CN114340659A

CN114340659A - 联合治疗

Info

Publication number: CN114340659A
Application number: CN202080044905.2A
Authority: CN
Inventors: M·库尔斯; T·梵德阿斯彻; B·德克斯马埃克
Original assignee: Ezer Arne Immunotherapy Co ltd
Current assignee: Ezer Arne Immunotherapy Co ltd
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: KR20220061946A; AU2020301582A1; US20220387573A1; CA3144296A1; CN114340659B; WO2020260685A1; MX2021015802A; JP2022540759A; ZA202200731B; BR112021025170A2; EP3990008A1; IL289130A

Abstract

本发明一般性涉及编码CD40、caTLR4和CD70的mRNA分子与编码肿瘤相关抗原的mRNA分子的组合，其用作治疗主要患有稳定恶性黑色素瘤疾病转移性癌症患者的治疗性疫苗，但也扩展到其他癌症类型，并且扩展到其疾病已经对先前治疗显示部分应答的患者。所述用途可进一步包括施用检查点抑制剂。本发明还提供了此类治疗的施用方案，重点是将治疗剂施用到淋巴结中，即所谓的淋巴结内治疗。

Description

联合治疗

发明领域

发明背景

黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤，并且是最危险形式的皮肤癌。黑色素瘤通常存在于皮肤中，但也发生在口腔、肠道或眼睛中。在过去的几十年中，恶性黑色素瘤的发病率有所增加。根据世界卫生组织(WHO)的数据，全球每年约有132,000例新的黑色素瘤病例被诊断出来。

当黑色素瘤在早期(可切除的疾病)被发现和治疗时，广泛的局部切除可以治愈。然而，15-20％的黑色素瘤患者会发生转移，这些转移可能是局部区域性的(locoregional)，也可能会到达多个器官(通常是肺、肝和脑，并且其可能无法切除，因此预后明显更差)。

在欧洲，原发性治疗后肿瘤复发风险高的可切除黑色素瘤患者长期以来只能选择有限的辅助治疗；观察或采用干扰素(IFN)α的辅助治疗。然而，IFNα的益处似乎不大，相关的副作用可能超过益处。在过去十年中开发了新的免疫治疗，其首先用于转移性疾病，现在也用于黑色素瘤患者的辅助治疗。

抗细胞毒T淋巴细胞相关蛋白(CTLA)-4、抗程序性细胞死亡蛋白(PD)-1和抗程序性细胞死亡蛋白配体(PD-L)1获批用于晚期(不可切除或转移性)黑色素瘤的一线治疗以及B-Raf和丝裂原激活的细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂的批准为转移性患者开辟了新的治疗选择。这些治疗为不可切除或转移性黑色素瘤患者带来了前所未有的总体客观应答率、无进展生存期和总生存期。通过伊匹单抗和纳武单抗的组合，抗PD1抗体(即纳武单抗和派姆单抗)单药治疗黑色素瘤的疗效可以显著提高。然而，这些令人印象深刻的改善是以毒性为代价的，并且它们仅对少数患者(通常不到25％)具有持久性。因此，非常需要具有相似或更好的抗肿瘤活性和风险收益特征好得多的替代治疗。

具体而言，本发明的一个目的是提供增强抗PD1治疗但是以可耐受的方式的替代治疗。发现该目的可以通过添加进一步的免疫刺激但是通过另一种模式并且重点是针对肿瘤相关抗原的树突状细胞致敏来实现。

发明概述

在第一方面，本发明提供一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的一种或多种mRNA分子；和

-编码肿瘤相关抗原(TAA)的一种或多种mRNA分子；

所述组合用于治疗患有在一线检查点抑制剂治疗之后作为最佳客观应答的稳定疾病的转移性癌症患者。

在本发明的一个具体实施方案中，所述组合还可与检查点抑制剂治疗联合使用。

在本发明进一步的实施方案中，所述肿瘤相关抗原是黑色素瘤抗原，优选选自包括以下的列表：酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)、在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)和纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)。

在本发明又进一步的实施方案中，所述组合用于治疗患有在至少6个月的一线检查点抑制剂治疗之后作为最佳客观应答的稳定疾病的转移性癌症患者。

在另一个具体实施方案中，所述检查点抑制剂治疗选自抗PD-1治疗和抗CTLA4治疗；优选抗PD-1治疗，更具体地，针对PD-1的拮抗性抗体，例如选自包括以下的列表：纳武单抗(BMS-936558/MDX1106)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)和派姆单抗(MK-3475)；优选派姆单抗(MK-3475)。

在本发明的一个具体实施方案中，所述一种或多种mRNA分子被配制用于肠胃外施用；更具体地用于静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、腹膜内、肌肉内或结内施用；优选结内施用。

在一个非常具体的实施方案中，本发明提供一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子；和

-编码酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)和NY-ESO-1的mRNA分子；

所述组合与派姆单抗联合使用；

所述组合用于通过结内施用治疗转移性癌症患者，其中所述患者被诊断为患有在6个月的一线派姆单抗治疗之后作为最佳客观应答的稳定疾病。

在另一个非常具体的实施方案中，本发明提供一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子；和

-编码酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)和在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)的mRNA分子；

所述组合与派姆单抗联合使用；

在另一个具体实施方案中，可根据以下施用方案施用根据本发明的用途使用的组合：

-施用1-5：每次间隔约1周；

-施用6：施用5之后约2周；

-施用7：施用6之后约3周；

-施用8：施用7之后约6周；

-施用9：施用8之后约6周。

在又一个具体实施方案中，可根据以下施用方案施用根据本发明的用途使用的组合：

-施用1-5：每次间隔约1周；

-施用6：施用5之后约2周；

-施用7：施用6之后约3周；

-施用8：施用7之后约6周；

-施用9：施用8之后约6周；

并且其中在施用1、4、6、7、8和9之前、同时或之后与所述组合在同一天施用所述检查点抑制剂治疗。

在使用检查点抑制剂治疗的情况下，可在施用7和8之间以及施用8和9之间另外施用所述检查点抑制剂治疗。

本发明还提供根据本文所定义的用途使用的组合，其中所述组合包含：

-约300μg编码CD40L的mRNA；

-约300μg编码caTLR4的mRNA；

-约300μg编码CD70的mRNA；

-约900μg编码肿瘤相关抗原的mRNA。

在一个非常具体的实施方案中，本发明提供根据本文所定义的用途使用的组合，其中所述组合包含：

-约600μg编码CD40L的mRNA；

-约600μg编码caTLR4的mRNA；

-约600μg编码CD70的mRNA；

-约1800μg编码肿瘤相关抗原的mRNA。

发明详述

如本文在上文中已经详细记载的，本发明提供一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的一种或多种mRNA分子；和

-编码肿瘤相关抗原(TAA)的一种或多种mRNA分子；

在本文中，编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子的所述组合也称为TriMix。具体而言，TriMix是信使核糖核酸(mRNA)的混合物，所述混合物编码有效树突状细胞(DC)和T细胞活化分子，即组成型活性Toll样受体4[caTLR4]、人分化簇40配体[CD40L]和T细胞共活化分子[人CD70]。从本质上讲，TriMix代表了在DC上表达时免疫活化环路的快捷方式：caTLR4向DC提供危险信号，CD40L将活化的T辅助细胞的逆行信号传递给DC，而CD70是由活化的DC分泌的CD8⁺T细胞活化剂。

这些分子中的每一个在本发明上下文中的相关性定义如下：

·caTLR4(组成型活性Toll样受体4)：病原体相关分子模式与Toll样受体(TLR)的结合为DC成熟提供信号。TLR的连接诱导与DC上CD40连接的类似效果，即共刺激分子的上调和增强的细胞因子/趋化因子分泌。在TLR配体中，脂多糖(LPS)(其与TLR4结合)是一种有吸引力的候选物，因为LPS成熟的DC已被证明可以获得刺激特定T细胞的增强能力。LPS结合对DC的影响可以通过工程改造DC来表达组成型活性形式的caTLR4来安全地模拟；在该构建体中，基因的细胞外结构域缺失，导致截短受体的组成型活化(Bonehill et al.,2008)。

·CD40L(分化簇40配体)：CD40-CD40L相互作用介导最有效的DC活化信号之一。通常，DC上的CD40连接由表达CD40L的活化CD4⁺T细胞提供。该过程(其可以通过工程改造的DC表达CD40L模拟)导致共刺激分子的上调和细胞因子/趋化因子的产生增强。在临床前模型中，CD40连接增加了CD4⁺和CD8⁺T细胞扩增的幅度。特别是对于记忆CD8⁺T细胞的诱导，相信CD40连接是必不可少的(Bonehill et al.,2008)。

·CD70(分化簇70)：与CD40L一样，CD70是共刺激分子肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。CD70是CD27的配体，在活化的B细胞、幼稚T细胞和几个亚群的记忆T细胞上表达。CD27连接是通过促进致敏T细胞的存活和增殖而对效应T细胞和记忆T细胞群形成的关键贡献。最近，CD70已成为致敏CD8⁺T细胞反应的关键分子。实际上，在小鼠中进行的几项研究描述了DC上的CD40连接，无论是否与TLR配体组合，都会诱导这些DC表达CD70；并且致敏后CD8⁺T细胞的指数扩增几乎完全依赖于CD70/CD27相互作用(Bonehill et al.,2008)。

在本发明进一步的实施方案中，所述肿瘤相关抗原是黑色素瘤抗原，优选选自包括以下的列表：酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)、在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)和纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)。在更优选的实施方案中，所述肿瘤相关抗原是选自上述列表的肿瘤抗原的组合，甚至更优选地是5种抗原的组合物，是酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)和在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)的组合；或者是酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)和纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)的组合。

本发明具体涉及针对黑色素瘤的免疫治疗，除了编码3种不同免疫刺激蛋白(组成型活性Toll样受体4[caTLR4]、分化簇40配体[CD40L]和分化簇70[CD70])的信使核糖核酸(mRNA)之外，其还含有编码肿瘤相关抗原(TAA)的mRNA。设计了3种mRNA的混合物来以结构化的方式活化并‘教育’DC，从而在局部和全身上对免疫系统进行最佳刺激。所包括的具体TAA是酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)A3、MAGE C2、在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)和/或纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)融合到工程改造形式的树突状细胞(DC)溶酶体相关膜蛋白(LAMP)。

肿瘤相关抗原：

酪氨酸酶：

本发明的组合可包含癌症抗原酪氨酸酶(Tyr)、其片段或其变体。酪氨酸酶是一种具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶催化活性的含铜酶，可在微生物和动植物组织中找到。具体而言，酪氨酸酶通过氧化如酪氨酸的酚类来催化黑色素和其他色素的产生。TYR基因中的突变导致哺乳动物眼皮白化病，而TYR基因的非病理性多态性导致皮肤色素沉着的变化。此外，在如黑色素瘤的癌症或肿瘤中，酪氨酸酶可能变得不受调控，导致黑色素合成增加。因此，酪氨酸酶是一种与黑色素瘤相关的癌症抗原。在罹患黑色素瘤的受试者中，酪氨酸酶可以成为细胞毒性T细胞识别的靶标。

糖蛋白100：

本发明的组合可包含癌症抗原糖蛋白100(gp100)、其片段或其变体。gp100也被称为黑色素细胞蛋白PMEL并且它是一种661个氨基酸长的I型跨膜糖蛋白，其富含黑色素体。它主要在皮肤组织中表达，在肝脏、骨髓、肌肉等中表达有限，......

MAGE A3：

本发明的组合可包含癌症抗原黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、其片段或其变体。MAGE-A蛋白是癌睾丸抗原(CTA)，其仅在肿瘤细胞和睾丸和胎盘的非MHC表达生殖细胞中表达。MAGE-A蛋白在多种人癌症中表达，包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌、白血病、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(如肝细胞癌)、肺癌(如非小细胞肺癌)、卵巢癌、多发性骨髓瘤、食道癌、肾癌、头癌(如鳞状细胞癌)、颈癌(如鳞状细胞癌)和尿路上皮癌。

MAGE C2：

本发明的组合可包含癌症抗原黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)、其片段或其变体。“MAGE-C2”是黑色素瘤抗原家族C2。在肿瘤样品中，MAGE-C2经常在精原细胞瘤、黑色素瘤和膀胱癌中表达。它也在显著比例的头颈癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和肉瘤中表达。

PRAME：

本发明的组合可包含癌症抗原PRAME、其片段或其变体。PRAME由PRAME基因编码，是一种由509个氨基酸组成的蛋白质，在睾丸、胎盘、子宫内膜、卵巢、肾上腺以及来源于黑色素瘤、肺癌、肾癌和头颈癌的组织中表达。

NY-ESO-1：

本发明的组合可包含癌症抗原纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1；也称为CTAG1)、其片段或其变体。NY-ESO-1由CTAG1B基因编码，是一种180个氨基酸长的蛋白，具有富含甘氨酸的N末端区和极度疏水的C末端区。NY-ESO-1在正常组织中表达有限，但在癌症中经常出现。NY-ESO-1可在许多癌症中表达，包括但不限于膀胱癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、滑膜癌和前列腺癌。

在一个具体实施方案中，本文所定义的组合还与检查点抑制剂治疗相结合，例如选自抗PD-1治疗和抗CTLA4治疗。所述检查点抑制剂治疗可包括使用PD-1抑制剂或CTLA4抑制剂。

如本文所用，术语“PD-1抑制剂”包括能够通过例如通过减少PD-1的表达(即转录和/或翻译)或其天然配体PD-L1/PD-L2或PD-1活性来直接或间接影响PD-1调控的任何化合物。它包括细胞内(例如，阻断PD-1相关信号传导分子或途径的物质，例如SHP-1和SHP-2)以及细胞外PD-1抑制剂。不受如此限制的情况下，这种抑制剂包括siRNA、反义分子、蛋白质、肽、小分子、抗体等。

因此，在一个具体实施方案中，所述PD-1途径抑制剂选自包括以下的列表：针对PD-1的纳米抗体，针对PD-1的拮抗抗体；针对PDL1的纳米抗体，针对PDL1的拮抗抗体；或其衍生物。抗体的衍生物可以例如包括scFV、双特异性抗体、......

在一个实施方案中，上述PD-1抑制剂阻断/抑制PD-1与PD-1配体(例如PD-L1、PD-L2)之间的相互作用。例如，这种抑制剂可以靶向PD-1和/或PD-L1和/或PD-L2的IgV结构域，例如如上所述参与相互作用的残基中一个或多个残基。

在一个实施方案中，上述PD-1抑制剂是阻断抗体，如抗PD-1或抗PD-L1/PD-L2抗体。阻断抗PD-1和/或抗PD-L1/PD-L2抗体在本领域中是众所周知的。如上文所讨论的，可由本领域技术人员根据PD-1和PD-L1/PD-L2之间的已知相互作用结构域容易地鉴定和制备其它阻断抗体。例如，对应于PD-1或PD-L1/PD-L2的IgV区域(或该区域的一部分)的肽可用作抗原，以使用本领域众所周知的方法开发阻断抗体。

在本发明上下文中，“抗PD-1抗体”或“抗PD-L1”或“抗PD-L2”是指能够检测/识别(即结合)PD-1、PD-L1或PD-L2蛋白或PD-1、PD-L1或PD-L2蛋白片段的抗体。在一个实施方案中，上述抗体抑制PD-1的生物活性，如PD-1-PD-L1/PD-L2相互作用或PD-1介导的T细胞抑制作用。在另一个实施方案中，PD-1或PD-L1/PD-L2蛋白片段是PD-1或PD-L1/PD-L2的细胞外结构域(例如，IgV结构域)。

在一个非常具体的实施方案中，所述抗PD-1治疗是针对PD-1的拮抗性抗体，例如选自包括以下的列表：纳武单抗(BMS-936558/MDX1106)、匹地利珠单抗(CT-011)和派姆单抗(MK-3475)；优选派姆单抗(MK-3475)。或者，PD-L1抑制剂阿特珠单抗(atezolizumab)也可以在本发明的上下文中适当地使用。

如本文所用，术语“CTLA4通路抑制剂”包括任何阻止或阻断CTLA4启动信号传导的化合物。因此，它可直接或间接地通过减少CTLA4受体(即转录和/或翻译)或其天然配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的表达来直接或间接地影响CTLA4的调节。不受如此限制的情况下，这种抑制剂包括siRNA、反义分子、蛋白质、肽、小分子、抗体、纳米抗体和其中任何一种的衍生物。在一个具体实施方案中，所述CTLA4抑制剂还可以编码所述抑制剂的mRNA的形式提供，例如编码抗CTLA4抗体的mRNA。

优选的抗CTLA4抗体是与人CTLA4特异性结合的人抗体。人抗体在本发明的治疗方法中提供显著优势，因为它们有望最大限度地减少与在人患者中使用非人抗体相关的免疫原性和过敏反应。

在例如WO 00/37504中详细记载了示例性人抗CTLA4抗体。这种抗体包括但不限于3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、ticilimumab、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1以及tremelimumab和伊匹单抗。

在本发明又进一步的实施方案中，所述联合用于治疗患有在至少6个月(并且优选少于12个月)的一线检查点抑制剂治疗之后作为最佳客观应答的稳定疾病的转移性癌症患者。在本发明的上下文中，根据RECIST1.1(Schwartz et al.,2017)标准如对2个连续影像学评价定义“稳定疾病”。

简言之，根据这些标准，稳定疾病被定义为：“既没有足够的收缩(与基线相比)以符合部分或完全应答(CR或PR)，也没有足够的增加(以基线或研究期间的最小直径总和作为参考，以最小者为准)以符合疾病进展(PD)”。应答的分类(CR或PR)与基线时的直径总和进行比较，而进展是基于与基线的最小直径总和或试验期间的最小直径总和(最低点)的比较。大多数方案要求在SD可以得出结论之前的指定时间段内(例如至少4周)的SD标准。因此，如果在研究的2周和4周进行影像学检查，并且在2周时不符合CR、PR或PD的标准，但在4周时符合PD标准，则最佳总体应答是PD，而不是SD，因为受试者的研究时间不够长，不符合SD。

在一个具体实施方案中，本发明的所述组合或mRNA分子被配制用于结内施用，例如被配制于合适的注射缓冲液中，例如林格氏乳酸缓冲液。

对于mRNA的直接体内施用，将mRNA递送到DC至关重要。由于淋巴结含有相对较多的DC并且是免疫诱导的主要部位(Van Lint et al.,2015)，这是最优选的方法。在鼠模型中，可以证明这种施用途径产生了与注射用mRNA电穿孔的DC相似甚至更好的结果。因此，患者优选接受将mRNA直接施用到淋巴结中(Van Lint et al.,2015)。

-编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子；和

所述组合与派姆单抗联合使用；

-编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子；和

-编码酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)和纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)的mRNA分子；

所述组合与派姆单抗联合使用；

-施用1-5：每次间隔约1周；

-施用6：施用5之后约2周；

-施用7：施用6之后约3周；

-施用8：施用7之后约6周；

-施用9：施用8之后约6周。

出于实际原因，施用方案可能会有一些细微的变化，例如“约1周”是打算在上一次施用后5-9天(即+/-2天)之间。对于间隔3-6周的施用也可能发生类似的变化。

-施用1-5：每次间隔约1周；

-施用6：施用5之后约2周；

-施用7：施用6之后约3周；

-施用8：施用7之后约6周；

-施用9：施用8之后约6周；

在一个优选实施方案中，在施用检查点抑制剂的同一天施用本发明的组合，但是，在需要的情况下也可以进行变化。

-约300μg编码CD40L的mRNA；

-约300μg编码caTLR4的mRNA；

-约300μg编码CD70的mRNA；

-约900μg编码肿瘤相关抗原的mRNA。

-约600μg编码CD40L的mRNA；

-约600μg编码caTLR4的mRNA；

-约600μg编码CD70的mRNA；

-约1800μg编码肿瘤相关抗原的mRNA。

实施例

实施例1：

在该研究中，在抗PD1治疗6个月后，在稳定疾病的晚期或转移性黑色素瘤患者中，在标准护理抗PD1(派姆单抗或纳武单抗)的基础上，结内施用两个不同剂量的ECI-006：剂量水平II(总剂量1800μg mRNA)和剂量水平III(总剂量3600μg mRNA)。

ECI-006

ECI-006是一种针对黑色素瘤的免疫治疗，除了编码3种不同免疫刺激蛋白(组成型活性Toll样受体4[caTLR4]、分化簇40配体[CD40L]和分化簇70[CD70])的信使核糖核酸(mRNA)之外，其还含有编码肿瘤相关抗原(TAA)的mRNA。设计了3种mRNA的混合物(EIA-001)来以结构化的方式活化并‘教育’DC，从而在局部和全身上对免疫系统进行最佳刺激。所包括的具体TAA是酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)A3、MAGE C2和在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)融合到工程改造形式的树突状细胞(DC)溶酶体相关膜蛋白(LAMP)。

本文中使用的mRNA分子是使用WO2015071295中描述的载体和程序生产的，并因此进一步包括WO2015071295中定义的翻译增强子元件和核保留元件。

ECI-006mRNA产品是一种不含添加剂的注射用水(WFI)中的肠胃外溶液，以单剂量小瓶的形式灌装，储存在-20℃以下。在使用之前，ECI-006mRNA在Hartmann缓冲液中复原。

在使用前立即将小瓶在室温下解冻，并使用1-mL注射器将880μl Hartmann溶液加入含有ECI-006的小瓶中进行复原。这导致总体积为1.1mL，体积浓度为80％Hartmann。在Hartmann溶液中复原后，从微生物学的角度来看，应立即使用mRNA。但是，如果复原是在受控和经过验证的无菌条件下进行的(药房的责任)，则使用中的储存时间可能会延长。在15-25℃下长达6小时验证复原药物产品的稳定性。

抗PD1

派姆单抗根据SmPC施用于患者。派姆单抗

以50mg或100mg用于输注浓缩液的粉末的形式提供于小瓶中。复原后，1mL浓缩液含有25mg派姆单抗。

纳武单抗根据SmPC施用于患者。纳武单抗

以40mg、100mg或240mg用于输注浓缩液的粉末的形式提供于小瓶中。复原后，1mL浓缩液含有10mg纳武单抗。

施用方式和剂量

注射液优选在超声引导下注射到患者的腹股沟淋巴结中。第一次注射到在左侧或右侧上的淋巴结中，第二次将交替注射到相反部位即右侧或左侧上的淋巴结。第三次注射将像第一次注射一样在左侧或右侧再次进行，下一次在右侧或左侧进行。最后一次注射将在相反侧上。如果腹股沟淋巴结无法注射，则可以根据治疗医师的判断使用腋窝淋巴结。

对于剂量水平II，将在500μL注射缓冲液中的ECI-006结内注射到淋巴结中，如队列1所述。对于剂量水平III，将在2个不同的淋巴结中注射1000μL，优选在同一侧(每个结中500μL)。

剂量水平II：包含组合900μg TAA的900μg EIA-001(总剂量为1800μg mRNA)

剂量水平III：包含组合1800μg TAA的1800μg EIA-001(总剂量为3600μg mRNA)

患者将分别接受2mg/kg或400mg派姆单抗

作为标准护理(21周的时间段内3周或6周的循环)。

每3周或6周静脉输注派姆单抗一次，每次30分钟。黑色素瘤患者的推荐剂量为2mg/kg(每3周)或400mg(每6周方案)。患者应接受派姆单抗治疗，直至疾病进展或出现不可接受的毒性。派姆单抗的剂量调整应根据接受派姆单抗的患者的当前临床实践进行。

以每2周240mg静脉输注30分钟或每4周480mg静脉输注60分钟的形式施用纳武单抗。

治疗方案

每位患者最多接受9次ECI-006施用：前5次，每次间隔1周。第六次施用是在上一次施用后2周。第七次施用是在上一次施用后3周。第八次和第九次施用是在上一次施用后6周。根据以下时间表将患者随机分配到2个不同的剂量水平：

·在剂量水平II(1800μg)，最初招募了3位患者。入组与每位患者的第一次给药之间至少间隔1天。安全观察期由每位患者首次治疗后6周的时间段组成。药物安全监测委员会(DSMB)将在第三位患者完成安全观察期后召集完成对安全性和耐受性的总体评价。

·如果在安全观察期过程中没有发生不可管理的安全问题(USI)并且DSMB已给出其建议，则3位患者被纳入剂量水平III(3600μg)。和以前一样，这3位患者的入组与每位患者的第一次给药之间至少间隔1天。同样，每位患者的安全观察期由6周组成。DSMB将在三位患者后完成对安全性和耐受性的总体评价。

·如果在安全观察期过程中，随机分配到剂量水平III组的前3位患者没有发生USI并且DSMB已给出建议，则可以在队列2的剂量水平III组中随机分配另外4位患者。

如果剂量水平II或III的前3位患者中的1位在安全观察期内经历USI，则另外3位患者将分别以相同的剂量水平II或III入组，并且评价如下：

·如果在治疗的前6周过程中在剂量水平II或III的另外3位患者中未观察到新的USI(6位患者中总共1个USI)，则分别可以开始进行剂量水平III组的入组或可以开始剂量水平III第7个且最后一个的患者的入组。

·如果在治疗的前6周过程中在3个另外患者中观察到1个或多个USI(6位患者中总共2个或更多个USI)，则不允许剂量递增。然后，该剂量将被视为已超过最大耐受剂量(MTD)，并且资助者可以决定在剂量水平II观察该情况时关闭研究，或在剂量水平III观察该情况时修改研究以在较低的剂量水平下继续进行研究。

ECI-006的第一次(第1天)和最后一次施用(第148天)之间总共最多有148天(21周)。患者总共接受9次ECI-006施用。每位患者每周接受5次ECI-006施用(前5次施用)，然后在第五次施用后2周施用1次ECI-006，在第六次施用后3周施用1次ECI-006，间隔6周2次施用ECI-006，导致治疗持续时间为21周，24周后进行最终活性评估。第一次ECI-006施用优选发生在派姆单抗治疗的同一天和之前。如果在研究的后期适用，可以在派姆单抗的同一天和之前施用ECI-006。

因此，详细治疗时间表如下：

第1天：开始治疗：基线免疫检测取样，安全性实验室测试，第一次施用ECI-006和派姆单抗

第8天(±2天)：第二次施用ECI-006

第15天(±2天)：第三次施用ECI-006

第22天(±2天)：第四次施用ECI-006；施用派姆单抗(除非患者在进行6周一次(6-weekly)的派姆单抗方案)

第29天(±2天)：第五次施用ECI-006；免疫检测取样

第43天(±2天)：第六次施用ECI-006；施用派姆单抗；安全性实验室测试

第64天(±2天)：第七次施用ECI-006；施用派姆单抗(除非患者在进行6周一次的派姆单抗方案)

第71天(±2天)：免疫检测取样，安全性实验室测试，肿瘤活检(任选)

第85天(±2天)：第一次疗效评估；施用派姆单抗

第106天(±5天)：第八次施用ECI-006；施用派姆单抗(除非患者在进行6周一次的派姆单抗方案)

第127天(±5天)：第二次疗效评估；施用派姆单抗；免疫检测取样，安全性实验室测试

第148天(±5天)：第九次施用ECI-006；施用派姆单抗(除非患者在进行6周一次的派姆单抗方案)

第169天(±5天)：第三次疗效评估，肿瘤活检(任选)，安全性实验室测试，免疫检测取样，施用派姆单抗

第176天(±5天)：电话随访(最后一次施用研究药物后4周)

患者群

待使用ECI-006治疗的患者被定义为在接受派姆单抗一线治疗至少6个月后，患有稳定疾病的III期或IV期不可切除的黑色素瘤患者。这些患者不太可能对派姆单抗表现出晚期部分或完全应答，但被保留作为抗PD1治疗的标准，认为抗PD1确实针对进展产生一定程度的抵抗，同时认识到这些患者很可能在不久的将来复发。越来越多的数据表明，接受aPD1治疗的SD黑色素瘤患者的免疫活性和检查点抑制剂水平高于部分应答或完全应答的患者，这突显了使用治疗性疫苗帮助将免疫斗争倾斜到患者优势的潜力(ASCO 2019的海报2515)。

实施例2：临床数据——Ib期

该实施例提供了根据实施例1的细节获得的关于正在治疗的患者的肿瘤评估方案和数据。

根据RECIST 1.1标准，经过6至12个月的免疫治疗后，通过2次连续影像学证明患有稳定疾病的黑色素瘤患者有资格参加该研究。在研究之前，作为护理标准的一部分，并使用机构指南进行影像学检查以确认稳定疾病。除了患有稳定疾病的黑色素瘤患者外，在免疫治疗6至12个月后部分应答的患者，如果研究者认为不太可能进一步应答，则也有资格参加该研究。

在计划的时间点(即筛查门诊和门诊10、12和14)以及怀疑疾病进展时，如果符合患者的最佳利益，研究者会根据需要进行任何其他检查，以记录疑似疾病进展。肿瘤评估由现场放射科工作人员根据机构指南或实践进行。尽管有任何治疗延迟的可能，但在治疗开始前(不超过采用ECI-006治疗前4周)和12周(±2天)、18周(±5天)和24周(±5天)进行影像学检查。

在筛查门诊中，肿瘤评估基于临床、实验室和CT评估(优先)——以及可能的MRI扫描。除胸、腹、骨盆和脑外，还评估所有已知的疾病部位。所有基线评估均尽可能接近治疗开始，不超过治疗前4周。随后的评估包括胸、腹和骨盆以及所有已知的疾病部位，并使用与基线相同的影像学检查方法。

评估放疗和化疗的抗肿瘤活性的金标准是实体瘤临床疗效评价标准(RECIST)。然而，在癌症免疫治疗的开发过程中，很快变得明显的是，RECIST不是最佳的。可以观察到肿瘤尺寸的增加，这是由于肿瘤消退前免疫细胞的浸润(称为“‘燃’瘤”或“假性进展”)。使用RECIST，这将被视为疾病进展，而会漏掉随后的临床应答。因此，在开发免疫相关标准时考虑了“假性进展”。因此，除了根据RECIST 1.1(Eisenhauer et al.2009)进行肿瘤评估外，还将根据iRECIST评估肿瘤。iRECIST的开发是为了代表RECIST工作组为评估对免疫治疗药物的疗效提供标准化(Seymour et al.2017)。

根据RECIST 1.1的疗效评估

评估整体肿瘤负荷和可测量的疾病

为了评估肿瘤对治疗的应答，必须估计基线的总体肿瘤负荷，并将其用作后续测量的比较器。可测量的疾病由存在至少一个可测量的肿瘤病变来定义。当CT扫描的切片厚度大于5mm时，可测量病变的最小尺寸应为切片厚度的两倍。

基线的肿瘤病变/淋巴结分为可测量或不可测量，如下所示。

可测量的病变

可测量的病变必须在至少一个维度(待记录的测量平面中的最大直径)中准确测量，最小尺寸为：

·CT/MRI扫描的10mm——(CT/MRI扫描切片厚度不大于5mm)

·临床检查卡尺测量的10mm(无法用卡尺准确测量的病变应记录为不可测量)

恶性淋巴结：要被认为是病理性肿大和可测量的，当通过CT扫描评估时，淋巴结必须短轴≤15mm(CT扫描切片厚度建议不大于5mm)。在基线和随访中，仅测量和随访短轴。

不可测量的病变

·所有其他病变，包括小病变(最长直径<10mm或10mm≤短轴<15mm的病理性淋巴结)，以及真正无法测量的病变。

·被认为真正无法测量的病变包括：软脑膜病、腹水、胸腔或心包积液、炎症性乳腺疾病、累及皮肤或肺的淋巴管炎、无法通过可再现的影像学技术测量而是通过体检发现的腹部肿块/腹部器官肿大。

按测量方法分类的说明

病变的测量

所有测量值均以mm为单位记录。所有基线评价均尽可能接近治疗开始，并且不超过治疗开始前28天。

评估方法

使用相同的评估方法以及相同的技术来表征基线和随访期间每个鉴定和报告的病变。基于影像学的评价优于临床检查，除非不能对随访的病变进行影像学检查，但可通过临床检查进行评估。

CT/MRI扫描

CT/MRI是测量选择用于应答评估的病变的优选方法。CT/MRI扫描对病变的可测量性基于CT/MRI切片厚度≤5mm的假设。当扫描的切片厚度为5mm时，可测量病变的最小尺寸应为切片厚度的两倍。

胸部X射线检查

胸部CT优于胸部X射线检查，因为CT比X射线检查更敏感，尤其是在鉴定新病变方面。

临床病变

临床病变仅在使用卡尺评估的浅表且直径≥10mm时才被认为是可测量的。对于皮肤病变，建议通过彩色摄影进行记录，包括用尺子估计病变的尺寸。如上所述，当可以通过影像学检查和临床检查评估病变时，应进行影像学检查。

超声

超声不用作测量方法。如果在进行研究期间通过超声发现新的病变，建议通过CT或MRI确认。

‘靶病变’和‘非靶病变’的基线记录

靶病变

当基线存在多个可测量病变时，代表所有累及器官的所有病变最多五个病变(并且每个器官最多两个病变)将被鉴定为靶病变，并将在基线时进行记录和测量。

根据其尺寸(直径最长的病变)选择靶病变，其代表所有累及器官，并应适合可再现的重复测量。

计算所有靶病变的直径总和(SoD，非淋巴结病变的最长直径，淋巴结病变则为短轴)并报告为基线直径总和。如果要将淋巴结包括在总和中，则如下所述，仅将短轴添加到总和中。基线SoD用作参考，以进一步表征疾病可测量维度中的任何客观肿瘤消退。

淋巴结

淋巴结是正常的解剖结构，即使它们不受肿瘤累及，也可能通过影像学检查可见。被定义为可测量且可鉴定为靶病变的病理淋巴结必须符合CT扫描≥15mm短轴的标准。只有这些淋巴结的短轴才能计入基线总和。短轴<10mm的淋巴结被认为是非病理性的，不应记录或随访。

非靶病变

包括病理性淋巴结在内的所有其他病变(或疾病部位)均被鉴定为非靶病变，并在基线处也记录。不需要测量，这些病变应作为“存在”、“不存在”或罕见的病例“明确进展”进行随访。此外，还可以在病例报告表上将涉及同一器官的多个非靶病变记录为单个项目。

根据RECIST 1.1的肿瘤疗效评价

靶病变的评价

完全应答(CR)：所有靶病变消失。任何病理性淋巴结(无论是靶病变还是非靶病变)都必须具有<10mm的短轴。

部分应答(PR)：与基线直径总和相比，靶病变的SoD至少降低了30％。

疾病进展(PD)：靶病变的SoD至少增加20％，以研究中的最小总和为参考(如果这是研究中最小的，则包括基线总和)。除了相对增加20％之外，总和还必须证明绝对增加至少5mm。

注：一个或多个新病变的发生也被认为是进展。

稳定疾病(SD)：在研究中参考最小的直径总和，既没有足够的收缩以符合PR，也没有足够的增加以符合PD。

变得‘太小而无法测量’的靶病变

在基线时记录的所有病变(淋巴结和非淋巴结)在每次后续评价中都记录了其实际测量值，即使当时非常小。如果放射科医生能够提供实际测量结果，即使它低于5mm，也会被记录下来。

治疗后分裂或合并的靶病变

当非淋巴结病变"碎片化"时，将碎片部分的最长直径相加以计算靶病变总和。

当病变合并时，它们之间的平面可能保持不变，这将有助于获得单个病变的最大直径测量值。如果病变确实已经合并，以至于它们不再可分离，则在这种情况下，最长直径的矢量是“合并病变”的最大最长直径。

非靶病变的评价

虽然一些非靶病变实际上可能是可测量的，但它们不需要测量，而只是在方案中指定的时间点进行定性评估。

CR：所有非靶病变消失。所有淋巴结必须是在尺寸上是非病理性的(短轴<10mm)。

非CR/非PD：一个或多个非靶病变持续高于正常限。

PD：现有非靶病变的明确进展。

注：一个或多个新病变的发生也被认为是进展。

非靶向疾病的明确进展

为了在非靶疾病的基础上实现“明确进展”，非靶疾病的总体水平必须有实质性恶化，这样，即使在靶疾病中存在SD或PR的情况下，总体肿瘤负荷也已增加，足以值得停止治疗。

一个或多个非靶病变尺寸的适度“增加”通常不足以符合明确进展状态。

新病变

新的恶性病变的出现表明疾病进展。新病变的发现应该是明确的：即，不能归因于扫描技术的差异、影像学检查模式的变化或被认为代表肿瘤以外的其他事物的发现(例如，一些‘新’骨病变可能只是愈合或先前存在的燃病变)。这一点尤其重要，然后患者的基线病变显示PR或CR。例如，肝病变坏死可能在CT扫描中报告为‘新’囊性病变，但事实并非如此。

在随访中鉴定在基线时未扫描到的解剖位置的病变被视为新病变，并且会表明疾病进展。这方面的一个实例是在基线时患有内脏疾病的患者，并且在研究中进行了CR或MRI脑扫描，显示出转移。患者的脑转移被认为是PD的证据，即使他/她在基线时没有脑部影像学检查。

如果新病变模棱两可，例如，由于其尺寸小，继续治疗和随访评估将阐明其是否确实代表新疾病。如果重复扫描确认肯定有新病变，则应使用初始扫描的日期声明进展。

疗效标准(RECIST 1.1)

对于在基线时患有可测量疾病的患者，表1提供了每个时间点的总体应答计算的摘要。

表1时间点应答——患有靶(±非靶)疾病的患者

靶病变	非靶病变	新病变	总体应答
				CR	CR	否	CR
CR	非CR/非PD	否	PR
				CR	未评价	否	PR
PR	非PD或未全部评价	否	PR
				SD	非PD或未全部评价	否	SD
未全部评价	非PD	否	没有可评价的
				PD	任何	是或否	PD
任何	PD	是或否	PD
				任何	任何	是	PD

扫描确认

验证应答：不需要确认应答，因为根据RECIST 1.1它不会增加对研究结果的解释的价值。

验证进展：在首次评估PD后4至8周进展模棱两可的情况下，可验证疾病进展。如果重复扫描确认PD，则使用初始扫描的日期声明进展。如果重复扫描不能确认PD，则根据RECIST 1.1，患者被认为没有PD。

最佳总体应答

一旦知道了患者的所有数据，就确定了最佳总体应答。它被定义为由研究者确定的最佳应答标志数据(designation)，记录在治疗开始数据和根据RECIST 1.1的客观记录的进展日期或后续治疗的日期之间，以先发生者为准。对于没有进展记录或后续治疗的患者，所有可用的应答标志数据都有助于BOR评估。患者的BOR评估将取决于靶疾病和非靶疾病的发现，并且还将考虑新病变的出现。

根据iRECIST的疗效评估

iRECIST基于经典RECIST的改良，以最佳地评估免疫治疗的抗肿瘤活性。非靶病变和靶病变的选择和测量与RECIST 1.1相同。然而，新病变的评估和管理是不同的。

iRECIST相对于RECIST的变化

新病变的管理

在RECIST 1.1中，仅记录新病变而不进行测量。新病变的出现总是意味着患者具有疾病进展(PD)。在iRECIST中，测量并随访新病变，因为总体应答取决于新病变的演变，而不仅仅是新病变是否出现。

在此，使用RECIST 1.1原则评估新病变：

·新病变分为可测量或不可测量。

·选择靶新病变(每2个部位最多5个)。测量靶新病变。新病变的直径不包括在基线时鉴定的靶病变的测量值总和中，而是记录为靶新病变的直径总和。

·其他新病变(可测量/不可测量)记录为非靶新病变，并报告为每个评估时间点不存在、存在、增加、明确增加。

·新病变不必因随后的稳定疾病或部分应答而消退，前提是下一次评估未确认进展

疗效评价

iRECIST疗效术语

用前缀“i”与RECIST 1.1类比的疗效：

对于靶病变：

·iCR/iPR：免疫完全/部分应答

·iSD：免疫稳定疾病

·iUPD/iCPD：免疫未确认/确认疾病进展(参见下文)

对于非靶病变

iCR：免疫完全应答

非iCR/非iPD：一个或多个非靶病变持续高于正常限。

iPD：免疫疾病进展

时间点应答

在RECIST 1.1中，一旦患者被评估为PD，他总是保持具有PD。然而，如上所述，使用免疫治疗，假性进展是可能的，随后是部分或完全应答。RECIST 1.1漏掉了这种应答。因此，在第一个时间点，根据RECIST 1.1患者被评价为PD，而对于iRECIST来说，这是“未经证实的”——称为iUPD(免疫未确认疾病进展)。

然后，iUPD必须在下一次肿瘤评估时(iUPD评估时间点后4至8周)得到确认。

如果确认，患者具有iCPD(免疫确认疾病进展)。

如果未得到确认，患者可以保持iUPD或演变为稳定疾病或部分或完全应答。

这意味着时间点应答是动态的，并且基于从iCR、iPR、iSD)的基线的变化或从PD的最低点的变化。

表2：疗效标准iRECIST

结果

该研究已招募了第一位患者。患者年龄76岁，被诊断为IV期肺、腺和腹转移性恶性黑色素瘤。患者于2019年3月开始接受基于伊匹单抗和纳武单抗的联合免疫治疗，随后使用纳武单抗单药治疗(每2周240mg)维持治疗。从2019年12月直到2020年5月，患者参加了实施例1中定义的剂量水平II(9次施用，每次1800μg)的当前研究。

对患者的放射学重新评估确认了稳定疾病，此外，如表3所示，靶病变减少了8.6％：

表3：各个门诊时靶病变的尺寸

此外，患者已经发表了几份声明，确认治疗对患者的生活质量有积极影响，例如‘我从未感觉这么好’，‘我感觉很棒’。最后，患者感觉非常重要，因为以下事实得到确认：患者可以步行长达40公里，并且可以与汽车一起长途行驶(>1000公里)而不会感到疲倦。

因此，这些结果确认，本发明的组合是治疗患有作为一线检查点抑制剂治疗后的最佳客观应答的定疾病的转移性癌症患者的宝贵工具。

参考文献

Bonehill A et al.,2008.Enhancing the T-cell stimulatory capacity ofhuman dendritic cells by co-electroporation with CD40L,CD70 andconstitutively active TLR4 encoding mRNA.Mol Ther.2008Jun；16(6):1170-80.

Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,Schwartz LH,Sargent D,Ford R,etal.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(version 1.1).Eur J Cancer.2009Jan；45(2):228-47.

Schwartz LH et al.,2016.RECIST 1.1–Update and Clarification:From theRECIST Committee.Eur.J.Cancer.2016Jul；62:132-37.

Seymour L,Bogaerts J,Perrone A,Ford R,Schwartz LH,Mandrekar S,Lin NU,Litière S,Dancey J,Chen A,Hodi FS,Therasse P,Hoekstra OS,Shankar LK,WolchokJD,Ballinger M,Caramella C,de Vries EG；RECIST working group.iRECIST:guidelines for response criteria for use in trials testingimmunotherapeutics.2017Mar；18(3):e143-e152

Van Lint S,Goyvaerts C,Maenhout S,Goethals L,Disy A,Benteyn D,etal.Preclinical evaluation of TriMix and antigen mRNA-based antitumortherapy.Cancer Res.2012Apr 1；72(7):1661-71.

Van Lint S,Renmans D,Broos K,Dewitte H,Lentacker I,Heirman C,etal.The ReNAissanCe of mRNA-based cancer therapy.Expert Rev Vaccines.2015Feb；14(2):235-51.

Claims

1.一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的一种或多种mRNA分子；和

-编码肿瘤相关抗原的一种或多种mRNA分子；

2.根据权利要求1所定义的用途使用的组合，其与检查点抑制剂治疗联合使用。

3.根据权利要求1至2中任一项所定义的用途使用的组合，其中所述肿瘤相关抗原是黑色素瘤抗原，优选选自包括以下的列表：酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、黑色素瘤相关抗原A3(MAGE A3)、黑色素瘤相关抗原C2(MAGE C2)、在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME)和纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)。

4.根据权利要求1至3中任一项所定义的用途使用的组合，其用于治疗患有在至少6个月的一线检查点抑制剂治疗之后作为最佳客观应答的稳定疾病的转移性癌症患者。

5.根据权利要求1至4中任一项所定义的用途使用的组合，其中所述检查点抑制剂治疗选自抗PD-1治疗和抗CTLA4治疗；优选抗PD-1治疗。

6.根据权利要求5所定义的用途使用的组合，其中所述抗PD-1治疗是针对PD-1的拮抗性抗体，例如选自包括以下的列表：纳武单抗(BMS-936558/MDX1106)、匹地利珠单抗(CT-011)和派姆单抗(MK-3475)；优选派姆单抗(MK-3475)。

7.根据权利要求1至6中任一项所定义的用途使用的组合，其中所述一种或多种mRNA分子被配制用于肠胃外施用；更具体地用于静脉内、肿瘤内、皮内、皮下、腹膜内、肌肉内或结内施用；优选结内施用。

8.一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子；和

所述组合与派姆单抗联合使用；

9.一种组合，其包含：

-编码CD40L、caTLR4和CD70的mRNA分子；和

所述组合与派姆单抗联合使用；

10.根据权利要求1至9中任一项所定义的用途使用的组合，其中根据以下施用方案施用所述组合：

-施用1-5：每次间隔约1周；

-施用6：施用5之后约2周；

-施用7：施用6之后约3周；

-施用8：施用7之后约6周；

-施用9：施用8之后约6周。

11.根据权利要求2至9中任一项所定义的用途使用的组合，其中根据以下施用方案施用所述组合：

-施用1-5：每次间隔约1周；

-施用6：施用5之后约2周；

-施用7：施用6之后约3周；

-施用8：施用7之后约6周；

-施用9：施用8之后约6周；

12.根据权利要求11所定义的用途使用的组合，其中在施用7和8之间以及施用8和9之间另外施用所述检查点抑制剂治疗。

13.根据权利要求1至12中任一项所定义的用途使用的组合，其中所述组合包含：

-约300μg编码CD40L的mRNA；

-约300μg编码caTLR4的mRNA；

-约300μg编码CD70的mRNA；

-约900μg编码一种或多种肿瘤相关抗原的mRNA。

14.根据权利要求1至12中任一项所定义的用途使用的组合，其中所述组合包含：

-约600μg编码CD40L的mRNA；

-约600μg编码caTLR4的mRNA；

-约600μg编码CD70的mRNA；

-约1800μg编码一种或多种肿瘤相关抗原的mRNA。