CN114324296A - 一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法，包括：收集分生孢子、拉曼光谱测量、数据处理、聚类分析和鉴别五个步骤，操作简便，所需的时间少，在测量时激发波长产生的基底信号更小，背景信号干扰小，对于白粉菌等难以培养的专性寄生菌来说具有极大的优势，在单孢子水平上实现白粉菌的快速鉴别，而且本发明鉴定方法对样品的需求量极小，不怕样品污染的存在和其他信号的干扰，为农作物白粉菌病害的防控提供了有力的支持。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法。
背景技术
随着微生物学和分子生物学的快速发展，植物病原真菌鉴定领域取得了巨大进展，主要包括传统诊断和分子鉴定方法的快速发展。植物病原菌(真菌)鉴定通常基于感病症状以及病原的形态学如菌核或菌丝体、孢子形态和产孢结构，过程较为复杂，且需要深厚的微生物或病原学基础知识。为提高微生物或者病原菌鉴定效率，研究者们已经报道了利用分子特征以及脂肪酸等鉴定病原菌，但这些方法均受到提取方法以及条件等限制，人们仍然力图开发更加高效的微生物或者病原菌鉴定手段。
拉曼技术作为指纹图谱具有其独特的优势，蕴含着被测物独特的拉曼散射信号。基于微生物或病原菌的生化特征，每一种病原菌均可能具有特有的拉曼光谱特征。拉曼光谱是一种基于非弹性散射的技术，其优点众多。首先，拉曼光谱对样品数量的要求极小，可以低至毫克或微克的数量级。其次，拉曼效应存在的范围广泛，气态、液态和固态的分子都可以被检测。除了这些特点以外，拉曼散射最突出的优点来源于其使用的探针分子为光子，光子对于待测样品是无损的，这种无损伤的检测格外适用于稀有珍贵的检测对象和活体的生物样本。
目前，已有应用拉曼技术区分微生物的研究报道，例如，在种、变种与亚种水平上区分不同的细菌；利用光镊和拉曼光谱区分水溶液中单个细菌细胞和物种；通过基于SERS的微流控芯片实现9个不同的大肠杆菌在菌株上的区分；利用SERS作为探测细菌生化成分的工具等。现有大多数有关拉曼技术主要针对医学领域与模式细菌微生物的探索，以真菌为样本的研究报道相对较少。
与细菌相比，真菌孢子在微观层面上相比于细菌细胞更大，真菌孢子具有更复杂的结构，例如具有细胞壁，细胞核以及其他细胞器，这些细胞结构的组成成分均会对拉曼散射产生一定的影响，复杂的细胞结构导致了更多的拉曼散射信号，这就对利用拉曼聚焦真菌及其信号收集提出了更高的要求。因此，真菌的拉曼研究，无论在样品制备、信号采集，还是峰值分析方面，均不能照搬细菌拉曼研究方法。
在运用拉曼光谱针对真菌的研究上，有报道拉曼技术对人类致病真菌犬小孢子菌、癣菌等进行种水平上区分，还有报道拉曼技术用于食品方面曲霉等微生物的鉴定，在植物病原真菌领域，已有报道利用拉曼技术对担子菌以及造成苹果腐烂的青霉、曲霉以及链格孢等真菌进行成分分析或种类鉴定，验证了SERS有潜力成为一种廉价、快速的检测和鉴定真菌种类的方法。但植物病原真菌包含着专性寄生真菌和非专性寄生真菌两大类，因为专性寄生真菌在合成培养基上无法培养，对其鉴定面临着种水平上致病症状以及分生孢子极其相似、无法纯分离培养、样本难以富集以及形态相似难以区分等难题，所以现有研究都集中在拉曼技术在非专性寄生真菌中的应用，目前尚未见拉曼技术应用于专性寄生真菌的研究报道。
我们的研究对象白粉菌(专性寄生)是重要的植物病原真菌，依靠气传侵染农作物，每年使作物减产从而带来的经济损失重大，对其快速准确的鉴别可以为农作物灾害防控提供有力的支持。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法，包括以下步骤：
S1.植物病原真菌分生孢子的收集；
S2.分生孢子拉曼光谱测量：将步骤S1收集到的样品进行拉曼光谱测量，收集每个分生孢子的拉曼光谱；
S3.数据处理：校正和标准化步骤S2收集到的拉曼光谱原始信息，得平均拉曼光谱曲线；计算所有范围的每个波数对应拉曼强度的标准偏差，并在平均光谱曲线上以阴影区域表示，得到平均拉曼光谱图；
S4.聚类分析：基于步骤S3校正和标准化后的信息进行聚类分析；
S5.鉴别：观察步骤S3的拉曼光谱图中是否存在白粉菌的特征峰，然后根据步骤S4的聚类分析结果判断种属。
优选的，所述分生孢子的收集方法，包括：孢子的培养方法和/或采集方法，例如孢子可以从空气中捕捉然后进行产孢培养，从发病部位采集等；在我们的发明中，白粉菌的分生孢子来自于橡胶叶片，PAD4突变型拟南芥和豇豆叶片表面。
优选的，所述拉曼光谱测量的激发光源为514nm，激光功率为5mW，光斑直径为1μm，收集时间为10s，光谱测量范围为600cm-1～2000cm-1，分辨率为1cm-1。
优选的，步骤S3中，校正和标准化包括减去单晶硅背景、平滑曲线、基线校正(5degree，Polymon)和刻度归一化。
优选的，所述聚类分析为主成分分析(PCA)。
优选的，所述PCA由Origin 2021b(Education Version,OriginLab,Northampton,Massachusetts，USA)完成。
优选的，步骤S5中，白粉菌的特征峰为1005cm-1，1156cm-1，1518cm-1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的鉴别方法在单孢子水平上实现白粉菌的鉴别，对样品的需求量极小，不怕样品污染的存在和其他信号的干扰，弥补了针对病原真菌分生孢子的传统鉴别和分子手段上的不足。
2.与传统的形态学鉴定和分子生物学鉴定流程相比，我们的方法更简便，所需的时间更少，对于白粉菌等难以培养的专性寄生菌来说具有极大的优势，能够快速鉴别白粉菌，为农作物白粉菌病害的防控提供有力的支持，还可为更大范围内的白粉菌种群以及其他专性寄生菌如霜霉菌、锈菌、黑粉菌等的鉴别手段提供研究基础，为植物病害防控提供先决依据。
3.该方法实现了白粉病等专性寄生病原真菌分生孢子在种水平上的鉴别，在实际生产上，可以在采样后快速鉴别空气中、上、土壤中的分生孢子，判断其种水平的归属。
4.与现有的拉曼光谱技术鉴别技术相比，使用的激发波长产生的基底信号更小，背景信号的干扰小，本发明的方法还结合了数据降维分析方法，如主成分分析(PCA)将鉴别结果可视化，更加直观和准确。
附图说明
图1为本发明白粉菌分生孢子快速鉴别方法的流程图；
图2中(A)部分为本发明E.quercicola,P.microspora,C.siamense,F.graminearum的分子孢子平均拉曼光谱；(B)部分为PCA得分图；
图3中(A)部分为本发明E.quercicola,P.hibiscicola,E.cichoracearum的分生孢子平均拉曼光谱；(B)部分为PCA得分图；
图4为本发明实施例2中三种白粉菌的显微观察图；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本发明做进一步的说明。
本发明实施例的拉曼光谱测量是使用配备有50mW激光器作为发射514nm线的激发光源的共聚焦显微拉曼光谱(inVia Reflex of Renishaw,England)进行的，仪器品牌与型号不局限于特定品牌和型号；
实施例1 不同属的植物病原真菌分生孢子的鉴别
S1.植物病原真菌分生孢子的收集：收集Fusarium graminearum，Pestalotiopsismicrospora，Erysiphe quercicola以及Colletotrichum siamense的分生孢子；
S2.分生孢子拉曼光谱测量：测量前使用单晶硅片位于520cm-1处的峰值校准仪器，再将步骤S1收集到的样品进行拉曼光谱测量，拉曼光谱测量的激发光源为514nm，激光功率为5mW，光斑直径为1μm，收集时间为10s，光谱测量范围为600cm-1～2000cm-1，分辨率为1cm-1，用50倍放大物镜收集每个分生孢子的拉曼光谱；每种分生孢子的测量均包含三个生物学重复，每个生物学重复包含随机视野中10个分子孢子的拉曼光谱作为技术重复；
S3.数据处理：使用LabSpec 5(HORIBA Scientific,Orsay,France)校正和标准化步骤S2收集到的拉曼光谱原始信息，得到平均拉曼光谱曲线；然后用EXCEL(Microsoft,USA)计算所有范围的每个波数对应拉曼强度的标准偏差，并在平均光谱曲线上以阴影区域表示，得到平均拉曼光谱图；
其中，校正和标准化，包括减去单晶硅背景、平滑曲线、基线校正和刻度归一化；
S4.聚类分析：基于步骤S3校正和标准化后的信息，使用Origin 2021b(EducationVersion,OriginLab,Northampton,Massachusetts，USA)进行PCA聚类分析；
S5.鉴别：观察步骤S3的拉曼光谱图中是否存在白粉菌的特征峰，然后根据步骤S4的聚类分析结果判断种属。
如图2所示，按本发明的鉴别方法，实现了Fusarium graminearum,Pestalotiopsis microspora,Erysiphe quercicola以及Colletotrichum siamense的分生孢子在属水平上的区分，图中B部分的阴影区域表示每个波数对应的标准偏差。
从图中A部分可以看出，四种菌的分生孢子都在1005cm-1,1156cm-1,1518cm-1处具有拉曼峰，依靠这三个主要的峰值和一些小峰，他们的样本在PCA得分图中被明显地分别聚类到了四个簇，显示出了良好的聚类分析效果。
实施例2 白粉菌分生孢子种水平上的鉴别
S1.植物病原真菌分生孢子的收集：选择患有白粉病的植物，分别收集发病的橡胶叶片、PAD4突变型拟南芥和豇豆叶片表面病原菌的分生孢子；
S2.分生孢子拉曼光谱测量：测量前使用单晶硅片位于520cm-1处的峰值校准仪器，再将步骤S1收集到的样品进行拉曼光谱测量，拉曼光谱测量的激发光源为514nm，激光功率为5mW，光斑直径为1μm，收集时间为10s，光谱测量范围为600cm-1～2000cm-1，分辨率为1cm-1，用50倍放大物镜收集每个分生孢子的拉曼光谱；每种分生孢子的测量均包含三个生物学重复，每个生物学重复包含随机视野中10个分子孢子的拉曼光谱作为技术重复；
S3.数据处理：使用LabSpec 5(HORIBA Scientific,Orsay,France)校正和标准化步骤S2收集到的拉曼光谱原始信息，得到平均拉曼光谱曲线；然后用EXCEL(Microsoft,USA)计算所有范围的每个波数对应拉曼强度的标准偏差，并在平均光谱曲线上以阴影区域表示，得到平均拉曼光谱图；
其中，校正和标准化，包括减去单晶硅背景、平滑曲线、基线校正和刻度归一化；
S4.聚类分析：基于步骤S3校正和标准化后的信息，使用Origin 2021b(EducationVersion,OriginLab,Northampton,Massachusetts，USA)进行PCA聚类分析；
S5.鉴别：观察步骤S3的拉曼光谱图中是否存在白粉菌的特征峰，然后根据步骤S4的聚类分析结果判断种属。
如图3所示，橡胶叶片、PAD4突变型拟南芥和豇豆叶片表面病原菌的分生孢子的病原菌种类分别为Erysiphe quercicola,Podosphaera hibiscicola，Erysiphecichoracearum，三种白粉菌分生孢子的平均光谱的主要区别不仅仅是三个主要峰值的强度不同，在光谱趋势、峰值之间的比例和一些小峰强度上也有很大的不同，这些不同促成了他们在主成分分析中聚类成了三个簇，即使它们的95％置信区间有一定重叠，但并未影响整体区分度，说明本发明的鉴别方法，可以实现Erysiphe quercicola,Podosphaerahibiscicola，Erysiphe cichoracearum的分生孢子在种水平上的鉴别。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.植物病原真菌分生孢子的收集；
S2.分生孢子拉曼光谱测量：将步骤S1收集到的样品进行拉曼光谱测量，收集每个分生孢子的拉曼光谱；
S3.数据处理：校正和标准化步骤S2收集到的拉曼光谱原始信息，得平均拉曼光谱曲线；计算所有范围的每个波数对应拉曼强度的标准偏差，并在平均光谱曲线上以阴影区域表示，得到平均拉曼光谱图；
S4.聚类分析：基于步骤S3校正和标准化后的信息进行聚类分析；
S5.鉴别：观察步骤S3的拉曼光谱图中是否存在白粉菌的特征峰，然后根据步骤S4的聚类分析结果判断种属。
2.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于，所述分生孢子的收集方法，包括：孢子的培养方法和/或采集方法。
3.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于，所述拉曼光谱测量的激发光源为514nm，激光功率为5mW，光斑直径为1μm，收集时间为10s，光谱测量范围为600cm-1～2000cm-1，分辨率为1cm-1。
4.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于，步骤S3中，校正和标准化包括减去单晶硅背景、平滑曲线、基线校正和刻度归一化。
5.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于，所述聚类分析为主成分分析。
6.根据权利要求1所述的白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于，步骤S5中，白粉菌的特征峰为1005cm-1，1156cm-1，1518cm-1。
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