好的水凝胶使用冷冻干燥法脱去水份，再使用冷冻电镜观察其横截面。其结果参见附图3，可见1％(wt％)浓度DP7的水凝胶孔径更细长，这是由于水凝胶强度略低于另外两种而有所塌陷。1％浓度水凝胶孔径大小约为20μm；2％，3％浓度的水凝胶孔径相较1％略大约为50μm左右。
DP7-ODEX以及CAZ-DP7-ODEX的FTIR数据，可以利用水凝胶的冻干样本进行检测得到。结果可见在交联成水凝胶后，ODEX在1731cm-1处的震动峰减弱。这是由于DP7与ODEX的醛基发生了希夫碱化学交联反应。
使用这种制备方式时，DP7的初始浓度可以在2％到6％之间调整(即终浓度为1％～3％，wt％，附图中的浓度均为终浓度)，DP7浓度在8％(初始浓度)以上时溶液粘度过高，不易于制备水凝胶，低于2％时粘度过低，与ODEX交联后强度太小不会成胶。而采取直接混合两种粉末，然后加水的方式可以提高终浓度。
CAZ的浓度根据实验不同而变化，体内实验时使用的浓度为50μg/ml即1ml水凝胶内含有50μg头孢他啶。体外抑菌实验中头孢他啶的给药量为测试细菌对头孢他啶最小抑制浓度(MIC)的1/4，例如PAO1 CQ941对头孢他啶耐药菌的MIC为64μg/ml则实验时1ml培养基内加入50μl CAZ-DP7-ODEX水凝胶的话则CAZ加入量为16μg，即50μl水凝胶内含有16μg头孢他啶再加入1ml培养基中。
流变性能测试。在37℃下，扭矩1.571μNm，测试角度6.28rad/s，测试时间10min，进行测定储存模量(G`)以及损耗模量(G``)随时间的变化。流变仪结果在图4中，随着DP7浓度的提升水凝胶的储存模量有所提升，3种DP7浓度的水凝胶测出的G`分别为42Pa，406Pa，420Pa。
成胶时间测定。水凝胶成胶时间利用倒置法进行测定，即在西林瓶底部制备水凝胶，以倒置小瓶水凝胶不向下流淌为标准测定水凝胶的交联时间。分别利用倒置法测定了DP7终浓度为1％，2％，3％的DP7-ODEX水凝胶(DEX 5％)的成胶时间。结果如图5所示，DP7浓度从1％变化到3％，成胶时间分别为311s，196s，171s。
实施例三、DP7-ODEX水凝胶的溶蚀速率测定
水凝胶的溶蚀速率分别在pH5.0以及pH7.4的两种介质中进行测定，因为DP7与ODEX通过希夫碱交联，因此DP7-ODEX水凝胶可能具有pH敏感性质，在酸性条件下可能加速降解。
分别在1.5ml的EP管底部制备了200μl DP7-ODEX凝胶(DP7 3％,ODEX 5％,wt％)，再分别加入1ml pH5.0或pH7.4的缓冲盐溶液，并至于37℃摇床(220rpm/min)内孵育，于规定的时间点移除释放介质，连同EP以同测定重量，以此计算出剩余水凝胶的质量随时间变化的曲线(图7)。前12h两种介质中水凝胶重量变化均不明显，12h后pH5.0介质中的水凝胶开始降解，到72h时只剩余30％左右的重量。
实施例四头孢他啶从CAZ-DP7-ODEX凝胶中释放速率检测
释放实验分别在pH5.0以及pH7.4的两种介质中进行测定，分别在1.5ml的EP管底部制备了200μl CAZ-DP7-ODEX凝胶(DP7 3％,ODEX 5％,wt％)，再分别加入1ml pH5.0或pH7.4的缓冲盐溶液，并至于37℃摇床(220rpm/min)内孵育，在规定的时间点内抽取200ul释放介质并补充200ul相应介质，取样完毕后使用高效液相色谱测定CAZ的累计释放量。从图6中可以看出头孢他啶在酸性介质下释放速率更高，释放三天的时间pH5.0的介质中CAZ释放了接近70％，而pH7.4得介质中CAZ的释放量仅有40％左右。
实施例五、体外抑菌实验
1、不同成分ODEX水凝胶抑菌能力对比
分别制备DP7-ODEX水凝胶(DP7 3％,ODEX 5％,wt％)，羧甲基壳聚糖(CMCS)水凝胶CMCS-ODEX(0.5％CMCS,wt％)，TAT肽(GRKKRRQRRRPQ)水凝胶TAT-ODEX(3％TAT,wt％)各50ul置于96孔板板底。再取PAO1,25923,K12三种菌株的菌液，用LB培养基调整浓度为105CFU/mL，96孔板内每孔加入200ul菌液后37℃静置孵育16h。孵育结束后再吸出菌液置于新的96孔板内于600nm处测定吸光度。(图8.)
DP7-ODEX的制备方法为先配置DP7浓度为6％(wt％)的PBS溶液，再将等体积的ODEX(10％，wt％)PBS溶液与其混合，室温静置3min。
CMCS-ODEX的制备方法为先配置CMCS浓度为1％(wt％)的PBS溶液，再将等体积的ODEX(10％，wt％)PBS溶液与其混合，室温静置3min。
TAT-ODEX的制备方法为先配置TAT肽的浓度为6％(wt％)的PBS溶液，再将等体积的ODEX(10％，wt％)PBS溶液与其混合，再向混合液中加入1μl氢氧化钠溶液(1mM)调节成碱性，室温静置3min。TAT肽虽也能和ODEX自组装成凝胶，但需要调节溶液为碱性，而且形成的水凝胶均匀性不佳。
结果见图8，只有DP7-ODEX组可以将细菌完全抑制(吸光度为对照组10％以下)，CMCS-ODEX以及TAT-ODEX的抑菌效果较弱，由此可见DP7-ODEX水凝胶相较其他抗菌材料制备成的水凝胶有着更强的抑菌效果。
2、不同DP7浓度的DP7-ODEX水凝胶抑菌能力对比
在96孔板底部制备50ul浓度分别为1％，2％，3％(DP7,wt％)的DP7-ODEX水凝胶，对照组为50ul普通琼脂(agar)，分别在其表面滴加10ul PAO1,K12,25923菌液(105CFU/mL，LB培养基)，37℃静置4h后使用200ul PBS冲洗水凝胶表面，再取20ul冲洗后的PBS滴加到LBagar固体培养基表面，37℃静置培养16h后取出观察(图9.)。从对培养皿的照片中可以看到，除了对照组以外，3种细菌在与3种浓度的DP7-ODEX水凝胶共孵育后均无法在LB agar固体培养基表面生长，证明与DP7-ODEX水凝胶的直接接触可以杀死这些细菌。
3、体外对耐药菌抑制实验
分别制备DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)，头孢他啶溶液，CAZ-DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)各50μl置于96孔板板底。再取PAO1临床耐药菌株(均对头孢他啶耐药)CQ184,CQ884,CQ941用LB培养基调菌液浓度至105CFU/mL，取200μl加入铺设了水凝胶的96孔板。对照组不加药物只加菌液，头孢他啶溶液组以及CAZ-DP7-ODEX水凝胶组中加入的头孢他啶终浓度为对应耐药菌对头孢他啶MIC(最小抑菌浓度)的1/4。之后37℃静置孵育16h。孵育完成后吸出菌液加入新的96孔板在600nm处测定吸光度，结果见图10。
结果表明，在1/4MIC浓度下头孢他啶对耐药菌株的抑制能力较弱，DP7-ODEX水凝胶在单独使用时虽然也表现出了抑制效果，但是还是不足以将细菌完全抑制，而将头孢他啶载入DP7-ODEX水凝胶后再进行给药，3种临床耐药菌株均被完全抑制(吸光度小于对照组的10％)，这说明了DP7-ODEX除了本身就能够对耐药菌起到抑制作用以外，在连用头孢他啶后可大幅提升整体的抑菌能力，同时所需的抗生素浓度相较于MIC要明显更低。
表1 DP7和头孢他啶对临床耐药菌的最小抑菌浓度
4、体外抑制耐药菌生物膜能力
分别制备DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)，头孢他啶溶液，CAZ-DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)各50μl置于24孔板板底。再取PAO1临床耐药菌株(均对头孢他啶耐药)CQ184、CQ884、CQ941用LB培养基调菌液浓度至108CFU/mL，取1ml加入铺设了水凝胶的24孔板。对照组不加药物只加菌液，头孢他啶溶液组以及CAZ-DP7-ODEX水凝胶组中加入的头孢他啶终浓度为对应耐药菌对头孢他啶MIC(最小抑菌浓度)的1/4。之后37℃静置孵育48h。孵育结束后倾倒并用PBS将菌液洗净，吹干孔板内水份后加入1ml结晶紫(0.1％，v/v)染色15min，再使用PBS将结晶紫洗去并吹干水份，染色后的生物膜使用200ul甲醇将染上的结晶紫洗脱，再将溶解了结晶紫的甲醇加入新的96孔板内于590nm处测定吸光度。
结果参见图11。结果表明单独使用头孢他啶(1/4MIC)或DP7-ODEX水凝胶对3种临床耐药菌的生物膜生成能力的影响较小，但是两者联用后可以大幅降低临床耐药菌的生物膜的产量。
实施例六、体内抑菌实验
6到8周龄C57雌性小鼠按40μL/10g的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛麻醉后切除背部的皮肤，制造出直径8mm的圆形伤口。之后滴加10μl CQ941菌液(生理盐水重悬，107CFU/ml)于伤口表面，再给予不同制剂进行治疗。治疗用的制剂分别为DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)，含有头孢他啶的琼脂凝胶(agar，头孢他啶浓度为50μg/ml)，CAZ-DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％,头孢他啶浓度为50μg/ml)各50μl，对照组给予50μl生理盐水。给药3天后将伤口皮肤取下，匀浆后取匀浆稀释液涂板计数统计伤口菌落数。
结果参见图12。结果表明给药治疗3天后单独使用CAZ以及DP7-ODEX水凝胶治疗组对细菌的抑制能力相差不大，但是两者联用后伤口处的细菌负载量明显减少，证明DP7-ODEX水凝胶与抗生素联用时可以起到很好的共同作用效果。
实施例七、促进体内细菌感染伤口的愈合实验
6到8周龄C57雌性小鼠按40μL/10g的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛麻醉后切除背部的皮肤，制造出直径8mm的圆形伤口。之后滴加10μl CQ941菌液(生理盐水重悬，107CFU/ml)于伤口表面，再给予不同制剂进行治疗。治疗用的制剂分别为DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)，含有头孢他啶的琼脂凝胶(agar，头孢他啶浓度为50μg/ml)，CAZ-DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％,头孢他啶浓度为50μg/ml)各50μl，对照组给予50μl生理盐水。每3天换一次药，同时在第0，3，7，14天时拍照记录伤口大小(图13)。同时取下伤口组织进行病理切片观察结构(图14)。分别进行了HE染色，Masson染色，CD31免疫组化染色，iNOs/CD206免疫荧光染色，I/III型胶原免疫荧光染色。
通过比较小鼠背部伤口的大小可以看出在第14天时，经过CAZ-DP7-ODEX水凝胶治疗的小鼠愈合速度明显优于其他实验组。从HE染色中可以看出经过DP7-ODEX以及CAZ-DP7-ODEX治疗的小鼠，他们在第7天和14天时能明显观察到有毛囊皮脂腺等皮肤附属器的再生(图14A)。从Masson染色中可以看到第14天时水凝胶治疗组的小鼠皮肤中的胶原附着情况要更好，胶原附着面积经过统计在附图14B中展示了出来(图14B)。利用CD31标记新生血管能够看出水凝胶治疗组的小鼠伤口组织中有更多的新生血管出现(图14C)。iNOs可以标记M1型巨噬细胞，这是一种促炎性巨噬细胞，相反CD206标记的M2型巨噬细胞是一种抑炎性巨噬细胞，M2型巨噬细胞的数量多余M1型时说明伤口的炎症反应较弱，有利于伤口愈合并减小瘢痕组织(图14D)。I/III型胶原的比例同样与无瘢痕修复息息相关，经过水凝胶治疗后III型胶原的附着量明显高于I型胶原，这一现象也可以说明治疗后的伤口愈合状况更为理想，贴近无瘢痕修复的特征(图14E)。
实施例七、促进糖尿病小鼠感染伤口愈合实验
6到8周龄C57雌性小鼠禁食过夜，之后按120mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ,10％w/w,溶于pH4.5的柠檬酸缓冲盐内)，7天后检测小鼠血糖，血糖值11.1mmol/L以上的视为糖尿病鼠。对糖尿病鼠按40μL/10g的剂量腹腔注射10％(v/v)水合氯醛麻醉后切除背部的皮肤，制造出直径8mm的圆形伤口。之后滴加10ul CQ941菌液(生理盐水重悬，107CFU/ml)于伤口表面，再给予不同制剂进行治疗。治疗用的制剂分别为DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％)，含有头孢他啶的琼脂凝胶(agar，头孢他啶浓度为50ug/ml)，CAZ-DP7-ODEX水凝胶(3％DP7,wt％,头孢他啶浓度为50μg/ml)各50μl，对照组给予50μl生理盐水。每3天换一次药，同时在第0，3，7，14天时拍照记录伤口大小。(图15)通过比较小鼠背部伤口的大小可以看出在第14天时，经过CAZ-DP7-ODEX水凝胶治疗的小鼠伤口面积最小，说明CAZ-DP7-ODEX水凝胶的治疗效果优于其他实验组，同时也证明了DP7-ODEX水凝胶以及CAZ-DP7-ODEX水凝胶在糖尿病外伤感染模型中同样有很好的治疗效果。
实施例八促进细胞迁移实验
在前期实验中，出人意料地发现了DP7-ODEX水凝胶有很好的促进皮肤修复和伤口愈合的作用后，为探究了DP7-ODEX水凝胶促进皮肤修复和伤口愈合的原因，进行了进一步的实验。由于成纤维细胞的迁移能力直接关系着伤口早期愈合情况是否理想，而早期伤口愈合又容易成为整个伤口愈合过程中的限速步骤；也就是说，成纤维细胞的迁移情况是和伤口愈合以及皮肤修复的速度及修复效果具有直接的关系。为此，设计了两方面的实验，其一是利用细胞划痕实验以及transwell迁移实验分别考察DP7以及DP7-ODEX水凝胶是否各自具有促进成纤维细胞迁移的功能，其二是通过Westernblot实验具体探究了DP7对于成纤维细胞在蛋白表达水平上的影响。
实验结果表明发现DP7以及DP7-ODEX水凝胶具有促进成纤维细胞迁移的功能。而且还发现DP7多肽可以激活成纤维细胞中的AKT蛋白磷酸化，而磷酸化后的AKT蛋白在很多报道中都被证实了可以促进成纤维细胞的迁移和增殖。由此可见，DP7多肽具有促进皮肤修复和伤口愈合的功能的原因主要是因为DP7多肽对于成纤维细胞AKT蛋白膦酸化过程的激活。
1、细胞划痕实验
NIH 3T3细胞接种于6孔板内(每孔3×105细胞)，待细胞贴壁后将细胞与DP7溶液(10μg/ml)或DP7-ODEX水凝胶(DP7 3％,ODEX 5％,wt％，50ul)共孵育24小时。之后使用PBS将细胞洗净，移除上述DP7溶液或DP7-ODEX水凝胶，再使用10ul枪尖在6孔板内划痕，使用PBS洗去脱落的细胞，再将PBS替换为含有1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。并于0，12，24小时的时间点拍照记录划痕变化，划痕面积使用ImageJ软件记录。对照组细胞不做任何处理。从图16A中可以看到DP7和DP7-ODEX水凝胶处理后的NIH 3T3细胞迁移速率要高于对照组，划痕的愈合速度更快，从图16B中的统计结果也可以得出这一结论，DP7以及DP7-ODEX水凝胶处理后，划痕愈合速度远高于对照组。
2、Transwell迁移实验
NIH 3T3细胞接种于6孔板内(每孔3×105细胞)，待细胞贴壁后将细胞与DP7溶液(10ug/ml)或DP7-ODEX水凝胶(DP7 3％,ODEX 5％,wt％，50ul)共孵育24小时。之后将细胞消化，装入transwell上室(6孔板，每孔10万细胞)，之后在下室装入含有1％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，37℃孵育6小时后使用棉球擦除上室内的细胞，并使用4％多聚甲醛固定迁移到背面的细胞5分钟，再使用0.1％(v/v)的结晶紫染色15min，最后使用PBS洗去未染色的结晶紫，迁移到背面的细胞使用倒置显微镜观察(Nikon,FHEIPSE Ti,Japan)。从图16C中可以看到DP7和DP7-ODEX水凝胶处理后的NIH 3T3细胞在相同时间内，迁移到transwell背面的细胞量更多，同时可以从图16D的细胞数量统计中看到这一结果。成纤维细胞的增殖以及迁移能力与伤口愈合速度息息相关，DP7以及DP7-ODEX水凝胶对成纤维细胞迁移能力的促进说明了他们应用于外伤治疗有助于伤口皮肤的愈合。
3、Westernblot实验探究DP7对成纤维细胞迁移促进的机制
NIH 3T3细胞接种于6孔板内(每孔3×105细胞)，待细胞贴壁后将细胞与DP7溶液(10ug/ml)或DP7-ODEX水凝胶(DP7 3％,ODEX 5％,wt％，50ul)共孵育24小时。之后使用RIPA裂解液提取蛋白，再进行Westernblot实验验证。图16E的Westernblot条带显示，3组之间Akt蛋白的表达量相当，但是DP7和DP7-ODEX水凝胶处理后的NIH 3T3细胞中磷酸化的p-Akt蛋白表达量升高，Akt蛋白磷酸化后会激活发挥功能，它的功能与细胞的迁移以及增殖有关，因此可以得出结论，DP7以及DP7-ODEX水凝胶促进成纤维细胞迁移是主要由于DP7激活了细胞中的Akt蛋白磷酸化这一途径。
序列表
<110> 四川大学
<120> 多肽的新用途、抗菌凝胶材料及局部药物递送系统
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Gln Trp Arg Ile Arg Ile Ala Val Ile Arg Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg
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<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Cys Val Ile Arg Arg
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<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Ala
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<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 12
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Val Gln Leu Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10
Claims (41)
1.抗菌凝胶材料，其特征在于是由抗菌肽和多糖为主要原料制备的；所述的抗菌肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK(SEQ ID No.4)；或为在其序列基础上进行1、2或3个插入、缺失或者替换突变的多肽。
2.根据权利要求1所述的凝胶材料，其特征于：所述的多糖为氧化多糖。
3.根据权利要求1或2任一项所述的凝胶材料，其特征在于：所使用的多糖为富含邻位羟基的多糖。
4.根据权利要求1～3任一项所述的凝胶材料，其特征在于：进一步的，所述的富含邻位羟基的多糖为：葡聚糖、普鲁兰多糖、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠或硫酸软骨素中的至少一种。
5.根据权利要求1～4任一项所述的凝胶材料，其特征在于：所述的多糖为葡聚糖、普鲁兰多糖或甲基纤维素钠中的至少一种。
6.根据权利要求1～5任一项所述的凝胶材料，其特征在于：所述的多糖的分子量为1万～10万道尔顿。
7.根据权利要求1～6任一项所述的凝胶材料，其特征在于：所述的抗菌肽与多糖之间的质量比例为:抗菌肽︰多糖＝0.2～0.8:1。
8.根据权利要求1～7任一项所述的凝胶材料，其特征在于：多糖的氧化程度为30％～75％；优选的，所述的多糖的氧化程度为40％～65％。
9.根据权利要求1～8任一项所述的凝胶材料，其特征在于由以下方法制成：多肽和多糖在溶液中自组装为水凝胶材料。
10.根据权利要求9所述的凝胶材料，其特征在于由以下方法制成
a、称取抗菌肽溶于溶剂中；
溶剂可以为水、磷酸盐缓冲液或氯化钠溶液中的至少一种
b、称取氧化多糖溶于溶剂中；
c、将步骤a和b得到的溶液在室温下混合，静置至形成凝胶；
或者，由以下方法制成：
a、称取阳离子多肽和氧化多糖，混合均匀；
b、向步骤a中的固体混合物中添加溶剂得到溶液，静置至形成凝胶。
11.根据权利要求9或10所述的凝胶材料，其特征在于：还包括将凝胶进行冷冻干燥或在-80℃～0℃的温度下冷冻再重新融化的步骤。
12.根据权利要求1～11任一所述的凝胶材料，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列为下表中的任意一条：
。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的应用，其特征在于：所述多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
14.根据权利要求1～13任一项所述的凝胶材料，其特征在于所述多肽为在VQWRIRVAVIRK的碳端进行酰胺化修饰的VQWRIRVAVIRK-NH2。
15.根据权利要求1～14任一项所述的凝胶材料，其特征在于所述抗菌肽结构为:
16.权利要求1～15任一项所述的凝胶材料在制备药物递送系统中的作用。
17.药物递送系统，其特征在于是由权利要求1～15任一项所述的凝胶材料装载药物制备而成。
18.根据权利要求17所述的药物递送系统，其特征在于所述的药物为小分子药物、或蛋白多肽类药物中的一种或几种；或者，所述的药物为装载有小分子药物、或蛋白多肽类药物中的一种或几种的纳米粒。
19.根据权利要求18所述的药物递送系统，其特征在于所述的小分子药物为抗生素。
20.根据权利要求19所述的药物递送系统，其特征在于所述的抗生素为β内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、喹诺酮类抗生素或磺胺类抗生素中的至少一种。
21.根据权利要求19所述的药物递送系统，其特征在于所述的抗生素为头孢他啶、万古霉素、亚胺培南或美罗培南中的至少一种。
22.根据权利要求18所述的药物递送系统，其特征在于所述的蛋白多肽类药物为细胞生长因子或免疫细胞趋化因子中的至少一种。
23.根据权利要求1～22任一项所述药物递送系统，其特征在于：抗菌肽与小分子药物按质量比0.1～600：1作为原料制备而成。
24.根据权利要求1～23任一项所述的药物递送系统，其特征在于：药物递送系统与装载有小分子药物或蛋白多肽类药物中的一种或几种的纳米粒按质量比0.1～10：1为原料制备而成。
25.根据权利要求1～24任一项所述的药物递送系统，其特征在于：抗菌肽与蛋白多肽类药物按质量比0.1～10：1为原料制备而成。
26.根据权利要求1～25任一项所述的药物递送系统，其特征在于：是由氧化多糖溶液，递送的药物溶液以及阳离子多肽溶液混合后交联固化制得。
27.根据权利要求1～26任一项所述的药物递送系统，其特征在于：所述的药物递送系统为局部药物递送系统。
28.权利要求要求1～15任一项所述的凝胶材料为主要载体材料或者17～27任一项所述的药物递送系统为主要成分制备得到的药物制剂。
29.根据权利要求28所述的药物制剂，其特征在所述药物制剂的剂型为应用于皮肤和/或粘膜表面的凝胶剂、乳膏、软膏、膜剂或喷雾剂。
30.制备权利要求17～27任一项所述的药物递送系统或权利要求28或29所述的药物制剂的方法。
31.权利要求17～27任一项所述的药物递送系统或权利要求28或29所述的药物制剂在制备治疗和/或预防伤口细菌或耐药菌感染、糖尿病足溃疡、伤口感染、或促进伤口愈合或皮肤修复的产品中的用途。
32.权利要求17～27任一项所述的药物递送系统或权利要求28或29所述的药物制剂在制备能激活细胞中Akt蛋白磷酸化活性的产品或能促进成纤维细胞迁移的产品中的用途。
33.根据权利要求31或32所述的用途，其特征在于所述产品为药品、消毒用品或化妆品中的至少一种。
34.多肽，或多肽的衍生物，或多肽的化学修饰产物在如下任一项中的应用：
a、制备促进皮肤修复的产品；或促进皮肤修复；
b、制备促进伤口愈合的产品；或促进伤口愈合；
c、制备预防和/或治疗糖尿病溃足的产品；或预防和/或治疗糖尿病溃足；
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK，或为在其序列基础上进行1、2、3或4个插入、缺失或者替换突变的多肽。
35.多肽、或多肽的衍生物、或多肽的化学修饰产物在如下任一项中的应用：
a、制备能激活细胞中Akt蛋白磷酸化活性的产品；或激活细胞中Akt蛋白磷酸化活性；
b、制备能促进成纤维细胞迁移的产品；或促进成纤维细胞迁移。
所述多肽的氨基酸序列为VQWRIRVAVIRK，或为在其序列基础上进行1、2或3个插入、缺失或者替换突变的多肽。
36.根据权利要求34或35任一所述的应用，其特征在于：所述的多肽的氨基酸序列为下表中的任意一条：
。
37.根据权利要求34～36中任一项所述的应用，其特征在于：所述多肽在其碳端进行酰胺化修饰或者在其氮端进行乙酰化修饰。
38.根据权利要求34～37中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药品、消毒用品或化妆品中的至少一种。
39.根据权利要求34～38中任一所述的应用，其特征在于：所述产品的剂型为应用于皮肤和/或粘膜表面的凝胶剂、乳膏、软膏、膜剂或喷雾剂。
40.根据权利要求34～39中任一所述的应用，其特征在于：多肽VQWRIRVAVIRK的碳端进行酰胺化修饰为VQWRIRVAVIRK-NH2。
41.根据权利要求35～40中任一所述的应用，其特征在于所述多肽结构为:
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