CN114306323B - 一种化合物作为靶向磷酸甘油酸激酶pgk1的激活剂的应用 - Google Patents
一种化合物作为靶向磷酸甘油酸激酶pgk1的激活剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物的研发技术领域，尤其涉及一种化合物作为靶向磷酸甘油酸激酶PGK1的激活剂的应用，所述化合物具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构；其中，R1选自经取代的或未经取代的C2～C30烯基、C1～C30烷氧基或羟基；R2选自C1～C30烷氧基或羟基；R4选自C1～C30烷基或取代的C6～C30苯基；同时限定了R3。本发明对具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物进行生物实验验证，通过PQ毒素诱导的果蝇模型发现所述化合物具有抗氧化应激作用；通过酶活实验发现化合物在一定范围内能激活PGK1；通过细胞缺氧缺血模型发现化合物具有神经保护作用；通过流式及westernblot实验发现化合物具有抑制细胞凋亡的作用。
Description
技术领域
本发明涉及药物的研发技术领域，尤其涉及一种化合物作为靶向磷酸甘油酸激酶PGK1的激活剂的应用。
背景技术
脑卒中(Cerebral Stroke)又称中风，是因脑部血管堵塞或破裂导致脑组织缺血缺氧，进而造成脑组织损伤的一组疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点(Stroke and stroke care in China:huge burden,significant workload,and anational priority.Stroke 2011,42,3651-3654.)。缺血性脑卒中最常见的发病原因是脑部供血血管内壁上有血栓，脱落后导致动脉栓塞，引起急性神经细胞死亡和迟发型神经细胞死亡，后者主要是一种程序性细胞死亡，即细胞凋亡(Delayed neuronal death in theCA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transientischemia is apoptosis.J Neurosci 15,1001-1011.)，是脑组织缺血缺氧性损伤后的主要病理改变(Programmed cell death in cerebral ischemia.J Cereb Blood FlowMetab 21,99-109)。脑卒中治疗研究者认为“血管再通+神经保护”治疗模式是最佳的治疗策略(脑卒中治疗靶点和药物研究.中国药理学与毒理学杂志，2016,30(12):1264-1272.)，但临床上并没有理想的神经保护药物可用。因此，迫切需要开发新颖、具有神经保护作用的抗细胞凋亡药物，用于脑卒中的临床治疗(Neuroprotective strategies targetingapoptotic and necrotic cell death or stroke.Apoptosis,2009,14(4):469–477.)。
ɑ1肾上腺素受体拮抗剂特拉唑嗪(Terazosin，TZ)通过促进PGK1释放ATP，进而激活分子伴侣Hsp90的活性，提高抗逆性，保护应激细胞，抑制细胞凋亡，缓解大鼠脑卒中症状(Terazosin activates Pgk1and Hsp90 to promote stressresistance.Nature ChemBio,2015,11(1):19-25.)。TZ临床上作为降血压药物使用，在起到抑制细胞凋亡作用的同时，不可避免的会带来血压降低的副作用。因此，TZ对于PGK1的激活作用存在一定的缺陷。所以寻找新的靶向PGK1抗细胞凋亡抑制剂，对脑卒中治疗有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种化合物作为靶向磷酸甘油酸激酶PGK1的激活剂的应用。
本发明提供了一种化合物作为靶向磷酸甘油酸激酶PGK1的激活剂的应用，所述化合物具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构；
其中，R1选自经取代的或未经取代的C2～C30烯基、C1～C30烷氧基或羟基；
R2选自C1～C30烷氧基或羟基；
R3选自
R4选自C1～C30烷基或取代的C6～C30苯基。
在本发明的某些实施例中，所述R1选自经取代的或未经取代的C2～C10烯基、C1～C10烷氧基或羟基。
在本发明的某些实施例中，R1选自
-OH或-OCH3。
在本发明的某些实施例中，R2选自C1～C10烷氧基或羟基。
在本发明的某些实施例中，R2选自-OH或-OCH3。
在本发明的某些实施例中，R4选自C1～C10烷基或取代的C6～C10苯基；所述取代的取代基为C1～C10烷基。
在本发明的某些实施例中，R4选自甲基、丙基或苯甲基。
在本发明的某些实施例中，所述式Ⅰ所示化合物具有式Ⅰ-1所示的结构；
其中，R1和R2的限定同上，在此不再赘述。
R5选自C1～C30烷基或取代的C6～C30苯基。
在本发明的某些实施例中，R5选自C1～C10烷基或取代的C6～C10苯基；所述取代的取代基为C1～C10烷基。
在本发明的某些实施例中，R5选自甲基、丙基或苯甲基。
在本发明的某些实施例中，所述式Ⅰ所示化合物选自以下结构；
在本发明的某些实施例中，所述式Ⅱ所示化合物选自以下结构；
本发明对上文所述的具有式Ⅰ所示结构的化合物和式Ⅱ所示结构的化合物的来源并无特殊的限制，可以自制，也可以为一般市售。
本发明还提供了一种上文所述的具有式Ⅰ所示结构的化合物或具有式Ⅱ所示结构的化合物的互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体和可药用盐中的至少一种作为靶向磷酸甘油酸激酶PGK1的激活剂的应用。
本发明还提供了一种上文所述的具有式Ⅰ所示结构的化合物或具有式Ⅱ所示结构的化合物、其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体和可药用盐中的至少一种在抑制细胞凋亡中的应用。
本发明还提供了一种上文所述的具有式Ⅰ所示结构的化合物或具有式Ⅱ所示结构的化合物、其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体和可药用盐中的至少一种在制备预防或治疗脑卒中神经保护药物中的应用。
在本发明的某些实施例中，所述脑卒中为缺血性脑卒中。
在本发明的某些实施例中，所述预防或治疗脑卒中神经保护药物包括上文所述的具有式Ⅰ所示结构的化合物或具有式Ⅱ所示结构的化合物、其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体和可药用盐中的至少一种，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明对具有式Ⅰ所示结构的化合物或具有式Ⅱ所示结构的化合物进行生物实验验证，通过PQ毒素诱导的果蝇模型发现所述化合物具有抗氧化应激作用；通过酶活实验发现化合物在一定范围内能激活PGK1；通过细胞缺氧缺血模型发现化合物具有神经保护作用；通过流式及western blot实验发现化合物具有抗炎，抑制细胞凋亡的作用，有希望成为潜在的细胞凋亡抑制剂，为缺血性脑卒中的治疗提供了新的选择。
附图说明
图1为本发明实施例1中的两种化合物对PQ诱导的果蝇氧化应激模型的作用；
图2为不同浓度的化合物在一定范围内对PGK1激活作用；
图3为不同浓度的化合物对缺血缺氧后PC12细胞活性的影响；
图4为本发明的化合物对缺血缺氧后PC12细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中采用的原料及试剂均为一般市售。
其中，果蝇w1118来自于兰州大学，生长状态良好。
人源PGK1的cDNA来自于上海生工生物工程股份有限公司。
含有His标签的pET28a(+)载体来自北京索莱宝科技有限公司。
BL21(DE3)化学感受态细胞来自于上海翌圣生物科技公司。
大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)来自于武汉普诺赛生命科技有限公司。
RAW264.7细胞来自于中国科学院。
实施例1
PQ(百草枯)诱导的果蝇氧化应激模型效果
果蝇w1118饲养在生化培养箱中，温度设定为25℃，在含有20g玉米粉、5.875g酵母、1.625g琼脂、34.375g蔗糖、0.5g苯甲酸钠、3.1mL丙酸和1L水的混合物上饲养。每组果蝇20只。
选取具有式Ⅰ所示结构中的一种化合物，具有式Ⅰ-1所示的结构；
分别设置对照组和实验组。对照组：用蔗糖溶液配置好的质量浓度为0.002％的化合物Ⅰ-1溶液处理果蝇48h；对照组的目的是证明该小分子化合物在此浓度下对果蝇正常存活无影响。实验组：先用蔗糖溶液配置好的质量浓度为0.002％的化合物Ⅰ-1溶液处理果蝇24h，再用6mg/mL百草枯处理，监测各组果蝇的存活情况。
图1为本发明实施例1中的化合物对PQ诱导的果蝇氧化应激模型的作用，其中化合物Ⅰ-1对应于图1中的AK。从图1中可知，上述化合物在质量浓度为0.002％时对果蝇的正常生长无影响；加入6mg/mL百草枯处理后果蝇致死率达到50％，而加入质量浓度0.002％的化合物后果蝇的存活率明显提高，说明这种化合物具有抗氧化作用，且在PQ诱导的氧化模型中效果显著。
实施例2
对PGK1激活作用的效果
为了诱导PGK1在体外的表达，将人源PGK1的cDNA克隆到含有His标签的pET28a(+)载体。用0.5mM IPTG诱导蛋白质的表达。5mM IPTG诱导BL21(DE3)化学感受态细胞中的蛋白质表达。在提取缓冲液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，5mM咪唑，5％的甘油，蛋白酶抑制剂混合物(100倍浓缩DMSO溶液)，pH7.9)中裂解细胞后，上清液用镍珠(AdarBiotech)纯化。洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，80mM咪唑，5％的甘油，蛋白酶抑制剂混合物(100倍浓缩DMSO溶液)，pH7.9)被用来洗脱His标记的PGK1。为了测量PGK1活性，将饱和量的底物(1.6mMGAP，1mM(βNAD，1mM ADP，20ng/μL GAPDH)与纯化的重组小鼠PGK1 His蛋白(2μg/mL)混合，并在缓冲液(20mM Tris，100mM NaCl，0.1mM MgSO4，10mM Na2HPO4，2mM DTT，pH 8.6)中加入实施例1中的化合物(1μM～1nM)进行反应，在339nm的吸光度波长下检测。
图2为不同浓度的化合物在一定范围内对PGK1激活作用。从图2中可知，在一定范围内，化合物Ⅰ-1(10μM～1nM)对PGK1具有激活作用。
实施例3
对神经细胞缺血缺氧损伤的保护效果
将大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)接种于96孔板，培养至贴壁，然后分为对照组和OGD/R组。对照组用Dulbecco's modified Eagle'smedium(DMEM,HyClone)在体积浓度95％O2、5％CO2的培养箱中培养。OGD/R组加入化合物Ⅰ-1(12.5～1.5625μM)，在体积浓度95％O2、5％CO2的培养箱中培养24h。然后换成含有药物的无糖培养基(北京阳光生物技术有限公司)，其中含有除葡萄糖以外的所有标准成分，在37℃的三气培养箱(体积浓度94％N2、5％CO2和1％O2)中培养12h。用含有葡萄糖的DMEM培养基代替，并在37℃的体积浓度95％O2、5％CO2的培养箱中培养24h进行复氧。
图3为化合物对缺血缺氧后PC12细胞活性的影响，其中AK-693/21087020对应于化合物Ⅰ-1。从图3中可知，化合物Ⅰ-1在1.5625～25μM浓度下对PC12细胞的正常生长无影响；经过OGD12h/R24h处理，PC12细胞存活率仅为50％左右，而加入化合物Ⅰ-1(1.5625～25μM)后PC12细胞的存活率明显提高，说明随着化合物Ⅰ-1浓度增大(1.5625～25μM)，缺血缺氧损伤后PC12细胞活力有明显改善。
实施例4
抑制细胞凋亡的效果
PC12细胞以每孔4×105个的密度一式三份的接种于6孔板中培养至贴壁，分别加入实施例1的化合物1.5625μM孵育24h。经过OGD 12h/R24h处理后收集细胞，并用PBS洗涤细胞，用1×Binding Buffer悬浮细胞，离心，弃上清，用1×Binding Buffer重悬细胞，每管加入100μL细胞(1×105个)，加入5μL Annexin V-FITC，室温，避光混匀10min，加入5μL PI避光孵育5min，加入PBS至500μL，1h后用流式细胞仪检测。
图4为化合物对缺血缺氧后PC12细胞凋亡的影响，其中化合物Ⅰ-1对应于图4中的AK。从图4中可知，加入化合物3.125μM之后，对于PC12细胞，凋亡细胞逐渐减少，说明化合物Ⅰ-1可以抑制缺血缺氧损伤后PC12细胞凋亡。
因此，本发明的化合物适用于缺血性脑卒中，能够保护缺血缺氧损伤后的神经细胞，抑制细胞凋亡。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (1)
1.一种化合物在制备预防或治疗缺血性脑卒中神经保护药物中的应用；
所述化合物具有式Ⅰ-1所示的结构；
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