CN114341188A - 结合至癌细胞且使放射性核素靶向所述细胞的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合至靶细胞上的抗原且使放射性核素靶向所述细胞的抗体及其使用方法。

Description

结合至癌细胞且使放射性核素靶向所述细胞的抗体
技术领域
本发明涉及结合至靶细胞上的抗原且使放射性核素靶向所述细胞的抗体及其使用方法。
背景技术
已研发出使药物靶向癌细胞的单克隆抗体。通过将毒性剂与结合至肿瘤相关抗原的抗体缀合，有潜力提供更多的特异性肿瘤杀伤及更少的对周围组织的损伤。
在预靶向放射免疫疗法(PRIT)中，利用一方面对肿瘤相关抗原具有亲和力且另一方面对带放射性标记物的化合物具有亲和力的抗体构建物。在第一步中，将抗体施用且定位至肿瘤。随后，施用放射性标记化合物。因为放射性标记化合物较小，因此可将其迅速递送至肿瘤并快速清除，这减少肿瘤以外的辐射暴露(Goldenberg et al.,Theranostics2012,2(5),523-540)。类似程序也可用于成像。预靶向可利用使用亲和素-生物素的双特异性抗体或系统，但后者具有亲和素/链霉亲和素具免疫原性的缺点。
预靶向放射免疫疗法或成像的方法通常利用清除剂或封闭剂，该清除剂或封闭剂在施用抗体步骤与施用放射性标记化合物步骤之间施用。目的在于自血液清除抗体和/或在于封闭放射性标记化合物的循环抗体的结合位点(参见例如Karacay et al.,Bioconj.Chem.,13(5),1054-1070(2002))。清除剂或封闭剂的使用允许待施用以用于有效治疗的足够水平的放射性，同时限制不良毒性，但必须谨慎选择时机及剂量。因此，在预靶向方法中清除阶段的使用是复杂的方面。
发明内容
本发明提供可用于预靶向方法中的抗体组及其使用方法。
在一个方面中，本发明提供一组抗体，该抗体组包含：
i)第一抗体，其结合至于靶细胞表面上表达的抗原，且进一步包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域，但不包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域；以及
ii)第二抗体，其结合至于靶细胞表面上表达的抗原，且进一步包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域，但不包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域，
其中第一抗体的所述VH域及第二抗体的所述VL域能够一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
第一抗体及第二抗体均不独自包含放射性标记化合物的功能抗原结合位点。第一抗体仅具有来自放射性标记化合物的功能性结合位点的VH域，且不具有VL域。第二抗体仅具有VL域，且不具有VH域。
当第一抗体及第二抗体的VH及VL域联合时，形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点。此种情况可例如在第一抗体及第二抗体结合至同一个别靶细胞或结合至邻接细胞时发生。
本文所描述的第一抗体及第二抗体可在本文中称为“单域分裂抗体”、“分裂抗体”或“半抗体(demibody)”。一起形成能够结合至放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域及VL域在两个抗体之间分裂，且不作为同一抗体的一部分存在。
分裂域格式是指放射性标记化合物不可独自结合至第一抗体或独自结合至第二抗体。在血液中，第一抗体与第二抗体之间存在很少或不存在稳定联合，且因此存在很少或不存在放射性标记化合物的稳定结合。
于靶细胞表面上表达的抗原可在本文中称为“靶抗原”或“TA”。根据本发明，上文所描述的第一抗体及第二抗体具有用于相同靶抗原的结合位点。(为避免疑问，在陈述抗体结合相同靶抗原的情况下，是指其具有能够结合至相同靶抗原的结合位点且包括抗体可结合至彼此相同的两个个别抗原分子的可能性)。举例而言，在一个实施方案中，第一抗体及第二抗体均结合至CEA。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体可结合至靶抗原的相同表位(具有用于靶抗原的相同表位的结合位点)。在其它实施方案中，第一抗体可结合至与第二抗体不同的靶抗原的表位(具有用于与第二抗体不同的靶抗原的表位的结合位点)。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体可包含相同用于靶抗原的抗原结合位点。就是说，其可包含能够结合至靶抗原的抗原结合位点，该抗原结合位点包含VL序列及VH序列，其中在第一抗体中及在第二抗体中，形成此抗原结合位点的VL序列及VH序列为相同的。
在一些实施方案中，对于靶抗原而言，每一个第一抗体及第二抗体均是二价的。在一些实施方案中，对于表位而言，其各自为二价且单特异性的。在其它实施方案中，对于靶抗原而言，每一个第一抗体及第二抗体均是双互补位的，即第一抗体及第二抗体各自具有用于靶抗原的两个不同表位的结合位点。
在一些实施方案中，可能优选的是，第一抗体和/或第二抗体包含Fc区。在放射免疫疗法及放射成像的情形下Fc区的存在有益，例如与用更小的片段可以观察到的相比延长蛋白质的循环半衰期和/或导致更高的肿瘤摄取。在此情形下，本文所描述的“分裂域”格式可能特别有利，这是因为其降低与放射性标记化合物的联合的较大可能性，该联合会由于循环抗体的延长存在而以其它方式发生。
在一些实施方案中，Fc域经修饰以减弱或消除效应功能。
在另一方面中，本发明提供包含如本文所描述的抗体组的药物组合物。在另一方面中，本发明提供包含两个单独药物组合物的试剂盒，该两个单独药物组合物各自包含本文所描述的抗体中之一者(即分别包含第一抗体及第二抗体)。
在另一方面中本发明涉及编码本文所描述的抗体中的任一者或抗体组的多核苷酸或一组多核苷酸。在另一方面中，本发明涉及包含该一个或多个多核苷酸的载体或一组载体，任选表达载体或一组表达载体。在另一方面，本发明涉及包含本发明的载体或一组载体的原核或真核宿主细胞或一组宿主细胞。另外，提供一种生成抗体的方法，该方法包括培养一个或多个宿主细胞使得抗体生成。
在一些实施方案中，如本文所描述的抗体用于预靶向放射免疫疗法(PRIT)方法中或预靶向放射成像方法中。
在一个方面中，本发明提供一种预靶向放射免疫疗法方法，该方法包括：
i)向个体施用如上文所描述的第一抗体及第二抗体；以及
ii)随后向该个体施用放射性标记化合物。
在另一方面中，本发明提供用于治疗方法中的上文所描述的第一抗体及第二抗体，该治疗方法包括向个体施用第一抗体及第二抗体以及随后向该个体施用放射性标记化合物。在另一方面中，本发明提供用于治疗方法中的如上文所描述的第一抗体，该治疗方法包括向个体施用第一抗体及第二抗体以及随后向该个体施用放射性标记化合物。在另一方面中，本发明提供用于治疗方法中的如上文所描述的第二抗体，该治疗方法包括向个体施用第一抗体及第二抗体以及随后向该个体施用放射性标记化合物。
在另一方面中，本发明提供一种放射成像方法，该方法包括：
i)向个体施用如本文所描述的第一抗体及第二抗体，其中抗体结合至靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面；
ii)随后施用放射性标记化合物；以及任选地
iii)对其中定位有放射性核素的组织或器官进行成像。
在另一方面中，本发明提供用于对人类或动物身体进行的诊断方法中的如本文所描述的第一抗体及第二抗体，其中该方法包括
i)向个体施用如本文所描述的第一抗体及第二抗体，其中抗体结合至靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面；
ii)随后施用放射性标记化合物；以及任选地
iii)对其中定位有放射性核素的组织或器官进行成像。
成像步骤之后可以为形成诊断的步骤且任选向个体递送该诊断的步骤。在一些实施方案中，该方法可进一步包含确定适当治疗且任选向个体施用该治疗。
在上述各方法/用途中，第一抗体及第二抗体与相同或邻接靶细胞的结合引起放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域及VL域的联合及放射性标记化合物的功能抗原结合位点的形成。因此，在施用放射性标记化合物之后，放射性标记化合物结合至通过联合VH及VL形成的功能抗原结合位点。
在本文所描述的方法及用途中的任一者中，第一抗体及第二抗体可同时或以任一次序依序施用。
通常在本领域中，PRIT或放射成像方法涉及清除步骤。清除步骤包括在施用抗体与施用放射性标记化合物之间施用药剂，其中药剂提高自血液移除抗体的速率和/或封闭放射性标记化合物与抗体的结合。
在本文所描述的方法及用途之一实施方案中，该方法不包含清除步骤。就是说，其不包含在施用第一抗体及第二抗体与施用放射性标记化合物之间(亦即，在施用抗体之后、但在施用放射性标记化合物之前)施用清除剂或封闭剂的步骤。在另一实施方案中，在施用第一抗体及第二抗体与施用放射性标记化合物之间不施用除任选选用的放射增敏剂、免疫治疗剂和/或化学治疗剂以外的药剂。在另一实施方案中，在施用第一抗体及第二抗体与施用放射性标记化合物之间不施用药剂。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体可作为联合疗法的一部分施用。举例而言，其可与一或多种放射增敏剂、免疫治疗剂和/或化学治疗剂组合施用：放射增敏剂、免疫治疗剂或化学治疗剂及抗体可同时或以任一次序依序施用。
本文所描述的放射成像方法及放射免疫疗法方法可如本文进一步论述任选组合。
在另一方面中，本发明提供试剂盒，该试剂盒包含：
i)如本文所描述的第一抗体及第二抗体；
ii)结合至通过联合第一抗体及第二抗体形成的抗原结合位点的放射性标记化合物。
试剂盒可任选排除(亦即不包含)如本文所描述的清除剂或封闭剂。
试剂盒可任选进一步包含放射增敏剂、免疫治疗剂或化学治疗剂。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体可存在于同一药物组合物中。在其它实施方案中，第一抗体及第二抗体可存在于单独药物组合物中。在一些实施方案中，放射性标记化合物与抗体分开存在于药物组合物中。
附图说明
图1显示属于比较实施例的靶抗原(TA)-DOTAM双特异性抗体(TA-DOTAM BsAb)及本发明的例示性TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的示意结构。
图2为显示肿瘤细胞上的分裂-VH/VL DOTAM结合子的装配的示意图。TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体不大量结合212Pb-DOTAM，除非结合至靶向细胞上的肿瘤抗原(TA)，其中DOTAM结合子的两个域得以装配。
图3显示涉及清除剂使用的三步TA-PRIT概念实施例的示意概述。
图4显示其中不使用清除剂的二步TA-PRIT概念实施例的示意概述。
图5显示用于展现CEA结合能力的分裂抗体与MKN45细胞的结合。使用人IgG特异性二级抗体进行抗体检测。
图6显示用于展现DOTAM结合能力的分裂抗体与MKN45细胞的结合。使用Pb-DOTAM-FITC进行抗体检测。
图7A显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中进行的利用CEA-分裂-DOTAM-VH/VL的二步PRIT的例示性方案(h＝小时，d＝天，w＝周)。
图7B显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中进行的三步PRIT对照的例示性方案(h＝小时，d＝天，w＝周)。
图8显示在注射经单独CEA-分裂-DOTAM-VH、单独CEA-分裂-DOTAM-VL或合并两个互补抗体预靶向或使用标准三步PRIT的212Pb-DOTAM之后6小时预靶向212Pb-DOTAM在携有SCBxPC3肿瘤的SCID小鼠中的生物分布(％ID/g±SD，n＝4)。
图9显示在SCID小鼠中IV注射之后的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL药物动力学。
图10显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中在2步(顶部)或3步(底部)中包含CEA-PRIT的方案158的实验设计。*CEA分裂DOTAM BsAb剂量经调节以补偿2/4构建物中的穴/穴杂质。
图11显示预靶向212Pb-DOTAM在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的生物分布(6hp.i.)。分布属于在注射经CEA-DOTAM BsAb或CEA-分裂-DOTAM抗体的双互补位组合预靶向的212Pb-DOTAM之后6小时携带肿瘤的SCID小鼠中的212Pb。器官及组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝4)。
图12显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中包含3步CEA-PRIT(顶部)、2步CEA-PRIT(中间)或1步CEA-RIT的一个循环的方案160的实验排程。在放射性注射之后24小时对生物分布(BD)侦察小鼠进行安乐死，而谨慎地维持且监测功效组中的小鼠直至达到终止准则为止。
图13显示预靶向212Pb-DOTAM及212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中的生物分布(24h p.i.)。分布属于在注射经CEA-DOTAM预靶向的212Pb-DOTAM或经预培育的212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM之后24小时携带肿瘤的SCID小鼠中的212Pb。器官及组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝3)。
图14显示BxPC3模型中PRIT治疗组及对照(A-E组)的肿瘤生长平均值+标准误差(n＝10)。曲线截短在n<5。竖点线指示根据研究设计的一些组或所有组的212Pb-DOTAM施用(20μCi)。
图15显示BxPC3模型中PRIT治疗组及对照(A-E组)的个别肿瘤生长曲线(n＝10)。竖点线指示212Pb标记化合物施用(20μCi)。
图16显示BxPC3模型中经CEA-PRIT及CEA-RIT治疗的小鼠(A-E组，n＝10)的平均体重损失。曲线截短在n<5。竖点线指示根据研究设计的一些组或所有组的212Pb标记化合物施用。
图17显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中包含二步CEA-PRIT的方案175的实验设计，其中在注射212Pb-DOTAM之后24小时进行处死及尸体剖检。CEA-分裂-DOTAM-VH-AST剂量经调节以补偿穴/穴杂质。
图18显示在注射经CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体预靶向的212Pb-DOTAM之后24小时212Pb在携带肿瘤的SCID小鼠中的分布(方案175)。器官及组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝4)。
图19显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中包含二步CEA-PRIT的方案185的实验设计，其中在注射212Pb-DOTAM之后6小时进行处死及尸体剖检。CEA-分裂-DOTAM-VH-AST(CH1A1A)剂量经调节以补偿穴/穴杂质。
图20显示在注射经CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体预靶向的212Pb-DOTAM之后6小时212Pb在携带肿瘤的SCID小鼠中的分布(方案185)。器官及组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD(n＝5)。
图21显示在注射之后7天CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对(合并VH及VL抗体)在两个所选SC BxPC3肿瘤中的分布。A及B显示来自注射有靶向T84.66的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL的小鼠A3的肿瘤切片，其中A显示CEA表达且B显示对应CEA-分裂-DOTAM-VH/VL分布。C及D显示来自注射有靶向CH1A1A的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL的小鼠C5的肿瘤切片：C显示CEA表达且D显示对应CEA-分裂-DOTAM-VH/VL分布。
图22显示在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中包含二步CEA-PRIT的方案189的实验设计，其中在注射212Pb-DOTAM之后6小时进行处死及尸体剖检。CEA-分裂-DOTAM-VH-AST(CH1A1A)剂量经调节以补偿穴/穴杂质。
图23显示与阳性对照(仅CH1A1A)相比在注射经CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体(T84.66及CH1A1A)的双互补位对预靶向的212Pb-DOTAM之后6小时212Pb在携带肿瘤的SCID小鼠中的分布。器官及组织中的放射性含量表示为平均％ID/g±SD。
图24显示如通过FACS所测定的SPLIT抗体的平均荧光强度(MFI)。通过FACS测定的Pb-DOTA-FITC的结合可仅针对两个SPLIT抗体与Pb-DOTA-FITC的共培育而显示。单SPLIT抗体不产生有效信号。
图25A-C显示如本文所描述的抗体的例示性格式。
图26显示评估个别TA-分裂-DOTAM-VH及TA-分裂-DOTAM-VL抗体与于芯片上捕获的经生物素标记DOTAM的结合的实施例11实验1的结果。
图27显示评估DOTAM与于芯片上捕获的个别TA-分裂-DOTAM-VH及TA-分裂-DOTAM-VL抗体的结合的实施例11实验2的结果。
图28显示评估DOTAM与于芯片上捕获的TA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体(抗体对)的结合的实施例11实验3的结果。
发明详述
定义
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含衍生自如下文所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含人免疫球蛋白框架或人共有框架的相同氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些方面中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些方面中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列具有序列一致性。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与该分子结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用的“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法，包括本文所描述的方法来测量。用于测量结合亲和力的特定说明性及例示性方法描述于以下中。
“亲和力成熟的”抗体指相较于亲本抗体而言在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，该亲本抗体不具有所述改变，所述改变引起抗体对抗原的亲和力改善。
术语“结合至于靶细胞表面上表达的抗原的抗体”指能够以足以使得抗体在靶向该抗原中可用作诊断剂和/或治疗剂的亲和力结合该抗原的抗体。在一个方面中，如例如通过表面等离振子共振(SPR)所测量，抗体与不相关非抗原蛋白的结合程度小于抗体与抗原的结合的约10％。在某些方面中，结合至于靶细胞表面上表达的抗原的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。据称当抗体的KD为1μM或更小时，抗体“特异性结合”至于靶细胞表面上表达的抗原。在某些方面中，抗体结合至该抗原的表位，该表位在来自不同物种的该抗原当中是保守的。
术语“放射性标记化合物的抗原结合位点”或“放射性标记化合物的功能抗原结合位点”指能够以足以使得抗体可用作诊断剂和/或治疗剂的亲和力结合至放射性标记化合物以联合放射性标记化合物与抗体的包含VH域及VL域的抗原结合位点。在一个方面中，如例如通过表面等离振子共振(SPR)所测量，抗原结合位点与不相关非抗原化合物的结合程度小于抗体与放射性标记化合物的结合的约10％。在某些方面中，结合至放射性标记化合物的抗原结合位点的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。可能优选的是，其KD为100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小。举例而言，功能性结合位点可以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合放射性标记化合物。据称当抗原结合位点的KD为1μM或更小时，抗原结合位点“特异性结合”至放射性标记化合物。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，所述抗体结构包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要所述抗体片段展现所需抗原结合活性即可。
“抗体片段”指除完整抗体以外包含完整抗体的一部分的分子，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、交叉Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv及scFab)；单域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Holliger及Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136(2005)。因此，术语“Fab片段”指包含有包含VL域及CL域的轻链以及包含VH域及CH1域的重链片段的抗体片段。“Fab'片段”与Fab片段的不同之处在于，在包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸的CH1域的羧基端处添加有残基。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab及F(ab')2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指其中重链及轻链的可变区或恒定区经互换的Fab片段。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)及重链恒定区1(CH1)构成的多肽链以及由重链可变区(VH)及轻链恒定区(CL)构成的多肽链。不对称Fab臂也可通过将带电荷或不带电荷氨基酸突变引入域界面中以指导正确Fab配对来进行工程改造。参见例如WO 2016/172485。
“单链可变片段”或“scFv”是通过肽接头连接的抗体重链(VH)及轻链(VL)可变域的融合蛋白。特别是接头为具有10至25个氨基酸的短多肽，且通常富含甘氨酸以获得柔性以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，且可连接VH的N端与VL的C端，反的亦然。不管恒定区移除及接头引入如何，此蛋白质仍保持原始抗体的特异性。对于scFv片段的概述，参见例如Plückthun,在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷中,Rosenburg及Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；亦参见WO 93/16185；以及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。
术语“封闭剂”指封闭效应分子，特别是放射性标记化合物，与用于该效应分子的功能性结合位点的结合的药剂。一般而言，该封闭剂结合至效应分子的功能性结合位点，例如特异性结合至该功能性结合位点。
术语“清除剂”指提高自个体循环清除抗体的速率的药剂。一般而言，清除剂结合至抗体，例如特异性结合至抗体。
如本文所使用的术语“清除步骤”或“清除阶段”涵盖封闭剂或清除剂的使用。一些药剂可充当清除剂且充当封闭剂。
术语“表位”指示抗体所结合的蛋白质或非蛋白质抗原上的位点。表位可由相连氨基酸伸长段(线性表位)或包含例如由于抗原折叠，亦即因蛋白质抗原的三级折叠而在空间上邻近的非相连氨基酸(构象表位)所形成。线性表位通常在蛋白质抗原暴露于变性剂之后仍与抗体结合，而构象表位通常在经变性剂处理之后受到破坏。表位在独特空间构象中包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8-10个氨基酸。
针对结合至特定表位的抗体(亦即结合至相同表位的抗体)的筛选可使用本领域中的常规方法来进行，所述方法诸如但不限于丙氨酸扫描、肽墨点法(参见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463)、肽裂解分析、表位切除、表位提取、抗原化学修饰(参见Prot.Sci.9(2000)487-496)以及交叉封闭(参见“Antibodies”,Harlow及Lane(ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)。
基于抗原结构的抗体剖析(ASAP)亦称为修饰辅助剖析(MAP)，允许基于来自特异性结合至抗原的一群单克隆抗体的抗体每一个抗体与经化学修饰或经酶修饰的抗原表面的结合概况来对该群单克隆抗体进行分仓(参见例如US 2004/0101920)。每个仓中的抗体结合至相同表位，该相同表位可为与由另一组所表示的表位截然不同或部分重叠的独特表位。
此外，竞争性结合可用于容易地判定抗体是否结合至与参照抗体相同的表位，或是否与参照抗体竞争结合。举例而言，“结合至与参照抗体相同的表位的抗体”指在竞争分析中封闭参照抗体与其抗原的结合达50％或更高的抗体，且相反，参照抗体在竞争分析中封闭该抗体与其抗原的结合达50％或更高。此外，举例而言，为判定抗体是否结合至与参照抗体相同的表位，使参照抗体在饱和条件下结合至抗原。在移除过量参照抗体之后，评估所讨论的抗体结合至抗原的能力。若所讨论的抗体能够在参照抗体饱和结合之后结合至抗原，则可得出结论：所讨论的抗体结合至与参照抗体不同的表位。但，若所讨论的抗体不能在参照抗体饱和结合之后结合至抗原，则所讨论的抗体可能结合至与参照抗体所结合的表位相同的表位。为确认所讨论的抗体为结合至相同表位或仅由于空间原因而结合受阻，可使用常规实验(例如使用ELISA的肽突变及结合分析、RIA、表面等离振子共振、流式细胞术或本领域中可获得的任何其它定量或定性抗体结合分析)。此分析应在两种设置下进行，亦即，在两种抗体均为饱和抗体的情况下进行。若在两种设置下，仅第一(饱和)抗体能够结合至抗原，则可得出结论：所讨论的抗体及参照抗体竞争结合至抗原。
在一些方面中，若如在竞争结合分析中所测量，过量1倍、5倍、10倍、20倍或100倍的一个抗体将另一抗体的结合抑制至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更高，则两个抗体视为结合至相同或重叠表位(参见例如Junghans et al.,Cancer Res.50(1990)1495-1502)。
在一些方面中，若抗原中减弱或消除一个抗体的结合的基本上所有氨基酸突变也减弱或消除另一抗体的结合，则两个抗体视为结合至相同表位。若减弱或消除一个抗体的结合的氨基酸突变仅有一个子集减弱或消除另一抗体的结合，则两个抗体视为具有“重叠表位”。
术语“嵌合”抗体指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，同时该重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
抗体“类别”指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些抗体中的几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。在某些方面中，抗体为IgG1同种型。在某些方面中，抗体为具有用于减弱Fc区效应功能的P329G、L234A及L235A突变的IgG1同种型。在其它方面中，抗体为IgG2同种型。在某些方面中，抗体为具有用于改善IgG4抗体稳定性的铰链区中S228P突变的IgG4同种型。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。抗体轻链可基于其恒定域的氨基酸序列归为称为κ(kappa)及λ(lambda)的两个类型中的一个。
“效应功能”指随抗体同种型而变化的可归因于抗体的Fc区的那些生物活性。抗体效应功能的例子包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；以及B细胞活化。
药剂(例如药物组合物)的“有效量”指在必需剂量下且持续必需时间段有效地达成所需治疗结果或预防结果的量。
术语“串联Fab”指包含经由肽接头/系链连接的两个Fab片段的抗体。在一些实施方案中，串联Fab可包含通过肽接头/系链连接的一个Fab片段及一个交叉Fab片段。
术语“Fc区”在本文中用于界定含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C端区。该术语包括原生序列Fc区及变异Fc区。在一个方面中，人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，宿主细胞所产生的抗体可能经历自重链的C端开始的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后裂解。因此，宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子所产生的抗体可包括全长重链，或其可包括全长重链的经裂解变体。此情况可以是重链的最末两个C端氨基酸为甘氨酸(G446)及赖氨酸(K447，根据EU索引编号)的情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)或C端甘氨酸(Gly446)及赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。在一个方面中，包括如本文所规定、包含于本发明的抗体中的Fc区的重链包含另一C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446及K447，根据EU索引编号)。在一个方面中，包括如本文所规定、包含于本发明的抗体中的Fc区的重链包含另一C端甘氨酸残基(G446，根据EU索引编号)。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除互补决定区(CDR)以外的可变域残基。可变域的FR一般由以下四个FR域组成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，在VH(或VL)中，CDR序列及FR序列一般以以下序列形式出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换使用以指代具有实质上与天然抗体结构类似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞株”及“宿主细胞培养物”可互换使用且指已引入有外源核酸的细胞，包括所述细胞之后代。宿主细胞包括“转化体”及“经转化细胞”，所述“转化体”及“经转化细胞”包括原代经转化细胞及在不考虑传代数目的情况下自其衍生的后代。后代的核酸内容物与母亲本细胞可能不完全一致，而是可能含有突变。本文包括具有与在原始经转化细胞中所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体后代。
“人抗体”指具有与人类或人类细胞所产生或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。此人抗体定义明确地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”指表示人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。一般而言，该精选人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变域序列亚组。一般而言，该序列子组为如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个方面中，对于VL，该亚组为如Kabat et al.,同前文献中的亚组κI。在一个方面中，对于VH，该亚组为如Kabat et al.,同前文献中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人CDR的氨基酸残基及来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些方面中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个如下的可变域，其中全部或基本上全部CDR对应于非人抗体的CDR，且全部或基本上全部FR对应于人抗体的FR。任选地，人源化抗体可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经历人源化的抗体。
如本文所使用的术语“高变区”或“HVR”指具序列高变性且决定抗原结合特异性的抗体可变域的区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
一般而言，抗体包含六个CDR：VH中的三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及VL中的三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的例示性CDR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)处的高变环(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)处的CDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)处的抗原接点(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指示，否则CDR根据Kabat et al.,同前文献来确定。本领域技术人员应理解，CDR名称也可根据以下来确定：Chothia，同前文献；McCallum，同前文献；或任何其它科学上所接受的命名法系统。代替上文，如本文所描述的CDR-H1的序列可自Kabat26延伸至Kabat35，例如对于Pb-DOTAM结合可变域而言。
在一个方面中，CDR残基包含在序列表中或本说明书中其它地方识别的CDR残基。
除非另外指示，否则可变域中的HVR/CDR残基及其它残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat et al.,同前文献来进行编号。
“免疫缀合物”为缀合至一个或多个异源分子的抗体，包括但不限于细胞毒性剂。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家畜(例如母牛、绵羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如人及诸如猴的非人灵长类动物)、兔以及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些方面中，个体或受试者是人。
如本文所描述的分子可为“经分离”的。“经分离”抗体为已与其天然环境的组分分离的抗体。在一些方面中，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)方法所测定，抗体经纯化至大于95％或99％纯度。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。各核苷酸由碱基，具体言之嘌呤或嘧啶碱基(亦即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即脱氧核糖或核糖)及磷酸基团构成。核酸分子常常通过碱基序列描述，由此所述碱基表示核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常自5'至3'表示。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)及基因组DNA；核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)；DNA或RNA的合成形式；以及包含这些分子中的两个或更多个的混合聚合物。核酸分子可为线性或环状的。另外，术语核酸分子包括有义链及反义链以及单链形式及双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生化的糖或磷酸主链连接的经修饰核苷酸碱基或经化学修饰的残基。核酸分子还涵盖适和作为用于在体外和/或在体内，例如在宿主或患者中直接表达本发明抗体的载体的DNA及RNA分子。该DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可不经修饰或经修饰。举例而言，mRNA可经化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或经编码分子的表达，以使得可将mRNA注射入受试者以在体内生成抗体(参见例如Stadler et al.,Nature Medicine 2017,2017年6月12日在线发布,doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823B1)。
“经分离”核酸指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。经分离核酸包括一般含有核酸分子的细胞中所含有的该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
“编码抗体的经分离核酸”指编码抗体重链及轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，亦即除可能性变异抗体(例如含有天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间产生的变异抗体，所述变体一般少量存在)之外，构成该群体的个别抗体具有一致性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。举例而言，本发明的单克隆抗体可通过多种技术制造，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、本文所描述的用于制造单克隆抗体的所述方法及其它例示性方法。
“裸抗体”指不缀合至异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。举例而言，原生IgG抗体为约150,000道尔顿(dalton)的由二硫键键合的两个一致轻链及两个一致重链构成的杂四聚体糖蛋白。各重链自N端至C端具有可变域(VH)，该VH又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定重域(CH1、CH2及CH3)。类似地，各轻链自N端至C端具有可变域(VL)，该VL又称作可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域。
术语“药品说明书”用于指通常包括于治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用所述治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌和/或警告的信息。
关于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列且必要时引入缺口以达成最大序列一致性百分比且出于比对的目的不将任何保守替代视为序列一致性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基具有一致性的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的而进行的比对可以本领域内的各种方式，例如使用公开可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包的来达成。本领域技术人员可确定适用于比对序列的参数，包括在所比较的序列全长内达成最大比对所需的任何算法。或者，一致性百分比值可使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比较计算机程序为由Genentech公司撰写，且源码已与华盛顿哥伦比亚特区美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)中的使用者文件一起提交，其中其以美国版权登记号TXU510087登记且描述于WO2001/007611中。
出于本文的目的，除非另外指示，否则氨基酸序列一致性百分比值使用FASTA套装36.3.8c版或更新版的ggsearch程序，用BLOSUM50比较矩阵生成。FASTA程序包为由W.R.Pearson及D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；及Pearson et al.(1997)Genomics 46:24-36撰写，且公开获自www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。或者，可使用可通过fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi访问的公共服务器，使用ggsearch(整体蛋白质:蛋白质)程序及默认选项(BLOSUM50；open：-10；ext：-2；Ktup＝2)以确保执行整体比对而非局部比对来比较序列。氨基酸一致性百分比在输出比对标题中给出。
术语“药物组合物”或“药物制剂”指呈便于准许其中所含活性成分的生物活性有效的形式且不含有对施用有药物组合物的受试者具有不可接受毒性的额外组分的制剂。
“药学上可接受的载剂”指药物组合物或制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另外指示，否则所提及的如本文所使用的靶抗原指来自任何脊椎动物来源的任何原生靶抗原，该任何脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)的哺乳动物。该术语涵盖“全长”、未经加工的靶抗原以及由细胞中的加工产生的靶抗原的任何形式。该术语亦涵盖靶抗原的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。举例而言，靶抗原CEA可具有示于UniProt(www.uniprot.org)寄存编号P06731(型号119)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004354.2中的人类CEA，特别是癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)的氨基酸序列。靶抗原的另一例子为纤维母细胞活化蛋白(FAP)。人类FAP的氨基酸序列示于UniProt(www.uniprot.org)寄存编号Q12884(型号149)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。靶抗原的另一例子为GPRC5D(对于人类序列，参见UniProt编号Q9NZD1(型号115)；NCBI RefSeq编号NP_061124.1)。
如本文中所提及的术语“分裂抗体(split antibody/split antibodies)”、“单域分裂抗体”或“SPLIT PRIT”是指一起形成能够结合至放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域及VL域在两个抗体之间分裂，且不作为同一抗体的一部分存在(在体内装配之前)。“靶向CEA的SPLIT PRIT”指靶向CEA的分裂抗体。术语“SPLIT PRIT”也可与术语“TA-分裂-DOTAM-VH/VL”(例如其中“TA”或靶抗原为CEA、FAP或GPRC5D)互换使用。术语“靶向CEA的SPLIT PRIT”可与术语“CEA-分裂-DOTAM-VH/VL”互换使用。
如本文所使用的“治疗(treatment)”(及其文法变化形式，诸如“治疗(treat/treating)”)指试图改变所治疗个体的疾病的自然过程且可出于预防或在临床病理学过程期间执行的临床介入。所需治疗效果包括但不限于预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性结果、预防转移、减缓疾病恶化速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改进预后。在一些方面中，本发明抗体用于推迟疾病发展或用于减慢疾病恶化。
术语“可变区”或“可变域”指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的域。天然抗体的重链及轻链的可变域(分别为VH及VL)一般具有类似结构，其中各域包含四个保守框架区(FR)及三个互补决定区(CDR)。(参见例如,Kindt et al.Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单一VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合抗原的抗体的VH域或VL域以分别筛选互补VL域或VH域的库来进行分离。参见例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所使用的术语“载体”指能够传播其所连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括呈自我复制核酸结构形式的载体以及并入已引入有其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导其可操作地连接的核酸的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所使用的术语“Pb”或“铅”包括例如Pb(II)的其离子。所提及的其它金属亦包括其离子。因此，举例而言，熟练读者理解术语铅、Pb、212Pb或203Pb意欲涵盖该元素的离子形式，特别是Pb(II)。
II.组合物及方法
在一个方面中，本发明部分基于包含第一抗体及第二抗体的一组抗体，其中各抗体可结合至靶细胞上的抗原，但其中用于效应剂的功能抗原结合位点仅在第一抗体及第二抗体彼此联合时形成。本发明抗体例如可用于预靶向免疫疗法和/或预靶向成像的方法。在优选方面中，所述方法去除施用清除剂或封闭剂的步骤。
A.靶抗原
于靶细胞表面上表达的抗原本文中也称为“靶抗原”。
在本发明涉及治疗方法且关于用于所述治疗方法中的产品的情况下，其适用于可通过靶向患者细胞，例如病变细胞的细胞毒性活性治疗的任何病况。因此，靶细胞是需要靶向细胞毒性的任何细胞，例如任何病变细胞。治疗优选属于肿瘤或癌症。然而，本发明的适用性不限于肿瘤及癌症。举例而言，治疗也可属于病毒感染(通过靶向受感染细胞)或经T细胞驱动的自体免疫疾病(通过靶向T细胞)。已针对诸如HIV、狂犬病及EBV的各种病毒感染研究针对于受感染细胞表面上表达的病毒抗原的免疫毒素。Cai及Berger 2011AntiviralResearch 90(3):143-50使用含有PE38的免疫毒素以靶向杀灭感染卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)的细胞。另外，
Figure BDA0003535314770000201
(A-dmDT390-bisFv(UCHT1))选择性地杀灭人类恶性T细胞且短暂耗尽正常T细胞，且视为能够治疗诸如多发性硬化症及移植物抗宿主疾病的经T细胞驱动的自体免疫疾病以及其所经历的临床试验所针对的T细胞血癌。同样，本发明的方法可适用于需要放射成像的任何细胞类型，包括但不限于癌细胞或肿瘤细胞。
因此，合适靶抗原可包括癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原。
抗原通常为过度表达或在异常时间表达的正常细胞表面抗原。理想地，靶抗原仅在病变细胞(诸如肿瘤细胞)上表达，然而，在实践中很少观测到此种情况。因此，靶抗原通常基于病变组织与健康组织之间的差异表达来加以选择。
举例而言，细胞表面标记物或靶抗原可为肿瘤相关抗原。
如本文所使用的术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤特异性抗原”指仅仅或主要由肿瘤细胞和/或癌细胞或由诸如癌症相关纤维母细胞的其它肿瘤基质细胞表达或过度表达以使得抗原与一或多种肿瘤和/或一或多种癌症相关联的任何分子(例如蛋白质、肽、脂质、碳水化合物等)。肿瘤相关抗原可另外由正常、非肿瘤或非癌细胞表达。然而，在所述情况下，由正常、非肿瘤或非癌细胞进行的肿瘤相关抗原表达不如由肿瘤细胞或癌细胞进行的表达稳健。在此方面，与由正常、非肿瘤或非癌细胞进行的抗原表达相比，肿瘤细胞或癌细胞可能会过度表达抗原或以显著较高水平表达抗原。此外，肿瘤相关抗原可另外由发育或成熟的不同状态的细胞表达。举例而言，肿瘤相关抗原可另外由胚胎或胎儿阶段的细胞表达，所述细胞通常在成年宿主中找不到。或者，肿瘤相关抗原可另外由干细胞或前体细胞表达，所述细胞通常在成年宿主中找不到。
肿瘤相关抗原可为由任何癌症或肿瘤，包括本文所描述的癌症及肿瘤的任何细胞表达的抗原。肿瘤相关抗原可为仅一种类型的癌症或肿瘤的肿瘤相关抗原以使得肿瘤相关抗原与仅一种类型的癌症或肿瘤相关联或为仅一种类型的癌症或肿瘤的特征。或者，肿瘤相关抗原可为超过一种类型的癌症或肿瘤的肿瘤相关抗原(例如可为特征性的)。举例而言，肿瘤相关抗原可由乳癌细胞及前列腺癌细胞表达，且完全不由正常、非肿瘤或非癌细胞表达。
本发明抗体可结合的例示性肿瘤相关抗原包括但不限于粘蛋白1(MUCl；肿瘤相关上皮粘蛋白)、黑色素瘤的优先表达抗原(PRAME)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PSCA、EpCAM、Trop2(滋胚层-2，亦称为EGP-1)、颗粒球-巨噬细胞群落刺激因子受体(GM-CSFR)、CD56、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)(亦称为erbB-2)、CDS、CD7、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)I及TRP2。在另一实施方案中，肿瘤抗原可选自由以下组成的群：分化簇(CD)19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33(唾液酸结合Ig样凝集素3，骨髓细胞表面抗原)、CD79b、CD123(介白素3受体α)、运铁蛋白受体、EGF受体、间皮素、钙粘蛋白、刘易斯Y(LewisY)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、FAP(纤维母细胞活化蛋白α)、GPRC5D(G蛋白偶联受体C类第5群成员D)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、CA9＝CAIX(碳酸酐酶IX)、Ll CAM(神经细胞粘附分子L1)、内皮唾酸蛋白、HER3(表皮生长因子受体家族成员3的经活化构象)、Alkl/BMP9复合物(未分化淋巴瘤激酶1/骨成形性蛋白9)、TPBG＝5T4(滋胚层糖蛋白)、ROR1(受体酪氨酸激酶样表面抗原)、HER1(表皮生长因子受体的活化构象)及CLL1(C型凝集素域家族12成员A)。间皮素在例如卵巢癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、输卵管癌、头颈癌、宫颈癌及胰脏癌中表达。CD22在例如毛细胞白血病、慢性淋巴球性白血病(CLL)、前淋巴球白血病(PLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、小淋巴球淋巴瘤(SLL)及急性淋巴白血病(ALL)中表达。CD25在例如白血病及淋巴瘤，包括毛细胞白血病及霍奇金氏淋巴瘤中表达。刘易斯Y抗原在例如膀胱癌、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肺癌及胰脏癌中表达。CD33在例如急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓单核球性白血病(CML)及骨髓增生病中表达。
特异性结合至肿瘤相关抗原的例示性抗体包括但不限于抗运铁蛋白受体抗体(例如HB21及其变体)、抗CD22抗体(例如RFB4及其变体)、抗CD25抗体(例如Tac抗体及其变体)、抗间皮素抗体(例如SS 1、MORAb-009、SS、HN1、HN2、MN、MB及其变体)及抗刘易斯Y抗原抗体(例如B3及其变体)。在此方面，靶向部分(细胞结合剂)可为选自由B3、RFB4、SS、SS1、MN、MB、HN1、HN2、HB21及MORAb-009组成的群的抗体及其抗原结合部分。适用于本发明嵌合分子中的别的例示性靶向部分公开于例如以下中：美国专利5,242,824(抗运铁蛋白受体)；美国专利5,846,535(抗CD25)；美国专利5,889,157(抗刘易斯Y)；美国专利5,981,726(抗刘易斯Y)；美国专利5,990,296(抗刘易斯Y)；美国专利7,081,518(抗间皮素)；美国专利7,355,012(抗CD22及抗CD25)；美国专利7,368,110(抗间皮素)；美国专利7,470,775(抗CD30)；美国专利7,521,054(抗CD25)；及美国专利7,541,034(抗CD22)；美国专利申请公开案2007/0189962(抗CD22)；Frankel et al.,Clin.Cancer Res.,6:326-334(2000)；以及Kreitmanet al.,AAPS Journal,8(3):E532-E551(2006)，通过援引将它们每一项收入本文中。
已培养靶向包括以下的特异性肿瘤相关抗原的另外抗体：畸胎瘤衍化生长因子(Cripto)、CD30、CD19、CD33、糖蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、CD56(NCAM)、CD22(Siglec2)、CD33(Siglec3)、CD79、CD138、PSCA、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、CD20、CD70、E-选择蛋白、EphB2、黑色素运铁蛋白、Muc16及TMEFF2。以上抗体中的任一者或其抗原结合片段可适用于本发明中，亦即可并入本文所描述的抗体中。
在本发明的一些实施方案中，可能优选的是，肿瘤相关抗原为癌胚抗原(CEA)。
CEA在本发明的上下文中是有利的，这是因为其内化相对缓慢，且因此在初始处理之后高百分比的抗体将保持在细胞表面上可用，以结合至放射性核素。其它低内化靶标/肿瘤相关抗原亦可为优选的。肿瘤相关抗原的其它例子包括CD20或HER2。在再另一实施方案中，靶标可为EGP-1(上皮糖蛋白-1，亦称为滋胚层-2)、结肠特异性抗原-p(CSAp)或胰腺粘蛋白MUC1。参见例如以引用的方式并入本文中的Goldenberg et al.2012(Theranostics 2(5))。此参考文献亦描述诸如以下的抗体：结合至CSAp的Mu-9(亦参见Sharkey etal.Cancer Res.2003；63:354-63)、结合至MUC1的hPAM4(亦参见Gold et al.CancerRes.2008:68:4819-26)、结合至CD20的维妥珠单抗(veltuzumab)(亦参见Sharkey etal.Cancer Res.2008；68:5282-90)及结合至EGP-1的hRS7(亦参见Cubas et al.BiochimBiophys Acta 2009；1796:309-14)。以上抗体中的任一者或其抗原结合部分可适用于本发明中，亦即可并入本文所描述的抗体中。已培养的抗CEA抗体的一个例子为T84.66(如NCBI寄存编号：用于重链的CAA36980及用于轻链的CAA36979中所示，或如WO2016/075278的SEQID NO 317及318中所示)以及其人源化及嵌合型式，诸如如WO2016/075278A1和/或WO2017/055389中所描述的T84.66-LCHA。另一例子为作为如WO2012/117002及WO2014/131712中所描述的抗CEA抗体的CH1A1a；及CEA hMN-14(亦参见US 6 676 924及US 5 874 540)。另一抗CEA抗体为如M.J.Banfield et al.,Proteins 1997,29(2),161-171中所描述的A5B7。衍生自鼠抗体A5B7的人源化抗体已公开于WO 92/01059及WO 2007/071422中。亦参见共同未决申请案PCT/EP2020/067582。A5B7的人源化型式的例子为A5H1EL1(G54A)。另一例示性抗CEA抗体为US7626011和/或共同未决申请案PCT/EP2020/067582中所描述的MFE23及其人源化型式。抗CEA抗体的再另一例子为28A9。以上抗体中的任一者或其抗原结合片段可用于形成本发明中的CEA结合部分。
在一些实施方案中，FAP(纤维母细胞活化蛋白α)或GPRC5D(G蛋白偶联受体C类第5群成员D)亦可为优选的。FAP为成像及疗法的已建立靶标，这是归因于其在例如胰脏癌、乳癌及肺癌的多个肿瘤类型的微环境中的广泛表达(Lindner,T.,Loktev,A.,Giesel,F.etal.Targeting of activated fibroblasts for imaging and therapy.EJNMMIradiopharm.chem.4,16(2019))。因此，期望使用FAP-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的SPLIT PRIT在经活化癌症相关纤维母细胞上生成212Pb-DOTAM的特异性积聚。因此，期望除邻接肿瘤细胞上的受限直接肿瘤杀灭效应之外，所发射的α辐射亦不利地影响表达FAP的恶性肿瘤的免疫抑制。G蛋白偶联受体家族C第5群成员D(GPRC5D)在多发性骨髓瘤浆细胞上过度表达(Atamaniuk J,Gleiss A,Porpaczy E,Kainz B,Grunt TW,Raderer M,etal.Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow isassociated with poor prognosis inpatients with multiple myeloma.Eur J ClinInvest.2012；42:953-60.)，且已建立SC(皮下)体内模型反映在多发性骨髓瘤患者中发现的例如OPM-2及NCI-H929表达(Kodama T,Kochi Y,Nakai W,Mizuno H,Baba T,Habu K,etal.Anti-GPRC5D/CD3 bispecific T-cell-redirecting antibody for the treatmentof multiple myeloma.Mol Cancer Ther.(2019)18:1555-64)。因此，我们期望使用GPRC5D-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的SPLIT PRIT生成212Pb-DOTAM的肿瘤特异性积聚、接着是经辐射诱导的肿瘤细胞死亡。
在一些实施方案中，本发明抗体可特异性结合至靶抗原(例如本文所论述的靶抗原中的任一者)。在一些实施方案中，其可以≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-7M或更小，例如10-7M至10-13M；10-8M或更小，例如10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)结合。
第一抗体及第二抗体各自结合至可称为“抗原A”的相同靶抗原(亦即所述抗体对相同靶抗原具有结合特异性)。所述抗体可各自对抗原A上的相同表位具有结合特异性。或者，第一抗体可结合至抗原A上的第一表位且第二抗体可结合至不同的抗原A上的第二表位。举例而言，在一个实施方案中，所述抗体中之一者可结合至CEA的T84.66表位且另一者可结合至CEA的A5B7表位。
在一些实施方案中，对于抗原A而言，第一抗体和/或第二抗体中的一者或两者可为双互补位的-亦即，个别抗体的每一个可结合至抗原A的两个不同表位。第一抗体可包含分别结合至抗原A的第一表位及第二表位的第一结合位点及第二结合位点，其中第一表位及第二表位彼此不同。或者/另外，第二抗体可包含结合至抗原A的第一表位及第二表位的第一结合位点及第二结合位点，其中第一表位及第二表位彼此不同。在一些实施方案中，第一抗体所结合的表位中之一者或两者可与第二抗体所结合的表位中之一者或两者不同。在其它实施方案中，第一抗体所结合的两个表位可与第二抗体所结合的两个表位相同。
B.放射性标记化合物
根据本发明，第一抗体及第二抗体的联合形成用于效应分子的功能性结合位点。本发明的效应分子为包含放射性同位素的放射性标记化合物，例如为放射性标记半抗原。
在一些实施方案中，效应分子可包含螯合的放射性同位素。
在一些实施方案中，用于效应分子的功能性结合位点可结合至包含螯合剂及放射性同位素的螯合物。在其它实施方案中，抗体可结合至与经螯合放射性同位素缀合的部分，例如组胺-丁二酰基-甘氨酸(HSG)、地高辛配基(digoxigenin)、生物素或咖啡因。
举例而言，螯合剂可为诸如氨基多羧酸或氨基多硫羧酸或其盐或功能性变体的多齿分子。举例而言，螯合剂可为双齿或三齿或四齿的。合适金属螯合剂的例子包括包含以下的分子：EDTA(乙二胺四乙酸或诸如CaNa2EDTA的盐形式)、DTPA(二乙烯乙三胺五乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、NOTA(2,2',2”-(1,4,7-三氮杂壬烷-1,4,7-三基)三乙酸)、IDA(亚胺二乙酸)、MIDA((甲基亚氨基)二乙酸)、TTHA(3,6,9,12-四(羧甲基)-3,6,9,12-四氮杂十四烷二酸)、TETA(2,2',2”,2”'-(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四基)四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、HEHA(1,4,7,10,13,16-六氮杂环十六烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸，可获自Macrocyclics公司,Plano,Texas)、NTA(氮基三乙酸)、EDDHA(乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯乙酸)、BAL(2,3,-二巯基丙醇)、DMSA(2,3-二巯基丁二酸)、DMPS(2,3-二巯基-1-丙磺酸)、D-青霉胺(B-二甲基半胱氨酸)、MAG3(巯基乙酰基三甘氨酸)、Hynic(6-肼基吡啶-3-甲酸)、对异硫氰基苄基-去铁胺(例如经锆标记以进行成像)及其能够螯合金属的盐或功能性变体/衍生物。在一些实施方案中，可能优选的是，螯合剂为DOTA或DOTAM或其能够螯合金属的盐或功能性变体/衍生物。因此，螯合剂可为或可包含具有与其螯合的放射性同位素的DOTA或DOTAM。
效应分子可包含以下或由以下组成：上文螯合剂的功能性变体或衍生物以及放射性核素。合适变体/衍生物具有在某种有限程度上有所不同的结构且保持充当螯合剂的能力(亦即，保持足以用于本文所描述的目的中的一个或多个的活性)。功能性变体/衍生物亦可包括缀合至一个或多个额外部分或取代基的如上文所描述的螯合剂，包括小分子、多肽或碳水化合物。此连接可例如在螯合剂的主链部分中经由构成碳中之一者发生。举例而言，合适取代基可为烃基，诸如烷基、烯基、芳基或炔基；羟基；醇基；卤素原子；硝基；氰基；磺酰基；硫醇基；氨基；氧代基；羧基；硫羧基；羰基；酰胺基；酯基；或杂环基，包括杂芳基。举例而言，取代基可为下文针对基团“R1”所定义的取代基中之一者。举例而言，小分子可为染料(诸如Alexa 647或Alexa488)、生物素或生物素模块或苯基或苄基模块。举例而言，多肽可为例如具有两个或三个氨基酸的寡肽的寡肽。例示性碳水化合物包括聚葡萄糖、直链或分支链聚合物或共聚物(例如聚亚烷基、聚(乙烯-赖氨酸)、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸、多糖或寡糖、树枝状聚合物)。衍生物亦可包括其中如上文所阐述的化合物经由接头部分连接的螯合剂化合物的多聚体。衍生物亦可包括保持螯合金属离子的能力的上文化合物的功能片段。
衍生物的特定实施例包括苄基-EDTA及羟乙基-硫脲基-苄基EDTA、DOTA-苯(例如(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)、DOTA-生物素及DOTA-TyrLys-DOTA。
在本发明的一些实施方案中，通过联合第一抗体及第二抗体形成的功能性结合位点结合至包含DOTAM及例如铅(Pb)的金属的金属螯合物。如上文所提及，“DOTAM”具有化学名称：
1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷，
其为下式化合物：
Figure BDA0003535314770000261
在某些方面及实施方案中，本发明亦可利用并入金属离子的DOTAM的功能性变体或衍生物。合适的DOTAM的变体/衍生物具有在某种有限程度上与DOTAM的结构有所不同的结构且保持起作用的能力(亦即，保持足以用于本文所描述的目的中的一个或多个的活性)。在所述方面及实施方案中，DOTAM或DOTAM的功能性变体/衍生物可为WO 2010/099536中所公开的活性变体中之一者。合适功能性变体/衍生物可为下式化合物：
Figure BDA0003535314770000271
或其药学上可接受的盐；其中
RN为H、C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基及C1-7杂芳基-C1-4烷基；其中C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基及C2-6炔基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的Rw基团取代；且其中该C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基及C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的Rx基团取代；
L1独立地为C1-6亚烷基、C1-6亚烯基或C1-6亚炔基，它们每一项任选经1、2或3个独立地选自R1基团的基团取代；
L2为C2-4直链亚烷基，其任选由经独立选择的R1基团取代；且其任选经1、2、3或4个独立地选自C1-4烷基和/或C1-4卤烷基的基团取代；
R1独立地选自D1-D2-D3、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷氧基、C1-6卤烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基亚磺酰基、C1-6烷基磺酰基、氨基、C1-6烷氨基、二C1-6烷氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基羰基氨基、二C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基羰基氨基、C1-6烷氧基羰基-(C1-6烷基)氨基、氨甲酰基、C1-6烷基氨甲酰基及二C1-6烷基氨甲酰基；
各D1独立地选自C6-10芳基-C1-4烷基、C1-9杂芳基-C1-4烷基、C3-10环烷基-C1-4烷基、C2-9杂环烷基-C1-4烷基、C1-8亚烷基、C1-8亚烯基及C1-8亚炔基；其中该C1-8亚烷基、C1-8亚烯基及C1-8亚炔基任选经1、2、3或4个经独立选择的R4基团取代；且其中该C6-10芳基-C1-4烷基、C1-9杂芳基-C1-4烷基、C3-10环烷基-C1-4烷基、C2-9杂环烷基-C1-4烷基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的R5基团取代；
各D2独立地不存在或为C1-20直链亚烷基，其中该C1-20直链亚烷基的1至6个非邻接亚甲基各自任选由经独立选择的-D4-模块置换，其限制条件为该C1-20直链亚烷基中的至少一个亚甲基单元不任选经-D4-模块置换；其中该C1-20直链亚烷基任选经一个或多个独立地选自以下的基团取代：卤素、氰基、硝基、羟基、C1-4烷基、C1-4卤烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤烷氧基、氨基、C1-4烷氨基、二C1-4烷氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷基羰基氨基、二C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基-(C1-4烷基)氨基、氨甲酰基、C1-4烷基氨甲酰基及二C1-4烷基氨甲酰基；
各D3独立地选自H、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-4烷基、C2-14杂环烷基、C2-14杂环烷基-C1-4烷基、C6-14芳基、C6-14芳基-C1-4烷基、C1-13杂芳基、C1-13杂芳基-C1-4烷基；其中该C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的R6基团取代；且其中该C3-14环烷基、C3-14环烷基-C1-4烷基、C2-14杂环烷基、C2-14杂环烷基-C1-4烷基、C6-14芳基、C6-14芳基-C1-4烷基、C1-13杂芳基、C1-13杂芳基-C1-4烷基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的R7基团取代；
各D4独立地选自-O-、-S-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝S)-、-NRbC(＝O)NRc-、-NRbC(＝S)NRc-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)NRa-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)NRa-、-OC(＝S)NRa-、-NRa-、-NRbS(＝O)NRc-及NRbS(＝O)2NRO-；
各R4及R6独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、C1-4烷氧基、C1-4卤烷氧基、C1-4烷硫基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、氨基、C1-4烷氨基、二C1-4烷氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷基羰基氨基、二C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基-(C1-4烷基)氨基、氨甲酰基、C1-4烷基氨甲酰基及二C1-4烷基氨甲酰基；
各R5独立地选自卤素、氰基、氰酸根、异硫氰酸根、硝基、羟基、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基、C1-4卤烷氧基、C1-4烷硫基、C1-4烷基亚磺酰基、C1-4烷基磺酰基、氨基、C1-4烷氨基、二C1-4烷氨基、C1-4烷基羰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、C1-4烷基羰基氨基、二C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基氨基、C1-4烷氧基羰基-(C1-4烷基)氨基、氨甲酰基、C1-4烷基氨甲酰基及二C1-4烷基氨甲酰基；
各R7独立地选自卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基、-ORO、-SRO、-S(＝O)RP、-S(＝O)2RP、-S(＝O)NRsRt、-C(＝O)RP、-C(＝O)ORP、-C(＝O)NRsRt、-OC(＝O)RP、-OC(＝O)NRsRt、-NRsRt、-NRqC(＝O)Rr、-NRqC(＝O)ORr、-NRqC(＝O)NRr、-NRqS(＝O)2Rr及-NRPS(＝O)2NRsRt；其中该C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的R'基团取代；且其中该C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的R”基团取代；
各Ra、Rb及Rc独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基；其中该C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基及C2-6炔基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的Rw基团取代；且其中该C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的Rx基团取代；
各Ro、Rp、Rq、Rr、Rs及Rt独立地选自H、C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基；其中该C1-6烷基、C1-6卤烷基、C2-6烯基、C2-6炔基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的Ry基团取代；且其中该C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-4烷基、C2-7杂环烷基、C2-7杂环烷基-C1-4烷基、苯基、苯基-C1-4烷基、C1-7杂芳基、C1-7杂芳基-C1-4烷基各自任选经1、2、3或4个经独立选择的Rz基团取代；
各R'、Rw及Ry独立地选自羟基、氰基、硝基、C1-4烷氧基、C1-4卤烷氧基、氨基、C1-4烷氨基及二C1-4烷氨基；以及
各R”、Rx及Rz独立地选自羟基、卤素、氰基、硝基、C1-4烷基、C1-4卤烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤烷氧基、氨基、C1-4烷氨基及二C1-4烷氨基；
其限制条件为不超出任选经取代的模块中各原子的价数。
适当地，上式功能性变体/衍生物对本发明抗体的亲和力与DOTAM对本发明抗体的亲和力相当或超过DOTAM对本发明抗体的亲和力，且对Pb的结合强度与DOTAM对Pb的结合强度相当或超过DOTAM对Pb的结合强度(“亲和力”是如上文所描述通过解离常数来测量的)。举例而言，功能性变体/衍生物与本发明抗体/Pb的解离常数可为DOTAM与同一抗体/Pb的解离常数的1.1倍或更小、1.2倍或更小、1.3倍或更小、1.4倍或更小、1.5倍或更小或2倍或更小。
各RN可为H、C1-6烷基或C1-6卤烷基；优选H、C1-4烷基或C1-4卤烷基。最优选地，各RN为H。
对于DOTAM变体，优选的是，1、2、3个或最优选每一个L2为C2亚烷基。有利地，DOTAM的C2亚烷基变体可对Pb具有特别地高的亲和力。L2的任选选用的取代基可为R1、C1-4烷基或C1-4卤烷基。适当地，L2的任选选用的取代基可为C1-4烷基或C1-4卤烷基。
任选地，各L2可为未经取代的C2亚烷基-CH2CH2-。
各L1优选为C1-4亚烷基、更优选C1亚烷基，诸如-CH2-。
DOTAM的功能性变体/衍生物可为下式化合物：
Figure BDA0003535314770000301
其中各Z独立地为如上文所定义的R1；p、q、r及s为0、1或2；且p+q+r+s为1或更大。优选地，p、q、r及s为0或1和/或p+q+r+s为1。举例而言，该化合物可具有p+q+r+s＝1，其中Z是对SCN-苄基模块-此类化合物可商购自Macrocyclics,Inc.(Plano,Texas)。
可用于本发明中的放射性核素可包括诸如铅(Pb)、镏(Lu)或钇(Y)的金属的放射性同位素。
在成像应用中特别有用的放射性核素可以是作为γ发射体的放射性核素。举例而言，其可选自203Pb或205Bi。
在治疗应用中特别有用的放射性核素是作为α或β发射体的放射性核素。举例而言，其可选自212Pb、212Bi、213Bi、90Y、177Lu、225Ac、211At、227Th、223Ra。
在一些实施方案中，可能优选的是，DOTAM(或其盐或功能性变体)与诸如上文所列的Pb或Bi放射性同位素中之一者的Pb或Bi螯合。在其它实施方案中，可能优选的是，DOTA(或其盐或功能性变体)与诸如上文所列的Lu或Y放射性同位素中之一者的Lu或Y螯合。
在一些实施方案中，方法及用途可包含利用例如适用于疗法的放射性同位素及适用于成像的放射性同位素的放射性同位素混合物的联合疗法及成像方法。举例而言，以上放射性同位素可以是通过相同螯合剂螯合的相同金属的不同放射性同位素。在一个实施方案中，该方法可包含施用呈混合物形式的203Pb-DOTAM及212Pb-DOTAM。在另一实施方案中，该方法可包含使用诸如203Pb或205Bi的γ发射体的剂量测定法的第一循环，接着为使用诸如212Pb、212Bi、213Bi、90Y、177Lu、225Ac、211At、227Th或223Ra的α或β发射体之一或多轮治疗。所述方法进一步描述于下文中。
在一些实施方案中，通过联合第一抗体及第二抗体形成的功能性结合位点可结合至Pb-DOTAM螯合物。
在一些实施方案中，通过联合第一抗体及第二抗体形成的功能性结合位点可特异性结合至放射性标记化合物。在一些实施方案中，其可结合至诸如Pb-DOTAM螯合物的放射性标记化合物，其中与Pb-DOTAM和/或靶标的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-7M或更小，例如10-7至10-13；10-8M或更小，例如10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)。在一些实施方案中，可能优选的是，其以100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小的结合亲和力Kd值结合。举例而言，功能性结合位点可以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合金属螯合物。
C.例示性用于DOTA的抗原结合位点
在本发明的一个特定实施方案中，第一抗体及第二抗体联合以形成用于DOTA(或其功能衍生物或变体)，例如与Lu或Y(例如177Lu或90Y)螯合的DOTA的功能性结合位点。举例而言，功能性结合位点可以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合放射性标记化合物。
C825是已知的对与诸如177Lu及90Y的放射性金属复合的DOTA-Bn(S-2-(4-氨基苄基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸)具有高亲和力的scFv(参见例如以引用的方式并入本文中的Cheal et al.2018,Theranostics 2018及WO2010099536)。本文提供C825的CDR序列以及VL及VH序列。在一个实施方案中，形成放射性标记化合物的抗原结合位点的一部分的重链可变区可包含至少一个、两个或全部三个选自以下的CDR：(a)包含35的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含36的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含37的氨基酸序列的CDR-H3。在一替代性实施方案中，CDR-H1可具有序列GFSLTDYGVH(SEQ ID NO.:148)。形成放射性标记化合物的结合位点的一部分的轻链可变区可包含至少一个、两个或全部三个选自以下的CDR：(d)包含38的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含39的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含40的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，(在第一抗体上)形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的一部分的重链可变域包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:41具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的结合位点保持优选以如本文所描述的亲和力结合至与Lu或Y复合的DOTA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:41中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在CDR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，抗体包含SEQID NO:41中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或序列GFSLTDYGVH(SEQ IDNO.:148)的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，(在第二抗体上)形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的一部分的轻链可变域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:42具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的结合位点保持优选以如本文所描述的亲和力结合至与Lu或Y复合的DOTA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:42中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在CDR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:42中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L3。
明确地考虑关于重链可变区及轻链可变区的实施方案组合。因此，功能抗原结合位点可分别在第一抗体及第二抗体上由如上文所定义的重链可变区及如上文所定义的轻链可变区形成。
在上文实施方案中的任一个中，形成用于DOTA复合物的结合位点的轻链可变区及重链可变区可为人源化的。在一个实施方案中，轻链可变区及重链可变区包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在一些实施方案中，如下文进一步论述，重链可变域可通过诸如一个或多个C端丙氨酸残基的一个或多个C端残基或来自CH1域N端的一个或多个残基延伸。
D.例示性用于DOTAM的抗原结合位点
在本发明的另一特定实施方案中，第一抗体及第二抗体联合以形成用于Pb-DOTAM螯合物(Pb-DOTAM)的功能抗原结合位点。
在某些实施方案中，结合至Pb-DOTAM的功能抗原结合位点可具有以下特性中之一或多者：
·特异性结合至Pb-DOTAM且特异性结合至Bi-DOTAM；
·与诸如Cu-DOTAM的其它经螯合金属相比，对Pb-DOTAM(及任选选用的Bi-DOTAM)具选择性；
·以极高亲和力结合至Pb-DOTAM；
·结合至Pb-DOTAM上与例如PRIT-0213或PRIT-0214的本文所描述的抗体相同的表位，和/或具有与所述抗体相同的接触残基。
Pb的放射性同位素可用于诊断及疗法方法中。可用于本发明中的铅的特定放射性同位素包括212Pb及203Pb。
因为短路径长度及高线性能量传递的组合，故作为α-粒子发射体的放射性核素能够比β-发射体在对周围组织损伤更小的情况下更特异性地杀灭肿瘤细胞。212Bi为α-粒子发射体，但其短半衰期妨碍其直接使用。212Pb为212Bi的母放射性核素且可充当212Bi的体内生成剂，由此有效地克服212Bi的短半衰期(Yong及Brechbiel,Dalton Trans.2001年6月21日；40(23)6068-6076)。
203Pb可用作成像同位素。因此，结合至203Pb-DOTAM的抗体可用于放射免疫成像(RII)中。
一般而言，放射性金属是以经螯合形式使用的。在本发明的某些方面中，DOTAM用作螯合剂。DOTAM为Pb(II)的稳定螯合剂(Yong及Brechbiel,Dalton Trans.2001年6月21日；40(23)6068-6076；Chappell et al.Nuclear Medicine and Biology,第27卷,第93-100页,2000)。因此，DOTAM与诸如212Pb及203Pb的如上文所论述的铅的同位素的组合是特别有用的。
在一些实施方案中，可能优选的是，抗体以100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小的结合亲和力Kd值结合Pb-DOTAM。举例而言，功能性结合位点可以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合放射性标记化合物。
在某个实施方案中，抗体另外结合至经DOTAM螯合的Bi。在一些实施方案中，可能优选的是，抗体以1nM、500pM、200pM、100pM、50pM、10pM或更小，例如9pM、8pM、7pM、6pM、5pM或更小的结合亲和力Kd值结合Bi-DOTAM(亦即，包含与铋复合的DOTAM的螯合物，在本文中亦称为“Bi-DOTAM螯合物”)。举例而言，功能性结合位点可以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合金属螯合物。
在一些实施方案中，抗体可以类似亲和力结合至Bi-DOTAM且结合至Pb-DOTAM。举例而言，可能优选的是，对Bi-DOTAM/Pb-DOTAM的亲和力的比率，例如Kd值的比率介于0.1-10，例如1-10的范围内。
在一个实施方案中，形成用于Pb-DOTAM的抗原结合位点的一部分的重链可变区可包含至少一个、两个或全部三个选自以下的CDR：(a)包含GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3。形成用于Pb-DOTAM的结合位点的一部分的轻链可变区可包含至少一个、两个或全部三个选自以下的CDR：(d)包含QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含QASKLAS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，抗体可包含与分别SEQ ID NO:1-6的氨基酸序列相比具有替代，例如1、2或3个替代的CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3中的一个或多个、或CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3中的一个或多个。
在一些实施方案中，抗体可分享与本文所描述的接触残基相同的接触残基：例如这些残基可为不变的。这些残基可包括以下：
a)在重链CDR2中：Phe50、Asp56和/或Tyr58及此外任选选用的Gly52和/或Arg 54；
b)在重链CDR3中：Glu95、Arg96、Asp97、Pro98、Tyr99、Ala100C和/或Tyr100D及此外任选选用的Pro100E；
c)在轻链CDR1中：Tyr28和/或Asp32；
d)在轻链CDR3中：Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c和/或Tyr96；
e)在轻链CDR2中：任选选用的Gln50；
全部为根据Kabat编号。
举例而言，在一些实施方案中，CDR-H2可包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQID NO:2)或在SEQ ID NO:2中具有至多1、2或3个替代的其变体，其中这些替代不包括Phe50、Asp56和/或Tyr58，且任选亦不包括Gly52和/或Arg 54，全部为根据Kabat编号。
在一些实施方案中，CDR-H2可在如下文所示的一个或多个位置处经替代。这里和在下面的替代表中，替代基于种系残基(加下划线)或通过理论上空间上配合且亦在经结晶全集中在位点处存在的氨基酸进行。在一些实施方案中，如上文所提及的残基可固定且其它残基可根据下表经替代：在其它实施方案中，任何残基的替代可根据下表进行。
Figure BDA0003535314770000361
任选地，CDR-H3可包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)或在SEQ IDNO:3中具有至多1、2或3个替代的其变体，其中这些替代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98，且任选亦不包括Ala100C、Tyr100D和/或Pro100E，和/或任选亦不包括Tyr99。举例而言，在一些实施方案中，替代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98、Tyr99、Ala100C及Tyr100D。
在某些实施方案中，CDR-H3可在如下文所示的一个或多个位置处经替代。在一些实施方案中，如上文所提及的残基可固定且其它残基可根据下表经替代：在其它实施方案中，任何残基的替代可根据下表进行。
WolfGuy Kabat AA 替代
351 95 E
352 96 R K、E
353 97 D
354 98 P
355 99 Y F、G、S、T、D
356 100 G
392 100A G
393 100B G
394 100C A S、T
395 100D Y F
396 100E P
397 100F P
398 101 H A、T、V、D
399 102 L Y、V、I、H、F
任选地，CDR-L1可包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)或在SEQ ID NO:4中具有至多1、2或3个替代的其变体，其中这些替代不包括Tyr28和/或Asp32(Kabat编号)。
在某些实施方案中，CDR-L1可在如下文所示的一个或多个位置处经替代。此外，在一些实施方案中，如上文所提及的残基可固定且其它残基可根据下表经替代：在其它实施方案中，任何残基的替代可根据下表进行。
Figure BDA0003535314770000371
Figure BDA0003535314770000381
任选地，CDR-L3可包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6中具有至多1、2或3个替代的其变体，其中这些替代不包括Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c和/或Tyr96(Kabat)。
在某些实施方案中，CDR-L3可在如下文所示的以下位置处经替代。(因为大部分残基为溶剂暴露的且无抗原接点，故可以想到许多替代)。此外，在一些实施方案中，如上文所提及的残基可固定且其它残基可根据下表经替代：在其它实施方案中，任何残基的替代可根据下表进行。
WolfGuy Kabat AA 替代
751 89 L A,V,Q
752 90 G A
753 91 G
754 92 Y A,D,E,F,G,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V
755 93 D A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y
756 94 D A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y
794 95 E A,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y
795 95A S A,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,V,W,Y
796 95B D A,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y
797 95C T S
798 96 Y F,H,R
799 97 G A,E,I,K,L,M,N,Q,S,T,V
抗体可进一步包含任选分别具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列或相对于其而言具有至少1、2或3个替代，任选保守替代的其变体的CDR-H1或CDR-L2。
因此，形成用于Pb-DOTAM的抗原结合位点的一部分的重链可变域可至少包含：
a)包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)或在SEQ ID NO:2中具有至多1、2或3个替代的其变体的重链CDR2，其中这些替代不包括Phe50、Asp56和/或Tyr58，且任选亦不包括Gly52和/或Arg54；
b)包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)或在SEQ ID NO:3中具有至多1、2或3个替代的其变体的重链CDR3，其中这些替代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98，且任选亦不包括Ala100C、Tyr100D和/或Pro100E，和/或任选亦不包括Tyr99。
在一些实施方案中，重链可变域另外包括任选为以下的重链CDR1：
c)包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)或在SEQ ID NO:1中具有至多1、2或3个替代的其变体的重链CDR1。
在一些实施方案中，重链可变域另外包括C端丙氨酸(例如根据Kabat编号系统的Ala114)以避免辨识游离VH区的预存在抗体的结合。如Holland MC et al.J.Clin Immunol(2013)中所报导，游离C端似乎对HAVH(人类抗VH域)自身抗体与VH域抗体的结合至关重要，这是因为HAVH自身抗体不结合至含有相同VH框架序列的完整IgG或IgG片段(fAb或经修饰VH分子)或不结合至VK域抗体。Cordy JC et al.Clinical and Experimental Immunology(2015)指出VH dAb的C端表位处隐藏表位的存在，该隐藏表位非可天然地接近全IgG分子中的HAVH抗体。
因此，在抗体包含游离VH区(不融合至其C端处的任何其它域)的情况下，序列可通过一个或多个C端残基延伸。延伸可防止辨识游离VH区的抗体的结合。举例而言，延伸可通过1-10个残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基进行。在一个实施方案中，VH序列可通过一个或多个C端丙氨酸残基延伸。VH序列亦可通过CH1域的N端部分，例如通过来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基延伸。(人IgG1 CH1域之前十个残基为ASTKGPSVFP(SEQ ID NO.:149)，且因此在一个实施方案中，1-10个残基可取自此序列的N端)。举例而言，在一个实施方案中，将肽序列AST(对应于IgG1 CH1域之前3个残基)添加至VH区的C端中。
在另一实施方案中，形成用于Pb-DOTAM的抗原结合位点的一部分的轻链可变域至少包含：
d)包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)或在SEQ ID NO:4中具有至多1、2或3个替代的其变体的轻链CDR1，其中这些替代不包括Tyr28及Asp32；
e)包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6中具有至多1、2或3个替代的其变体的轻链CDR3，其中这些替代不包括Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c及Tyr96。
在一些实施方案中，轻链可变域另外包括任选为以下的轻链CDR2：
f)包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5中具有至少1、2或3个替代的其变体的轻链CDR2，所述替代任选不包括Gln50。
在包括包含如上文所阐述的CDR(例如具有可变域)的序列变体的本发明任何实施方案中，蛋白质可在如上文所阐述的CDR残基中的一个或多个中为不变的。
任选地，(在第一抗体上)形成用于Pb-DOTAM的功能抗原结合位点的一部分的重链可变域包含选自由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO 9组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的结合位点保持优选以如本文所描述的亲和力结合至Pb-DOTAM的能力。VH序列可保留如上文所阐述的不变残基。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:7或SEQ ID NO 9中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在CDR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰，该VH序列任选具有C端Ala。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，如上文所提及，在一些变体中，SEQ ID NO:7或9可通过一个或多个额外C端残基，例如通过一个或多个丙氨酸残基，任选通过单个丙氨酸残基延伸。因此，举例而言，在一个特异性变体中，SEQ ID NO:7的序列可延伸为：
VTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTYSMSWIRQPPGKALEWLGFIGSRGDTYYASWAKGRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARERDPYGGGAYPPHLWGRGTLVTVSSA(SEQ ID NO.:150)
在其它实施方案中，延伸可通过如上文所描述的CH1域的N端部分，例如通过来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基进行。举例而言，延伸可通过肽序列AST进行。
任选地，(在第二抗体上)形成用于Pb-DOTAM的功能抗原结合位点的一部分的轻链可变域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗Pb-DOTAM结合位点保持优选以如本文所描述的亲和力结合至Pb-DOTAM的能力。VL序列可保留如上文所阐述的不变残基。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:8中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在CDR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，抗Pb-DOTAM抗体包含SEQ ID NO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L3。
明确地考虑关于重链可变区及轻链可变区的实施方案组合。因此，用于Pb-DOTAM的功能抗原结合位点可分别在第一抗体及第二抗体上由如上文所定义的重链可变区及如上文所定义的轻链可变区形成。
任选地，对Pb-DOTAM螯合物具有特异性的抗原结合位点可由包含选自由SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9组成的群的氨基酸序列或如上文所定义的其变体(包括具有如上文所论述的C端延伸部分的变体)的重链可变域及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变域或如上文所定义的其变体形成。举例而言，对Pb-DOTAM螯合物具有特异性的抗原结合位点可包含有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体的重链可变域及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体的轻链可变域，所述氨基酸序列或其变体包括那些序列的翻译后修饰。在另一实施方案中，其可包含有包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其变体(包括具有如上文所论述的C端延伸部分的变体)的重链可变域及包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其变体的轻链可变域，所述氨基酸序列或其变体包括那些序列的翻译后修饰。
在上文实施方案中的任一个中，形成抗Pb-DOTAM结合位点的轻链可变区及重链可变区可为人源化的。在一个实施方案中，轻链可变区及重链可变区包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。在另一实施方案中，轻链可变区和/或重链可变区包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含衍生自vk 1 39和/或vh 2 26的框架区。在一些实施方案中，对于vk 139，可不存在回复突变。对于vh 2 26，种系Ala49残基可经回复突变成Gly49。
E.例示性CEA的抗原结合位点
在可与上文所论述的实施方案组合的本发明的另一特定实施方案中，第一抗体及第二抗体所结合的靶抗原可为CEA(癌胚抗原)。已培养的抗CEA抗体包括T84.66以及其人源化及嵌合型式，诸如如WO2016/075278A1和/或WO2017/055389中所描述的T84.66-LCHA、CH1A1a、如WO2012/117002及WO2014/131712中所描述的抗CEA抗体以及CEAhMN-14或拉贝珠单抗(labetuzumab)(例如如US 6 676 924及US 5 874 540中所描述)。另一例示性抗CEA抗体为A5B7(例如如M.J.Banfield et al.,Proteins 1997,29(2),161-171中所描述)或如WO92/01059及WO 2007/071422中所描述的衍生自鼠A5B7的人源化抗体。亦参见共同未决申请案PCT/EP2020/067582。A5B7的人源化型式的实施例为A5H1EL1(G54A)。另一例示性抗CEA抗体为US 7 626 011和/或共同未决申请案PCT/EP2020/067582中所描述的MFE23及其人源化型式。抗CEA抗体的又另一实施例为28A9。以上抗体中的任一者或其抗原结合片段可用于形成本发明中的CEA结合部分。
任选地，对于单价结合而言，结合至CEA的抗原结合位点可以1nM或更小、500pM或更小、200pM或更小或100pM或更小的Kd值结合。
在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体可结合至CEA的CH1A1a表位、A5B7表位、MFE23表位、T84.66表位或28A9表位。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体中的至少一者结合至不存在于可溶CEA(sCEA)上的CEA表位。可溶CEA是通过GPI磷脂酶裂解且释放至血液中的CEA分子的一部分。在可溶CEA上找不到的表位的实施例为CH1A1A表位。任选地，第一抗体和/或第二抗体中之一者结合至不存在于可溶CEA上的表位，且另一者结合至存在于可溶CEA上的表位。
用于CH1A1a及其亲本鼠抗体PR1A3的表位描述于WO2012/117002A1及Durbin H.etal.,Proc.Natl.Scad.Sci.USA,91:4313-4317,1994中。结合至CH1A1a表位的抗体结合至CEA分子的B3域及GPI锚内的构象表位。在一个方面中，该抗体结合至与具有本文中的具有SEQ ID NO:25的VH及具有SEQ ID NO 26的VL的CH1A1a抗体相同的表位。A5B7表位描述于共同未决申请案PCT/EP2020/067582中。结合至A5B7表位的抗体结合至CEA的A2域，亦即，结合至包含具有SEQ ID NO:154的氨基酸的域：
PKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQ LSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILN(SEQ ID NO:154)。
在一个方面中，抗体结合至与具有本文中的具有SEQ ID NO:49的VH及具有SEQ IDNO:50的VL的A5B7抗体相同的表位。
在一个方面中，抗体结合至与WO2016/075278中所描述的T84.66相同的表位。抗体可结合至与具有本文中的具有SEQ ID NO:17的VH及具有SEQ ID NO:18的VL的抗体相同的表位。
MFE23表位描述于共同未决申请案PCT/EP2020/067582中。结合至MFE23表位的抗体结合至CEA的A1域，亦即，结合至包含具有SEQ ID NO:155的氨基酸的域：
PKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILN(SEQ ID NO:155)。
在一个方面中，抗体可结合至与具有本文中的具有SEQ ID NO:167的VH域及具有SEQ ID NO:168的VL域的抗体相同的表位。
在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体可结合至与本文所提供的抗体，例如P1AD8749、P1AD8592、P1AE4956、P1AE4957、P1AF0709、P1AF0298、P1AF0710或P1AF0711相同的CEA-表位。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体结合彼此相同的CEA的表位。因此，举例而言，第一抗体及第二抗体均可结合至CH1A1a表位、A5B7表位、MFE23表位、T84.66表位或28A9表位。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体均可具有来自CH1A1A的CEA结合序列(亦即CDR和/或VH/VL域)；或第一抗体及第二抗体均可具有来自A5B7或其人源化型式的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自T84.66或其人源化型式的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自MFE23或其人源化型式的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自28A9或其人源化型式的CEA结合序列。例示性序列公开于本文中。
在其它实施方案中，第一抗体及第二抗体结合至CEA的不同表位。因此，举例而言，i)一个抗体可结合CH1A1A表位且另一抗体可结合A5B7表位、T84.66表位、MFE23表位或28A9表位；ii)一个抗体可结合A5B7表位且另一抗体可结合CH1A1A表位、T84.66表位、MFE23表位或28A9表位；iii)一个抗体可结合MFE23表位且另一抗体可结合CH1A1A表位、A5B7表位、T84.66表位或28A9表位；iv)一个抗体可结合T84.66表位且另一抗体可结合CH1A1A表位、A5B7表位、MFE23表位或28A9表位；或v)一个抗体可结合28A9表位且另一抗体可结合CH1A1a表位、A5B7表位、MFE23表位或T84.66表位。
在一些实施方案中，i)一个抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)且另一抗体可具有来自A5B7或其人源化型式、来自T84.66或其人源化型式、来自MFE23或其人源化型式或来自28A9或其人源化型式的CEA结合序列；ii)一个抗体可具有来自A5B7或其人源化型式的CEA结合序列且另一抗体可具有来自CH1A1A、来自T84.66或其人源化型式、来自MFE23或其人源化型式或来自28A9或其人源化型式的CEA结合序列；iii)一个抗体可具有来自MFE23或其人源化型式的CEA结合序列且另一抗体可具有来自CH1A1A、来自A5B7或其人源化型式、来自T84.66或其人源化型式或来自28A9或其人源化型式的CEA结合序列；iv)一个抗体可具有来自T84.66或其人源化型式的CEA结合序列且另一抗体可具有来自CH1A1A、来自A5B7或其人源化型式、来自MFE23或其人源化型式或来自28A9或人源化型式的CEA结合序列；v)一个抗体可具有来自28A9或其人源化型式的CEA结合序列且另一抗体可具有来自CH1A1A、来自A5B7或其人源化型式、来自T84.66或其人源化型式或来自MFE23或其人源化型式的CEA结合序列。
在一个特定实施方案中，一个抗体可结合CH1A1A表位且另一抗体可结合A5B7表位。第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列且第二抗体可具有来自A5B7(包括其人源化型式)的CEA结合序列；或第一抗体可具有来自抗体A5B7(包括其人源化型式)的CEA结合序列且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。
在另一特定实施方案中，一个抗体可结合CH1A1A表位且另一抗体可结合T84.66表位。第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列且第二抗体可具有来自T84.66(包括其人源化型式)的CEA结合序列；或第一抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化型式)的CEA结合序列且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。在一些实施方案中，第一抗体可结合T84.66表位和/或具有如下文(i)中所描述的抗原结合位点，且第二抗体可结合CH1A1A表位和/或具有如下文(ii)中所描述的抗原结合位点。
例示性CEA结合序列i)-v)公开于下文中。所述例示性CEA结合序列i)-v)提供来自i)T84.66、ii)CH1A1A、iii)A5B7、iv)28A9及v)MFE23(或来自其人源化型式)的CEA结合序列的实施例。
i).在一个实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2及(iii)包含选自SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；以及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2及(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面中，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:17中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:17中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1、(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H2及(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:18中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:18中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18中的VH序列及VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
ii).在另一特定实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VLCDR序列：(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2及(iii)包含选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面中，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:25中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:25中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1、(b)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-H2及(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:26中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:26中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:25及SEQ ID NO:26中的VH序列及VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
iii)在另一特定实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2及(iii)包含选自SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；以及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2及(c)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
在另一方面中，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1可具有序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:49中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:49中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列或序列GFTFTDYYMN(SEQ ID NO.:151)的CDR-H1、(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2及(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:50中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:50中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50中的VH序列及VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
iv)在再另一特定实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2及(iii)包含选自SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面中，结合至CEA的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:65中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，结合至CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:65中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1、(b)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H2及(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:66中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，CEA的抗原结合位点包含SEQ ID NO:66中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:66中的VH序列及VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
v)在再另一特定实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:157或158的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:160、161或162的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:163、164或165的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至CEA的抗原结合位点可包含：
VH CDR序列，其(a)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:157或158的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDR-H3；和/或
VLCDR序列，其(a)包含SEQ ID NO:160、161或162的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:163、164或165的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个实施方案中，CEA的抗原结合位点包含有包含SEQ ID NO:167或(更优选地)选自SEQ ID NO:169、170、171、172、173或174的氨基酸序列的重链可变区(VH)以及包含SEQID NO:168或(更优选地)选自SEQ ID NO:175、176、177、178、179或180的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗CEA抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在一特定方面中，能够结合至CEA的抗原结合域包含：
(a)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(c)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(d)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(e)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(f)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(g)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与如上文a)至g)中所提及的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含与如上文a)至g)中所提及的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至CEA的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。
在另一实施方案中，结合至CEA的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。
F.例示性用于其它靶标的抗原结合位点
在可与上文所论述的实施方案(例如用于DOTA或DOTAM的结合位点)组合的本发明的另一特定实施方案中，第一抗体及第二抗体所结合的靶抗原可为GPRC5D或FAP。
任选地，对于单价结合而言，结合至GPRC5D或FAP的抗原结合位点可以1nM或更小、500pM或更小、200pM或更小或100pM或更小的Kd值结合。
例示性GPRC5D结合序列描述于下文中。
在一个实施方案中，结合至GPRC5D的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至GPRC5D的抗原结合位点可包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2及(iii)包含选自SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面中，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗GPRC5D抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在另一实施方案中，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至GPRC5D的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:73中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含SEQ ID NO:73中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-H1、(b)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H2及(c)包含SEQ IDNO:69的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一实施方案中，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至GPRC5D的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:74中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，用于GPRC5D的抗原结合位点包含SEQ ID NO:74中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，结合至GPRC5D的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:73及SEQ ID NO:74中的VH序列及VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
例示性FAP结合序列描述于下文中。
在一个实施方案中，结合至FAP的抗原结合位点可包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至FAP的抗原结合位点可包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
任选地，结合至FAP的抗原结合位点包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
任选地，结合至FAP的抗原结合位点包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VH CDR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1、(ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2及(iii)包含选自SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下的VL CDR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1、(ii)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面中，结合至FAP的抗原结合位点包含(a)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的CDR-L3。
在上文实施方案中的任一个中，多特异性抗体可为人源化的。在一个实施方案中，抗FAP抗原结合位点包含如同上文实施方案中的任一个一般的CDR，且进一步包含例如人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架。
在另一实施方案中，结合至FAP的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VH序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以如上文所阐述的亲和力结合至FAP的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:81中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，结合至FAP的抗原结合位点包含SEQ ID NO:81中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1、(b)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2及(c)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一实施方案中，结合至FAP的抗原结合位点包含与SEQ ID NO:82的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，相对于参考序列而言，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的VL序列含有替代(例如保守替代)、插入或删除，但包含该序列的抗原结合位点保持优选以上文所阐述的亲和力结合至FAP的能力。在某些实施方案中，总计1至10个氨基酸已在SEQ ID NO:82中经替代、插入和/或删除。在某些实施方案中，替代、插入或删除发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选地，用于FAP的抗原结合位点包含SEQ ID NO:82中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一实施方案中，结合至FAP的抗原结合位点包含如同上文所提供任一个实施方案中的VH及如同上文所提供任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包含SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82中的VH序列及VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
G.抗体格式
如上文所描述，本发明涉及一组抗体，其包含：
i)第一抗体，其结合至于靶细胞表面上表达的抗原，且进一步包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域，但不包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域；以及
ii)第二抗体，其结合至于靶细胞表面上表达的抗原，且进一步包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域，但不包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域，
其中第一抗体的该VH域及第二抗体的该VL域能够一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体可各自包含Fc域。在放射免疫疗法及放射成像的情形下Fc区的存在具有效益，例如延长蛋白质的循环半衰期和/或引起肿瘤吸收高于可在较小片段情况下观测到的肿瘤吸收。
在一些实施方案中，在Fc区存在的情况下，可能优选的是，Fc区经工程改造以减弱或消除效应功能。此工程改造可包括Fc区残基234、235、238、265、269、270、297、327和/或329中的一个或多个，例如234、235和/或329中的一个或多个的替代。在一些实施方案中，Fc区可经工程改造以包括Pro329至Gly、Leu 234至Ala和/或Leu 235至Ala(根据EU索引编号)的替代。
在一些实施方案中，如上文所论述，在放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域在其C端处游离(例如不经由其C端融合至另一域)的情况下，则其可通过一个或多个残基延伸以避免HAVH自身抗体结合。举例而言，延伸可通过1-10个残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基进行。在一个实施方案中，其可通过一个或多个丙氨酸残基，任选通过一个丙氨酸残基延伸。VH序列亦可通过CH1域的N端部分，例如通过来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基延伸。(人IgG1 CH1域之前十个残基为ASTKGPSVFP(SEQ ID NO.:149)，且因此在一个实施方案中，1-10个残基可取自此序列的N端)。举例而言，在一个实施方案中，将肽序列AST(对应于IgG1 CH1域之前3个残基)添加至VH区的C端中。在一些实施方案中，对于靶抗原(例如肿瘤相关抗原)而言，第一抗体和/或第二抗体可各自为多价的，例如二价的。这具有提高亲合力的优点。
在一些实施方案中，可能优选的是，当第一抗体及第二抗体联合时，其形成对于放射性标记化合物而言为单价的抗体复合物。因此，第一抗体可包含放射性标记化合物的抗原结合位点的仅一个VH域，且第二抗体可包含放射性标记化合物的抗原结合位点的仅一个VL域，以使得其一起形成放射性标记化合物的仅一个完整功能性结合位点。
抗体可各自包含i)包含对靶抗原具有特异性的抗原结合位点的至少一个抗体片段、ii)放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域及iii)任选选用的Fc区。抗体片段可为例如包含对靶抗原具有特异性的抗原结合位点的至少一个Fv、scFv、Fab或交叉Fab片段。抗体片段可融合至a)放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域或b)若抗体包含与放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域融合的Fc区，则融合至Fc区。在一些实施方案中，Fc区的C端融合至VL域或VH域的N端。
融合可为直接或间接的。在一些实施方案中，融合可经由接头进行。举例而言，Fc区可经由铰链区或另一合适接头融合至抗体片段。类似地，放射性标记化合物的抗原结合位点的VL或VH域与抗体结构的其余部分的连接可经由接头进行。接头可为具有至少5个氨基酸、优选5至100个、更优选10至50个或25至50个氨基酸的肽。接头可为刚性接头或柔性接头。在一些实施方案中，其为包含以下或由以下组成的柔性接头：Thr、Ser、Gly和/或Ala残基。举例而言，其可包含以下或由以下组成：Gly及Ser残基。在一些实施方案中，其可具有诸如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的重复模体，其中n为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一实施方案中，该肽接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6，且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，且m＝0、1、2或3)，例如x＝4且n＝2或3，例如其中x＝4，n＝2。在一些实施方案中，接头可为或可包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO.:31)。技术人员可以使用且能鉴定其它接头。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含以下或由以下组成：
a)scFv片段，其中scFv片段结合靶抗原；以及
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域，其中VH域的C端融合至恒定域的N端；
其中该多肽是通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至scFv片段的C端的。
第二抗体可包含以下或由以下组成：
c)结合靶抗原的第二scFv；以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域，其中VL域的C端融合至恒定域的N端；
其中该多肽是通过VL域的N端，优选经由肽接头融合至scFv片段的C端的。
第一抗体的抗体重链可变域(VH)及第二抗体的抗体轻链可变域(VL)在联合两个抗体时一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
任选地，部分b(i)的多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
scFv的重链及轻链的辨识靶抗原的可变域可通过肽系链连接。此类肽系链可包含1至25个氨基酸、优选12至20个氨基酸、优选12至16个或15至20个氨基酸。上文所描述的系链可包含一个或多个(G3S)和/或(G4S)模体，详言之1、2、3、4、5或6个(G3S)和/或(G4S)模体、优选3或4个(G3S)和/或(G4S)模体、更优选3或4个(G4S)模体。
任选地，第一抗体可基本上由上文所列的组分(a)及(b)组成或由上文所列的组分(a)及(b)组成，且第二抗体可由上文所列的组分(c)及(d)组成或基本上由上文所列的组分(c)及(d)组成。在任何情况下，第一抗体不包含与第一抗体的组分(b)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)；且第二抗体不包含与第二抗体的组分(d)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体重链可变(VH)域。
在另一特定实施方案中，第一抗体可包含以下或由以下组成：
a)结合靶抗原的Fab片段，以及
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体重链可变域(VH)，或
ii)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域，其中VH域的C端融合至恒定域的N端；
其中多肽是通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至Fab片段的CL域或CH1域的C端的。
第二抗体可包含以下或由以下组成：
c)结合靶抗原的Fab片段，以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
iii)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)，或
iv)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域，其中VL域的C端融合至恒定域的N端；
其中多肽是通过VL域的N端，优选经由肽接头融合至Fab片段的CL域或CH1域的C端的。
(b)的多肽的抗体重链可变域(VH)及(d)的多肽的抗体轻链可变域(VL)一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点(亦即在联合两个抗体时)。
任选地，部分b(i)的多肽可另外包含如上文所描述的VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
任选地，第一抗体可基本上由上文所列的组分(a)及(b)组成或由上文所列的组分(a)及(b)组成，且第二抗体可由上文所列的组分(c)及(d)组成或基本上由上文所列的组分(c)及(d)组成。在任何情况下，第一抗体不包含与第一抗体的组分(b)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)；且第二抗体不包含与第二抗体的组分(d)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体重链可变(VH)域。
融合至多肽的Fab片段的链可独立地经选择以用于第一抗体及第二抗体。因此，在一个实施方案中，(b)的多肽融合至第一抗体的Fab片段的CH1域的C端，且(d)的多肽融合至第二抗体的Fab片段的CH1域的C端。在另一实施方案中，(b)的多肽融合至第一抗体的Fab片段的CL域的C端，且(d)的多肽融合至第二抗体的Fab片段的CL域的C端。在另一实施方案中，(b)的多肽融合至第一抗体的Fab片段的CH1域的C端，且(d)的多肽融合至第二抗体的Fab片段的CL域的C端。在另一实施方案中，(b)的多肽融合至第一抗体的Fab片段的CL域的C端，且(d)的多肽融合至第二抗体的Fab片段的CH1域的C端。
如上文所提及，在一些实施方案中，对于靶抗原(例如肿瘤相关抗原)而言，第一抗体和/或第二抗体可各自为多价的，例如二价的。此抗体具有渐增亲合力的优势。抗体可为多价的，例如二价的，且可各自对特定表位(其可为用于第一抗体及第二抗体的相同表位，或可为用于第一抗体及第二抗体的不同表位)具有单特异性。因此，在一些实施方案中，第一抗体可包含i)包含对靶抗原的相同表位具有特异性的抗原结合位点的两个或更多个抗体片段、ii)放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域(但非两者)及iii)任选选用的Fc区。第二抗体可包含i)包含对靶抗原的相同表位具有特异性的抗原结合位点的两个或更多个抗体片段、ii)放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域(但非两者)及iii)任选选用的Fc区。如上文所陈述，表位可对于第一抗体及第二抗体而言为相同的，或可对于第一抗体及第二抗体而言为不同的。
举例而言，第一抗体及第二抗体中的各者可包含经由肽系链连接的串联Fab(Fab-系链-Fab)，亦即两个Fab片段，其中第一Fab经由其C端连接至第二Fab的N端。
在一个实施方案中，第一抗体包含
a)包含两个Fab片段的串联Fab，其中第一Fab片段及第二Fab片段结合相同靶抗原(“靶抗原A”)且第一Fab片段所结合的表位与第二Fab片段所结合的表位相同，且其中第一Fab片段及第二Fab片段经由肽系链连接，其中第一Fab经由其C端连接至第二Fab的N端；以及
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至CH1域的N端；
其中该多肽是通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至第二Fab片段的CL域或CH1域的C端的；
且第二抗体包含
c)包含两个Fab片段的串联Fab，其中第一Fab片段及第二Fab片段结合靶抗原A且第一Fab片段所结合的表位与第二Fab片段所结合的表位相同，且其中第一Fab片段及第二Fab片段经由肽系链连接，其中第一Fab经由其C端连接至第二Fab的N端；以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)，其中VL域的C端融合至恒定域的N端；
其中该多肽是通过VL域的N端，优选经由肽接头融合至第二Fab片段的CL域或CH1域的C端的。
(第一抗体中)部分b的抗体重链可变域(VH)及(第二抗体中)部分(d)的抗体轻链可变域(VL)一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点，亦即在联合两个抗体时进行。
任选地，部分b(i)的多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
融合至多肽的串联Fab的链(亦即不论多肽是否融合至第二Fab片段的CL域或CH1域)可独立地经选择以用于第一抗体及第二抗体。
如上文所描述，串联Fab的第一Fab片段连接至第二Fab片段的N端。在一个实施方案中，第一Fab片段的重链片段的C端连接至第二Fab片段的重链片段或轻链片段的N端。在另一实施方案中，第一Fab片段的轻链片段的C端连接至第二Fab片段的重链片段或轻链片段的N端。因此，在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体的串联Fab可包含如下三个链：
1)第一Fab片段的轻链片段((VLCL)1)、经由肽系链连接至第二Fab片段的重链片段的第一Fab片段的重链片段((VHCH1)1-系链-(VHCH1)2)以及第二Fab片段的轻链片段((VLCL)2)；或
2)第一Fab片段的轻链片段((VLCL)1)、经由肽系链连接至第二Fab片段的轻链片段的第一Fab片段的重链片段((VHCH1)1-系链-(VLCL)2)以及第二Fab片段的重链片段((VH-CH1)2)；或
3)第一Fab片段的重链片段(VHCH1)、经由肽系链连接至第二Fab片段的轻链片段的第一Fab片段的轻链片段((VLCL)1-系链-(VLCL)2)以及第二Fab片段的重链片段；或
4)第一Fab片段的重链片段(VHCH1)、经由肽系链连接至第二Fab片段的重链片段的第一Fab片段的轻链片段((VLCL)1-系链-(VHCH1)2)以及第二Fab片段的轻链片段((VLCL)2)。
在另一实施方案中，第一抗体和/或第二抗体可各自结合靶抗原的超过一个，任选两个不同表位。因此，对于靶抗原而言，抗体中之一者或两者可为双互补位的。在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体可各自包含i)包含对靶抗原A的第一表位具有特异性的抗原结合位点的抗体片段；ii)包含用于靶抗原A的第二表位的抗原结合位点的抗体片段；iii)放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域(但非两者)；以及iv)任选选用的Fc区。
在所述实施方案中，轻链与其各自重链的正确装配可通过使用交叉mab技术来辅助。举例而言，在一个实施方案中，各抗体可包含有包含一个Fab及一个交叉Fab的串联Fab，其中选自Fab及交叉Fab的一个片段对第一表位具有特异性且另一片段对第二表位具有特异性。
在一个特定实施例中，第一抗体可包含：
a)包含第一片段及第二片段的串联Fab，其中第一片段经由肽系链通过其C端连接至第二片段的N端，其中第一片段结合靶抗原A的第一表位且第二片段结合靶抗原A的第二表位，且其中选自第一片段及第二片段的片段中之一者为Fab且另一者为交叉Fab，
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至CH1域的N端；
其中该多肽是通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至第二片段的链中之一者的C端的。
第二抗体可包含
c)包含第一片段及第二片段的串联Fab，其中第一片段是通过其C端连接至第二片段的N端的，其中第一片段结合靶抗原A的第一表位且第二片段结合靶抗原A的第二表位，且其中选自第一片段及第二片段的片段中之一者为Fab且另一者为交叉Fab；以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)，其中VL域的C端融合至轻链恒定域的N端
其中该多肽是通过VL域的N端，优选经由肽接头融合至第二片段的链中之一者的C端的。
第一抗体的抗体重链可变域(VH)及第二抗体的抗体轻链可变域(VL)一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
任选地，部分b(i)的多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
第一片段或第二片段可为交叉Fab，只要串联Fab包含一个常规Fab及一个交叉Fab即可。
在上文所描述的串联Fab实施方案(包括涉及交叉Fab的串联Fab实施方案)中的任一个中，任选地，第一抗体可基本上由组分(a)及(b)组成或由组分(a)及(b)组成且第二抗体可由组分(c)及(d)组成或基本上由组分(c)及(d)组成。在任何情况下，第一抗体不包含与第一抗体的组分(b)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)；且第二抗体不包含与第二抗体的组分(d)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体重链可变(VH)域。
在串联Fab实施方案(包括涉及交叉Fab的串联Fab实施方案)中的任一个中，在第一抗体及第二抗体中连接Fab片段的肽系链可为具有长度为至少5个氨基酸、优选长度为5至100个、更优选10至50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，该肽接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6，且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，且m＝0、1、2或3)，优选地x＝4且n＝2或3，更优选地其中x＝4，n＝2。在一个实施方案中，该肽系链为(G4S)2。
如上文所提及，在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体可各自包含任选经工程改造以减弱或消除效应功能的Fc域。
在一个实施方案中，第一抗体及第二抗体中的各者可包含i)Fc域；ii)包含对靶抗原具有特异性的抗原结合位点的至少一个抗体片段，诸如scFv、Fv、Fab或交叉Fab片段；以及iii)放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域(但非两者)。
任选地，就结合至靶抗原而言，包含Fc域的抗体可为单价的。在其它实施方案中，其可为多价的，例如二价的。第一抗体及第二抗体可各自为多价的且对靶抗原的相同表位具有单特异性。在再其它实施方案中，第一抗体及第二抗体可各自具有用于靶抗原的不同表位的结合位点-例如其可为双互补位的。
抗体片段可为scFv。因此，在一个实施方案中，第一抗体可包含以下或由以下组成：
a)scFv片段，其中scFv片段结合靶抗原；
b)Fc域；以及
c)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至恒定域的N端；
其中(a)的scFv融合至Fc域的N端，且其中c)的多肽通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至Fc域的C端。
任选地，部分c(i)的多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
第二抗体可包含以下或由以下组成：
d)结合靶抗原的第二scFv；
e)Fc域；以及
f)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)，其中VL域的C端融合至恒定域的N端；
其中(d)的scFv融合至Fc域的N端，且其中(f)的多肽通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至Fc域的C端。
在另一实施方案中，第一抗体及第二抗体可各自为包含用于靶抗原的Fab(例如用于靶抗原的单一Fab)及Fc域的单臂IgG。因此，第一抗体可包含以下或由以下组成：
i)完整轻链片段；
ii)完整重链；
iii)另一缺乏Fd的Fc链；以及
iv)包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽；
其中(i)的轻链及(ii)的重链一起提供用于靶抗原的抗原结合位点；且其中包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽通过其N端，优选经由接头融合至(ii)或(iii)的C端。
第二抗体可包含以下或由以下组成：
v)完整轻链片段；
vi)完整重链；
vii)另一缺乏Fd的Fc链；以及
viii)包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽；
其中(v)的轻链及(vi)的重链一起提供用于靶抗原的抗原结合位点；且其中包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽通过其N端，优选经由接头融合至(vi)或(vii)的C端。
包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽可为包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)，在此情况下多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基；或任选选用的如上文所描述的CH1域的N端部分；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至CH1域的N端。
包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽可为包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体轻链恒定域，其中VH域的C端融合至恒定域的N端。
当例如就单臂IgG而论，第一抗体及第二抗体为杂二聚体时，其装配可通过使用如下文进一步描述的节-入-穴(knob-into-hole)技术来辅助。
在另一实施方案中，抗体可各自包含如上文所描述的串联Fab(例如包含两个Fab片段，其中第一Fab片段及第二Fab片段均结合靶抗原A的相同表位；或包含Fab及交叉Fab，其中其中之一者结合靶抗原A的第一表位且另一者结合靶抗原A的第二表位)，其中串联Fab(例如经由其C端)融合至Fc域的N端，且其中包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或VL域或由其组成的肽(例如经由其N端)融合至Fc域的C端。
因此，第一抗体可包含以下或由以下组成：
a)选自以下的串联Fab：
i)包含两个Fab片段的串联Fab，其中第一Fab片段及第二Fab片段结合靶抗原A且第一Fab片段所结合的表位与第二Fab片段所结合的表位相同，且其中第一Fab片段及第二Fab片段经由肽系链连接，其中第一Fab经由其C端连接至第二Fab的N端；以及
ii)包含第一片段及第二片段的串联Fab，其中第一片段是经由肽系链通过其C端连接至第二片段的N端的，其中第一片段结合靶抗原A的第一表位且第二片段结合靶抗原A的第二表位，且其中选自第一片段及第二片段的片段中之一者为Fab且另一者为交叉Fab；
b)Fc域；以及
c)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至CH1域的N端，
其中串联Fab融合至Fc域的链中之一者的N端，且c)的多肽通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至Fc域的链中之一者的C端。
任选地，部分c(i)的多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
第二抗体可包含以下或由以下组成：
d)选自以下的串联Fab：
i)包含两个Fab片段的串联Fab，其中第一Fab片段及第二Fab片段结合靶抗原A且第一Fab片段所结合的表位与第二Fab片段所结合的表位相同，且其中第一Fab片段及第二Fab片段经由肽系链连接，其中第一Fab经由其C端连接至第二Fab的N端；以及
ii)包含第一片段及第二片段的串联Fab，其中第一片段经由肽系链通过其C端连接至第二片段的N端，其中第一片段结合靶抗原A的第一表位且第二片段结合靶抗原A的第二表位，且其中选自第一片段及第二片段的片段中之一者为Fab且另一者为交叉Fab；
e)Fc域；以及
f)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体轻链恒定域，其中VH域的C端融合至轻链恒定域的N端，
其中(d)的串联Fab融合至Fc域的链中之一者的N端，且(f)的多肽通过VL域的N端，优选经由肽接头融合至Fc域的链中之一者的C端。
第一抗体的VH域及第二抗体的VL域一起形成放射性标记化合物的抗原结合位点，亦即在联合两个抗体时进行。
若第一抗体包含根据(a)(i)的串联Fab，则一般为以下情况：第二抗体包含根据d(i)的串联Fab；若第一抗体包含根据(a)(ii)的串联Fab，则一般为以下情况：第二抗体包含根据d(ii)的串联Fab。
串联Fab可一般如上文所描述。举例而言，连接串联Fab的两个片段的系链可如上文所描述。串联Fab可由上文所阐述的链组中的任一个构成。一般而言，第二Fab(其可为交叉Fab)的重链片段可连接至Fc域。
在另一实施方案中，第一抗体及第二抗体中的各者可包含a)Fc域；b)包含用于靶抗原的抗原结合位点的至少一个抗体片段，诸如scFv、Fv、Fab或交叉Fab片段；以及c)包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域(但非两者)的多肽，其中(b)的抗体片段的C端融合至Fc域的一个链的N端，且(c)的多肽的C端融合至Fc域的另一链的N端。(b)的抗体片段的融合优选经由铰链区进行。(c)的多肽的融合可经由位于多肽C端与Fc区N端之间的接头和/或经由上铰链区中的一些或全部(例如根据EU编号索引，Asp221及其C端残基)进行。在一个实施方案中，(b)的抗体片段可为Fab片段。在一个实施方案中，在第一抗体中，(c)的多肽由放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域组成；且在第二抗体中，(c)的多肽由放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域组成。
因此，在一个实施方案中，第一抗体可包含以下或由以下组成：
i)完整轻链；
ii)完整重链；
iii)另一Fc链；以及
iv)包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽；
其中(i)的轻链及(ii)的重链一起提供用于靶抗原的抗原结合位点；且其中包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽通过其C端，优选经由接头融合至(iii)的N端。
第二抗体可包含以下或由以下组成：
v)完整轻链；
vi)完整重链；
vii)另一Fc链；以及
viii)包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽；
其中(v)的轻链及(vi)的重链一起提供用于靶抗原的抗原结合位点；且其中包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽通过其C端，优选经由接头融合至(vii)的N端。
接头可包含如本领域技术人员已知的任何柔性接头，例如接头GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG(SEQ ID NO.:152)。接头可进一步包括全部上铰链区的一部分，例如可自Asp221延伸至(例如Cys226处的)Fc链开始处。
在再另一实施方案中，第一抗体和/或第二抗体各自包含具有用于靶抗原的抗原结合位点的全长抗体，且进一步包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含：
a)由两个抗体重链及两个抗体轻链组成的第一全长抗体，其中全长抗体的至少一个臂结合至靶抗原A；以及
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)另一抗体重链可变域(VH)；或
ii)另一抗体重链可变域(VH)及另一抗体恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至CH1域的N端，
其中该多肽是通过VH域的N端，优选经由肽接头融合至该第一全长抗体的两个重链中之一者的C端的。
第二抗体可包含
c)由两个抗体重链及两个抗体轻链组成的第二全长抗体，其中全长抗体的至少一个臂结合至靶抗原A；以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
i)另一抗体轻链可变域(VL)；或
ii)另一抗体轻链可变域(VL)及另一抗体轻链恒定域(CL)，其中VL域的C端融合至CL域的N端，
其中该多肽是通过VL域的N端，优选经由肽接头融合至该第二全长抗体的两个重链中之一者的C端的。
第一抗体的抗体重链可变域(VH)及第二抗体的抗体轻链可变域(VL)一起形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点，亦即在联合两个抗体时进行。
任选地，部分b(i)的多肽可另外包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。任选地，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
任选地，第一抗体可基本上由上文所列的组分(a)及(b)组成或由上文所列的组分(a)及(b)组成，且第二抗体可基本上由上文所列的组分(c)及(d)组成或由上文所列的组分(c)及(d)组成。在任何情况下，第一抗体不包含与第一抗体的组分(b)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)；且第二抗体不包含与第二抗体的组分(b)联合的能够形成放射性标记化合物的功能抗原结合位点的抗体重链可变(VH)域。
可能优选的是，全长抗体的两个臂均对靶抗原A具有结合特异性。在对于靶抗原而言抗体为二价抗体的情况下，全长抗体的两个臂均可结合至靶抗原A的相同表位。
在另一实施方案中，对于靶抗原而言，抗体可为双互补位的；例如全长抗体的一个臂可结合至靶抗原A的第一表位且一个臂可结合至靶抗原A的第二表位。在所述实施方案中，抗体的一个臂可包含Fab且一个臂可包含交叉Fab以辅助轻链与其各自重链的正确装配。因此，在一个实施方案中，全长抗体的第一重链可包含代替VH域的VL域(例如VL-CH1-铰链-CH2-CH3)且第一轻链可包含更换为VL域的VH域(例如VH-CL)，或第一重链可包含代替HC1域的CL域(例如VH-CL-铰链-CH2-CH3)且第一轻链可包含代替CL域的CH1域(例如VL-CH1)。在此实施方案中，第二重链及第二轻链具有常规域结构(分别例如VH-CH1-铰链-CH2-CH3及VL-CL)。在一替代性实施方案中，全长抗体的第二重链可包含代替VH域的VL域(例如VL-CH1-铰链-CH2-CH3)且第二轻链可包含更换为VL域的VH域(例如VH-CL)，或第二重链可包含代替HC1域的CL域(例如VH-CL-铰链-CH2-CH3)且第二轻链可包含代替CL域的CH1域(例如VL-CH1)。在此实施方案中，第一重链及第一轻链具有常规域结构。
在一些实施方案中,另外/或者通过使用如下文进一步讨论的电荷修饰能帮助轻链与它们各自重链的正确组装。
杂二聚体重链的正确装配可通过节-入-穴技术来辅助。
如本文所使用的术语“全长抗体”表示由两个“全长抗体重链”及两个“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”可以是在N端至C端方向上由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定重链域1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定域2(CH2)及抗体重链恒定域3(CH3)(缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3)以及在亚类IgE的抗体情况下任选选用的抗体重链恒定域4(CH4)组成的多肽。优选地，“全长抗体重链”是在N端至C端方向上由VH、CH1、HR、CH2及CH3组成的多肽。交叉Mab形成的可能性不意欲由所提及的“全长”排除-因此，重链可具有调换为VL域的VH域或调换为CL域的CH1域。“全长抗体轻链”可为在N端至C端方向上由抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)(缩写为VL-CL)组成的多肽。或者，在交叉Mab的情况下，VL域可调换为VH域，或CL域可调换为CH1域。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ或λ。两个全长抗体链经由CL域与CH1域之间及全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型全长抗体的例子是天然抗体，如IgG(例如IgG1及IgG2)、IgM、IgA、IgD及IgE。本发明的全长抗体可来自单一物种例如人，或其可以是嵌合或人源化抗体。本文所描述的全长抗体包含各自通过一对VH及VL形成的两个抗原结合位点，在一些实施方案中该两个抗原结合位点均可特异性结合至相同抗原或可结合至不同抗原。该全长抗体的重链或轻链的C端表示该重链或轻链的C端处的最末氨基酸。
b)下的多肽的抗体重链可变域(VH)的N端及d)下的多肽的抗体轻链可变域(VL)表示VH域或VL域的N端处的最末氨基酸。
已知用于制造多特异性抗体的技术亦可用于制造本文所描述的杂二聚体中的任一个。所述技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein及Cuello,Nature 305:537(1983))及“节-入-穴”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号及Atwell et al.,J.Mol.Biol.270:26(1997))。其它方法包括工程改造用于制造抗体Fc-杂二聚体分子的静电操纵效应(参见例如WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利第4,676,980号及Brennan et al.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链(参见例如Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)及WO2011/034605)；以及使用常用于规避轻链错配问题的轻链技术(参见例如WO98/50431)。
如上文所描述的全长抗体的CH3域可通过“节-入-穴”技术进行改变，该技术以若干实施例详细描述于例如WO 96/027011、Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng 9(1996)617-621以及Merchant,A.M.,et al.,Nat Biotechnol 16(1998)677-681中。在此方法中，两个CH3域的相互作用表面经改变以增加含有此两个CH3域的两个重链的杂二聚化。(两个重链的)两个CH3域中的各者可以是“节”，而另一者是“穴”。举例而言，根据EU索引编号，一个CH3域包含所谓的“节突变”(T366W及任选选用的S354C或Y349C中之一者)，且另一CH3域包含所谓的“穴突变”(T366S、L368A及Y407V以及任选选用的Y349C或S354C)(参见例如Carter,P.et al.,Immunotechnol.2(1996)73)。
另外/或者，双硫桥键的引入可用于稳定化杂二聚体(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)且增加产率。
因此，在一些实施方案中，第一抗体和/或第二抗体的特征进一步在于：全长抗体的一个重链的CH3域及全长抗体的另一重链的CH3域各自在包含抗体CH3域之间的原始界面的界面处相遇(meet)；其中该界面经改变以促进抗体形成，其中改变的特征在于：
a)一个重链的CH3域经改变以使得在一条重链的CH3域遇到三价双特异性抗体内的另一条重链的CH3域的原始界面的原始界面内，氨基酸残基经具有较大侧链体积的氨基酸残基置换，由此在可位于另一重链的CH3域界面内的空腔中的一个重链的CH3域界面内生成隆凸
以及
b)另一重链的CH3域经改变以使得第二CH3域遇到三价双特异性抗体内的第一CH3域的原始界面的原始界面内，氨基酸残基经具有较小侧链体积的氨基酸残基置换，由此在第二CH3域界面内生成空腔，第一CH3域界面内的隆凸可定位于该空腔内。
该具有较大侧链体积的氨基酸残基可任选选自由以下组成的群：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。该具有较小侧链体积的氨基酸残基可任选选自由以下组成的群：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。
任选地，在一些实施方案中，两个CH3域是通过引入半胱氨酸(C)作为各CH3域的对应位置中的氨基酸以使得可在两个CH3域之间形成双硫桥键来进行进一步改变。
本发明的多特异性(例如双互补位)抗体可包含其中所包含的Fab分子(包括交叉Fab分子)中的氨基酸替代，所述氨基酸替代特别有效地减少轻链与非匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)，所述错配可以在具有它们的结合臂中一个(或多个,在包含多于两个抗原结合性Fab分子的分子的情况中)中的VH/VL交换的基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的生成中发生(亦参见PCT公开案第WO 2015/150447号，特别是其中的实施例，通过援引完整收入本文中)。所需多特异性抗体与非所需副产物，特别是存在于其结合臂中的一个中的Bence Jones型副产物的比可通过在Fab分子的CH1域及CL域中的特异性氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷氨基酸(有时在本文中称为“电荷修饰”)来改善。
因此，在一些实施方案中，包含Fab分子的本发明抗体包含至少一个具有包含如本文所描述的电荷修饰的重链恒定域CH1域及包含如本文所描述的电荷修饰的轻链恒定CL域的Fab。
电荷修饰可在本发明抗体中所包含的一个或多个常规Fab分子中或在本发明抗体中所包含的一个或多个交换Fab分子中进行(但非在两者中均进行)。在特定实施方案中，电荷修饰为在本发明抗体中所包含的一个或多个常规Fab分子中进行。
在一些实施方案中，在包含有包含电荷修饰的轻链恒定域CL及包含电荷修饰的重链恒定域CH1的Fab或交叉Fab中，轻链恒定域CL中的电荷修饰为在位置124处且任选在位置123处(根据Kabat编号)，且重链恒定域CH1中的电荷修饰为在位置147和/或213处(根据Kabat EU索引编号)。在一些实施方案中，在轻链恒定域CL中，位置124处的氨基酸独立地经赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)替代(根据Kabat编号)(在一个优选实施方案中，独立地经赖氨酸(K)替代)，且在重链恒定域CH1中，位置147处的氨基酸和/或位置213处的氨基酸独立地经谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)替代(根据Kabat EU索引编号)。
H.例示性抗体
在一些实施方案中，关于靶标结合(例如CEA结合、FAP结合或GPRC5D结合)的方面及实施方案以及关于DOTA结合的方面及实施方案可组合。亦即，可能优选的是，第一抗体及第二抗体各自包含用于CEA、FAP或GPRC5D的例如包含如上文所描述序列中的任一个的结合位点，且第一抗体及第二抗体联合以形成用于DOTA螯合物的具有如上文所描述序列中的任一个的结合位点。亦经明确地考虑，关于CEA结合、FAP或GPRC5D和/或DOTA结合的方面及实施方案可与如上文所描述抗体的优选格式组合-亦即在优选格式中的任一个中，结合靶抗原的部分可包含如上文所描述的CDR或可变区序列，和/或结合放射性核素标记化合物的部分可为具有如上文所描述的CDR和/或可变区序列的DOTA结合子。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含：
a)特异性结合至CEA且由两个抗体重链及两个抗体轻链组成的第一全长抗体；以及
b)包含抗体重链可变域(VH)或由其组成的多肽，其中重链可变域包含具有SEQ IDNO 35-37的重链CDR(或其中CDR-H1具有序列GFSLTDYGVH(SEQ ID NO.:148))，和/或其中重链可变域与SEQ ID NO 41具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性；
其中该多肽为利用VH域的N端，优选经由肽接头融合至该第一全长抗体的两个重链中之一者的C端。
第一抗体不包含与(b)的多肽联合以形成放射性标记化合物的功能结合域的轻链域。
可能优选的是，(b)的多肽进一步包含VH域的C端处的一个或多个残基，例如1-10个残基。任选地，所述残基可为一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。在另一实施方案中，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
在一些实施方案中，部分(a)中的两个抗体重链具有一致可变域，任选一致可变CH1和/或CH2域。其不同之处可任选仅在于其CH3域，例如通过节-入-穴突变及意欲促进杂二聚体的正确联合的其它突变的产生而不同。
第二抗体可包含：
c)特异性结合CEA且由两个抗体重链及两个抗体轻链组成的第二全长抗体；以及
d)包含抗体轻链可变域(VL)或由其组成的多肽，其中轻链可变域包含具有SEQ IDNO:38-40的CDR和/或其中轻链可变域与SEQ ID NO 42具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性；
其中该多肽为利用VL域的N端，优选经由肽接头融合至该第二全长抗体的两个重链中之一者的C端，且其中第二抗体不包含与(d)的多肽联合以形成放射性标记化合物的功能结合域的重链域。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链具有彼此一致的可变域，任选一致的可变CH1和/或CH2域。其不同之处可任选仅在于其CH3域，例如通过节-入-穴突变及意欲促进杂二聚体的正确联合的其它突变的产生而不同。
CEA结合位点/序列可为上文所描述的CEA结合位点/序列中的任一者。
在一个特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(a)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 22-24的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO 103具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(a)中的两个轻链彼此一致。
部分(a)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:19-21的CDR和/或部分(a)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(a)中的一个重链具有SEQ ID NO:100的序列且另一重链具有SEQ ID NO:102的序列。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含具有SEQ ID NO:100的第一重链及具有SEQ ID NO:101(其中C端AST为任选选用的且可不存在或经如本文所描述的另一C端延伸部分替代)的第二重链以及具有SEQ ID NO:103的轻链。
第二抗体亦可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(c)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 22-24的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO:103具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链彼此一致。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链具有与第一抗体的(a)中的轻链相同的序列，例如部分(a)及(c)中的全部所述轻链具有相同序列。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链包含具有SEQ ID NO:19-21的CDR和/或部分(c)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(c)的一个重链具有SEQ ID NO:97的序列且另一重链具有SEQ ID NO:99的序列。
在一个特定实施方案中，第二抗体可包含具有SEQ ID NO:97的第一重链及具有SEQ ID NO:98的第二重链以及具有SEQ ID NO:103的轻链。
类似地，在一些实施方案中，关于靶标结合(例如CEA结合、FAP结合或GPRC5D结合)的方面及实施方案以及关于Pb-DOTAM结合的方面及实施方案可组合。亦即，可能优选的是，第一抗体及第二抗体各自包含用于CEA、FAP或GPRC5D的例如包含如上文所描述序列中的任一个的结合位点，且第一抗体及第二抗体联合以形成用于Pb-DOTAM螯合物的具有如上文所描述序列中的任一个的结合位点。亦经明确地考虑，关于CEA结合、FAP或GPRC5D和/或Pb-DOTAM结合的方面及实施方案可与如上文所描述抗体的优选格式组合-亦即在优选格式中的任一个中，结合靶抗原的部分可包含如上文所描述的CDR或可变区序列，和/或结合放射性核素标记化合物的部分可为具有如上文所描述的CDR和/或可变区序列的Pb-DOTAM结合子。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含：
a)特异性结合至CEA且由两个抗体重链及两个抗体轻链组成的第一全长抗体；以及
b)包含抗体重链可变域(VH)或由其组成的多肽，其中重链可变域包含具有SEQ IDNO 1-3的重链CDR，和/或其中重链可变域与SEQ ID NO 7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性；
其中该多肽为利用VH域的N端，优选经由肽接头融合至该第一全长抗体的两个重链中之一者的C端。
第一抗体不包含与(b)的多肽联合以形成放射性标记化合物的功能结合域的轻链域。
可能优选的是，(b)的多肽进一步包含VH域的C端处的一个或多个残基，任选一个或多个丙氨酸残基，任选单个丙氨酸残基。举例而言，(b)的多肽可包含以下或由以下组成：具有C端丙氨酸延伸部分的SEQ ID NO:7，亦即序列
Figure BDA0003535314770000811
在另一实施方案中，额外残基可为如上文所描述的CH1域的N端部分，例如来自例如人IgG1 CH1域的CH1域的N端的1-10个残基。举例而言，额外残基可为AST。
在一些实施方案中，部分(a)中的两个抗体重链具有一致可变域，任选一致可变CH1和/或CH2域。其不同之处可任选仅在于其CH3域，例如通过节-入-穴突变及意欲促进杂二聚体的正确联合的其它突变的产生而不同。
第二抗体可包含：
c)特异性结合CEA且由两个抗体重链及两个抗体轻链组成的第二全长抗体；以及
d)包含抗体轻链可变域(VL)或由其组成的多肽，其中轻链可变域包含具有SEQ IDNO:4-6的CDR和/或其中轻链可变域与SEQ ID NO 8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性；
其中该多肽是利用VL域的N端，优选经由肽接头融合至该第二全长抗体的两个重链中之一者的C端的，且其中第二抗体不包含与(d)的多肽联合以形成放射性标记化合物的功能结合域的重链域。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链具有彼此一致的可变域，任选一致的可变CH1和/或CH2域。其不同之处可任选仅在于其CH3域，例如通过节-入-穴突变及意欲促进杂二聚体的正确联合的其它突变的产生而不同。
在一特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(a)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 22-24的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO 34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(a)中的两个轻链彼此一致。
部分(a)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:19-21的CDR和/或部分(a)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(a)中的一个重链具有SEQ ID NO:27的序列且另一重链具有SEQ ID NO:28的序列。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含具有SEQ ID NO:28的第一重链及具有SEQ ID NO:32(或包含额外C端丙氨酸或诸如具有AST的延伸部分的如本文所描述的其它C端延伸部分的其变体)的第二重链以及具有SEQ ID NO:34的轻链。具有C端丙氨酸延伸部分的SEQ ID NO:32的变体显示于下：
Figure BDA0003535314770000821
在另一特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体A5B7(包括其人源化型式)的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(a)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 46-48的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(a)中的两个轻链彼此一致。
在一些实施方案中，部分(a)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:43-45的CDR和/或部分(a)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(a)中的一个重链具有SEQ ID NO:51的序列且另一重链具有SEQ ID NO:53的序列。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含具有SEQ ID NO:51的第一重链及具有SEQ ID NO:52(或具有C端丙氨酸延伸部分或诸如具有AST的延伸部分的如本文所描述的其它C端延伸部分的其变体)的第二重链以及具有SEQ ID NO:54的轻链。
在另一特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化型式)的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(a)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 14-16的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(a)中的两个轻链彼此一致。
在一些实施方案中，部分(a)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:11-13的CDR和/或部分(a)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(a)中的一个重链具有SEQ ID NO:86的序列且另一重链具有SEQ ID NO:88的序列。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含具有SEQ ID NO:86的第一重链及具有SEQ ID NO:87(或其中C端“AST”不存在或经如本文所公开的不同C端延伸部分替代的其变体)的第二重链以及具有SEQ ID NO:89的轻链。
在另一特定实施方案中，第一抗体可具有来自抗体28A9(包括其人源化型式)的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(a)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 62-64的CDR和/或可包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(a)中的两个轻链彼此一致。
在一些实施方案中，部分(a)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:59-61的CDR和/或部分(a)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(a)中的一个重链具有SEQ ID NO:93的序列且另一重链具有SEQ ID NO:95的序列。
在一个特定实施方案中，第一抗体可包含具有SEQ ID NO:93的第一重链及具有SEQ ID NO:94(或不具有C端“AST”或具有如本文所描述的不同C端延伸部分的其变体)的第二重链以及具有SEQ ID NO:96的轻链。
在一些实施方案中，第二抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(c)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 22-24的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO 34具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链彼此一致。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链具有与第一抗体的(a)中的轻链相同的序列，例如部分(a)及(c)中的全部所述轻链具有相同序列。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链包含具有SEQ ID NO:19-21的CDR和/或部分(c)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(c)的一个重链具有SEQ ID NO:29的序列且另一重链具有SEQ ID NO:30的序列。
在一个特定实施方案中，第二抗体可包含具有SEQ ID NO:30的第一重链及具有SEQ ID NO:33的第二重链以及具有SEQ ID NO:34的轻链。
在另一特定实施方案中，第二抗体可具有来自A5B7(包括其人源化型式)的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(c)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 46-48的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO 58具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链彼此一致。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链具有与第一抗体的(a)中的轻链相同的序列，例如部分(a)及(c)中的全部所述轻链具有相同序列。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链包含具有SEQ ID NO:43-45的CDR和/或部分(c)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(c)的一个重链具有SEQ ID NO:55的序列且另一重链具有SEQ ID NO:57的序列。
在一个特定实施方案中，第二抗体可包含具有SEQ ID NO:55的第一重链及具有SEQ ID NO:56的第二重链以及具有SEQ ID NO:58的轻链。
在另一特定实施方案中，第二抗体可具有来自抗体T84.66(包括其人源化型式)的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(c)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 14-16的CDR和/或可包含与SEQ ID NO 18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链彼此一致。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:11-13的CDR和/或部分(c)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(c)中的一个重链具有SEQ ID NO:83的序列且另一重链具有SEQ ID NO:85的序列。
在一个特定实施方案中，第二抗体可包含具有SEQ ID NO:83的第一重链及具有SEQ ID NO:84的第二重链以及具有SEQ ID NO:89的轻链。
在另一特定实施方案中，第二抗体可具有来自抗体28A9(包括其人源化型式)的CEA结合序列(亦即CDR或VH/VL域)。
举例而言，(c)中的两个轻链可包含具有SEQ ID NO 62-64的CDR和/或可包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的轻链可变域。在一些实施方案中，其可与SEQ ID NO:96具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性。在一些实施方案中，可能优选的是，(c)中的两个轻链彼此一致。
在一些实施方案中，部分(c)中的两个抗体重链可包含具有SEQ ID NO:59-61的CDR和/或部分(c)中的两个抗体重链包含与SEQ ID NO 65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的可变域。在一个实施方案中，部分(c)中的一个重链具有SEQ ID NO:90的序列且另一重链具有SEQ ID NO:92的序列。
在一个特定实施方案中，第二抗体可包含具有SEQ ID NO:90的第一重链及具有SEQ ID NO:91的第二重链以及具有SEQ ID NO:96的轻链。
在一些实施方案中，第一抗体及第二抗体结合CEA的相同表位。因此，举例而言，第一抗体及第二抗体均可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自A5B7(包括其人源化型式)的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自T84.66(包括其人源化型式)的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自28A9(包括其人源化型式)的CEA结合序列；或第一抗体及第二抗体均可具有来自MFE23(包括其人源化型式)的CEA结合序列。
因此，举例而言：
i)第一抗体可包含具有SEQ ID NO:28的第一重链、具有SEQ ID NO:32(任选具有例如AST的如本文所描述的C端延伸部分)的第二重链及具有SEQ ID NO:34的轻链；且第二抗体可包含具有SEQ ID NO:30的第一重链、具有SEQ ID NO:33的第二重链及具有SEQ IDNO:34的轻链；
ii)第一抗体可包含具有SEQ ID NO:51的第一重链、具有SEQ ID NO:52(任选具有例如AST的如本文所描述的C端延伸部分)的第二重链及具有SEQ ID NO:54的轻链；且第二抗体可包含具有SEQ ID NO:55的第一重链、具有SEQ ID NO:56的第二重链及具有SEQ IDNO:58的轻链；
iii)第一抗体可包含具有SEQ ID NO:86的第一重链、具有SEQ ID NO:87(其中C端AST残基为任选选用的且可不存在或经替代性C端延伸部分替代)的第二重链及具有SEQ IDNO:89的轻链；且第二抗体可包含具有SEQ ID NO:83的第一重链、具有SEQ ID NO:84的第二重链及具有SEQ ID NO:89的轻链；或
iv)第一抗体可包含具有SEQ ID NO:93的第一重链、具有SEQ ID NO:94(其中C端AST残基为任选选用的且可不存在或经替代性C端延伸部分替代)的第二重链及具有SEQ IDNO:96的轻链；且第二抗体可包含具有SEQ ID NO:90的第一重链、具有SEQ ID NO:91的第二重链及具有SEQ ID NO:96的轻链。
在其它实施方案中，第一抗体及第二抗体结合至如上文所论述的CEA的不同表位。因此，举例而言，第一抗体可具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列且第二抗体可具有来自A5B7的CEA结合序列；或第一抗体可具有来自抗体A5B7的CEA结合序列且第二抗体可具有来自CH1A1A的CEA结合序列。双互补位(CH1A1A及A5B7)对的使用实施例描述于实施例6c中。
在再另一特定实施方案中，靶抗原可为GPRC5D或FAP且格式可如图25B中所示。任选地，第一抗体及第二抗体联合以形成用于Pb-DOTAM螯合物(Pb-DOTAM)的功能抗原结合位点。
因此，在一个实施方案中(其中靶抗原为GPRC5D)：
i)第一抗体包含具有SEQ ID NO:104的第一重链、具有SEQ ID NO:106(其中C端丙氨酸为任选选用的且可不存在或经如本文所描述的替代性C端延伸部分置换)的第二重链及具有SEQ ID NO:107的轻链；以及
ii)第二抗体包含具有SEQ ID NO:104的第一重链、具有SEQ ID NO:105的第二重链及具有SEQ ID NO:107的轻链。
在另一实施方案中(其中靶抗原为FAP)：
i)第一抗体包含具有SEQ ID NO:108的第一重链、具有SEQ ID NO:110(其中C端丙氨酸为任选选用的且可不存在或经如本文所描述的替代性C端延伸部分置换)的第二重链及具有SEQ ID NO:111的轻链；以及
ii)第二抗体包含具有SEQ ID NO:108的第一重链、具有SEQ ID NO:109的第二重链及具有SEQ ID NO:111的轻链。
在再另一特定实施方案中，靶标可为例如具有来自抗体CH1A1A的CEA结合序列的CEA，且格式可如图25C中所示。任选地，第一抗体及第二抗体联合以形成用于Pb-DOTAM螯合物(Pb-DOTAM)的功能抗原结合位点。因此，在一个特定实施方案中：
i)第一抗体包含具有SEQ ID NO:112的第一重链、具有SEQ ID NO:114的第二重链及具有SEQ ID NO:115的轻链；以及
ii)第二抗体包含具有SEQ ID NO:112的第一重链、具有SEQ ID NO:113的第二重链及具有SEQ ID NO:115的轻链。
I.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文所提供的抗体的氨基酸序列变体。举例而言，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码该抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。所述修饰包括例如自以下的删除和/或向以下中的插入和/或以下的替代：抗体的氨基酸序列内的残基。可进行删除、插入及替代的任何组合以获得最终构建物，其限制条件为最终构建物具有例如抗原结合的所需特征。
替代、插入及删除变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸替代的抗体变体。所关注的替代型突变诱发位点包括HVR(CDR)及FR。保守替代显示于表1中“优选替代”标题下。更多实质性变化提供于表1中“例示性替代”标题下，且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸替代引入所关注的抗体中，且筛检产物的例如所保持/经改善的抗原结合、经降低的免疫原性或经减弱或消除的ADCC或CDC的所需活性。
表1
Figure BDA0003535314770000891
氨基酸可根据共同侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要这些类别中之一者的成员更换成另一类别。
一种类型的替代型变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，经选择以用于进一步研究的一个或多个所得变体相对于亲本抗体而言将在某些生物特性方面具有修改(例如改善)(例如亲和力提高、免疫原性降低)和/或将实质上保持亲本抗体的某些生物特性。例示性替代型变体为亲和力成熟抗体，该亲和力成熟抗体可例如使用诸如本文所描述的技术的基于噬菌体展示的亲和力成熟技术便利地生成。简言之，使一个或多个CDR残基突变且在噬菌体上呈现变异抗体且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛检。
改变(例如替代)可在CDR中进行例如以提高抗体亲和力。所述改变可在CDR“热点”，亦即由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中进行，其中测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构筑二级库且自二级库再选择达成的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom et al.的Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien etal.,编,Human Press,Totowa,NJ,(2001).)中。在亲和力成熟的一些方面中，通过各种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸导引的突变诱发)中的任一种将多样性引入经选择以用于成熟的可变基因中。随后产生二级库。随后，对该库进行筛检以识别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一用于引入多样性的方法涉及CDR导引方法，其中将若干CDR残基(例如一次4-6个残基)随机分组。可例如使用丙氨酸扫描突变诱发或模型化特异性地识别参与抗原结合的CDR残基。特别是常常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些方面中，替代、插入或删除可发生在一个或多个CDR内，只要所述改变不实质上减弱抗体结合抗原的能力即可。举例而言，不实质上减弱结合亲和力的保守改变(例如如本文所提供的保守替代)可在CDR中进行。举例而言，所述改变可在CDR中接触抗原的残基外部进行。在上文所提供的某些变异VH及VL序列中，各CDR未经改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸替代。
如Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述，可用于识别可针对突变诱发进行靶向的抗体残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”。在此方法中，残基或靶标残基群(例如带电荷残基，诸如arg、asp、his、lys及glu)经识别且经中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以判定抗体与抗原的相互作用是否受影响。可在对初始替代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入另外替代。或者/另外，抗原-抗体复合物的晶体结构可用于识别抗体与抗原之间的接触点。所述接触残基及相邻残基可作为用于替代的候选物进行靶向或消除。可对变体进行筛检以判定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N端或C端融合至延长抗体血清半衰期的酶(例如针对ADEPT(抗体导引的酶前药疗法))或多肽。
糖基化变体
在某些方面中，本文所提供的抗体经改变以提高或降低抗体糖基化的程度。向抗体中添加糖基化位点或删除抗体的糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得产生或移除一个或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体包含Fc区的情况下，可改变与其连接的寡糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N键连接至Fc区的CH2域的Asn297的分支双触角寡糖。参见例如Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸的各种碳水化合物以及连接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以便产生具有某些经改善特性的抗体变体。
在一个方面中，提供具有非岩藻糖基化寡糖，亦即缺乏(直接地或间接地)连接至Fc区的岩藻糖的寡糖结构的抗体变体。特别是该非岩藻糖基化寡糖(亦称为“无岩藻糖基化”寡糖)为缺乏连接至双触角寡糖结构的主干中的第一GlcNAc的岩藻糖残基的N键联寡糖。在一个方面中，提供相较于原生或亲本抗体而言具有经增加比例的Fc区中非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。举例而言，非岩藻糖基化寡糖的比例可为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(亦即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比如通过例如如WO 2006/082515中所描述的MALDI-TOF质谱法所测量，相对于连接至Asn 297的全部寡糖(例如复合、杂交及高甘露糖结构)的总和而言缺乏岩藻糖残基的寡糖的(平均)量。Asn297指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的少量序列变体，故Asn297亦可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，亦即位置294与300之间。具有经增加比例的Fc区中非岩藻糖基化寡糖的所述抗体可具有经改善的FcγRIIIa受体结合和/或经改善的效应功能，特别是经改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能够产生具有经减少的岩藻糖基化的抗体的细胞株的例子包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/0157108；以及WO 2004/056312，尤其在实施例11处)；及基因敲除细胞株，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO 2003/085107)；或具有经减弱或消除的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见例如US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一方面中，提供具有对分寡糖的抗体变体，例如其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖经GlcNAc对分。所述抗体变体可具有如上文所描述的经减少的岩藻糖基化和/或经改善的ADCC功能。所述抗体变体的实施例描述于例如以下中：Umana et al.,NatBiotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara et al.,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540；WO 2003/011878。
亦提供具有连接至Fc区的寡糖中至少一个半乳糖残基的抗体变体。所述抗体变体可具有经改善的CDC功能。所述抗体变体描述于例如以下中：WO 1997/30087；WO 1998/58964；以及WO 1999/22764。
可能优选的是，抗体经修饰以降低糖基化程度。在一些实施方案中，抗体可为无糖基化或去糖基化的。抗体可包括例如N297D/A的N297处的替代。
Fc区变体
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如替代)的人类Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有经减弱的效应功能，例如经减弱或消除的CDC、ADCC和/或FcyR结合的抗体变体。在某些方面中，本发明考虑具有一些但非全部效应功能的抗体变体，所述效应功能使其成为如下应用的期望候选物,其中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应功能(诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))不必要或有害的应用的所需候选物。
可进行活体外和/或体内细胞毒性分析以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。举例而言，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcyR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。用于调节ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核球表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估所关注分子的ADCC活性的活体外分析的非限制性实施例描述于以下中：美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom,I.et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I etal.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利第5,821,337号(参见Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology公司Mountain View,CA)及CytoTox
Figure BDA0003535314770000931
非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用于所述分析的效应细胞包括周边血液单核细胞(PBMC)及自然杀手(NK)细胞。或者/另外，可例如在诸如公开于Clynes et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中的动物模型的动物模型中体内评估所关注分子的ADCC活性。亦可进行C1q结合分析以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为评估补体活化，可执行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。亦可使用本领域中已知的方法执行FcRn结合及体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929 Al)。
具有经减弱的效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中的一个或多个的替代的抗体(美国专利第6,737,056号)，例如P329G。所述Fc突变体包括具有氨基酸位置265、269、270、297及327中的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括具有残基265及297成丙氨酸的替代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
在某些方面中，抗体变体包含具有减少FcyR结合的一个或多个氨基酸替代的Fc区，该一个或多个氨基酸替代例如Fc区的位置234及235(残基的EU编号)处的替代。在一个方面中，替代为L234A及L235A(LALA)。在某些方面中，抗体变体进一步包含衍生自人IgG1Fc区的Fc区中的D265A和/或P329G。在一个方面中，替代为衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的L234A、L235A及P329G(LALA-PG)。(参见例如WO 2012/130831)。在另一方面中，替代为衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的L234A、L235A及D265A(LALA-DA)。
在其它实施方案中，或许有可能使用诸如IgG4或IgG2的具有经减弱的效应功能的IgG亚型。
描述了具有经改善或减少的与FcR结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；以及Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，例如如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642以及Idusogieet al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述，在Fc区中进行改变，产生经改变(亦即经改善或经减少，优选经减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些方面中，抗体变体包含具有减少FcRn结合的一个或多个氨基酸替代的Fc区，该一个或多个氨基酸替代例如Fc区的位置253和/或310和/或435(残基的EU编号)处的替代。在某些方面中，抗体变体包含具有位置253、310及435处的氨基酸替代的Fc区。在一个方面中，替代为衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的I253A、H310A及H435A。参见例如Grevys,A.,et al.,J.Immunol.194(2015)5497-5508。
在某些方面中，抗体变体包含具有减少FcRn结合的一个或多个氨基酸替代的Fc区，该一个或多个氨基酸替代例如Fc区的位置310和/或433和/或436(残基的EU编号)处的替代。在某些方面中，抗体变体包含具有位置310、433及436处的氨基酸替代的Fc区。在一个方面中，替代为衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的H310A、H433A及Y436A。(参见例如WO 2014/177460 Al)。举例而言，在一些实施方案中，可使用正常FcRn结合。
亦参见Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
如本文所报导的全长抗体的重链的C端可为以氨基酸残基PGK终止的完整C端。重链的C端可为经缩短的C端，其中已移除C端氨基酸残基中之一或两个。重链的C端可为以PG终止的经缩短的C端。在如本文所报导的全部方面中的一个方面中，如本文所规定，包含包括C端CH3域的重链的抗体包含C端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)。如本文所使用的术语“全长抗体”或“全长重链”仍明确地涵盖C端甘氨酸残基。
抗体衍生物
在某些方面中，可对本文所提供的抗体进行进一步修饰以含有本领域中已知且可易于获得的额外非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧杂环戊烷、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性而可在生产中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支或非分支的。连接至抗体的聚合物的数目可变化，且若连接超过一个聚合物，则它们可为相同或不同分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改善的抗体的特定特性或功能，抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法中等。
J.重组方法及组合物
抗体可使用例如如美国专利第4,816,567号中所描述的重组方法及组合物来产生。在一个实施方案中，提供编码本文所描述的一组抗体的经分离核酸或一组经分离核酸。
举例而言，一组核酸可包含以下编码第一抗体的核酸：
i)编码第一抗体的第一重链的核酸，其中该第一重链包含特异性结合靶抗原的全长抗体的重链，该重链经由其C端融合至包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的多肽；
ii)编码第一抗体的第二重链的核酸，其中该第二重链包含特异性结合靶抗原的全长抗体的重链且不包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域(任选地，第二重链由特异性结合靶抗原的全长抗体的重链组成)；
iii)编码第一抗体的轻链的核酸。
另外/或者，本发明的一组核酸可包含以下编码第二抗体的核酸：
iv)编码第二抗体的第一重链的核酸，其中该第一重链包含特异性结合靶抗原的全长抗体的重链，该重链经由其C端融合至包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域的多肽；
v)编码第二抗体的第二重链的核酸，其中该第二重链包含特异性结合靶抗原的全长抗体的重链且不包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域(任选地，第二重链由特异性结合靶抗原的全长抗体的重链组成)；
vi)编码第二抗体的轻链的核酸。
在一些实施方案中，这些核酸中的某些可彼此相同。举例而言，(iii)中的核酸可与(vi)中的核酸相同以使得整组仅包含5个不同核酸序列。
核酸可包含于一个或多个核酸分子或表达载体中。
因此，在另一实施方案中，提供包含该一个或多个核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在一个实施方案中，各各自重链及轻链为由个别质粒表达。
在另一实施方案中，提供包含该一个或多个核酸或一个或多个载体的宿主细胞或一组宿主细胞。在一个实施方案中，提供表达第一抗体的第一宿主细胞，且提供表达第二抗体的第二宿主细胞。
在一个该实施方案中，第一宿主细胞包含以下(例如经以下转化)：(1)包含上文核酸(i)-(iii)的载体；或(2)包含核酸(i)的第一载体、包含核酸(ii)的第二载体及包含核酸(iii)的第三载体；或(3)共同地包含上文核酸(i)-(iii)的两个载体。第二宿主细胞包含以下(例如经以下转化)：(1)包含上文核酸(iv)-(vi)的载体；或(2)包含核酸(iv)的第一载体、包含核酸(v)的第二载体及包含核酸(vi)的第三载体；或(3)共同地包含上文核酸(iv)-(vi)的两个载体。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制造本发明抗体的方法，其中该方法包括在适用于表达如上文所提供的抗体的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，且任选自宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗体的重组产生，分离例如如上文所描述的编码抗体的核酸且将其插入一个或多个载体中以进行进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。该核酸可使用常规程序(例如通过使用能够特异性地结合至编码抗体重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离且定序。
适用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所描述的原核细胞或真核细胞。举例而言，抗体可在细菌中产生，尤其在不需要糖基化及Fc效应功能时如此。对于抗体片段及多肽在细菌中的表达，参见例如US5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦参见描述抗体片段在大肠杆菌(E.coli)中的表达的Charlton,K.A.的Methods inMolecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编),Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页)。在表达之后，抗体可以可溶洗脱份与细菌细胞糊状物分离且可经进一步纯化。
除原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物为适用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化路径已经“人源化”，引起具有部分或完全人类糖基化型态的抗体产生的真菌及酵母菌株。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；及Li,H.et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
适用于表达(糖基化)抗体的宿主细胞亦衍生自多细胞生物体(无脊椎动物及脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞及昆虫细胞。已识别出可与昆虫细胞结合使用，尤其用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物亦可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞亦可用作宿主。举例而言，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞株可为适用的。有用的哺乳动物宿主细胞株的其它实施例为经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如例如Graham,F.L.et al.,J.Gen Virol.36(1977)59-74中所描述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞特利氏细胞(mouse sertoli cell)(如例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(如例如Mather,J.P.et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞株包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0及Sp2/0。对于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.及Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
在一个方面中，宿主细胞系真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
K.分析
可通过本领域中已知的各种分析识别本文所提供的抗体，针对其物理/化学特性和/或生物活性对其加以筛检或表征。
在一个方面中，例如通过诸如ELISA、西方墨点法等的已知方法针对本发明抗体的抗原结合活性对其进行测试。
抗体亲和力
在某些实施方案中，本文所提供的抗体针对靶抗原的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10- 13M，例如10-9M至10-13M)或如本文在其它方面所陈述。
在某些实施方案中，放射性标记化合物的抗原结合位点针对放射性标记化合物的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在一些实施方案中，Kd为1nM或更小、500pM或更小、200pM或更小、100pM或更小、50pM或更小、20pM或更小、10pM或更小、5pM或更小或1pM或更小或如本文在其它方面所陈述。举例而言，功能性结合位点可以约1pM-1nM，例如约1-10pM、1-100pM、5-50pM、100-500pM或500pM-1nM的Kd结合放射性标记化合物/金属螯合物。
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记抗原结合分析(RIA)来测量。在一个实施方案中，用Fab型式的所关注抗体及其抗原执行RIA。举例而言，Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过以下来测量的：在存在未标记抗原的滴定系列的情况下用最低浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，随后用经抗Fab抗体包被板捕获经结合抗原(参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为建立分析条件，用含5μg/ml捕获抗Fab抗体(CappelLabs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)包被
Figure BDA0003535314770000991
多孔板(Thermo Scientific)过夜，且随后在室温(约23℃)下用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS封闭两至五小时。在非吸附板(Nunc编号269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与所关注Fab的连续稀释液混合(例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。随后，培育所关注Fab过夜；然而，培育可持续较长时段(例如约65小时)以确保达到平衡。其后，在室温下将混合物转移至捕获板中以进行培育(例如达一小时)。随后，移除溶液且用含0.1％聚山梨醇酯
Figure BDA0003535314770000992
的PBS洗涤板八次。当板已经干燥时，添加150微升/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上对板计数10分钟。选定提供小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合分析中。
根据另一实施方案，使用
Figure BDA0003535314770000993
表面等离振子共振分析测量Kd。举例而言，使用
Figure BDA0003535314770000994
或
Figure BDA0003535314770000995
(BIAcore公司,Piscataway,NJ)的分析是在25℃下用固定抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)执行的。在一个实施方案中，根据供货商说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧基甲基化聚葡萄糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸钠(pH4.8)将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5微升/分钟的流动速率注射以达成约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/min的流动速率在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中注射Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单一比一朗谬结合模型(one-to-one Langmuir binding model)(
Figure BDA0003535314770001001
评估软件3.2版)，通过同时拟合结合传感器图谱及解离传感器图谱来计算结合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)经计算为比率koff/kon。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若根据上文表面等离振子共振分析，结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定结合速率，该荧光淬火技术在存在如于诸如具有搅拌式光析槽的停流装备型分光亮度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCO TM分光亮度计(ThermoSpectronic))的光谱仪中所测量的渐富集度的抗原情况下，在25℃下测量含20nM抗抗原抗体(Fab形式)的PBS(pH 7.2)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或降低。
在另一实施方案中，Kd是使用SET(溶液平衡滴定)分析来测量的。根据此分析，测试抗体通常以恒定浓度施用且与测试抗原的连续稀释液混合。在进行培育以建立平衡之后，在经抗原包被表面上捕获游离抗体的部分且一般使用电化学发光用经标记/加卷标的抗物种抗体对其进行检测(例如如Haenel et al.Analytical Biochemistry 339(2005)182-184中所描述)。
举例而言，在一个实施方案中，将384孔链霉亲和素板(Nunc，Microcoat编号11974998001)与25微升/孔的抗原-生物素-异构体混合物在浓度为20ng/ml的PBS-缓冲液中在4℃下培育过夜。为了用游离抗原进行抗体样品平衡：在以2500nM、500nM或100nM抗原的浓度起始的1:3、1:2或1:1.7稀释步骤中用相关抗原滴定0.01nM-1nM抗体。将样品在经密封REMP储存聚丙烯微量板(Brooks)中在4℃下培育过夜。在过夜培育之后，用90μl PBST/孔洗涤链霉亲和素板3次。将15μl来自平衡板的各样品转移至分析板且在RT下培育15min，接着用PBST缓冲液进行3次90μl洗涤步骤。通过添加25μl山羊抗人IgG抗体-POD缀合物(Jackson，109-036-088，在OSEP中1:4000)，接着用PBST缓冲液进行6次90μl洗涤步骤来进行检测。将25μl TMB底物(Roche Diagnostics有限责任公司，目录号：11835033001)添加至各孔中。在Safire2读取器(Tecan)上在370/492nm处进行测量。
在另一实施方案中，Kd是使用KinExA(动力学排除)分析来测量的。根据此分析，通常将抗原滴定至恒定浓度的抗体结合位点中，使样品平衡，且随后快速抽吸通过流槽，在该流槽中在经抗原包被珠粒上捕获游离抗体结合位点，同时将抗原饱和抗体复合物洗掉。随后，用标记抗物种抗体，例如荧光标记抗物种抗体检测珠粒捕获抗体(Bee et al.PloSOne,2012；7(4):e36261)。举例而言，在一个实施方案中，在室温(RT)下使用PBS(pH 7.4)作为运行缓冲液执行KinExA实验。在补充有1mg/ml BSA的运行缓冲液(“样品缓冲液”)中制备样品。使用0.25ml/min的流动速率。通过以100pM起始的两倍连续稀释(浓度范围0.049pM-100pM)用抗原滴定恒定量的具有5pM结合位点浓度的抗体。一个不具有抗原的抗体样品充当100％信号(亦即不具有抑制)。将抗原-抗体复合物在RT下培育至少24h以允许达到平衡。随后，以5ml的体积将经平衡混合物抽吸通过KinExA系统中的抗原偶联珠粒管柱，准许在不扰乱溶液平衡状态的情况下由珠粒捕获未结合抗体。使用含250ng/ml Dylight
Figure BDA0003535314770001011
缀合抗人类Fc片段特异性二级抗体的样品缓冲液检测所捕获抗体。对于全部平衡实验，各样品一式两份测量。使用KinExA软件(4.0.11版)内所含的单位点均质结合模型，使用“标准分析”法，由数据的非线性回归分析获得KD。
L.治疗方法及组合物
如本文所描述的抗体组可用于治疗方法中。在一个方面中，提供用作药剂的如本文所描述的一组抗体。在某些方面中，提供用于治疗方法中的一组抗体。
如上文所论述，在一些方面中，本发明的抗体组适用于其中需要向个体中的靶细胞递送放射性核素的任何治疗。举例而言，提供用于预靶向放射免疫疗法方法中例如以进行癌症治疗的如本文所描述的一组抗体。
在某些方面中，本发明提供用于个体中的预靶向放射免疫疗法方法中的抗体组，该方法包括向个体施用有效量的抗体组。如上文方面中任一个的“个体”优选为人类。
如上文所提及，治疗可属于可通过靶向患者病变细胞的细胞毒性活性治疗的任何病况。治疗优选属于肿瘤或癌症。然而，本发明的适用性不限于肿瘤及癌症。举例而言，治疗亦可属于病毒感染或例如原核生物的另一病原性生物体感染。任选地，亦可靶向T细胞以治疗经T细胞驱动的自体免疫疾病或T细胞血癌。因此，待治疗的病况可包括诸如HIV、狂犬病、EBV及卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒的病毒感染以及诸如多发性硬化症及移植物抗宿主疾病的自体免疫疾病。
如本文所使用的术语“癌症”包括实体癌症及血液癌，诸如淋巴瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、包括胰管腺癌(PDAC)的胰脏癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、肛门区癌、胃癌(stomachcancer/gastric cancer)、可为结肠癌和/或直肠癌的结肠直肠癌、乳癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括上文癌症中的任一种的难治愈型式、上文癌症中的任一种的检查点抑制剂经历型式或上文癌症中之一或多种的组合。
使放射性同位素靶向细胞、组织或器官以用于疗法的方法可包含：
i)向个体施用如本文所描述的第一抗体及第二抗体(同时或以任一次序依序)，其中抗体结合至靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面；且其中第一抗体及第二抗体的联合形成放射性标记化合物的功能性结合位点；
以及
ii)随后施用放射性标记化合物，其中放射性标记化合物结合至放射性标记化合物的功能性结合位点。
放射性标记化合物经对细胞具细胞毒性的放射性同位素标记。合适放射性同位素包括如上文所论述的α及β发射体。
在利用双特异性抗体(亦即非本发明的“分裂”抗体)的预靶向放射免疫疗法方法中，惯例为在施用抗体与施用放射性标记化合物之间施用清除剂或封闭剂。清除剂结合至抗体且增强其自身体清除的速率。其包括抗个体基因型抗体。封闭剂通常为结合至放射性标记化合物的抗原结合位点、但未经自身放射性标记的药剂。举例而言，在放射性标记化合物包含负载有特定化学元素(例如金属)的放射性同位素的螯合剂情况下，封闭剂可包含负载有相同元素(例如金属)的非放射性同位素的相同螯合剂，或可包含非负载螯合剂或负载有不同非放射性部分(例如不同元素的非放射性同位素)的螯合剂，其限制条件为其仍可与抗原结合位点结合。在一些情况下，封闭剂可另外包含增大分子的尺寸和/或流体动力学半径的部分。封闭剂在循环中阻碍分子接近肿瘤的能力，而不干扰分子结合至抗体的能力。例示性部分包括亲水性聚合物。部分可为例如聚葡萄糖、糊精、PEG、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸、羟乙基淀粉(HES)或聚(2-乙基2-噁唑啉)(PEOZ)的聚合物或共聚物。在其它实施方案中，部分可为非结构化肽或蛋白质，诸如XTEN多肽(非结构化亲水性蛋白质聚合物)、高氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)、弹性蛋白样肽(ELP)或明胶样蛋白(GLK)。另外例示性部分包括诸如白蛋白(例如牛血清白蛋白)或IgG的蛋白质。适用于部分/聚合物的分子量可介于例如至少50kDa，例如50kDa与2000kDa之间的范围内。举例而言，分子量可为200-800kDa，任选大于300、350、400或450kDa，且任选小于700、650、600或550kDa，任选约500kDa。
根据本发明的某些方面，不存在向个体施用清除剂或封闭剂的步骤。在某些方面中，不存在于施用抗体与施用放射性标记化合物之间施用结合至第一抗体或第二抗体的任何药剂的步骤。在某些方面中，不存在于施用抗体与放射性标记化合物之间施用任何药剂的步骤，选自化学治疗剂、免疫治疗剂及放射增敏剂的任选选用的化合物除外。在一些实施方案中，在施用抗体与施用放射性标记化合物之间不施用药剂。在一些实施方案中，在施用抗体与施用放射性标记化合物之间可不向个体注射或输注任何其它药剂。
在一些实施方案中，该方法可为由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成的预靶向放射免疫疗法两步法：i)施用抗体组(其中第一抗体及第二抗体可同时或以任一次序依序施用)，及ii)随后施用放射性标记化合物。治疗可涉及该疗法的多个循环，亦即此两个步骤的多个循环。例示性治疗循环持续时间为28天，其中抗体组为在循环第1天施用，且放射性标记化合物任选在循环第1、2、3、4、5、6、7或8天，例如在第7天施用。治疗循环数可变化。在一个实施方案中，可存在4、5或6个治疗循环。
本发明人出乎意料地判定，使用本发明的抗体有可能获得肿瘤对放射性标记化合物的治疗上有效吸收，同时避免正常组织中放射性的过量积聚。实际上，在实施例中，发现非靶标组织中放射性积聚水平低于使用双特异性抗体及清除步骤、同时亦利用较简单程序的三步PRIT方法中的放射性积聚水平。
在一些实施方案中，一旦已给予第一抗体及第二抗体合适时间段以定位至靶细胞，则可向个体施用放射性标记化合物。举例而言，在一些实施方案中，在第一抗体及第二抗体之后立即或在第一抗体及第二抗体之后至少4小时、8小时、1天或2天可向个体施用放射性标记化合物。任选地，其可在第一抗体及第二抗体之后不超过3天、5天或7天施用。在一个特定实施方案中，在第一抗体及第二抗体之后2至7天可向个体施用放射性标记化合物。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体可作为联合疗法的一部分施用。举例而言，其可与一或多种化学治疗剂组合施用：化学治疗剂及抗体可同时或以任一次序依序施用。另外/或者，其可与一或多种免疫治疗剂组合施用：免疫治疗剂及抗体可同时或以任一次序依序施用。
在一些实施方案中，另外/或者，本文所描述的抗体可与放射增敏剂组合施用。放射增敏剂及抗体可同时或以任一次序依序施用。
本发明抗体(及例如放射性标记化合物的任何额外治疗剂)可通过包括非经肠、肺内及鼻内的任何合适手段施用，且视需要用于局部治疗、病灶内施用。非经肠输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何合适途径，例如通过诸如静脉内或皮下注射的注射进行。
在一些实施方案中，可在如上文所描述的一个或多个治疗循环之前使用一个或多个剂量测定法循环。剂量测定法循环可包含以下步骤：i)施用抗体组(其中第一抗体及第二抗体可同时或以任一次序依序施用)，及ii)随后施用经γ-发射体放射性标记的适用于成像的化合物(其中该放射性标记化合物结合至放射性标记化合物的功能性结合位点)。该化合物可与后续治疗循环中所使用的化合物相同，不同之处在于其经γ发射体而非α或β发射体标记。举例而言，在一个实施方案中，剂量测定法循环中所使用的放射性标记化合物可为203Pb-DOTAM，且治疗循环中所使用的放射性标记化合物可为212Pb-DOTAM。患者可经受成像以测定肿瘤对化合物的吸收和/或以估计化合物的吸收剂量。此信息可用于估计后续治疗步骤中的预期辐射暴露且用于将治疗步骤中所使用的放射性标记化合物的剂量调节至安全水平。
M.药物制剂
本文所描述的第一抗体及第二抗体可在单一药物组合物中或在单独药物组合物中调配。因此，在另一方面中，本发明提供例如用于本文所描述的治疗或诊断方法中的任一种中的包含本发明的第一抗体及第二抗体的药物组合物或包含本发明的第一抗体的第一药物制剂及包含本发明的第二抗体的第二药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在另一实施方案中，药物组合物进一步包含例如如下文所描述的至少一种额外治疗剂。
具有如本文所描述的抗体的药物制剂可通过混合具有所需纯度的该抗体与一或多种任选选用的药学上可接受的载剂来以冻干制剂或水溶液的形式制备(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))。
在所采用剂量及浓度下的药学上可接受的载剂一般对接受者无毒，且包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子界面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶PH-20玻尿酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0003535314770001051
Halozyme公司)。某些例示性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法描述于美国专利公开案第2005/0260186号及第2006/0104968号中。在一个方面中，sHASEGP与一或多种诸如软骨素酶的额外葡萄糖胺聚糖酶组合。
例示性冻干抗体组合物描述于美国专利第6,267,958号中。水性抗体组合物包括美国专利第6,171,586号及WO 2006/044908中所描述的水性抗体组合物，后者组合物包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的制剂亦可含有为所治疗的特定适应症所必需的超过一种活性成分，优选具有不会彼此不利影响的互补活性的活性成分。举例而言，可能需要进一步提供如上文所论述的化学治疗剂、免疫治疗剂和/或放射增敏剂。所述活性成分适当地以有效达成预期目的的量以组合形式存在。
活性成分可包覆于微胶囊中，其为例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；包覆于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)中或巨乳液中。所述技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实施例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质为呈例如膜或微胶囊的成形物品形式。
待用于体内施用的制剂一般为无菌。无菌性很容易例如通过经过无菌过滤膜过滤来达成。
N.用于诊断及检测的方法及组合物
如本文所描述的抗体组亦可用于诊断或成像方法，优选为预靶向放射免疫成像方法或包含预靶向放射免疫成像的方法。因此，本发明提供诊断及成像方法。其进一步提供抗体组在如本文所描述的成像方法中的用途，及如本文所描述的一组抗体(亦即如本文所描述的第一抗体及第二抗体)用于在个体上，例如在人类或动物身体上进行的诊断方法中的用途。
成像方法适用于对身体中的靶抗原的存在和/或分布进行成像。举例而言，该方法可为对表达疾病相关抗原的细胞进行成像的方法，该疾病诸如上文所论述的疾病病况中的任一者。任选地，该方法为用于对肿瘤或癌症进行成像。该方法可用于诊断疑似患有诸如癌症的增生性病症或感染性疾病的个体的目的。
在一些实施方案中，该个体优选为人类。
使放射性同位素靶向组织或器官以进行成像或诊断的方法可包含：
i)向个体施用如本文所描述的第一抗体及第二抗体(同时或以任一次序依序施用)，其中抗体结合至靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面，其中第一抗体及第二抗体的联合会形成放射性标记化合物的功能性结合位点；
以及
ii)随后施用放射性标记化合物，其中放射性标记化合物结合至放射性标记化合物的功能性结合位点。
任选地，该方法可进一步包含：
iii)对其中定位或期望定位放射性标记化合物的组织或器官进行成像。
任选地，该方法可进一步包含一个或多个形成诊断、向个体递送诊断和/或基于诊断确定和/或施用合适治疗的步骤。
在另一实施方案中，本发明的方法可包含对个体的组织或器官进行成像，其中个体先前已施用有：
i)如本文所描述的第一抗体及第二抗体(同时或以任一次序依序)，其中抗体结合至靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面，且其中第一抗体及第二抗体的联合形成放射性标记化合物的功能性结合位点；以及
ii)放射性标记化合物，其中放射性标记化合物结合至通过第一抗体及第二抗体的联合形成的该放射性标记化合物的抗原结合位点。
在如本文所描述的成像和/或诊断方法中，放射性标记化合物经适用于成像的放射性同位素标记。合适放射性同位素包括如上文所论述的γ发射体。
在常规预靶向放射成像方法中，惯例为在施用抗体与施用放射性标记化合物之间施用清除剂或封闭剂，例如如上文所描述的清除剂或封闭剂。
在本发明的某些实施方案中，不存在施用清除剂或封闭剂的步骤。在某些方面中，不存在于施用抗体与施用放射性标记化合物之间施用结合至第一抗体或第二抗体的任何药剂的步骤。在某些方面中，不存在于施用抗体与放射性标记化合物之间施用任何药剂的步骤，选自化学治疗剂、免疫治疗剂及放射增敏剂的任选选用的化合物除外。在一些实施方案中，在施用抗体与施用放射性标记化合物之间不施用药剂。在一些实施方案中，在施用抗体与施用放射性标记化合物之间可不向个体注射或输注任何其它药剂。
在一些实施方案中，一旦已给予第一抗体及第二抗体合适时间段以定位至靶细胞，则可向个体施用放射性标记化合物。举例而言，在一些实施方案中，在第一抗体及第二抗体之后立即或在第一抗体及第二抗体之后至少4小时、8小时、1天或2天可向个体施用放射性标记化合物。任选地，其可在第一抗体及第二抗体之后不超过3天、5天或7天施用。在一个特定实施方案中，在第一抗体及第二抗体之后2至7天可向个体施用放射性标记化合物。
在一些实施方案中，成像方法可为由以下步骤组成或基本上由以下步骤组成的预靶向放射成像方法：i)施用抗体组(其中第一抗体及第二抗体可同时或以任一次序依序施用)，ii)随后施用放射性标记化合物，及iii)对所关注的组织或器官进行成像。诊断方法可由以下组成或基本上由以下组成：该步骤，接着为形成诊断的步骤，该步骤可随后递送至患者且可用作用于所选择治疗方案和/或施用治疗方案的基础。
靶抗原可为如本文所论述的任何靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原可为如上文所论述的肿瘤特异性抗原，且成像可为对一或多种肿瘤进行成像的方法。个体可已知或疑似患有肿瘤。
举例而言，该方法可为对患有或疑似患有以下的个体的肿瘤进行成像的方法：肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、包括PDAC的胰脏癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、可为直肠癌和/或结肠癌的结肠直肠癌、肛门区癌、胃癌(stomach cancer/gastric cancer)、乳癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)赘瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤及尤文氏肉瘤，包括上文癌症中的任一种的难治愈型式或这些癌症中的任一种的检查点抑制剂经历型式或上文癌症中之一或多种的组合。
III.序列
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IV.实施例
以下为本发明的方法及组合物的实施例。应理解，在上文所提供的一般描述的情况下，可实践各种其它实施方案。
缩写词汇表
ADA 抗药物抗体
AST 丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸
BsAb 双特异性抗体
CA 清除剂
CEA 癌胚抗原
DOTAM 1,4,7,10-四(氨甲酰基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷
ID 注射剂量
ELISA 酶联结免疫吸附分析
FAP 纤维母细胞活化蛋白
GPRC5D G蛋白偶联受体家族C第5群成员D
IV 静脉内
MW 分子量
PBS 磷酸盐缓冲盐水
p.i. 注射后
PK 药物动力学
PRIT 预靶向放射免疫疗法
RIT 放射免疫疗法
RT 室温
SC 皮下
SCID 严重合并性免疫缺失病
SD 标准偏差
SOPF 不含特异性及机会性病原体
TA 靶抗原
TGI 肿瘤生长抑制
TR 肿瘤消退
实施例1：生成兔DOTAM结合抗体
实施例1A：兔免疫接种
如WO 2000/46251、WO 2002/12437、WO 2005/007696、WO 2006/047367、US 2007/0033661及WO 2008/027986中所报导，使用2个对映异构Pb-DOTAM-烷基-PEG4-KLH洗脱份(MS2-DOTAM KLH洗脱份1及MS2-DOTAM KLH洗脱份2)的1:1混合物以对新西兰白兔或包含人免疫球蛋白基因座的转基因兔进行免疫接种。各兔在第0天通过皮内施用免疫接种500μg经完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)乳化的免疫原混合物，且在第7天、第14天、第28天、第56天通过交替肌内及皮下施用各500μg。其后，兔接受每月一次500μg皮下免疫接种，且在免疫接种之后7天采集少量血液样品以测定血清效价。在免疫接种第三个月期间及第九个月期间(在免疫接种之后5-7天)采集更多血液样品(估计总血容量的10％)，且分离周边单核细胞，所述周边单核细胞用作B细胞克隆过程中抗原特异性B细胞的来源。
测定血清效价(ELISA)
将2个对映异构Pb-DOTAM洗脱份(PJRD05.133F1或PJRD05.133F2)中的各者于PBS中以1μg/ml、100微升/孔固定在96孔NUNC Maxisorp板上，接着：用200微升/孔的含2％Crotein C的PBS封闭板；一式两份施用100微升/孔的抗血清于含0.5％Crotein C的PBS中的连续稀释液；用HRP缀合驴抗兔IgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152；1/16 000)及链霉亲和素-HRP进行检测；各者100微升/孔稀释于含0.5％Crotein C的PBS中。对于全部步骤，将板在37℃下培育1h。在全部步骤之间，用含0.05％Tween 20的PBS洗涤板3次。通过添加100微升/孔的BM Blue POD可溶底物(Roche)来显现信号；且通过添加100微升/孔的1M HCl来终止。以690nm作为参考在450nm处读出吸亮度。将效价定义为产生半最大信号的抗血清的稀释度。
实施例1B：来自兔的B细胞克隆
分离兔周边血液单核细胞(PBMC)
采集经免疫接种兔的血液样品。根据制造商说明书，用1×PBS(PAA,Pasching,Austria)将含EDTA的全血稀释两倍，之后使用哺乳动物淋巴球(Cedarlane Laboratories,Burlington,Ontario,Canada)进行密度离心。用1×PBS将PBMC洗涤两次。
EL-4B5培养基
使用补充有10％FCS(Hyclone,Logan,UT,USA)、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液(PAA,Pasching,Austria)、2mM丙酮酸钠、10mM HEPES(PAN Biotech,Aidenbach,Germany)及0.05mM b-巯基乙醇(Gibco,Paisley,Scotland)的RPMI 1640(Pan Biotech,Aidenbach,Germany)。
包被板
在4℃下用含2μg/ml KLH的碳酸盐缓冲液(0.1M碳酸氢钠、34mM碳酸氢二钠，pH9.55)涂布无菌细胞培养6孔板过夜。将板在使用之前在无菌PBS中洗涤三次。在室温下用经生物素标记TCMC-Pb-dPEC3-生物素异构体A(1μg/ml)及B(1μg/ml)于PBS中的1+1对映异构体混合物涂布无菌链霉亲和素涂布的6孔板(Microcoat,Bernried,Germany)3h。在淘选步骤之前，将这些6孔板用无菌PBS洗涤三次。
耗尽巨噬细胞/单核球
将PBMC接种于无菌KLH涂布的6孔板上以经由非特异性粘附耗尽巨噬细胞及单核球且以移除结合至KLH的细胞。用4ml培养基及来自经免疫接种兔的至多6×10e6个PBMC最大填充各孔且使其在37℃及5％CO2下结合1h。使用于上清液中的细胞(周边血液淋巴球(PBL))以用于抗原淘选步骤。
在含Pb的TCMC对映异构体上富集B细胞
使涂有TCMC-Pb-dPEC3-生物素异构体A及B的对映异构体混合物的6孔板接种至多6×10e6个PBL/4ml培养基，且使其在37℃及5％CO2下结合1h。通过用1×PBS谨慎地洗涤孔1-3次来移除非粘附细胞。在37℃及5％CO2下通过胰蛋白酶剥离剩余粘性细胞10min。用EL-4B5培养基终止胰蛋白酶化。将细胞保持在冰上直至免疫荧光染色为止。
免疫荧光染色及流式细胞术
使用抗IgG FITC(AbD Serotec,Düsseldorf,Germany)以进行单一细胞分选。对于表面染色，将来自耗尽及富集步骤的细胞与抗IgG FITC抗体在PBS中一起培育且在暗处在4℃下培育45min。在染色之后，用冰冷PBS洗涤PBMC两次。最后，使PBMC再悬浮于冰冷PBS中且立即经受FACS分析。在FACS分析之前，添加浓度为5μg/ml的碘化丙片(BD Pharmingen,SanDiego,CA,USA)以区别死细胞与活细胞。
使用配备有计算机的Becton Dickinson FACSAria及FACSDiva软件(BDBiosciences,USA)以进行单一细胞分选。
B细胞培养物
通过Lightwood et al.(J Immunol Methods,2006,316:133-143)所描述的方法制备兔B细胞培养物。简言之，在培育箱中在37℃下在具有200微升/孔的含有Pansorbin细胞(1:100000)(Calbiochem(Merck),Darmstadt,Deutschland)、5％兔胸腺细胞上清液(MicroCoat,Bernried,Germany)及经γ照射的鼠EL-4B5胸腺瘤细胞(5×10e5个细胞/孔)的EL-4B5培养基的96孔板中培育经单一分选的兔B细胞7天。移除具有B细胞培养物的上清液以进行筛检，且立即收取剩余细胞并在-80℃下在100μl RLT缓冲液(Qiagen,Hilden,Germany)中进行冷冻。
实施例1C：表达兔抗体
V域的PCR扩增
根据制造商方案，使用NucleoSpin 8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)由B细胞溶解物(再悬浮于RLT缓冲液-Qiagen-目录号79216中)制备总RNA。用60μl不含RNA酶的水洗脱RNA。根据制造商说明书，通过逆转录酶反应，使用Superscript III第一链合成超混合液(Invitrogen 18080-400)及寡dT引物，使用6μl RNA来生成cDNA。全部步骤均在Hamilton ML Star系统上执行。用AccuPrime超混合液(Invitrogen 12344-040)在50μl最终体积中，对于重链使用引物rbHC.up及rbHC.do，且对于轻链使用引物rbLC.up及rbLC.do，使用4μl cDNA来扩增免疫球蛋白重链及轻链可变区(VH及VL)(下表)。全部正向引物均对信号肽(分别VH及VL的信号肽)具有特异性，而逆向引物对恒定区(分别VH及VL的恒定区)具有特异性。RbVH+RbVL的PCR条件如下：在94℃下5min热启动；在94℃下20s、在70℃下20s、在68℃下45s的35个循环，且在68℃下7min最终延长。
引物序列
Figure BDA0003535314770001421
将50μl PCR溶液中的8μl负载于48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。根据制造商方案，使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)清洁阳性PCR反应物，且在50μl洗脱缓冲液中进行洗脱。全部清洁步骤均在Hamilton ML Starlet系统上执行。
兔单克隆二价抗体的重组表达
对于兔单克隆二价抗体的重组表达，通过突出物克隆方法将编码VH或VL的PCR产物以cDNA形式克隆至表达载体中(RS Haun et al.,Biotechniques(1992)13,515-518；MZLi et al.,Nature Methods(2007)4,251-256)。表达载体含有由包括内含子A的5'CMV启动子及3'BGH聚腺苷酸化序列组成的表达盒。除表达盒之外，质粒含有pUC18源性复制起点及为大肠杆菌中的质粒扩增赋予氨苄西林(ampicillin)抗性的β-内酰胺酶基因。使用基础质粒的三个变体：一个质粒含有设计成接纳VH区的兔IgG恒定区，而两个额外质粒含有兔或人类κLC恒定区以接纳VL区。通过PCR使用重叠引物来扩增编码κ或γ恒定区及VL/VH插入片段的经线性化表达质粒。将经纯化PCR产物与T4 DNA-聚合酶一起培育，此举生成单链突出物。通过dCTP添加终止反应。在下一步骤中，将质粒及插入片段组合且与recA一起培育，此举诱导位点特异性重组。将经重组质粒转化至大肠杆菌中。次日，通过质粒制备、限制分析及DNA-定序选取生长群落且针对正确经重组质粒进行测试。对于抗体表达，通过遵循试剂供货商所建议的程序，使用239-Free转染剂(Novagen)，将经分离HC及LC质粒短暂共转染至2ml(96孔板)FreeStyle HEK293-F细胞(Invitrogen R790-07)中。在1周之后收取上清液且递送以进行纯化。
实施例1D：选择兔单克隆抗体
如下文所描述进行SET(溶液平衡滴定)分析。
SET分析
材料：
1.DOTAM-生物素-异构体混合物：
以下组分的混合物浓度＝20ng/ml
-Pb-Dotam-Bn-生物素/TCMC-Pb-dPEG3-生物素，异构体A
-Pb-Dotam-Bn-生物素/TCMC-Pb-dPEG3-生物素，异构体B
-Pb-Dotam-烷基-生物素异构体A
-Pb-Dotam-烷基-生物素异构体B
2.PBS：DPBS、PAN、P04-36500
3.BSA：Roche，10735086001
4.Tween 20：聚山梨醇酯20(usb，编号20605，500ml)
5.PBST：10×，Roche，编号11666789001/0.1％Tween 20
6.OSEP：PBS(10×，Roche，编号11666789001)/0.5％BSA(牛血清白蛋白洗脱份V，不含脂肪酸，Roche，编号10735086001)/0.05％Tween 20
制备分析板：将384孔链霉亲和素板(Nunc,Microcoat编号11974998001)与浓度为20ng/ml的25μl/孔的含DOTAM-生物素-异构体混合物的PBS-缓冲液一起在4℃下培育过夜。
用游离DOTAM-金属螯合物(Pb、Bi、Ca、Cu、Zn、Mg、Fe)平衡抗DOTAM抗体样品：在以2500nM、500nM或100nM DOTAM-金属螯合物的浓度起始的1:3、1:2或1:1.7稀释步骤中用相关DOTAM-金属螯合物滴定0.01nM-1nM抗体。将样品在经密封REMP储存聚丙烯微量板(Brooks)中在4℃下培育过夜。
在过夜培育之后，用90μl PBST/孔洗涤链霉亲和素板3次。将15μl来自平衡板的各样品转移至分析板且在RT下培育15min，接着用PBST缓冲液进行3次90μl洗涤步骤。通过添加25μl山羊抗人IgG抗体-POD缀合物(Jackson，109-036-088，在OSEP中1:4000)，接着用PBST缓冲液进行6次90μl洗涤步骤来进行检测。将25μl TMB底物(Roche Diagnostics有限责任公司，目录号：11835033001)添加至各孔中。在Safire2读取器(Tecan)上在370/492nm处进行测量。
下表显示如使用此分析测定的各种单克隆二价兔抗体的特性。选择PRIT-0128作为主要候选物，这是因为其具有相当的与经螯合Pb及Bi的结合、经减少的与其它经螯合金属的结合及高亲和力(<100pM)。
将单克隆二价兔抗体结合至经螯合金属
Figure BDA0003535314770001441
WTRa：野生型兔；TgRa：转基因兔
实施例2：人源化
人源化
接着，使主要候选物PRIT-0128经受人源化。
对于DOTAM结合子PRIT-0128人源化期间的合适人类受体框架的识别，使用两种方法的组合。一方面，通过搜索与亲本抗体具有高序列同源性的受体框架且随后将CDR区移植至此受体框架上来进行经典方法。针对对结合子结构完整性的影响判断所识别的框架与亲本抗体的各氨基酸差异，且适当时引入回复至亲本序列的回复突变。
另一方面，使用内部研发的计算机仿真工具以预测人源化型式的VH域及VL域朝向彼此的定向(参见WO2016/062734)。此举为针对CDR在全部可能性人类种系组合上的虚拟移植来进行。将结果与亲本结合子的VH-VL域定向作比较以选择在几何结构中与起始抗体接近的框架组合。
在各情况下，将以下亲本抗体的CDR区移植至受体框架上(根据Kabat编号)：
VH_CDR1：31-35
VH_CDR2：50-65
VH_CDR3：95-102
VL_CDR1：24-34
VL_CDR2：50-56
VL_CDR3：89-97
产生呈包含针对CEA的全长抗体的格式的人源化变体，其中重链中之一者的C端融合至Dotam-结合子的VH域的N端，且另一重链的C端融合至DOTAM-结合子的VL域的N端，形成具有两个用于CEA的结合位点及一个用于DOTAM的功能性结合位点的双特异性抗体。因此，使DOTAM结合子融合至靶向肿瘤的IgG的Fc的C端作为VH/VL Fv融合物(分别不具有CH1及Ck)。呈此双特异性格式的亲本DOTAM结合子PRIT-0128源性分子称为PRIT-0156。
由于就VH/VL预测而言的适合性及经提高的框架稳定性，亦包括赫赛汀(Herceptin)框架。对于全部VH人源化变体，使用人类J元素hJH2。对于全部VK人源化变体，使用人类J元素hJK4。
HC4为PRIT-128于具有一个回复突变Kabat A49G的人类种系IGHV3-30-02上的移植。
为得到可变重链HC5，将CDR移植于具有作为回复突变的A49G及用于反映原始兔N端的第一氨基酸删除的人类种系hVH_2_26上。
移植于赫赛汀V区(衍生自人类种系hVH3_66)上的变体HC7的特征在于受体框架中的几个修饰：N端E、A49G、A71R及S93A的删除。
对于HC10，将PRIT-128的CDR移植于人类种系IGHV4_34_01上。
此处，N端经修饰，以V2起始，以反映以Q2起始的原始兔抗体。另外，关于Kabat命名法，G29F及F31L以及框架3中的V71R及F78V视为回复突变。
对于轻链LC1，将CDR移植于不具有任何回复突变的人类种系IGKV1_39_01上。起始选为I2以反映以A2起始的原始兔Ab。
通过将CDR移植于人类种系hVK1_5上来获得轻链变体LC3。D1经删除且I2A回复突变视为新N端。考虑K42Q及A43P作为额外回复突变。
并非全部可能性人源化基质组合均产生，但基于如VH/VL预测及既定组合的序列风险的考虑因素选择精选限定组合。
选择候选物
人源化的目标在于获得就对DOTAM的亲和力而言不损失超过10倍的人源化结合子。此靶标为用具有相当或甚至更优选的对DOTAM的亲和力的若干结合子达成。
如上文所提及，PRIT-0156为包含兔DOTAM结合子PRIT-0128与CEA结合子CH1A1A的组合的2:1抗体。PRIT-0178至PRIT-0204为呈具有相同CEA结合子的相同格式的人源化变体。PRIT-0205至PRIT-0221在DOTAM结合部分中对应于PRIT-0178至PRIT-0204人源化变体，但使CEA结合子变成T84.66。
基于溶液平衡的kd测定
为针对人源化候选物对Pb-DOTAM的亲和力筛选较大量的人源化候选物，使用溶液平衡滴定(SET)。下表详述针对Pb-DOTAM的所选择人源化DOTAM结合子的基于SET的亲和力测定。此表中的全部抗体均为包含与CEA的二价结合及与Pb-Dotam的单价结合(2:1格式)的双特异性抗体：
Figure BDA0003535314770001461
Figure BDA0003535314770001471
基于Kinexa的kd测定
对于亲和力测定的更详细分析及正交方法，使用Kinexa。
仪器使用及材料
使用来自Sapidyne Instruments(Boise,ID)的具有自动取样器的KinExA3200仪器。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)珠粒是购自Sapidyne，而PBS(磷酸盐缓冲盐水)、BSA(牛血清白蛋白洗脱份V)及抗DOTAM抗体是在内部制备(Roche)。
Figure BDA0003535314770001472
缀合的亲和力纯化的山羊抗人IgG-Fc片段交叉吸附抗体是购自Bethyl Laboratories(Montgomery,TX)。经生物素标记Pb-DOTAM抗原(Pb-DOTAM-烷基-生物素异构体A及B、Pb-DOTAM-Bn-生物素/TCMC-Pb-dPEG3-生物素异构体A及B)及未经生物素标记Pb-DOTAM是获自AREVA Med(Bethesda,MD)。
制备抗原包被的珠粒
根据用于经生物素标记分子的KinExA Handbook方案(Sapidyne)包被PMMA珠粒。简言之，首先，每小瓶(200mg)用于吸附包被的珠粒添加含10μg生物素-BSA(ThermoScientific)的1ml PBS(pH 7.4)。在于室温下旋转2h之后，移除上清液且用1ml PBS洗涤珠粒5次。其次，将1ml含100μg中性亲和素(NeutrAvidin)生物素结合蛋白(ThermoScientific)的含有10mg/ml BSA的PBS添加至珠粒中且在室温下再培育2h以使中性亲和素与珠粒偶联，且为后续经生物素标记蛋白质的结合提供额外生物素结合位点。随后，将中性亲和素包被的珠粒用1ml PBS冲洗5次。最后，用含200ng/ml经生物素标记Pb-DOTAM-异构体混合物(各异构体50ng)的PBS包被珠粒且在室温下再培育2h。随后，使珠粒再悬浮于30mlPBS中且立即使用。
KinExA平衡分析
在室温(RT)下使用PBS(pH 7.4)作为运行缓冲液执行全部KinExA实验。在补充有1mg/ml BSA的运行缓冲液(“样品缓冲液”)中制备样品。使用0.25ml/min的流动速率。通过以100pM起始的两倍连续稀释(浓度范围0.049pM-100pM)用Pb-DOTAM抗原滴定恒定量的具有5pM结合位点浓度的抗DOTAM抗体。一个不具有抗原的抗体样品充当100％信号(亦即不具有抑制)。将抗原-抗体复合物在RT下培育至少24h以允许达到平衡。随后，以5ml的体积将经平衡混合物抽吸通过KinExA系统中的Pb-DOTAM偶联珠粒管柱，准许在不扰乱溶液平衡状态的情况下由珠粒捕获未结合抗体。使用含250ng/ml Dylight
Figure BDA0003535314770001481
缀合抗人类Fc片段特异性二级抗体的样品缓冲液检测所捕获抗体。对于全部平衡实验，各样品一式两份测量。
使用KinExA软件(4.0.11版)内所含的单位点均质结合模型，使用“标准分析”法，由数据的非线性回归分析获得KD。软件计算KD且通过将数据点拟合成理论KD曲线来确定95％信赖区间。95％信赖区间(Sapidyne TechNote TN207R0)为以低KD及高KD给出。
针对人源化PRIT分子的热稳定性测量
方法及数据分析
将呈最终格式的人源化PRIT分子的不同变体(在20mM组氨酸、140mM NaCl，pH 6.0中)在相同缓冲液中稀释至1mg/ml。将30μl各样品转移至384孔板过滤装置中(以及作为参考的抗HER3抗体)。在于1,000g下离心1min之后，用10μl石蜡油覆盖孔。将板再次离心(1,000g达1min)且转移至DLS板式读取器(Dyna Pro PlateReader-II,Wyatt)中。以25℃起始，将温度以0.05℃/min的速度升高至79.9℃。使用Dynamics软件(7.0版)记录散射光。
将数据转移至Excel(Microsoft)，通过样品及温度进行分选且使用软件插件建立熔融曲线。出现相对于基线的清晰偏差情况下的温度定义为“聚集起点”且熔融曲线的拐点定义为“熔融温度”。
结果
Figure BDA0003535314770001491
候选物特性
下表概述各种PRIT分子的一致性且比较其特性。优选化合物为PRIT-0213及PRIT-0214。
候选物概述
Figure BDA0003535314770001492
Figure BDA0003535314770001501
特性比较
Figure BDA0003535314770001502
Figure BDA0003535314770001511
下文提供PRIT-0213的如通过Kinexa所测定的另外亲和力值数据。(PRIT-0213为与PRIT-0186相同的分子，结合VH/VL的另一CEA除外)。
PRIT-0213
CEA-DOTAM BsAb的金属-DOTAM螯合物亲和力
Figure BDA0003535314770001512
Figure BDA0003535314770001521
额外值如下文所示：
Figure BDA0003535314770001522
*宽信赖区间，指示所测量的KD不精确
°对于nM亲和力，分析不完全优化
序列
下文提供用于此实施例的序列。PRIT-0213及PRIT-0214均具有包含具有下文SEQID NO 116-121的CDR的Pb-DOTAM结合位点。PRIT-0213的Pb-DOTAM结合位点的重链及轻链可变域的序列示于SEQ ID NO:122-123中，且PRIT-0214的Pb-DOTAM结合位点的重链及轻链可变的序列示于SEQ ID NO:124-125中。
PRIT-0214由以下构成：
i)一个具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链；
ii)一个具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链；以及
iii)两个具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的抗体轻链。
PRIT-0213由以下构成：
i)一个具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的第一重链；
ii)一个具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的第二重链；以及
iii)两个具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的抗体轻链。
Figure BDA0003535314770001531
Figure BDA0003535314770001541
Figure BDA0003535314770001551
Figure BDA0003535314770001561
Figure BDA0003535314770001571
Figure BDA0003535314770001581
Figure BDA0003535314770001591
Figure BDA0003535314770001601
实施例3：Fab P1AA1227 Pb-DOTAM复合物的结晶、数据收集及结构确定
对于复合物形成，将称为P1AA1227的衍生自PRIT-0213中人源化VH/VL的Fab以26mg/ml与Pb-DOTAM粉末以1:4.2的摩尔浓度比混合。在于4℃下培育2小时之后，在沉滴式蒸气扩散设置中在21℃下使用JCSG+筛(Qiagen,Hilden)执行初始结晶试验。晶体在5天自0.2M(NH4)2SO4、0.1M BIS-TRIS(pH 5.5)、25％w/v PEG3350出现。在无任何其它优化步骤的情况下直接自筛检板收取晶体。
数据收集及结构确定。对于数据收集，在含有10％乙二醇的沉淀剂溶液中于100K下快速冷冻晶体。在Swiss Light Source(Villigen,Switzerland)的射束线X10SA下使用PILATUS 6M检测器在
Figure BDA0003535314770001602
的波长下收集衍射数据。将数据用XDS(Kabsch,W.ActaCryst.D66,133-144(2010))处理，且用SADABS(BRUKER)按比例调整。复合物的晶体属于具有
Figure BDA0003535314770001603
Figure BDA0003535314770001604
及β＝108.36°的晶胞轴的空间群C2，且衍射至
Figure BDA0003535314770001605
的分辨率。通过用PHASER进行的分子置换(McCoy,A.J,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Storoni,L.C.及Read,R.J.J.Appl.Cryst.40,658-674(2007))使用内部Fab结构坐标作为搜索模型确定结构。使用差异电子密度以置放Pb-DOTAM且根据序列差异通过实际空间优化来改变氨基酸。用来自CCP4套件(Collaborative ComputationalProject,Number 4Acta Cryst.D50,760-763(1994).)及BUSTER(Bricogne,G.,Blanc,E.,Brandl,M.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Roversi,P.,Sharff,A.,Smart,O.S.,Vonrhein,C.,Womack,T.O.(2011).Buster 2.9.5版Cambridge,United Kingdom:GlobalPhasing有限公司)的程序优化结构。用COOT进行手动重建(Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.及Cowtan,K.Acta Cryst D66,486-501(2010))。
下文概述资料收集及优化统计。
全部图形呈现均用PYMOL来准备(The Pymol Molecular Graphics System,1.7.4版.
Figure BDA0003535314770001611
LLC.)。
用于Fab P1AA1227-Pb-DOTAM复合物的资料收集及优化统计
Figure BDA0003535314770001612
Figure BDA0003535314770001621
*括号中的值是针对最高分辨率壳的。
与Pb-DOTAM复合的Fab P1AA1227的结构
为表征Pb-DOTAM与Fab P1AA1227的相互作用细节，我们确定在
Figure BDA0003535314770001622
的分辨率下的复合物的晶体结构。结构揭示Fab P1AA1227是通过轻链的CDR1及CDR3的主要贡献且通过重链的CDR2及CDR3的主要贡献而结合至Pb-DOTAM的。
用程序PISA进行的结合界面分析揭示经由3个氢键、极性相互作用及范德华接触进行的Fab P1AA1227与Pb-DOTAM的相互作用模式。Pb-DOTAM为在由重链及轻链形成的袋形物中结合。此袋形物具有在一侧开放的盒的形状。袋形物的侧壁及底部促进非极性相互作用，而在壁边缘，极性相互作用占主导。在重链的CDR3残基Glu95及Asp97与DOTAM氨甲酰基氮原子N7及N8之间形成侧链氢键。经由Arg96的主链羰基原子与DOTAM的原子N7建立另一氢键。复合物经由重链CDR2 Phe50及Tyr58侧链的非极性相互作用进一步稳定，所述侧链的边缘是取向面向氮杂环十二烷环的。轻链主要贡献袋形物的“底部”，其中CDR3残基Gly91-Tyr96提供与四环十二烷环的非极性接触。Asp32使氢键关注DOTAM的氨甲酰基氮原子N6。(根据Kabat编号)。
基于用程序PISA进行的分析，下表显示重链互补位残基。
Figure BDA0003535314770001623
Figure BDA0003535314770001631
基于用程序PISA进行的分析，下表显示轻链互补位残基。
Figure BDA0003535314770001632
在下文序列中互补位残基亦加下划线：
>P1AA1227_HC
Figure BDA0003535314770001633
>P1AA1227_LC
Figure BDA0003535314770001641
实施例4：生成CEA-分裂-DOTAM VH/VL抗体
使用具有用于靶抗原的结合位点及放射性标记化合物的结合位点的双特异性抗体的PRIT(预靶向放射免疫疗法)方法通常在施用抗体与放射性配位体之间使用清除剂(CA)，以确保有效靶向及高肿瘤与正常组织吸收剂量比(参见图3)。在一种该方法的例子中，允许所注射BsAb足够时间，一般4-10天渗透至肿瘤中，其后使用Pb-DOTAM-聚葡萄糖-500CA中和循环BsAb。CA在不渗透至肿瘤中的情况下封闭212Pb-DOTAM结合至未经靶向BsAb，此举将封闭预靶向位点。此预靶向方案允许随后施用的放射性标记螯合物212Pb-DOTAM的有效肿瘤积聚。
然而，在涉及清除剂的方法中，CA的使用在方法中引入了额外步骤因此是低效的。此外，重要之处可在于谨慎选择CA施用的时机及用量，而其是一种复杂因素。
为解决清除剂使用相关问题，本发明人提出分裂DOTAM VL域及VH域以使得在独立抗体上找到其的策略。
下文进一步论述例示性分裂DOTAM VH/VL抗体的生成。
生成用于抗体重链或轻链的重组表达的质粒
通过短暂转染人类胚肾细胞(HEK 293)表达所需蛋白质。对于所需基因/蛋白质(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或含有额外域(例如其C端处的免疫球蛋白重链或轻链可变域)的全长抗体重链)的表达，使用包含以下功能元素的转录单元：
-包括内含子A的来自人类巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期强化子及启动子，
-人类重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，
-待表达的基因/蛋白质，以及
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
除包括待表达的所需基因的表达单元/盒之外，基础/标准哺乳动物表达质粒亦含有
允许在大肠杆菌中复制此质粒的来自载体pUC18的复制起点，以及
在大肠杆菌中赋予氨苄西林抗性的β-内酰胺酶基因。
a)用于抗体重链的表达质粒
通过将编码各自通过G4Sx4接头分离的各自序列元素(V重或V轻)的DNA片段融合至人IgG分子的CH3域的C端来装配抗体重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)编码基因，所述基因包括包含完整且功能性抗体重链、接着为额外抗体V重域或V轻域的C端融合基因。使用节-入-穴技术表达在两个CH3域的C端处分别携带一个VH域及一个VL域的重组抗体分子。
除具有C端VH域或VL域表达盒的抗体重链片段之外，用于在HEK293细胞中短暂表达具有C端VH域或VL域的抗体重链的表达质粒亦包含允许在大肠杆菌中复制此质粒的来自载体pUC18的复制起点及在大肠杆菌中赋予氨苄西林抗性的β-内酰胺酶基因。具有C端VH域或VL域融合基因的抗体重链片段的转录单元包含以下功能元素：
-包括内含子A的来自人类巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期强化子及启动子，
-人类重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-抗体重链(VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH或VH-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VL)编码核酸，以及
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
具有C端VH域或VL域融合蛋白的成熟抗体重链片段的氨基酸序列示于下文中：
具有DOTAM-VH-P1AD8749的PRIT分裂抗体
>D1AC4022
Figure BDA0003535314770001661
>D1AA4507
Figure BDA0003535314770001662
具有DOTAM-VL-P1AD8592的PRIT分裂抗体
>:D1AA4506
Figure BDA0003535314770001671
>:D1AC4023
Figure BDA0003535314770001672
b)用于抗体轻链的表达质粒
通过融合编码各自序列元素的DNA片段来装配包含完整且功能性抗体轻链的抗体轻链编码基因。
除抗体轻链片段之外，用于短暂表达抗体轻链的表达质粒亦包含允许在大肠杆菌中复制此质粒的来自载体pUC18的复制起点及在大肠杆菌中赋予氨苄西林抗性的β-内酰胺酶基因。抗体轻链片段的转录单元包含以下功能元素：
-包括内含子A的来自人类巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期强化子及启动子，
-人类重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-抗体轻链(VL-CL)编码核酸，以及
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
对于P1AD8592及P1AD8749，成熟抗体轻链片段的氨基酸序列为相同的。
>D1AA3384
Figure BDA0003535314770001681
抗体分子的短暂表达
在于F17培养基(Invitrogen公司)中培养的经短暂转染的HEK293细胞(人类胚肾细胞株293源性)中生成抗体分子。对于转染，使用“293-Free”转染剂(Novagen)。如上文所描述的各自抗体重链及轻链分子为由个别表达质粒表达。如制造商说明中所规定执行转染。在转染之后三至七(3-7)天，收取含有免疫球蛋白的细胞培养上清液。将上清液储存于低温(例如-80℃)下直至纯化为止。
关于人免疫球蛋白在例如HEK293细胞中的重组表达的总体信息提供于Meissner,P.et al.,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中。
通过MabSelect Sure(亲和力色谱法)且接着为Superdex 200(粒径排阻色谱法)来纯化PRIT半抗体(Hemibody)(分裂抗体)。对于具有DOTAM-VL-P1AD8592的PRIT分裂抗体，基于分析性SEC及CE-SDS产生5mg浓度为1.372mg/mL且纯度为>96％的该PRIT分裂抗体。对于具有DOTAM-VH-P1AD8749的PRIT分裂抗体，基于分析性SEC及CE-SDS产生14mg浓度为2.03mg/mL且纯度为>91％的该PRIT分裂抗体。
亦生成抗体P1AE4956及P1AE4957且本文提供其序列。(P1AE4956具有具备SEQ IDNO:51及52的重链及具备SEQ ID NO:54的轻链；P1AE4957具有具备SEQ ID NO 55及56的重链及具备SEQ ID NO:58的轻链)。对于具有DOTAM-VL-P1AE4957的PRIT分裂抗体，基于分析性SEC及CE-SDS产生19mg浓度为2.6mg/mL且纯度为>81.6％的该PRIT分裂抗体。对于具有DOTAM-VH-P1AE4956的PRIT分裂抗体，基于分析性SEC及CE-SDS产生6.9mg浓度为1.5mg/mL且纯度为>90％的该PRIT分裂抗体。使用ESI-MS以确认PRIT半抗体之一致性。
实施例5：分裂抗体功能的FACS分析
为评估分裂抗体或半抗体的功能，在37℃下使用阿库酶(accutase)自培养容器剥离MKN-45细胞10分钟。随后，将细胞在PBS中洗涤两次，且接种至96孔v形底板中以达到4×106个细胞/孔的最终密度。
将半抗体P1AD8749及P1AD8592以及人ISO对照1:1混合，以如图5中所指示的浓度添加至细胞中。随后，将细胞在冰上培育1h且在PBS中洗涤两次。使细胞集结粒再悬浮且添加40μl/孔的检测试剂，亦即含<人IgG(H+L)>FITC(10μg/ml)或Pb_Dotam_FITC 1:100＝>(10μg/ml)的PBS/5％FCS。在于冰上培育60min之后，将细胞在PBS中洗涤两次且再悬浮于200μl PBS/5％FCS中以使用FACS canto测量FITC荧光。
为评估半抗体与CEA在MKN-45细胞上的结合能力，使用抗体，使用人IgG特异性二级抗体对所述半抗体进行检测(图5)。如所期望，未在这些细胞上观测到大量人ISO对照结合。当调节至相同IgG浓度时，两个半抗体以及两者组合显示与MKN-45细胞的剂量依赖性结合，其中如所期望在极高浓度下具有明显钩状效应(hook effect)。此实验证实，CEA结合在半抗体中起作用。
为评估半抗体与DOTAM的结合能力，在存在人ISO对照或其各自分裂抗体配偶体的情况下以1:1比将所述半抗体结合至细胞。在其结合至MKN-45细胞之后，洗涤细胞以移除未经结合抗体。随后，添加Pb-DOTAM-FITC(荧光标记的Pb-DOTAM)以检测DOTAM结合胜任细胞结合的抗体(图6)。如所期望，当分裂抗体配偶体中之一者与人ISO对照组合时未在这些细胞上观测到大量FITC。仅呈1:1比的两个半抗体的组合显示剂量依赖性FITC信号。此实验显示，当两个半抗体在一个细胞上合于一起时，DOTAM结合位点可以发挥作用。
实施例6：体内研究
实施例6a：材料及方法-概要
全部实验方案均由地方当局(ComitéRégional d'Ethique de l'Expérimentation Animale du Limousin[CREEAL],Laboratoire Départemental d'Analyseset de Recherches de la Haute-Vienne)审查及批准。根据伦理准则，将雌性严重合并性免疫缺失病(SCID)小鼠(Charles River)维持在具有每日光/暗(12h/12h)循环的不含特异性及机会性病原体(SOPF)条件下。在到达之后前5天期间不执行操作以使动物习惯新环境。每日控制动物的临床症状且检测不良事件。
通过皮下(SC)注射在与
Figure BDA0003535314770001701
基底膜基质(生长因子减少；目录号354230)1:1混合的细胞培养基中的表达CEA的肿瘤细胞来建立实体异种移植物。肿瘤体积经由每周3次手动测径规测量来估计，根据下式来计算：体积＝0.5×长度×宽度2。视肿瘤生长速率而定需要时进行额外肿瘤测量。
若小鼠由于肿瘤负荷、注射副作用或其它原因而显示难以消除的痛苦或疼痛征象，则在排定的终点之前对其进行安乐死。疼痛、痛苦或不适的指示包括但不限于急性体重(BW)损失、毛皮不整洁(scruffy fur)、下痢、驼背姿势及嗜睡。每周3次测量经治疗动物的BW，其中视健康状况而定需要时进行额外测量。在放射性注射之后当天开始向全部小鼠提供湿食，持续7天或直至全部个体自任何急性BW损失中充分恢复为止。对BW损失超过其初始BW 20％或肿瘤体积达到3000mm3的小鼠立即施以安乐死。出于伦理原因考虑施以安乐死的其它因素为肿瘤状态(例如坏死区域、血液/液体渗出、自残征象)及动物一般外观(例如毛皮、姿势、动作)。
为将放射性尿液/粪便的再摄取减至最少，在施用212Pb-DOTAM之后将全部功效研究小鼠置于具有格子地板的笼中4小时，之后转移至具有标准垫料的新笼。随后，在注射(p.i.)后24小时更换全部笼。在放射性注射之后24小时内不对出于生物分布目的而处死的小鼠执行此程序。
如由方案所指定，在进行安乐死时，对经麻醉小鼠使用眼眶后采血自静脉窦收集血液，之后经由颈椎脱位术终止，接着进行额外组织收取以进行放射性测量和/或组织学分析。记载意外或异常状况。将经收集以用于福尔马林固定的组织立即置于10％中性缓冲福尔马林(4℃)中，且随后在5天之后转移至磷酸盐缓冲盐水(PBS；4℃)。将出于生物分布的目的而收集的器官及组织称重且使用2470WIZARD2自动γ计数器(PerkinElmer)测量放射性，且随后计算每公克组织的注射剂量百分比(％ID/g)，包括针对衰变及背景进行的校正。
使用GraphPad Prism 7(GraphPad Software公司)及JMP 12(SAS Institute公司)执行统计分析。基于平均肿瘤体积使用下式执行肿瘤生长抑制(TGI)曲线分析：
Figure BDA0003535314770001711
其中d指示研究日且0指示基线值。媒介选为参考组。肿瘤消退(TR)为根据以下计算：
Figure BDA0003535314770001712
其中正值指示肿瘤消退，且低于-1的值表示超出双倍基线值的生长。
测试化合物
用于所描述研究中的化合物分别针对双特异性抗体、清除剂及放射性标记螯合物呈现于下表中。
CEA-DOTAM(RO7198427，PRIT-0213)为靶向CEA的T84.66表位的完全人源化BsAb，而DIG-DOTAM(RO7204012)为用作阴性对照的非CEA结合BsAb。P1AD8749、P1AD8592、P1AE4956及P1AE4957为靶向CEA的CH1A1A或A5B7表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体。将全部抗体构建物储存于-80℃下直至注射的日为止，在注射的日将其解冻且在标准媒介缓冲液(20mM组氨酸、140mM NaCl；pH 6.0)或0.9％NaCl中稀释至其最终各自浓度以用于静脉内(IV)或腹膜内(IP)施用。
将Pb-DOTAM-聚葡萄糖-500CA(RO7201869)储存于-20℃下直至注射的日为止，在注射的日将其解冻且在PBS中稀释以用于IV或IP施用。
用于放射性标记的DOTAM螯合物是由Macrocyclics提供的且在由Orano Med(Razès,France)执行放射性标记之前维持在-20℃下。212Pb-DOTAM(RO7205834)是通过用DOTAM洗脱由钍生成剂生成的，且随后在标记之后用Ca淬灭。将212Pb-DOTAM溶液用0.9％NaCl稀释以获得IV注射所需的212Pb活性浓度。
媒介对照组中的小鼠接受多次代替BsAb、CA及212Pb-DOTAM的媒介缓冲液注射。
双特异性抗体
Figure BDA0003535314770001721
清除剂
Figure BDA0003535314770001722
Figure BDA0003535314770001731
放射性标记螯合物
Figure BDA0003535314770001732
肿瘤模型
用于小鼠接种的所用肿瘤细胞株及注射量描述于下表中。BxPC3是天然表达CEA的人类原代胰脏腺癌细胞株。在富含10％胎牛血清(GE Healthcare Hyclone SH30088.03)的RPMI 1640培养基、GlutaMAXTM补充剂、HEPES(Gibco，参考编号72400-021)中培养细胞。在研究第0天在各SCID小鼠中通过将在与
Figure BDA0003535314770001733
基底膜基质(生长因子减少；目录号354230)1:1混合的RPMI培养基中的细胞皮下注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。
肿瘤细胞株
Figure BDA0003535314770001734
*欧洲认证细胞培养物保藏中心(Salisbury,UK)
实施例6b：方案144
方案144的目标在于在使用CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb进行2步PRIT之后提供携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中预靶向212Pb-DOTAM的PK及体内分布数据。
通过分开或一起注射CEA-分裂-DOTAM-VH及CEA-分裂-DOTAM-VL(P1AD8749及P1AD8592)，7天后接着注射212Pb-DOTAM来执行二步PRIT。在放射性注射之后6小时处死小鼠，且收取血液及器官以进行放射性测量。将2步流程与3步PRIT作比较，该3步PRIT为使用标准CEA-DOTAM双特异性抗体，7天后接着使用Ca-DOTAM-聚葡萄糖-500CA且在CA之后24小时使用212Pb-DOTAM。
通过在抗体注射之后1小时至7天重复血液取样来收集CEA-分裂-DOTAM-VH/VL清除的PK数据，且随后通过ELISA进行分析。
研究概述示于图7中。图7A显示2步PRIT方案的概述，该方案包括在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中CEA-分裂-DOTAM-VH/VL PK的血液取样。图7B显示3步PRIT方案的概述，该方案为在携有SC BxPC3肿瘤的SCID小鼠中执行(h＝小时，d＝天)。
研究设计
方案144的时程及设计示于下表中。
方案144的时程
Figure BDA0003535314770001741
Figure BDA0003535314770001751
方案144中的研究组
Figure BDA0003535314770001752
在研究第0天在各SCID小鼠中通过将含5×106个细胞(第26代)的RPMI/MatrigelSC注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后十四天，以116mm3的平均肿瘤体积将小鼠分选至实验组中。在接种之后第22天注射212Pb-DOTAM；在第21天平均肿瘤体积为140mm3。
在CEA-分裂-DOTAM-VH/VL注射之后1h(右眼)、24h(左眼)及168h(右眼，终止时)经由麻醉眼眶后采血来收集来自Aa、Ba及Ca组中的小鼠的血液。类似地，在CEA-分裂-DOTAM-VH/VL注射之后4h(右眼)、72h(左眼)及168h(右眼，终止时)自Ab、Bb及Cb组中的小鼠采集样品。
在注射212Pb-DOTAM之后6小时，将Aa、Ba、Ca及D组中的小鼠处死且进行尸体剖检，且收取以下器官及组织以测量放射性含量：血液、皮肤、膀胱、胃、小肠、结肠、脾、胰脏、肾、肝、肺、心脏、骰骨、肌肉、脑、尾、耳及肿瘤。
结果
注射之后6小时全部所收集组织中的平均212Pb积聚及清除展现于图8中。单独CEA-分裂-DOTAM-VH或CEA-分裂-DOTAM-VL预靶向不引起肿瘤中的放射性积聚。与标准3步PRIT方案的87±15％ID/g相比，组合的两个互补抗体引起65±12％ID/g的2步PRIT之后的肿瘤吸收。利用杜凯氏多重比较检定(Tukey's multiple comparisons test)的双向变异数分析(ANOVA)显示，两个PRIT治疗之间的肿瘤吸收差异显著，如于膀胱中的差异一般(对于2步及3步PRIT，分别为1±2％ID/g及38±17％ID/g)；使用此测试的组织积聚中无统计学上显著的其它差异(p＝0.05)。
如通过酶联结免疫吸附分析(ELISA)所分析的IV注射的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建物的清除示于图9中。
不良事件及毒性
不存在与此研究相关的不良事件或毒性。
结论
研究结果证实使用互补CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的CA非依赖性2步预靶向的概念验证。使用2步PRIT及标准3步PRIT达成212Pb-DOTAM的高且特异性肿瘤吸收，且在使用互补CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的正常组织中具有极少放射性积聚。
实施例6c：方案158
方案158的目标在于评估由用于清除剂非依赖性2步CEA-PRIT的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的双互补位(CH1A1A及A5B7)对预靶向的小鼠中212Pb-DOTAM与皮下BxPC3肿瘤的联合。将肿瘤吸收与标准3步CEA-PRIT的肿瘤吸收作比较。
使携有皮下BxPC3肿瘤的小鼠注射
·CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体，7天后接着为放射性标记212Pb-DOTAM(2步PRIT)，或
·CEA-DOTAM BsAb，7天后接着为CA，且最后在24小时后为放射性标记212Pb-DOTAM(3步PRIT)。
在放射性注射之后6小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述示于图10中。
研究设计
方案158的时程及设计示于下表中。
方案158的时程
Figure BDA0003535314770001771
方案158中的研究组
Figure BDA0003535314770001772
Figure BDA0003535314770001781
*P1AD8749剂量调节至154μg以补偿35％穴/穴杂质；**P1AD8592剂量调节至167μg以补偿40％穴/穴杂质。
在研究第0天在各SCID小鼠中通过将含5×106个细胞(第27代)的RPMI/MatrigelSC注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后十四天，以177mm3的平均肿瘤体积将小鼠分选至实验组中。在接种之后第20天注射212Pb-DOTAM；在第21天平均肿瘤体积为243mm3。
在注射212Pb-DOTAM之后6小时，将全部组中的小鼠处死且进行尸体剖检，且收取以下器官及组织以测量放射性含量：血液、皮肤、膀胱、胃、小肠、结肠、脾、胰脏、肾、肝、肺、心脏、骰骨、肌肉、脑、尾及肿瘤。
结果
注射之后6小时全部所收集组织中的平均212Pb分布示于图11中。利用杜凯氏多重比较检定的双向ANOVA显示，三种治疗之间正常组织中无显著212Pb吸收差异，膀胱除外，其中两个双互补位CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对产生低于标准3步PRIT的积聚。对于全部三种治疗，肾吸收为3-4％ID/g。与对于3步PRIT的67％ID/g相比，双互补位组合引起约56％ID/g的肿瘤积聚；2步与3步PRIT之间的差异系统计学上显著的(p<0.0001)。
不良事件及毒性
不存在与此研究相关的不良事件或毒性。
结论
此研究评估与标准3步PRIT相比由用于CA非依赖性2步CEA-PRIT的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的双互补位对预靶向的小鼠中212Pb-DOTAM与SC BxPC3肿瘤的联合。对于2步及3步PRIT，注射之后6小时的212Pb分布是相当的，其中肿瘤中的积聚高且健康组织中的放射性极少。此种情况证实使用CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的2步CEA-PRIT的表达CEA的肿瘤的双互补位预靶向概念验证。
实施例6d：方案160
方案160的目标在于比较携有SC BxPC3肿瘤的小鼠中使用互补CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的CA非依赖性2步CEA-PRIT的3个循环之后的治疗功效与标准3步CEA-PRIT的治疗功效。亦与使用在注射之前与212Pb-DOTAM一起预培育的BsAb的1步CEA-RIT进行比较。
使携有SC BxPC3肿瘤的小鼠注射
·CEA-DOTAM BsAb，7天后接着为CA，且最后在24小时后为放射性标记212Pb-DOTAM(3步PRIT)，
·CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体，7天后接着为放射性标记212Pb-DOTAM(2步PRIT)，或
·212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM BsAb(经预培育；1步RIT)。
在20μCi 212Pb-DOTAM的3个重复循环中施用疗法，所述循环亦包括与非CEA结合对照抗体(DIG-DOTAM)及无治疗(媒介)进行比较。出于生物分布目的处死专用小鼠以确认各治疗循环时的212Pb-DOTAM靶向及清除。就TGI及TR而言评估治疗功效，且谨慎地监测小鼠达用于评估治疗耐受性的研究持续时间。研究概述示于图12中。
方案160的时程及设计示于下表中。
方案160的时程
Figure BDA0003535314770001791
Figure BDA0003535314770001801
方案160中的研究组
Figure BDA0003535314770001802
Figure BDA0003535314770001811
*P1AD8749：调节至154μg以补偿储备溶液中的35％穴/穴杂质的剂量；**P1AD8592；***由于第一治疗循环时的急剧辐射诱发毒性而自3个循环调节至1个循环。
在研究第0天在SCID小鼠中通过将含5×106个细胞(第24代)的RPMI/Matrigel SC注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后十五天，以122mm3的平均肿瘤体积将小鼠分选至实验组中。在接种之后第23天注射212Pb-DOTAM；在第22天平均肿瘤体积为155mm3。
根据上表(方案160中的研究组)，将CEA-DOTAM及DIG-DOTAM抗体在媒介缓冲液中稀释至100μg/200μL的最终浓度以用于IP施用。将CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体一起混合至一种单一注射溶液中以用于IP施用，每200μL含有100μg各构建物。对于P1AD8749，将剂量调节至154μg以补偿储备溶液中的35％穴/穴杂质(不携有VH/VL的分子侧)。根据图12中的实验排程，在BsAb注射之后7天IP施用CA-DOTAM-聚葡萄糖-500CA(25μg/200μL PBS)，24小时后接着为212Pb-DOTAM(RO7205834)。使经PRIT治疗小鼠(2步及3步)IV注射100μL经Ca淬灭的212Pb-DOTAM溶液(于100μL 0.9％NaCl中20μCi)。
经1步RIT治疗的小鼠仅接受一种注射：预结合212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM(于100μL0.9％NaCl中20μCi/20μg BsAb以用于IV注射)。通过在37℃下将212Pb-DOTAM与CEA-DOTAMBsAb一起培育10分钟来制备经直接标记抗体。
在安乐死时自A-E组中的小鼠收取以下器官及组织：血清、肝、脾、肾、胰脏及肿瘤。在安乐死之前，对活小鼠进行麻醉以收集眼眶后血液。在5分钟期间以10 000rcf离心所收集血液样品，且将所得血清洗脱份分离、冷冻且储存于-20℃下。紧接着将所切离组织置于10％中性缓冲福尔马林(4℃)中且随后在24小时之后转移至1×PBS(4℃)。将经福尔马林固定样品运送至Roche Pharma Research and Early Development，Roche InnovationCenter Basel以供进一步处理及分析。
在F、G、J及M组中的小鼠第一次且唯一一次注射212Pb-DOTAM或212Pb-DOTAM-BsAb之后24小时处死小鼠且进行尸体剖检；在H及K组中的小鼠第二次注射212Pb-DOTAM之后24小时处死小鼠且进行尸体剖检；在I及L组中的小鼠第三次注射212Pb-DOTAM之后24小时处死小鼠且进行尸体剖检。在安乐死时在经麻醉小鼠上使用眼眶后采血来自静脉窦收集血液，之后经由颈椎脱位术终止。出于生物分布目的亦收取以下器官及组织：膀胱、脾、肾、肝、肺、肌肉、尾、皮肤及肿瘤。
结果
注射之后24小时全部所收集组织中的平均212Pb积聚及清除为针对各疗法及治疗循环示于图13中。阴性对照引起肿瘤中无吸收(0.4％ID/g)。利用杜凯氏多重比较检定的双向变异数分析(ANOVA)显示，对于2步及3步PRIT，任何循环时的分布非显著地不同；然而，与阴性对照及1步RIT相比，全部循环时的差异是统计学上显著的(p<0.05)。肿瘤吸收对于3步PRIT为25-45％ID/g且对于2步PRIT为25-30％ID/g，其中任一治疗或循环之间无任何统计学上显著的差异。对于1步RIT，一次且唯一一次治疗循环时的肿瘤吸收为99％。对于两个PRIT方案，正常组织中的吸收极低，但在1步RIT之后在全部器官及组织中显著地较高，这是由于与小放射性标记DOTAM螯合物相比经预培育抗体的循环时间长得多。
平均肿瘤发展及个别肿瘤生长曲线分别示于图14及图15中。未经治疗媒介组及DIG-DOTAM组中的肿瘤稳定地生长，但在第三治疗之后，后者中的倍增速率略微地较低。相比之下，在第一治疗循环之后PRIT及RIT组中的肿瘤尺寸减小，且维持肿瘤对照直至接种之后约10周为止，在接种之后约10周时肿瘤尺寸开始增大。2步及3步PRIT治疗产生几乎一致的肿瘤对照。无肿瘤完全消退。
在研究第83天，亦即可基于平均值分析全部治疗组的最后一天，与媒介对照相比，对于使用CEA-DOTAM的PRIT(3步)及使用CEA-分裂-DOTAM-VH/VL的PRIT(2步)，TGI分别为91.7％及88.4％。对于1步RIT，对应数值为72.6％，而对于非特异性DIG-DOTAM对照，TGI为-59.7％。在同一天，基于平均值的TR对于3步CEA-DOTAM PRIT为-1.9，对于2步CEA-分裂-DOTAM-VH/VL PRIT为-2.9，对于1步RIT为-4.7，对于DIG-DOTAM PRIT为-28.8，且对于媒介对照为-39.3。
由于下文所描述的不良事件，故存活分析视为统计学上非相关的。
不良事件及毒性
全部疗法组中的BW发展示于图16中。利用20μCi 212Pb-DOTAM的2步及3步PRIT的多个循环具有良好耐受性，但急剧BW损失出现在接受1步RIT的小鼠中，其中在第一RIT循环之后(在212Pb照射之后6-11天)由于20％或更多的BW下降而对E组中的8/10小鼠进行安乐死。不给予剩余2只RIT小鼠任何另外212Pb-DOTAM-CEA-DOTAM注射，但连续地追踪以用于肿瘤生长评估。
另外，出于伦理原因，由于肿瘤状态衰弱，亦即肿瘤敞开或渗漏而处死多只小鼠。在DIG-DOTAM组中，出于此原因在达到3000mm3的肿瘤体积之前对9/10小鼠进行安乐死；对于未经治疗的媒介对照，对应数目为5/10。在PRIT组及RIT组中问题不太明显，其中出于此原因而分别在3步PRIT组、2步PRIT组及1步RIT组中对1/10、2/10及2/10小鼠进行安乐死。此种情况反映于图15中的个别肿瘤生长曲线中。
最后，由于肛门下创伤退化，故对C组中的1只小鼠进行安乐死。
全部不良事件均列于下表中。
方案160中的不良事件
Figure BDA0003535314770001841
在研究第23天(循环1)、第37天(循环2)及第51天(循环3)执行212Pb照射。
结论
在使用3步流程(CEA-DOTAM BsAb、CA及212Pb-DOTAM)与2步流程(CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体及212Pb-DOTAM)的CEA-PRIT之间未看见差异；对于两种治疗，TGI是相当大的且几乎一致的，且20μCi的3个循环可在两种情况下安全地施用。对比地，20μCi在注射之前预结合至CEA-DOTAM的212Pb-DOTAM(1步RIT)不为大部分经治疗小鼠耐受。
因此，研究证实使用所研发的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建物的CA非依赖性2步PRIT的耐受性及治疗功效。
实施例7：方案175
方案175的目标在于评估经增加的预靶向抗体注射量对后续肿瘤及健康组织中的212Pb积聚的影响。比较两个不同剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体：标准量(100μg)及2.5倍高的剂量(250μg)。此外，对CEA-分裂-DOTAM-VH构建物进行修饰以延伸其VH来避免抗药物抗体(ADA)形成(该ADA为与先前所测试的CEA-分裂-DOTAM-VL构建物一起使用)。VH经延伸以包含来自抗体CH1域之前三个氨基酸：丙氨酸、丝氨酸及苏氨酸(AST)，且此后构建物称为CEA-分裂-DOTAM-VH-AST。
抗体P1AD8592已描述于上文实施例4中。P1AF0171与P1AD8749相同，不同之处在于融合HC是通过残基AST延伸-因此，抗体P1AD0171由如上文所描述的轻链D1AA3384(SEQ IDNO:34)、如上文所描述的第一重链D1AC4022(SEQ ID NO:28)及如下文所示的第二重链D1AE3669组成：
D1AE3669(HC节<CEA>CH1A1A Dotam-VH-AST)
Figure BDA0003535314770001851
使携有SC BxPC3肿瘤的小鼠注射
·1×标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb，7天后接着为放射性标记212Pb-DOTAM，或
·2.5×标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb，7天后接着为放射性标记212Pb-DOTAM。
在放射性注射之后24小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述示于图17中。
研究设计
方案175的时程及设计显示如下。
方案175的时程
Figure BDA0003535314770001852
Figure BDA0003535314770001861
*由于低化合物浓度(200μL/构建物＝总计400μL)而所需的IP注射
方案175中的研究组
Figure BDA0003535314770001862
*P1AF0171剂量调节至143及357μg以补偿～30％穴/穴杂质。
在研究第0天在各SCID小鼠中通过将含5×106个细胞(第24代)的RPMI/MatrigelSC注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后二十一天，以310mm3的平均肿瘤体积将小鼠分选至实验组中。在接种之后第29天注射212Pb-DOTAM；在第30天平均肿瘤体积为462mm3。
在212Pb-DOTAM注射之后24小时处死全部小鼠且进行尸体剖检，且收取以下器官及组织以测量放射性含量：血液、皮肤、脾、胰脏、肾、肝、肌肉、尾及肿瘤。
结果
注射之后24小时全部所收集组织中的平均212Pb分布示于图18中。在肿瘤或正常组织中不存在介于两个剂量水平之间的显著212Pb吸收差异。对于两个治疗组，肿瘤积聚为30％-31％ID/g，且此时肾吸收为<2％ID/g。一只小鼠由于212Pb-DOTAM注射问题而具有尾中的～1％ID/g，但其它所收集健康组织不显示任何可观212Pb积聚。
不良事件及毒性
不存在与此研究相关的不良事件或毒性。
结论
在此体内模型中将预靶向CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体的剂量增加2.5倍并不改善随后施用的212Pb-DOTAM的肿瘤积聚。然而，其亦并不增加正常组织中的放射性积聚，突出显示使用此2步预靶向方案达成的强特异性。最后，结果验证经延伸-VH CEA-分裂-DOTAM-VH-AST构建物的功能。
实施例8：方案185
方案185的目标在于评估靶向T84.66表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL。本文提供P1AF0709及P1AF0298的序列。P1AF0709具有D1AE4688(SEQ ID NO：83)的第一重链及D1AA4920(SEQ ID NO：84)的第二重链。P1AF0298具有D1AE4687(SEQ ID NO：86)的第一重链及D1AE3668(SEQ ID NO：87)的第二重链。两者均具有D1AA4120(SEQ ID NO：89)的轻链。
使携有SC BxPC3肿瘤的小鼠注射标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb(100μg/抗体)，6天后接着为放射性标记212Pb-DOTAM。在放射性注射之后6小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述示于图19中。
研究设计
方案185的时程及设计显示如下。
方案185的时程
研究日 日期 实验程序
0 2020-03-04 制备BxPC3细胞且填充注射器
0 2020-03-04 SC注射BxPC3细胞
22 2020-03-26 IV注射CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb
27 2020-03-31 洗脱<sup>212</sup>Pb-DOTAM且填充注射器
28 2020-04-01 IV注射<sup>212</sup>Pb-DOTAM
28 2020-04-01 安乐死及组织收取(6h p.i.)+γ计数
方案185中的研究组
Figure BDA0003535314770001881
*P1AF0171剂量调节至143μg以补偿～30％穴/穴杂质。
在研究第0天在各SCID小鼠中通过将含5×106个细胞(第27代)的RPMI/MatrigelSC注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后二十二天，以224mm3的平均肿瘤体积将小鼠分选至实验组中。在接种之后第28天注射212Pb-DOTAM，此时平均肿瘤体积达到385mm3。
在212Pb-DOTAM注射之后6小时处死全部小鼠且进行尸体剖检，且收取以下器官及组织以测量放射性含量：血液、皮肤、脾、胰脏、肾、肝、肌肉、尾及肿瘤。将所收集肿瘤分成两块：一块针对放射性含量加以测量，且另一块置于含有
Figure BDA0003535314770001882
最佳切割温度(OCT)嵌式培养基的冰冻模具中，且置于干冰上以快速凝固。将OCT中的冷冻样品维持在-80℃下，之后进行冷冻切片、免疫荧光染色，且使用Zeiss Axio Scope.A1模块显微镜进行分析。
结果
注射之后6小时全部所收集组织中的平均212Pb分布示于图20中。肿瘤积聚为40％ID/g(CH1A1A)或44％ID/g(T84.66)。唯一其它可观放射性积聚为在肾中发现：对于两个组，在6h p.i.下3％-5％ID/g。
靶向T84.66(A组)或CH1A1A(B组)的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对的瘤内分布的实施例示于图21中。图A及C显示BxPC3肿瘤中的CEA表达高且均一，且图B及D展示注射之后7天的抗体分布为类似分布。然而，与来自B组的肿瘤样品相比，来自A组的样品展现总体更强信号，提供T84.66为强于CH1A1A的结合子的证明。
不良事件及毒性
不存在与此研究相关的不良事件或毒性。
结论
结果验证靶向CEA的T84.66表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建物的功能。预靶向表达CEA的肿瘤中的所得212Pb积聚是高且特异性的，且靶向CH1A1A或T84.66表位的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL对均质地分布于表达CEA的肿瘤内部。
实施例9：方案189
方案189的目标在于与靶向CH1A1A VH-AST/VL的阳性对照对相比评估靶向T84.66VH-AST/CH1A1A VL及T84.66 VL/CH1A1 VH-AST的双互补位CEA-分裂-DOTAM-VH/VL抗体对。此双互补位组合排除可溶CEA上全Pb-DOTAM结合子的形成，该可溶CEA仅表达两个表位中之一者(例如T84.66)，由此减少其潜在副作用，诸如经提高循环放射性及相关辐射诱发毒性以及经降低的与肿瘤外靶标竞争方面的功效。
使携有SC BxPC3肿瘤的小鼠注射标准剂量的CEA-分裂-DOTAM-VH/VL BsAb(100μg/抗体)，7天后接着为放射性标记212Pb-DOTAM。在放射性注射之后6小时评估212Pb-DOTAM的体内分布。研究概述示于图22中。
研究设计
方案189的时程及设计显示如下。
ARCoLab方案189的时程
Figure BDA0003535314770001891
Figure BDA0003535314770001901
ARCoLab方案189中的研究组
Figure BDA0003535314770001902
*P1AF0171剂量调节至143μg以补偿～30％穴/穴杂质。
在研究第0天在各SCID小鼠中通过将含5×106个细胞(第31代)的RPMI/MatrigelSC注射至右侧腹中来建立实体异种移植物。在肿瘤细胞注射之后十四天，以343mm3的平均肿瘤体积将小鼠分选至实验组中。在接种之后第22天注射212Pb-DOTAM；在第21天平均肿瘤体积达到557mm3。
在212Pb-DOTAM注射之后6小时处死全部小鼠且进行尸体剖检，且收取以下器官及组织以测量放射性含量：血液、皮肤、脾、胰脏、肾、肝、肌肉、尾及肿瘤。
结果
注射之后6小时全部所收集组织中的平均212Pb分布示于图23中。对于T84.66 VH-AST+CH1A1A VL及T84.66 VL+CH1A1A VH-AST，双互补位变体的肿瘤积聚分别为71％ID/g及46％ID/g。阳性CH1A1A对照引起37％ID/g。利用杜凯氏多重比较检定的双向ANOVA显示，就肿瘤吸收而言，全部三个组彼此显著地不同(相对于两个其它组，对于T84.66 VH-AST+CH1A1A VL为p<0.0001；仅相对于CH1A1A，对于T84.66 VL +CH1A1A VH-AST为p＝0.0020)。其它器官不显示各组间统计学上显著的差异，但血液中略微高的滞留指示与两个其它组相比的T84.66 VH-AST+CH1A1A VL组合：与<1％ID/g相比的2％ID/g。肾吸收类似地略微高，但并非统计学上显著地如此：与对于另两个的3％ID/g相比，对于T84.66 VH-AST+CH1A1A的4.5％ID/g。
不良事件及毒性
不存在与此研究相关的不良事件或毒性。然而，在此研究中与标准生长速率相比，BxPC3肿瘤生长显著地较快且伴以较大变化性。在尸体剖检时，得出结论：大肿瘤(大部分)填充有液体，当在放射性测量之前将肿瘤切成两半时将其清空；此液体有可能导致生长速率加速，但并不任何大程度地影响％IA/g，这是因为肿瘤是在敞开之后称重且测量的。
结论
结果使用所测试CEA-分裂-DOTAM-VH/VL构建物验证CEA的T84.66及CH1A1A表位的双互补位靶向的功能，且与阳性CH1A1A对照相比，此组合展现意外高的功效。在T84.66 VH-AST+CH1A1A VL对的特定优势的指示下，212Pb在表达预靶向CEA的肿瘤中的所得积聚较高且具有特异性。
实施例10
这些实施例研究通过如本文所述的分裂抗体将Pb-DOTA募集至细胞。
P1AF0712具有具备SEQ ID NO:97的第一重链、具备SEQ ID NO:98的第二重链及具备SEQ ID NO:103的轻链。P1AF0713具有具备SEQ ID NO:100的第一重链、具备SEQ ID NO:101的第二重链及具备SEQ ID NO:103的轻链。
使用胰蛋白酶自培养瓶分离MKN-45细胞且使用Casy细胞计数器计数。在4℃下粒化之后，使300g细胞再悬浮于FACS缓冲液(含2.5％FCS的PBS)中，调节至2.0E+06个细胞/毫升，分配至96孔V形底PP板(25微升/孔＝5.0E+04细胞/孔)。
使用DOTA-FITC进行FACS染色
将CEA特异性SPLIT抗体(分别为P1AF0712或P1AF0713)调节至40μg/mL于FACS缓冲液中，使得最终浓度为10μg/mL。将两种抗体组合或分离地添加至细胞中，且随后添加至缓冲液中，且在4℃下培育1小时。随后，将经FITC标记的Pb-DOTA以与抗体呈等摩尔浓度比添加至细胞中，且在4℃下培育1小时。随后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次且再悬浮于70μl/孔FACS缓冲液中以使用FACS Canto(BD,Pharmingen)进行测量。其展示(图24)SPLIT两半均不产生荧光信号，指示缺乏Pb-DOTA结合能力。仅SPLIT两半的组合能够将Pb-DOTAM-FITC募集至靶细胞(图24)。
使用<huIgG(H+L)A488>进行FACS染色
将CEA特异性SPLIT抗体(分别为P1AF0712或P1AF0713)调节至40μg/mL于FACS缓冲液中，使得最终浓度为10μg/mL。将两种抗体添加至细胞中，分离，随后添加至缓冲液中，或合并，且在4℃下培育1小时。随后在FACS缓冲液中洗涤细胞两次。在洗涤之后，使细胞再悬浮于50μL含有二级抗体(<huIgG(H+L)>-Alexa488，c＝10μg/mL)的FACS-缓冲液中，在4℃下培育1小时。随后将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次且再悬浮于70μl/孔FACS缓冲液中以使用FACS Canto(BD,Pharmingen)进行测量。两种SPLIT抗体的EC50相当，指示两种SPLIT抗体的CEA特异性细胞结合。由于抗体在混合物中的量更高，在这些情形下获得较低EC50，如下表中所示。
SPLIT抗体的EC50测定
Figure BDA0003535314770001921
使用基于二级抗体的检测(<hu>488，上图)或Pb-DOTA-FITC(DOTA-FITC下图)测定SPLIT抗体的EC50
实施例11：Biacore结合实验
此实施例测试与参照抗体CEA-DOTAM(RO7198427、PRIT-0213)相比，单独TA-分裂-DOTAM-VH及TA-分裂-DOTAM-VL与DOTAM的结合。其进一步测试与参照抗体相比，DOTAM与TA-分裂-DOTAM-VH/VL对的结合。
这些实施例中所使用的编码与本申请案中其它地方所使用的蛋白质编号之间的对应性显示如下。亦提供序列。在此实施例中，参照抗体编码为“PRIT_RS”。
Figure BDA0003535314770001931
Figure BDA0003535314770001941
对于这些实验，PRIT SPLIT抗体由MabSelect Sure的第一步骤(亲和力色谱法)和作为第二步骤的离子交换色谱法(例如POROS XS)纯化，接着由Superdex 200(粒径排阻色谱法)精制。
在25℃下用Biacore T200执行测量温度的实验。全部Biacore T200实验均在HBS-P+(GE Healthcare,Br-1008-27)pH 7.4运行缓冲液中进行。使用不同DOTAM洗脱份对各测试抗体/抗体对执行两项实验。
1.在第一实验中，相对于参照抗体而言，评估个别TA-分裂-DOTAM-VH及TA-分裂-DOTAM-VL抗体与在芯片上捕获的经生物素标记DOTAM的结合。
在CAP芯片表面上以高密度捕获DOTAM(含120nM溶液的HBS-P+)(10微升/分钟，60秒)。随后，在DOTAM表面上注射含600nM前药_A或前药_B溶液的HBS-P+(10微升/分钟，90秒)。在10微升/分钟的流动速率下监测解离240秒。使用T200评估软件评估相对最大反应测定。
结果示于图26中。个别抗体中无一者显示结合至所捕获DOTAM。
2.在第二实验中，首先在芯片中使用固定hFab抗体捕获个别TA-分裂-DOTAM-VH及TA-分裂-DOTAM-VL抗体，且随后评估DOTAM-单链霉亲和素复合物的结合(DOTAM+单链霉亲和素偶联600nM，1:1mol，在RT下1h)。
在hFab抗体(GE Healthcare,BR-1008-27)CM5芯片表面上注射含600nM前药_A或前药B溶液的HBS-P+(10微升/分钟，120秒)。在高密度捕获前药A或B溶液之后，注射DOTAM-单链霉亲和素复合物(20微升/分钟，90秒)。在20微升/分钟的流动速率下监测解离180秒。对于新循环，通过使用甘氨酸2.1及75秒再生时间以10微升/分钟再生表面。使用T200评估软件评估相对最大反应测定。
结果显示于图27中。低最大反应百分比(如在图中标记有*)被认为是与DOTAM-SA的“痕量”或非特异性相互作用，且反映使分析优化的需要。
3.在第三实验中，与参照抗体相比，评估TA-分裂-DOTAM-VH/VL对与DOTAM的结合。首先在芯片中使用固定hFab抗体捕获抗体，且随后评估DOTAM-单链霉亲和素复合物的结合(DOTAM+单链霉亲和素偶联600nM，1:1mol，在RT下1h)。
在hFab抗体(GE Healthcare,BR-1008-27)CM5芯片表面上注射含300nM前药_A和前药B溶液的HBS-P+(10微升/分钟，120秒)。在高密度捕获前药A及B溶液之后，注射DOTAM-单链霉亲和素复合物(20微升/分钟，90秒)。在20微升/分钟的流动速率下监测解离180秒。对于新循环，通过使用甘氨酸2.1及75秒再生时间以10微升/分钟再生表面。使用T200评估软件评估相对最大反应测定。
结果示于图28中。全部TA-分裂-DOTAM-VH/VL对均显示大量针对DOTAM的结合，为DOTA结合子的P6_AB(P1AF0712/P1AF0713)对除外。
对于FAP结合剂P1AF8286和P1AF8287，也得到了类似的结果，显示TA-split-DOTAM-VH/VL对存在大量的DOTAM结合，而这一对的个体成员没有。P1AF8286是由SEQ IDNO:108的第一重链、SEQ ID NO:109的第二重链和SEQ ID NO:111的轻链组成，P1AF8287是由SEQ ID NO:108的第一重链、SEQ ID NO:110的第二重链和SEQ ID NO:111的轻链组成。然而，该分析仍需优化。
尽管出于清楚理解的目的，已借助于说明及实施例相当详细地描述前述本发明，但描述及实施例不应解释为限制本发明的范畴。本文所引用的全部专利及科学文献的公开内容均以全文引用的方式明确并入。
SEQUENCE LISTING
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 结合至癌细胞且使放射性核素靶向所述细胞的抗体
<130> 007681943
<150> EP19186135
<151> 2019-07-12
<160> 180
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1, <Pb-Dotam>
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <Pb-Dotam>
<400> 2
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <Pb-Dotam>
<400> 3
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1, <Pb-Dotam>
<400> 4
Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <Pb-Dotam>
<400> 5
Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <Pb-Dotam>
<400> 6
Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 7
Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly
35 40 45
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr
65 70 75 80
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 8
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu
85 90 95
Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0214
<400> 9
Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0214
<400> 10
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu
85 90 95
Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <CEA> T84.66
<400> 11
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <CEA> T84.66
<400> 12
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <CEA> T84.66
<400> 13
Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> T84.66
<400> 14
Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> T84.66
<400> 15
Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <CEA> T84.66
<400> 16
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <CEA> T84.66
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <CEA> T84.66
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <CEA> CH1A1A
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe Gly Met Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <CEA> CH1A1A
<400> 20
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <CEA> CH1A1A
<400> 21
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> CH1A1A
<400> 22
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> CH1A1A
<400> 23
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <CEA> CH1A1A
<400> 24
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <CEA> CH1A1A
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <CEA> CH1A1A
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 <CEA> of P1AD8749 不具有 接头 及 <DOTAM-VH>' 与 SeqID32相同的质粒, 缺乏 接头 及 <DOTAM>
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 28
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AD8749 重链 穴 <CEA> CH1A1A
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 <CEA> of P1AD8592 不具有 接头 及 <DOTAM-VL>' 与 SeqID33相同的质粒, 缺乏 接头 及 <DOTAM>
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 30
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AD8592 重链 节 <CEA>CH1A1A
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 32
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AD8749 重链 节 <CEA>CH1A1A<Dotam-VH>
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
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Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
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Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
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545 550 555 560
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Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AD8592 重链 穴 <CEA>CH1A1A<Dotam-VL>
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
515 520 525
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
545 550 555 560
Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
Lys Val Glu Ile Lys
580
<210> 34
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AD8749 及 P1AD8592 轻链 <CEA> CH1A1A
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR 1, <C825>
<400> 35
Asp Tyr Gly Val His
1 5
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR 2, <C825>
<400> 36
Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR 3, <C825>
<400> 37
Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe Asp Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR 1, <C825>
<400> 38
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR 2, <C825>
<400> 39
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1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR 3, <C825>
<400> 40
Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val
1 5
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <C825>
<400> 41
His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Asn Ile Tyr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域, <C825>
<400> 42
Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Pro Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Thr
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asp
85 90 95
His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <CEA> A5B7
<400> 43
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 44
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <CEA> A5B7
<400> 44
Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <CEA> A5B7
<400> 45
Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> A5B7
<400> 46
Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> A5B7
<400> 47
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <CEA> A5B7
<400> 48
Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
1 5
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <CEA> A5B7
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <CEA> A5B7
<400> 50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE4956 重链 穴 <CEA> A5B7
<400> 51
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 52
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE4956 重链 节 <CEA> A5B7 <Dotam-VH>
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 53
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 <CEA> of P1AE4956 不具有 接头 及 DOTAM-VH
<400> 53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 54
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE4956 轻链 <CEA> A5B7
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 55
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE4957 重链 节 <CEA> A5B7
<400> 55
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 56
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE4957 重链 穴 <CEA> A5B7 <Dotam-VL>
<400> 56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
Lys Val Glu Ile Lys
580
<210> 57
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 <CEA> of P1AE4957 不具有 接头 及 DOTAM-VL
<400> 57
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
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50 55 60
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 58
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AE4957 轻链 <CEA> A5B7
<400> 58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <CEA> 28A9
<400> 59
Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <CEA> 28A9
<400> 60
Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <CEA> 28A9
<400> 61
Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> 28A9
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> 28A9
<400> 63
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <CEA> 28A9
<400> 64
Gln Gln Asn Thr Gln Tyr Pro Met Thr
1 5
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <CEA> 28A9
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <CEA> 28A9
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Thr Gln Tyr Pro Met
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <GPRC5D>
<400> 67
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala
1 5 10
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <GPRC5D>
<400> 68
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <GPRC5D>
<400> 69
His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <GPRC5D>
<400> 70
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn
1 5 10 15
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <GPRC5D>
<400> 71
His Ala Ser Ile Leu Ala Ser
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <GPRC5D>
<400> 72
Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 73
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <GPRC5D>
<400> 73
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 74
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <GPRC5D>
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <FAP> 4B9
<400> 75
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <FAP> 4B9
<400> 76
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <FAP> 4B9
<400> 77
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <FAP> 4B9
<400> 78
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <FAP> 4B9
<400> 79
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <FAP> 4B9
<400> 80
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 81
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <FAP> 4B9
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <FAP> 4B9
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0709 HC节 <CEA> T84.66 (D1AE4688)
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 84
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0709 HC穴 <CEA> T84.66 Dotam-VL (D1AA4920)
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
515 520 525
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
545 550 555 560
Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
Lys Val Glu Ile Lys
580
<210> 85
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0709 HC穴 <CEA> T84.66 不具有 接头 及 DOTAM
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 86
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PIAF0298 HC穴 <CEA> T84.66 (D1AE4687)
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 87
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PIAF0298 HC节 <CEA> T84.66 Dotam-VH-AST (D1AE3668)
<400> 87
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
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370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
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580 585 590
Ser Thr
<210> 88
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PIAF0298 HC节 <CEA> T84.66 不具有 接头 及 DOTAM
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
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180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 90
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF710 HC节 <CEA> 28A9 (D1AE4690)
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
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435 440 445
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF710 HC穴 <CEA> 28A9 Dotam-VL (D1AC3172)
<400> 91
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
465 470 475 480
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser
485 490 495
Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
515 520 525
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
530 535 540
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly
545 550 555 560
Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys
565 570 575
Val Glu Ile Lys
580
<210> 92
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF710 HC穴 <CEA> 28A9 不具有 接头 或 DOTAM
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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130 135 140
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
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210 215 220
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
<210> 93
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF711 HC穴 <CEA> 28A9 (D1AE4689)
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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165 170 175
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
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275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 94
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF711 1 HC节 <CEA> 28A9 Dotam-VH-AST (D1AE3671)
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val
465 470 475 480
Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser
485 490 495
Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala
500 505 510
Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala
515 520 525
Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser
530 535 540
Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr
545 550 555 560
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro
565 570 575
Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
580 585 590
Thr
<210> 95
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF711 HC节 <CEA> 28A9 不具有 接头 及 DOTAM
<400> 95
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF710 及 P1AF711 轻链 (D1AA2299)
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
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<211> 579
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0712 HC穴 <CEA> CH1A1A DOTA-VL (D1AE4684)
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu
465 470 475 480
Thr Thr Pro Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
485 490 495
Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
500 505 510
Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro
515 520 525
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala
530 535 540
Leu Thr Ile Ala Gly Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys
545 550 555 560
Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu
565 570 575
Thr Val Leu
<210> 99
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0712 HC穴 <CEA> 不具有 接头 或 DOTA
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 100
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0713 HC穴 <CEA> CH1A1A (D1AC4022)
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 101
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0713 HC节 <CEA> CH1A1A DOTA-VH-AST (D1AE3670)
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
465 470 475 480
Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
485 490 495
Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly
500 505 510
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala
515 520 525
Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Tyr Arg Asp Asn Ser
530 535 540
Lys Asn Gln Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr
545 550 555 560
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe
565 570 575
Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
580 585 590
<210> 102
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0713 HC节 <CEA> CH1A1A 不具有 接头 及 DOTA
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 103
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF0712 及 P1AF0713 轻链 (D1AA3384)
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 104
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8284 及 P1AF8285 HC节 <GPRC5D> (D1AF6517)
<400> 104
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 105
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8284 HC穴 Dotam-VL (D1AG3592)
<400> 105
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser
260 265 270
Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
275 280 285
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala
290 295 300
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
305 310 315 320
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
325 330 335
Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly
340 345 350
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
355
<210> 106
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8285 H穴 Dotam-VHA (D1AG3591)
<400> 106
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val
245 250 255
Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
260 265 270
Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
275 280 285
Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr
290 295 300
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
325 330 335
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala
340 345 350
Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Ala
<210> 107
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8284 及 P1AF8285 轻链 (D1AF6469)
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 108
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8286 及 P1AF8287 HC节 <FAP> 4B9 (D1AF6515)
<400> 108
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 109
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8286 HC穴 Dotam-VL (D1AG3592)
<400> 109
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
245 250 255
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser
260 265 270
Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
275 280 285
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala
290 295 300
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
305 310 315 320
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
325 330 335
Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly
340 345 350
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
355
<210> 110
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8287 HC穴 Dotam-VHA (D1AG3591)
<400> 110
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val
245 250 255
Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
260 265 270
Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
275 280 285
Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr
290 295 300
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
325 330 335
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala
340 345 350
Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Ala
<210> 111
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF8286 及 P1AF8287 轻链 (D1AB9974)
<400> 111
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 112
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF7782 及 P1AF7784 HC节 <CEA> CH1A1A (D1AD3419)
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 113
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF7782 HC穴 Dotam-VL (D1AG2237)
<400> 113
Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp
85 90 95
Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 114
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF7784 HC穴 Dotam-VH (D1AG2236)
<400> 114
Gly Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Lys
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
275 280 285
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 115
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AF7782 及 P1AF7784 轻链 (D1AD3421)
<400> 115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 116
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser
1 5 10
<210> 117
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 117
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 118
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 118
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu
1 5 10
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 119
Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 120
Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 121
Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly
1 5 10
<210> 122
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> <Pb-Dotam> PRIT-0213 的重链 可变域 1
<400> 122
Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly
35 40 45
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr
65 70 75 80
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0213
<400> 123
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu
85 90 95
Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 124
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0214
<400> 124
Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 125
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <Pb-Dotam> PRIT-0214
<400> 125
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn
20 25 30
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu
85 90 95
Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 126
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 1 双特异性, 三价 <CEA/Pb-Dotam> PRIT-0214
VH_84.66
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu
465 470 475 480
Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
545 550 555 560
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
580 585 590
<210> 127
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 2 双特异性, 三价<CEA/Pb-Dotam> PRIT-0214
VL_84.66
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
465 470 475 480
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His
485 490 495
Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
500 505 510
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
515 520 525
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
530 535 540
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
545 550 555 560
Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr
565 570 575
Lys Val Glu Ile Lys
580
<210> 128
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 <CEA> 84.66
<400> 128
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 129
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 1 双特异性, 三价 <CEA/Pb-Dotam> PRIT-0213
VH_84.66 --> 节
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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20 25 30
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<220>
<223> https://protect-eu.mimecast.com/s/2MppC3lXQckn6XCQnhR8?domain=rblc.do 引物序列
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P1AA1227_LC
<400> 146
Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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210 215
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<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D1AE3669 (HC节 <CEA> CH1A1A Dotam-VH-AST)
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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275 280 285
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Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
580 585 590
Ser Thr
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 148
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val His
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 IgG1 CH1 域
<400> 149
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1 5 10
<210> 150
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 带 c 末端延伸
<400> 150
Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser
20 25 30
Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly
35 40 45
Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr
65 70 75 80
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 151
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 152
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性 接头
<400> 152
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly
20
<210> 153
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有c端丙氨酸延伸的变体
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu
465 470 475 480
Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
485 490 495
Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
500 505 510
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr
515 520 525
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
530 535 540
Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
545 550 555 560
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr
565 570 575
Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
580 585 590
<210> 154
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A5B7 表位
<400> 154
Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu
1 5 10 15
Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr
20 25 30
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn
50 55 60
Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser Val Asp
65 70 75 80
His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn
85
<210> 155
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE23 表位
<400> 155
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
1 5 10 15
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
20 25 30
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
50 55 60
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
65 70 75 80
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn
85
<210> 156
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR1 <CEA> MFE23
<400> 156
Asp Ser Tyr Met His
1 5
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <CEA> MFE23
<400> 157
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR2 <CEA> MFE23-H26
<400> 158
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 159
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 CDR3 <CEA> MFE23
<400> 159
Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> MFE23
<400> 160
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> MFE23-L24, L25
<400> 161
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 162
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR1 <CEA> MFE23-L26
<400> 162
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Met Arg Ala Ser Gln Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ser Tyr Met
20
<210> 163
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> MFE23
<400> 163
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> MFE23-L26
<400> 164
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR2 <CEA> MFE23-L29
<400> 165
Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 CDR3 <CEA> MFE23
<400> 166
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 167
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链 可变域 <CEA> MFE23
<400> 167
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 168
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链 可变域 <CEA> MFE23
<400> 168
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 169
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H24
<400> 169
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 170
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H25
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H26
<400> 171
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 172
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H27
<400> 172
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 173
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H28
<400> 173
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 174
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-H29
<400> 174
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 175
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L24
<400> 175
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 176
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L25
<400> 176
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L26
<400> 177
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 178
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L27
<400> 178
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 179
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L28
<400> 179
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 180
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MFE-L29
<400> 180
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (103)

1.一组抗体，其包含：
i)第一抗体，其结合至于靶细胞表面上表达的抗原，且进一步包含放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域，但不包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域；以及
ii)第二抗体，其结合至于该靶细胞表面上表达的该抗原，且进一步包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域，但不包含该放射性标记化合物的该抗原结合位点的VH域，
其中该第一抗体的该VH域及该第二抗体的该VL域能够一起形成该放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
2.根据权利要求1的抗体组，其中该第一抗体及该第二抗体各自包含i)包含对在靶细胞表面上表达的该抗原具有特异性的抗原结合位点的抗体片段及ii)该放射性标记化合物的该抗原结合位点的VL域或VH域。
3.根据权利要求2的抗体组，其中该抗体片段选自至少一个Fv、scFv或Fab或交叉Fab片段。
4.根据权利要求3的抗体组，其中该第一抗体包含以下或由以下组成：
a)结合该抗原的Fab片段，以及
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体重链可变域(VH)，或
ii)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域，其中VH域的C端融合至该恒定域的N端；
其中该多肽通过该VH域的N端融合至该Fab片段的CL或CH1域的C端；
且其中该第二抗体包含以下或由以下组成：
c)结合该抗原的Fab片段，以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
iii)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)，或
iv)放射性标记化合物的抗原结合位点的抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域，其中该VL域的C端融合至该恒定域的N端；
其中该多肽通过该VL域的N端融合至该Fab片段的CL或CH1域的C端；
且其中(b)的多肽的抗体重链可变域(VH)及(d)的多肽的抗体轻链可变域(VL)能够一起形成该放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
5.根据权利要求4的抗体组，其中(b)的多肽经由肽接头通过该VH域的N端融合至(a)的Fab片段的CL或CH1域的C端；且其中(d)的多肽经由肽接头通过VL域的N端融合至(c)的Fab片段的CL或CH1域的C端。
6.根据权利要求3的抗体组，其中该第一抗体包含
a)包含两个Fab片段的串联Fab，其中第一Fab片段及第二Fab片段各自结合该抗原的相同表位，且其中该第一Fab片段及该第二Fab片段经由肽系链连接，其中该第一Fab经由其C端连接至该第二Fab的N端；以及
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至该CH1域的N端；
其中该多肽通过该VH域的N端融合至该第二Fab片段的CL或CH1域的C端；
且该第二抗体包含
c)包含两个Fab片段的串联Fab，其中第一Fab片段及第二Fab片段各自结合该抗原的相同表位，且其中该第一Fab片段及该第二Fab片段经由肽系链连接，其中该第一Fab经由其C端连接至该第二Fab的N端；以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)，其中VL域的C端融合至该恒定域的N端；
其中该多肽通过该VL域的N端融合至该第二Fab片段的CL或CH1域的C端；
且其中(b)的多肽的抗体重链可变域(VH)及(d)的多肽的抗体轻链可变域(VL)能够一起形成该放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
7.根据权利要求6的抗体组，其中(b)的多肽经由肽接头通过该VH域的N端融合至(a)的第二Fab片段的CL或CH1域的C端；且其中(d)的多肽经由肽接头通过该VL域的N端融合至(c)的第二Fab片段的CL或CH1域的C端。
8.根据权利要求3的抗体组，其中该第一抗体包含
a)包含第一片段及第二片段的串联Fab，其中该第一片段经由肽系链通过其C端连接至该第二片段的N端，其中该第一片段结合该抗原的第一表位且该第二片段结合该抗原的第二表位，且其中选自该第一片段及该第二片段的片段中之一者为Fab且另一者为交叉Fab，
b)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体重链恒定域(CH1)，其中VH域的C端融合至该CH1域的N端；
其中该多肽通过该VH域的N端融合至该第二片段的其中一个链的C端；且
其中该第二抗体包含
c)包含第一片段及第二片段的串联Fab，其中该第一片段通过其C端连接至该第二片段的N端，其中该第一片段结合该抗原的第一表位且该第二片段结合该抗原的第二表位，且其中选自该第一片段及该第二片段的片段中之一者为Fab且另一者为交叉Fab；以及
d)包含以下或由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)，其中VL域的C端融合至该轻链恒定域的N端
其中该多肽通过该VL域的N端融合至该第二片段的其中一个链的C端；
且其中(b)的该多肽的抗体重链可变域(VH)及(d)的多肽的抗体轻链可变域(VL)能够一起形成该放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
9.根据权利要求8的抗体组，其中(b)的多肽经由肽接头通过该VL域的N端融合至(a)的该第二片段的其中一个链的C端；且其中(d)的该多肽经由肽接头通过该VL域的N端融合至(c)的该第二片段的其中一个链的C端。
10.根据权利要求1至3中任一项的抗体组，其中该第一抗体及该第二抗体各自进一步包含Fc域。
11.根据权利要求10的抗体组，其中该第一抗体及该第二抗体各自包含i)包含对于靶细胞表面上表达的该抗原具有特异性的抗原结合位点的抗体片段、ii)Fc区以及iii)融合至该Fc区的该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域。
12.根据权利要求10或11的抗体组，其中该Fc域经修饰以减弱或消除效应功能。
13.根据权利要求10至12中任一项的抗体组，其中该第一抗体包含以下或由以下组成：
i)完整轻链片段；
ii)完整重链；
iii)另一缺乏Fd的Fc链；以及
iv)包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽；
其中(i)的轻链及(ii)的重链一起提供用于该抗原的抗原结合位点；且其中包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的该多肽通过其N端融合至(ii)或(iii)的C端；且
其中该第二抗体包含以下或由以下组成：
v)完整轻链片段；
vi)完整重链；
vii)另一缺乏Fd的Fc链；以及
viii)包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽；
其中(v)的轻链及(vi)的重链一起提供用于该抗原的抗原结合位点；且其中包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的该多肽通过其N端融合至(vi)或(vii)的C端；
其中(iv)的多肽的抗体重链可变域(VH)及(viii)的多肽的抗体轻链可变域(VL)能够一起形成该放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
14.根据权利要求13的抗体组，其中(iv)的多肽经由接头通过其N端融合至(ii)或(iii)的C端；且(viii)的多肽经由接头通过其N端融合至(vi)或(vii)的C端。
15.根据权利要求10至12中任一项的抗体组，其中该第一抗体及该第二抗体中的各者包含a)Fc域；b)包含用于靶抗原的抗原结合位点的至少一个抗体片段，诸如scFv、Fv、Fab或交叉Fab片段；以及c)包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或VH域的多肽，其中(b)的抗体片段的C端融合至该Fc域的一个链的N端，且(c)的多肽的C端融合至该Fc域的另一链的N端。
16.根据权利要求15的抗体组，其中该第一抗体包含：
i)完整轻链；
ii)完整重链；
iii)另一Fc链；以及
iv)包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域或由其组成的多肽；
其中(i)的轻链及(ii)的重链一起提供用于该靶抗原的抗原结合位点；且其中包含该放射性标记化合物的该抗原结合位点的VH域或由其组成的该多肽经由接头通过其C端融合至(iii)的N端；且
该第二抗体包含：
v)完整轻链；
vi)完整重链；
vii)另一Fc链；以及
viii)包含该放射性标记化合物的该抗原结合位点的VL域或由其组成的多肽；
其中(v)的轻链及(vi)的重链一起提供用于该靶抗原的抗原结合位点；且其中包含该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域或由其组成的该多肽经由接头通过其C端融合至(vii)的N端。
17.根据权利要求16的抗体组，其中：
i)该第一抗体包含具有SEQ ID NO:112的第一重链、具有SEQ ID NO:114的第二重链及具有SEQ ID NO:115的轻链；以及
ii)该第二抗体包含具有SEQ ID NO:112的第一重链、具有SEQ ID NO:113的第二重链及具有SEQ ID NO:115的轻链。
18.根据权利要求10至12中任一项的抗体组，其中该第一抗体包含
a)第一全长抗体且由两个抗体重链及两个抗体轻链组成，其中该全长抗体的至少一个臂结合该抗原；以及
b)由以下组成的多肽：
i)抗体重链可变域(VH)；或
ii)抗体重链可变域(VH)及抗体恒定域(CH1)，
其中该多肽通过该VH域的N端融合至该第一全长抗体的该两个重链中一个链的C端，且
其中该第二抗体包含：
c)第二全长抗体且由两个抗体重链及两个抗体轻链组成，其中该抗体的至少一个臂结合至该抗原；以及
d)由以下组成的多肽：
i)抗体轻链可变域(VL)；或
ii)抗体轻链可变域(VL)及抗体轻链恒定域(CL)，
其中该多肽通过该VL域的N端融合至该第二全长抗体的该两个重链中一个链的C端，
其中(b)的多肽及(d)的多肽一起能够形成该放射性标记化合物的功能抗原结合位点。
19.根据权利要求18的抗体组，其中该(b)的多肽经由肽接头通过该VH域的N端融合至该第一全长抗体的该两个重链中一个链的C端；且(d)的多肽经由肽接头通过该VL域的该N端融合至该第二全长抗体的该两个重链中一个链的C端。
20.根据权利要求18或19的抗体组，其中对于该抗原而言，该第一抗体及该第二抗体分别为二价。
21.根据权利要求20的抗体组，其中该全长抗体的两个臂结合至该抗原的相同表位。
22.根据权利要求18或19的抗体组，其中对于该抗原而言，该第一抗体及该第二抗体中的各者为双互补位(biparatopic)。
23.根据权利要求22的抗体组，其中该第一抗体的两个臂各自结合至该抗原上的表位且彼此结合至不同表位；且其中该第二抗体的两个臂各自结合至该抗原上的表位且彼此结合至不同表位。
24.根据前述权利要求中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物包含放射性标记的DOTA或其盐或功能性变体。
25.根据前述权利要求中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物为放射性标记有Lu或Y放射性同位素的DOTA或其盐或功能性变体。
26.根据权利要求24或25的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域包含(a)包含35的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含36的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含37的氨基酸序列的CDR-H3。
27.根据权利要求24至26中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:41具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
28.根据权利要求27的抗体组，其中将一个或多个丙氨酸残基添加至该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的C端中，或其中将来自CH1域的N端的一个或多个残基添加至该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的C端中。
29.根据权利要求28的抗体组，其中将残基AST添加至该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的C端中。
30.根据权利要求24至29中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域包含(d)包含38的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含39的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含40的氨基酸序列的CDR-L3。
31.根据权利要求24至30中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:42具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
32.根据权利要求1至23中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物包含Pb-DOTAM。
33.根据权利要求32的抗体组，其中Pb-DOTAM的功能性结合位点以100pM、50pM、20pM、10pM、5pM、1pM或更小，例如0.9pM或更小、0.8pM或更小、0.7pM或更小、0.6pM或更小或0.5pM或更小的结合亲和力Kd值结合。
34.根据权利要求32或权利要求33的抗体组，其中该Pb-DOTAM的功能性结合位点结合至Pb-DOTAM且结合至Bi-DOTAM。
35.根据权利要求32至34中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域包含：
a)包含氨基酸序列FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)或在SEQ ID NO:2中具有至多1、2或3个取代的其变体的重链CDR2，其中这些取代不包括Phe50、Asp56和/或Tyr58，且任选亦不包括Gly52和/或Arg54；
b)包含氨基酸序列ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)或在SEQ ID NO:3中具有至多1、2或3个取代的其变体的重链CDR3，其中这些取代不包括Glu95、Arg96、Asp97、Pro98，且任选亦不包括Ala100C、Tyr100D和/或Pro100E，和/或任选亦不包括Tyr99；
以及重链CDR1，其任选为：
c)包含氨基酸序列GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)或在SEQ ID NO:1中具有至多1、2或3个取代的其变体的重链CDR1。
36.根据权利要求35的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域包含(a)包含GFSLSTYSMS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含FIGSRGDTYYASWAKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含ERDPYGGGAYPPHL(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR-H3。
37.根据权利要求32至36中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域包含选自由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO 9组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
38.根据权利要求37的抗体组，其中将一个或多个丙氨酸残基添加至该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的C端中，或其中将来自CH1域的N端的一个或多个残基添加至该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的C端中。
39.根据权利要求38的抗体组，其中将残基AST添加至该放射性标记化合物的抗原结合位点的VH域的C端中。
40.根据权利要求32至39中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域包含
d)包含氨基酸序列QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)或在SEQ ID NO:4中具有至多1、2或3个取代的其变体的轻链CDR1，其中这些取代不包括Tyr28及Asp32；
e)包含氨基酸序列LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)或在SEQ ID NO:6中具有至多1、2或3个取代的其变体的轻链CDR3，其中这些取代不包括Gly91、Tyr92、Asp93、Thr95c以及Tyr96，
以及轻链CDR2，其任选为
f)包含氨基酸序列QASKLAS(SEQ ID NO:5)或在SEQ ID NO:5中具有至少1、2或3个取代的其变体的轻链CDR 2，所述取代任选不包括Gln50。
41.根据权利要求40的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域包含(d)包含QSSHSVYSDNDLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含QASKLAS(SEQ IDNO:5)的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含LGGYDDESDTYG(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的CDR-L3。
42.根据权利要求32至41中任一项的抗体组，其中该放射性标记化合物的抗原结合位点的VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
43.根据前述权利要求中任一项的抗体组，其中该第一抗体及该第二抗体结合至于靶细胞表面上表达的该抗原的相同表位。
44.根据权利要求1至42中任一项的抗体组，其中该第一抗体结合至与该第二抗体不同的抗原的表位。
45.根据前述权利要求中任一项的抗体组，其中于靶细胞表面上表达的该抗原为肿瘤相关抗原。
46.根据前述权利要求中任一项的抗体组，其中于靶细胞表面上表达的该抗原选自由以下组成的群：癌胚抗原(CEA)、CD20、HER2、EGP-1(上皮糖蛋白-1，亦称为滋胚层-2)、结肠特异性抗原-p(CSAp)、胰脏粘蛋白MUC1、GPRC5D以及FAP。
47.根据前述权利要求中任一项的抗体组，其中于靶细胞表面上表达的该抗原选自由以下组成的群：CEA、GPRC5D以及FAP。
48.根据权利要求47的抗体组，其中：
i)该第一抗体包含SEQ ID NO:104的第一重链；SEQ ID NO:106的第二重链，其中SEQID NO:106的C端丙氨酸为任选选用且可不存在或被替代性C端延伸部分置换；及SEQ IDNO:107的轻链；以及
ii)该第二抗体包含有SEQ ID NO:104的第一重链、SEQ ID NO:105的第二重链及SEQID NO:107的轻链。
49.根据权利要求47的抗体组，其中
i)该第一抗体包含SEQ ID NO:108的第一重链；SEQ ID NO:110的第二重链，其中SEQID NO:110的C端丙氨酸为任选选用且可不存在或被替代性C端延伸部分置换；及SEQ IDNO:111的轻链；以及
ii)该第二抗体包含SEQ ID NO:108的第一重链、SEQ ID NO:109的第二重链及SEQ IDNO:111的轻链。
50.根据权利要求1至47中任一项的抗体组，其中于靶细胞表面上表达的该抗原为CEA。
51.根据权利要求50的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，该抗原结合位点包含
重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
52.根据权利要求50至51中任一项的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:25组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
53.根据权利要求50至52中任一项的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:26组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
54.根据权利要求50的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
55.根据权利要求50或54的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:49组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
56.根据权利要求50、54或55中任一项的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:50组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ IDNO:50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
57.根据权利要求50的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含
重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
58.根据权利要求50或57的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:17组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
59.根据权利要求50、57或58的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:18组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
60.根据权利要求50的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含
重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
61.根据权利要求50或权利要求60的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:65组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
62.根据权利要求50、60或61的抗体组，其中该第一抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:66组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
63.根据权利要求50的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:157或158的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:160、161或162的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQID NO:163、164或165的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDR-L3。
64.根据权利要求50或63的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:169、170、171、172、173或174的氨基酸序列或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列；以及轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:175、176、177、178、179或180的氨基酸序列或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。
65.根据权利要求50、63或64的抗体组，其中该第一抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(c)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(d)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(e)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(f)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(g)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域。
66.根据权利要求50至65中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含
重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3。
67.根据权利要求50至66中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:25组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
68.根据权利要求50至67中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:26组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
69.根据权利要求50至65中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3。
70.根据权利要求50至65或69中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:49组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ IDNO:49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
71.根据权利要求50至65、69或70中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:50组成的群的氨基酸序列或包含与SEQID NO:50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
72.根据权利要求50至65中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含
重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L3。
73.根据权利要求50至65或72中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:17组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ IDNO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
74.根据权利要求50至65、72或73中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:18组成的群的氨基酸序列或包含与SEQID NO:18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
75.根据权利要求50至65中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含
重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:60的氨基酸序列的CDR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO:63的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-L3。
76.根据权利要求50至65或75中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VH序列包含选自由SEQ ID NO:65组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ IDNO:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
77.根据权利要求50至65、75或76的抗体组，其中该第二抗体包含CEA的抗原结合位点，其包含的VL序列包含选自由SEQ ID NO:66组成的群的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其变体。
78.根据权利要求50至65的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：重链可变区，其包含(a)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQID NO:157或158的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDR-H3；以及轻链可变区，其包含(d)包含SEQ ID NO:160、161或162的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:163、164或165的氨基酸序列的CDR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDR-L3。
79.根据权利要求50至65或78的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:169、170、171、172、173或174的氨基酸序列或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列；以及轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:175、176、177、178、179或180的氨基酸序列或与其具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。
80.根据权利要求50至65、78或79的抗体组，其中该第二抗体包含结合至CEA的抗原结合位点，其包含：
(a)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(b)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(c)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的VL域，或
(d)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(e)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(f)包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域，或
(g)包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的VL域。
81.根据权利要求50的抗体组，其中该第一抗体为根据权利要求57至59中任一项的抗体且该第二抗体为根据权利要求66至68中任一项的抗体。
82.根据权利要求1的抗体组，其中该第一抗体包含SEQ ID NO:28的第一重链、SEQ IDNO:32的第二重链及SEQ ID NO:34的轻链。
83.根据权利要求82的抗体组，其中将一个或多个丙氨酸残基添加至SEQ ID NO:32的C端中，或其中将序列AST添加至SEQ ID NO:32的C端中。
84.根据权利要求1的抗体组，其中该第一抗体包含SEQ ID NO:51的第一重链及SEQ IDNO:52的第二重链以及SEQ ID NO:54的轻链。
85.根据权利要求84的抗体组，其中将一个或多个丙氨酸残基添加至SEQ ID NO:52的C端中，或其中将序列AST添加至SEQ ID NO:32的C端中。
86.根据权利要求1的抗体组，其中该第一抗体包含SEQ ID NO:86的第一重链；SEQ IDNO:87的第二重链，其中C端AST残基为任选选用且可不存在或被不同C端延伸部分置换；及SEQ ID NO:89的轻链。
87.根据权利要求1的抗体组，其中该第一抗体包含SEQ ID NO:93的第一重链；SEQ IDNO:94的第二重链，其中C端AST残基为任选选用且可不存在或被不同C端延伸部分置换；及SEQ ID NO:96的轻链。
88.根据权利要求1或82至87中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含SEQ ID NO:30的第一重链、SEQ ID NO:33的第二重链及SEQ ID NO:34的轻链。
89.根据权利要求1或82至87中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含SEQ ID NO:55的第一重链及SEQ ID NO:56的第二重链以及SEQ ID NO:58的轻链。
90.根据权利要求1或82至87中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含SEQ ID NO:83的第一重链及SEQ ID NO:84的第二重链以及SEQ ID NO:89的轻链。
91.根据权利要求1或82至87中任一项的抗体组，其中该第二抗体包含SEQ ID NO:90的第一重链及SEQ ID NO:91的第二重链以及SEQ ID NO:96的轻链。
92.一组核酸，其表达根据前述权利要求中任一项的抗体组。
93.一种表达载体或一组表达载体，其包含根据权利要求92的核酸组。
94.一种宿主细胞或一组宿主细胞，其包含根据权利要求93的表达载体或表达载体组。
95.一种预靶向放射免疫疗法的方法，该方法包括：
i)对个体施用根据权利要求1至91中任一项的抗体组，其中所述第一抗体和第二抗体同时或以任一次序依序施用，其中所述抗体结合靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面；且其中该第一抗体及该第二抗体的联合形成该放射性标记化合物的功能性结合位点；
且
ii)随后施用放射性标记化合物，其中所述放射性标记化合物结合至该放射性标记化合物的功能性结合位点。
96.根据权利要求95的方法，其中该方法不包含施用清除剂或封闭剂的步骤。
97.根据权利要求95或96的方法，其中该个体为人类。
98.根据权利要求95至97中任一项的方法，其中该靶抗原为癌症或肿瘤相关抗原，且该方法为肿瘤或癌症的放射免疫疗法的方法。
99.根据权利要求1至91中任一项的抗体组，其用于根据权利要求95至98中任一项的预靶向放射免疫疗法的方法中。
100.一种使放射性同位素靶向组织或器官以进行放射成像的方法，该方法包括：
i)对个体施用根据权利要求1至91中任一项的抗体组，其中所述第一抗体和第二抗体同时或以任一次序依序施用，其中所述抗体结合靶抗原且定位至表达靶抗原的细胞表面；且其中该第一抗体及该第二抗体的联合形成该放射性标记化合物的功能性结合位点；
且
ii)随后施用放射性标记化合物，其中所述放射性标记化合物结合至该放射性标记化合物的功能性结合位点。
101.根据权利要求100的方法，其中该方法不包含施用清除剂或封闭剂的步骤。
102.根据权利要求100或101的方法，其中该方法进一步包含成像步骤。
103.根据权利要求102的方法，其中该靶抗原为癌症或肿瘤相关抗原，且该放射成像用于对肿瘤或癌症进行成像。
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