CN114304062B

CN114304062B - 一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN114304062B
Application number: CN202111160155.8A
Authority: CN
Inventors: 曾惠阳; 刘谦; 周健; 武珅; 王宁利
Original assignee: BEIJING INSTITUTE OF OPHTHALMOLOGY
Current assignee: BEIJING INSTITUTE OF OPHTHALMOLOGY
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2041-09-30
Also published as: CN114304062A

Abstract

本发明的涉及一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将重组小鼠Recoverin蛋白，按1‑3mg/ml的量加入到等体积含有4mg热灭活结核分支杆菌H37Ra的不完全氟式佐剂中，在0‑4℃下用匀浆机在8000‑10000rpm/min速度下混匀1‑2h，再反复抽吸到5ml注射器中，直至混匀成乳液状且乳液不分散；(2)取8只7‑9周C57BL/6雄性或雌性小鼠，随机均分为两组：实验组：在小鼠上方背部皮下，按含有重组recoverin蛋白200‑300μg/只小鼠的量注射步骤(1)制备得到的乳液，免疫第0天及第2天在小鼠腹腔，按200ng/只小鼠的量注射百日咳(PTX)；对照组：不注射含有重组recoverin蛋白及热灭活结核分支杆菌H37Ra的不完全氟式佐剂乳液；(3)观察第3‑8周的实验组和对照组的小鼠，用于验证小胶质细胞活化介导自身免疫性视网膜病变的机制。

Description

一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

自身免疫性视网膜病变(autoimmune retinopathy，AIR)是一类由免疫炎症介导的可致盲性眼病，患者表现为双眼无痛性亚急性视力丢失，ERG异常，血清中存在循环抗视网膜抗体(anti-retinal antibodies,ARAs)。该疾病分为副肿瘤(non-paraneoplastic,p-AIR)及非副肿瘤性AIR(non-paraneoplastic,np-AIR)。p-AIR包括癌症相关性视网膜病变(cancer-associated retinopathy，CAR)、黑色素瘤相关性视网膜病变melanoma-associated retinopathy，MAR)。某些良性肿瘤也会引起CAR样改变。np-AIR患者系统检查未发现肿瘤存在，但常伴有自身免疫性疾病。

尽管目前主流观点认为ARAs是AIR致病的主要机制，但一直受到某种程度质疑，原因是除了AIR，ARAs还存在于视网膜变性及其他类型炎症性病变患者血清中，存在于无视网膜病变的系统自身免疫性疾病患者甚至健康人血清中(6-42％)。不仅如此，并无证据表明上述细胞毒性ARAs可在人体内直接导致感光细胞死亡，甚至有研究显示：外周血recoverin并不能破坏正常大鼠的血-视网膜屏障进入眼内。最近多个研究证实：除了体液免疫，细胞免疫也可能显著参与了致病过程，提示AIR发病的复杂性。尽管如此，导致感光细胞凋亡的关键步骤仍不清楚，需要进一步确认。因此建构自身免疫性视网膜病变动物模型对该类疾病发病机制的研究十分重要。

视网膜小胶质细胞是卵黄囊来源的组织宿主巨噬细胞，在视网膜局部具有重要的免疫监视、稳态维持和组织修复等功能。在正常视网膜中，小胶质细胞呈典型分支状，胞体位于内层视网膜，包括节细胞层、内丛状层及外丛状层，通过移动其轴突使视网膜处于被监视状态，发挥免疫监视、突触修饰、调节神经发育及轴突生长等多种功效。视网膜病变如视网膜变性及自身免疫性葡萄膜炎等均可通过细胞死亡或炎性细胞因子活化小胶质细胞，导致其形态变化，分布改变。活化的小胶质细胞在不同病理条件下呈现不同的功能状态(如吞噬、抗原呈递或产生致炎因子等)，从而对受损组织产生有益或有害影响。以往研究显示：多种视网膜神经元变性疾病伴随小胶质细胞活化及多种细胞因子/细胞毒性介质产生或表达上调，导致感光细胞或节细胞凋亡。AIR是免疫炎症介导的感光细胞变性疾病，前期研究证实了AIR患者血清中ARAs及CC趋化因子含量显著高于健康人。而小胶质细胞本身具备接受ARAs刺激的FC受体，CC趋化因子对小胶质细胞具有强烈的趋化作用，因此有理由猜测：在AIR发病过程中，视网膜小胶质细胞被穿过血-视网膜屏障的ARAs及趋化因子等因素激活，并通过释放炎性因子或细胞毒性介质，促进视网膜炎性细胞浸润和感光细胞死亡。也就是说，小胶质细胞活化介导的神经元毒性反应可能是导致视网膜变性的关键机制，而ARAs可能仅为诱发因素。但尚未有AIR小鼠模型可以支持和验证上述假设。

发明内容

本发明的目的在于提供一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)将重组小鼠Recoverin蛋白，按1-3mg/ml的量加入到等体积含有4mg热灭活结核分支杆菌H37Ra的不完全氟式佐剂中，在0-4℃下用匀浆机在8000-10000rpm/min速度下混匀1-2h，再反复抽吸到5ml注射器中，直至混匀成乳液状且乳液不分散；

(2)取8只7-9周C57BL/6雄性或雌性小鼠，随机均分为两组：

实验组：在小鼠上方背部皮下，按含有重组recoverin蛋白200-300μg/只小鼠的量注射步骤(1)制备得到的乳液，免疫第0天及第2天在小鼠腹腔，按200ng/只小鼠的量注射百日咳(PTX)；

对照组：不注射含有重组recoverin蛋白及热灭活结核分支杆菌H37Ra的不完全氟式佐剂乳液；

(3)对第3-8周的实验组和对照组的小鼠，检测其活体视网膜病变、视网膜功能，观察视网膜组织学变化、外周血recoverin抗体生成、视网膜小胶质细胞活化指标，用于验证小胶质细胞活化介导自身免疫性视网膜病变的机制。

本发明优选的技术方案中，重组小鼠Recoverin蛋白的recoverGenbankaccession No为19674。

本发明优选的技术方案中，重组小鼠Recoverin蛋白的纯度为不低于95％。

本发明的另一目的在于一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法在小胶质细胞活化介导自身免疫性视网膜病变机制研究中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用自身免疫性视网膜病变动物模型筛选治疗自身免疫性视网膜病变的药物的方法，其特征在于，给予该动物模型以候选药物，检测该药物对抑制小胶质细胞活化的能力及对感光细胞的保护作用。

本发明优选的技术方案中，所述药物为小胶质细胞抑制剂，包括PLX5622及激素。

本发明的另一目的在于提供一种小胶质细胞抑制剂在制备自身免疫性视网膜病变的药物中的应用。

本发明优选的技术方案中，所述小胶质细胞抑制剂利用自身免疫性视网膜病变动物模型筛选得到。

本发明优选的技术方案中，所述动物模型为视网膜变性小鼠模型、自身免疫性视网膜病变动物模型中的任一种。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明通过构建自身免疫性视网膜病变动物模型，验证了视网膜小胶质细胞活化在视网膜炎性病变中的活化反应，为后续深入探讨小胶质细胞介导AIR感光细胞凋亡的关键机制奠定了坚实基础，将为AIR治疗策略、时机选择及疗效分析提供新的思路和靶标。

2、本发明提供了一种利用自身免疫性视网膜病变动物模型筛选预防或治疗自身免疫性视网膜病变的药物的方法，为新靶点和新药物的研发提供了思路。

3、本动物模型将为检测除recoverin之外的其他ARAs的致病性提供帮助，如TULP-1，TRPM-1，transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70；IRBP及CRMP-5等，进而明确这些抗体在疾病中存在的意义和致病性。

附图说明

图1免疫6周AIR小鼠模型眼底照相、光学相干断层成像(OCT)(a)眼底照(b)OCT

图2免疫6周AIR小鼠模型炎症细胞浸润视网膜情况(HE染色)

图3免疫8周AIR小鼠模型眼底照相、光学相干断层成像(OCT)(a)眼底照(b)OCT

图4免疫8周AIR小鼠眼底荧光造影FFA

图5免疫8周AIR小鼠模型炎症细胞浸润视网膜情况(HE染色)

图6免疫8周AIR小鼠模型小胶质细胞浸润视网膜情况

图7免疫8周AIR小鼠模型视网膜功能与对照组小鼠比较(ERG检测)(a)模型组(b)对照组

图8免疫8周AIR小鼠模型外周血recoverin抗体检测

具体实施方式

以下参照实施例说明本发明，但本发明不局限于实施例。

实施例1

自身免疫性视网膜病变动物模型的构建，包括如下步骤：

(1)将实施例1制备的重组小鼠Recoverin蛋白(recoverGenbank accession No为19674，由艾力克(北京)科技有限公司优化并合成，纯度为不低于95％)，按1mg/ml的量加入到等体积含有4mg热灭活结核分支杆菌H37Ra的不完全氟式佐剂(商购于北京博蕾德生物科技有限公司)中，在0-4℃下用匀浆机在8000-10000rpm/min速度下混匀1-2h，再反复抽吸到5ml注射器中，直至混匀成乳液状；制成的乳液滴一滴在烧杯中，如乳剂不分散，则表明乳剂稳定；如果乳液分散，则再加不完全氟式佐剂，重新混匀直至乳液不分散。

(2)取8只7-9周C57BL/6雄性或雌性小鼠，随机均分为两组：实验组和对照组。

实验组：在7-9周雄性或雌性C57BL/6小鼠上方背部皮下，按含有重组recoverin蛋白200μg/只小鼠的量注射步骤(1)制备得到的乳液。第0天及第2天在小鼠腹腔，按200ng/只小鼠的量注射百日咳(PTX)，促进血视网膜屏障的破坏。

对照组：不注射含有重组recoverin蛋白的不完全氟氏佐剂乳液。

(3)对第6周和第8周的实验组和对照组小鼠，分别检测其活体视网膜病变、视网膜功能、视网膜组织学、外周血recoverin抗体生成、视网膜小胶质细胞活化等指标，用于验证小胶质细胞活化介导自身免疫性视网膜病变机制。

具体评价方法为：

活体视网膜病变：眼底照相、及光学相干断层成像技术(OCT)检测。病变评分系统分级如下：0＝没有变化；0.5＝轻微变化，眼底影像学显示1-2个变性灶；1＝少量变性灶；2＝中等数量变性灶且无玻璃体浸润；3＝大量变性灶，OCT显示玻璃体浸润；4＝广泛病变及融合病灶，玻璃体较多细胞浸润。

视网膜功能：视网膜电生理(ERG)检测。

视网膜组织学：摘取眼球、制作冰冻切片进行HE染色。

外周血recoverin抗体生成(Western blot法检测)：

①小鼠眼眶后静脉丛采血：一只手固定老鼠，食指拇指轻轻按压颈部两侧，导致眼眶后静脉充血，用针以45°角从内眼角刺入，并向下旋转；每次取0.2-0.3mL血液，离心后取血清；

②通过免疫印迹法：将小鼠重组recoverin蛋白(recoverGenbank accession No为19674，由艾力克(北京)科技有限公司优化并合成，纯度为不低于95％)加热至100℃5分钟，溶解在5×SDS(十二烷基硫酸钠)样品缓冲液中，并通过12％SDSPAGE进行分离，然后，通过电印迹将蛋白质转移到PVDF膜上，将AIR小鼠的血清用PBS稀释200至300倍后，淹没PVDF膜，40℃孵育过夜，阳性对照包括用小鼠重组recoverin蛋白(商购于美国Abcam公司)与重组recoverin抗体蛋白(商购于美国Abcam公司)反应，阴性对照包括不加小鼠血清。

③将PVDF膜洗涤并在室温下用二抗(用PBS稀释2000倍的带有荧光的抗人IgG抗体)孵育30分钟，加入ECL荧光剂，发光显影，确定阳性抗体种类；

视网膜小胶质细胞活化：免疫荧光法检测。观察recoverin免疫动物前及免疫后第8周视网膜小胶质细胞的活化状态，包括形态、数量及移动情况。CD11b抗体用于标记小胶质细胞。

统计学分析：所有数据表示为平均数±标准差。实验结果在window8环境下采用SPSS 17.0分析。

(4)验证造模效果

通过免疫6周小鼠模型眼底照相、光学相干断层成像(OCT)(图1)、和HE染色(图2)，可见视网膜有少量黄白色圆点样病灶、外层视网膜受损(活体视网膜病变评分：0.5)及炎性细胞对视网膜的浸润。

通过免疫8周小鼠模型眼底照相、光学相干断层成像(OCT)(图3)，可以看到大片黄白色病灶及外层视网膜组织破坏。活体视网膜病变评分：2分。通过眼底荧光造影可以看到视网膜内、外屏障破坏(图4)。炎症细胞浸润视网膜情况(图5)可以看出炎症细胞侵入视网膜外层、内层及全层；小胶质细胞浸润视网膜情况(图6)可以看出小胶质细胞侵入视网膜外核层及病灶内，未免疫动物视网膜小胶质细胞仅位于内层视网膜。AIR模型小鼠视网膜功能较正常对照鼠明显下降(图7)，AIR模型小鼠recoverin抗体阳性条带与阳性对照相当(图8)。

实施例2

待筛选药物：CSf1r抑制剂PLX5622(seron,Inc.)，该药物可清除小胶质细胞。

用实施例1的动物模型构建方法，构建动物模型的前7天，动物模型开始的第0天、第3周和出现视网膜炎性细胞的时间点，给小鼠口饲含有1200ppm PLX5622的饲料。观察指标包括活体视网膜状态评价(眼底照相、FFA、OCT)、视网膜组织学、小胶质细胞活性状态、视网膜免疫炎性细胞浸润、致炎细胞因子产生及感光细胞凋亡状态等，比较在recoverin免疫前后的不同时间点，有和没有小胶质细胞对视网膜感光细胞凋亡水平、炎性细胞浸润以及细胞因子、抗体水平的影响。实验结果发现PLX5622对小胶质细胞有明显的清除及对感光细胞的保护。

用同样的方法可筛选出其他抑制小胶质细胞活化从而实现对感光细胞保护的物质在制备治疗自身免疫性视网膜病变的药物。

实施例3

1、收集临床疑似AIR患者

临床疑似AIR患者纳入标准：目前尚无统一诊断标准，本研究采用2016年美国葡萄膜炎协会发表于AJO的关于非副肿瘤性AIR的诊断与治疗共识(副肿瘤AIR患者除了患有恶性肿瘤，其他临床体征与此相似)：5条基本诊断标准：视功能异常没有其他明显病因可以解释；ERG异常(伴或不伴有视野异常)；存在血清抗视网膜抗体；无明显眼底病变或引起视功能丢失的视网膜变性疾病；无明显眼内炎症。3条支持性诊断标准：出现闪光感、暗点、色盲或夜盲或畏光；个人或家族性系统自身免疫性疾病；视力变化较快(急性或亚急性)。全身排除肿瘤。

临床疑似AIR患者58例，其中p-AIR 15例，np-AIR33例。

典型RP12例、双眼葡萄膜炎15例作为疾病对照组。疾病诊断参见各自诊断标准。

正常人对照组(10例)：定义为无明显视网膜病变、视功能无明显异常。

临床疑似AIR患者排除标准：有明显病因可解释的双眼视功能异常；ERG正常；其他可引起视功能异常的视网膜病变

2、治疗方案及结果

15名p-AIR患者中，两名新诊断出肺癌的患者接受了化疗，另外13名p-AIR患者接受了针对肿瘤的治疗，包括切除肿瘤、化疗或诊断时放疗。确认诊断后，其中12人服用局部或/和全身使用糖皮质激素，3名患者选择观察。

33名np-AIR患者中，8名np-AIR患者由于全身合并自身免疫性疾病口服糖皮质激素。AIR被诊断后，26名患者开始或继续接受局部或/和全身糖皮质激素或环孢素治疗，7名np-AIR患者选择观察。

在接受治疗的患者中，30％眼(26/85)的视力得到改善，23％眼(16/85)的视力下降，53％眼(46/85)在观察期内视力保持稳定。

两种类型的视网膜病变对玻璃体腔注射曲安奈德(TA)或地塞米松注射植入剂(Ozurdex)反应良好：一种合并黄斑水肿，另一种具有强烈的视网膜炎症。所有12只AIR患眼经治疗后黄斑水肿减轻，视网膜炎症反应迅速消退。视力在注射后短时间内显著增加，但其中一半在反复注射后仍然由于视神经萎缩而失明。

无论疾病分期如何，近90％的患者都接受了一种以上的疗法，只有5名np-AIR患者选择观察。超过一半的患者视觉功能得到维持，三分之一患者视觉功能得到改善。值得注意的是，单独玻璃体内注射TA或OZURDEX仍能改善黄斑水肿或视网膜明显炎性浸润患者的视功能，而不必全身口服激素。在5年的观察期内，5名未经特殊治疗的np-AIR患者中有2名视力稳定。急性发作的CAR或np-AIR患者的视力预后通常在随访一年后较差，及时治疗有暂时改善。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims

1.一种自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)取8只7-9周C57BL/6雄性或雌性小鼠，随机均分为两组：实验组：在小鼠上方背部皮下，按含有重组recoverin蛋白200-300μg/只小鼠的量注射步骤(1)制备得到的乳液，免疫第0天及第2天在小鼠腹腔，按200ng/只小鼠的量注射百日咳(PTX)；对照组：不注射含有重组recoverin蛋白及热灭活结核分支杆菌H37Ra的不完全氟式佐剂乳液；

(3)对第3-8周的实验组和对照组的小鼠，检测活体视网膜病变、视网膜功能及小胶质细胞的活化情况指标，用于验证小胶质细胞活化介导自身免疫性视网膜病变的机制；

步骤(3)中所述活体视网膜病变、视网膜功能指标包括视网膜组织学变化、外周血recoverin抗体生成、视网膜小胶质细胞活化指标。

2.如权利要求1所述的自身免疫性视网膜病变动物模型的构建方法在小胶质细胞活化介导自身免疫性视网膜病变机制研究中的应用。

3.利用如权利要求1所述的自身免疫性视网膜病变动物模型筛选治疗自身免疫性视网膜病变药物的方法。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，给予该动物模型以候选药物，检测该药物对抑制小胶质细胞活化的能力及对感光细胞的保护作用。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述药物为小胶质细胞抑制剂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药物为PLX5622、激素中的任一种。