CN114295832A - 基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统及方法，包括微流控芯片、光子计数模块、加样模块、控制检测模块、暗箱和恒温恒湿箱，微流控芯片设置在暗箱内，暗箱设置在恒温恒湿箱内，加样模块通过导管与微流控芯片连接，微流控芯片的信号输出端与光子计数模块的信号输入端连接，光子计数模块的信号输出端与控制检测模块的信号输入端连接。本发明将免疫反应和反应产物的分离在微米量级的微流控芯片上实现，是一种超微量分析技术，大大降低试剂的消耗量，微降低成本提供了可能，而且系统高度微型化、集成化，为现场检测粮食真菌毒素提供一条新方法。

Description

基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统及方法

技术领域

本发明涉及一种粮食检测技术领域，具体涉及一种基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统及方法。

背景技术

细菌、放线菌以及霉菌等微生物在储粮中普遍存在，侵染粮食的一些霉菌含有活性很强的各种酶类，不仅能够分解粮食中的营养物质导致粮食霉变，而且代谢产生具有强烈毒性和致癌性的真菌毒素，对储粮安全品质危害极大。粮食储藏过程中真菌毒素的存在已经成为我国粮食、食品安全的重要隐患，因此，加强粮食真菌毒素快速检测方法研究，降低检测成本，提高检测手段的普适性，已成为保障我国粮食安全和维护国家经济利益的迫切需求。

虽然化学发光免疫分析方法具有背景干扰低、灵敏度高和信噪比高等优点，但这种传统化学发光免疫分析方法仍存一些瓶颈。探测化学发光强度所用的光电倍增管探测头有较大的体积尺寸，这种较大尺寸探测头对于测量精度存在诸多要求和限制。一是必须保证反应池中化学发光元与探测头的位置完全对准，稍有偏差就会引起较大的测量误差；二是化学发光强度随着被测距离的增加会产生较大的衰减，为了保证系统的测量精度，探头与化学发光元之间的距离必须保持恒定。实际测量过程中需要不断地调节探头或者化学发光元的位置，然而通过机械装置的调整实现探测头与化学发光元的精确对准或等距离控制是很难达到高精度的，系统测量精度难以进一步提高是阻碍化学免疫分析方法发展的一大瓶颈。

目前的化学发光免疫分析方法一种开放式的检测方法，检测装置的尺寸比较大，尽管采用密闭设计，还是容易引入外部干扰以及环境条件参数波动的影响，从而导致系统测量精度难以进一步提高。为了保证探测的准确性和测量精度，目前采用绝对测量法（实时校准法），也就是说每次在测量未知样品的真菌毒素浓度时，都要通过与标准真菌毒素样品溶液进行比对，才能保证测量的精度。这种方法必然导致标准样品试剂耗费量大、单次测量价格高的缺点。

现有的常规免疫分析存在分析时间较长，通常需要数小时；仪器设备较大，实验室操作，操作程序烦琐复杂，需要专业人员操作，难以满足现场检验的要求；采用比较测量法，需要消耗大量标准试剂，单次测量价格比较高，已经成为免疫分析在粮食行业推广应用的主要制约因素。在医疗行业，人们对各种疾病病毒的检测价格不太敏感，这种分析方法在医疗领域得到了广泛的应用。然而在粮食行业，我国粮食储藏企业是通过国家补贴（每年每吨粮食补贴100元左右）的方式来运营的，企业对粮食品质检测的价格非常敏感。单次测量价格动辄几百元，大大限制了该方法在粮食行业的推广应用。

发明内容

本发明为了解决现有技术中的不足之处，提供一种操作方便、检测试剂用量少、检测精度高、成本低的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，包括微流控芯片、光子计数模块、加样模块、控制检测模块、暗箱和恒温恒湿箱，微流控芯片设置在暗箱内，暗箱设置在恒温恒湿箱内，加样模块通过导管与微流控芯片连接，微流控芯片的信号输出端与光子计数模块的信号输入端连接，光子计数模块的信号输出端与控制检测模块的信号输入端连接。

微流控芯片内部设有微反应腔，微流控芯片上设有均与微反应腔连通的四条独立的进液通道、一条出液通道和一个光纤接口，四条独立的进液通道的进口均通过一条所述的导管与加样模块连接，出液通道的出液口通过出液管连接有废液暂存容器，光纤接口为微流控芯片的信号输出端。

微流控芯片采用高分子聚合物材料PDMS制作，整体长18mm、宽12mm、厚度为8mm；微反应腔为底面直径8mm、高1mm的腔体，一条出液通道和四条进液通道位于同一平面且该平面平行于微反应腔的底面，四条进液通道的出口与微反应腔的左侧壁连通，四条进液通道的进口均开设在微流控芯片的顶部，出液通道的进口与微反应腔的右侧壁连通，出液通道的出口开设在微流控芯片的右侧边，进液通道的进口和出液通道的出口均为直径0.8mm的圆孔，进液通道和出液通道的横断截面的深度1mm、宽0.5mm。

光子计数模块包括光子计数器和多模光纤，光子计数器通过多模光纤与光纤接口连接。

加样模块包括由四通道注射泵和四个100μL的微量注射器，每个微量注射器的出口均通过一条所述的导管与一个进液通道的进口连接，四个微量注射器分别为第一注射器、第二注射器、第三注射器和第四注射器，第一注射器、第二注射器、第三注射器和第四注射器分别用于加入并注射待测样品溶液或标准样品溶液、酶标记物溶液、发光底物溶液和洗涤液。

控制检测模块包括单片机和上位机PC，单片机通过检测光子计数器产生的脉冲频率信号实现对光子数的检测，单片机与上位机PC通过串口通讯实现数据交互。

基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，包括以下步骤：

（1）准备试验材料；

（2）制备待测样品溶液、标准样品溶液、酶标记物溶液、发光底物溶液、洗涤液；

（3）将步骤（2）中制备的各溶液通过四通道注射泵和四个微量注射器注入到微流控芯片内，进行真菌毒素检测试验。

步骤（1）中的试验材料包括：

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、1mg/mL的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、1mg/mL的黄曲霉毒素B1酶标抗原；

稀释液：pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）；

包被液：0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）；

浓缩洗涤液：pH 7.4、含0.5%的Tween-20的磷酸盐缓冲液；

封闭液：含1 %BSA的磷酸盐缓冲液；

无菌去离子水；鲁米诺溶液、过氧化氢、纯净小麦样品、含AFB1的样品。

步骤（2）各溶液的具体制备过程为：

A、待测样品溶液：将纯净小麦样品粉碎并进行编号，每组称取4 g，然后加入20 mL甲醇水（7：3）溶液，振摇 15 min，使用滤纸过滤，取 1 mL滤液加入 1 mL纯水进行稀释，即为待测样品溶液；

B、标准样品溶液：用稀释液将1mg/mL的黄曲霉毒素B1酶标抗原分别配制成（0、1、2.5、5、10、12.5、20μg/L）的标准样品溶液；

C、发光底物溶液：将鲁米诺溶液与过氧化氢溶液等比例混合得到；

D、洗涤液：用无菌去离子水将浓缩洗涤液稀释20倍至工作浓度得到；

E、包被AFB1抗体：用包被液将包被原AFB1单克隆抗体稀释至一定浓度，加入50 μL至微反应腔中，4 ℃恒温箱中包被过夜，用洗涤液洗涤3次，将AFB1抗体包被在微反应腔中；通入50 μL封闭液，37 ℃恒温箱中孵育1 h，用洗涤液洗涤3次备用。

基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，步骤（3）的具体过程为：

①.使用四通道注射泵通过第一注射器将10μL待测样品溶液或者标准样品溶液注入到微反应腔中；

②.使用四通道注射泵通过第二注射器将10μL AFB1酶标记物溶液、即酶标抗原溶液注入到微反应腔中，与样品溶液中AFB1酶标抗原竞争结合，在微反应腔上形成包被抗体结合位点，将恒温恒湿箱温度设置为恒温37 ℃，孵育30 min左右；

③.孵育结束后，使用四通道注射泵通过第四注射器中向微反应腔内注入稀释好的洗涤液，持续通入洗涤液至微反应腔内以洗涤未结合抗原，待微反应腔内充满洗涤液后，静置1 min，再项微反应腔内注射空气排出洗涤液，洗涤液通过出液管排到废液暂存容器内；

④.使用四通道注射泵通过第三注射器将20μL发光底物溶液注入至微反应腔，在恒温恒湿箱内37 ℃避光反应10 min，再与包被抗体结合的酶标抗原上辣根过氧化物酶的催化作用下发光底物产生化学发光；

⑤.在步骤④进行过程中，光子计数器通过多模光纤对微反应腔内的发光强度检测，并通过单片机串口将光子计数值传输至上位机PC，上位机PC显示实时数据与曲线，并保存数据进行分析。

采用上述技术方案，随着微全分析系统(μTAS)的出现，譬如基于微流控免疫化学发光检测系统，或者基于片上实验室芯片化学发光免疫分析微系统，为化学发光免疫分析技术开辟了一条更广阔的发展前景。微流控芯片技术是利用微通道精确控制和处理微尺度流体，从而在微芯片上实现了毛细管电泳与流动注射分析，将泵、阀、管道、反应腔、检测元件等组件，通过微加工工艺集成在一块芯片上的小型化分析系统。不仅可实现微量样的进样、混合、反应、分离、检测等过程，而且构建尺寸可达到细胞的大小水平。本发明通过微流控技术设计一个集化学反应池和光纤收集于一体的微反应腔，将多模光纤直接固定在微型反应腔内，光纤与化学发光元之间距离固定不变，测量过程中无需调整。完全克服了传统化学发光免疫分析方法中探测头与化学发光元的对准或等距离控制的难题。

在微流控芯片上进行非均相免疫反应可显著提高检测效率并降低检测成本。微流控芯片是在微米级空间进行免疫化学反应，一方面加快了反应动力学过程，使得基于生物大分子扩散控制的免疫反应速度提高几个数量级；基于微流控技术的化学免疫分析，将免疫反应和反应产物的分离在微米量级的微流控芯片上实现，是一种超微量分析技术，大大降低试剂的消耗量，微降低成本提供了可能，而且系统高度微型化、集成化，为现场检测提供了方便。

由于探测化学发光信号所用的光电倍增管探测头有较大的体积尺寸（内置多级高压电极等原因），这种大尺寸探测头直接检测时位置稍有偏差就会引起较大的测量误差；且化学发光强度随着被测距离的增加会产生较大的衰减，为了保证系统的测量精度，探头与化学发光元之间的距离必须保持恒定。本发明通过微流控技术设计一个集化学反应池和光纤收集于一体的微型反应腔，将小尺寸接口光纤直接固定在微型反应腔内，光纤与化学发光元之间距离固定不变，测量过程中无需调整。因光纤接口小，在微反应腔范围内不需要实现探测口与反应孔的精确对准，检测误差很小，且光纤结构简单稳定、抗干扰、连接容易，易于封装用于小部件的现场检测。完全克服了传统化学发光免疫分析方法中探测头与化学发光元的对准和等距离控制的难题。本发明设计新颖，原理科学，试剂用量小，检测成本低，通过微流控和化学免疫发光相结合的方法，克服传统免疫化学发光检测方法的缺点，为粮食真菌毒素的检测提供一条新方法。

本发明中的整个暗箱放置于密闭的恒温恒湿箱中，恒温恒湿箱可控温度范围为-10~100°C，其误差不超过±0.5°C。暗盒为检测提供避光环境，避免外部光源干扰；恒温恒湿箱用于检测过程中控制检测环境温度。单片机通过检测光子计数器产生的脉冲频率信号实现对光子数的检测，单片机与上位机PC通过串口通讯实现数据交互。

本发明探测的是微弱化学发光信号的时域信息，采用单光子计数探测系统。光子计数器以微处理器STM32F407ZGT6为核心，采用光纤型光子计数探头，多模光纤采用大芯径多模石英光纤，芯径为400 μm，数值孔径NA为0.22，光谱范围为200~1200 nm，工作环境温度-40 ~ 85 ℃；光纤型光子计数探头选用Hamamatsu Photonics的H10682-210光子计数探头，工作环境温度 5 ~ 40 ℃，输入电压4.75~5.25 V，光谱响应范围为230~700 nm，内含高速光子计数电路，具有较高计数灵敏度，能够通过对入射的单个光子进行计数，并将光子信号转换成TTL脉冲信号输出，设置单片机TIM2采用向上计数模式，时钟选用外部时钟源模式2，用以计数光子计数模块输出的脉冲信号。

加样模块包括四通道注射泵和四个100 μL微量注射器。四通道注射泵流量范围：0.001μl-28.135ml/min，线速度范围为5μm/min-130mm/min（流量=线速度×注射器内截面积）；工作环境温度：0℃-40℃；可通过数码旋钮与薄膜按键操作，也可采用485通讯总线与上位机相连，通过上位机PC对其进行控制。

附图说明

图1是本发明中基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的结构示意图；

图2是图1中微流控芯片的放大图。

具体实施方式

如图1-图2所示，本发明的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，包括微流控芯片1、光子计数模块、加样模块、控制检测模块、暗箱2和恒温恒湿箱3，微流控芯片1设置在暗箱2内，暗箱2设置在恒温恒湿箱3内，加样模块通过导管8与微流控芯片1连接，微流控芯片1的信号输出端与光子计数模块的信号输入端连接，光子计数模块的信号输出端与控制检测模块的信号输入端连接。

微流控芯片1内部设有微反应腔4，微流控芯片1上设有均与微反应腔4连通的四条独立的进液通道5、一条出液通道6和一个光纤接口7，四条独立的进液通道5的进口均通过一条所述的导管8与加样模块连接，出液通道6的出液口通过出液管9连接有废液暂存容器10，光纤接口7为微流控芯片1的信号输出端。

微流控芯片1采用高分子聚合物材料PDMS制作，整体长18mm、宽12mm、厚度为8mm；微反应腔4为底面直径8mm、高1mm的腔体，一条出液通道6和四条进液通道5位于同一平面且该平面平行于微反应腔4的底面，四条进液通道5的出口与微反应腔4的左侧壁连通，四条进液通道5的进口均开设在微流控芯片1的顶部，出液通道6的进口与微反应腔4的右侧壁连通，出液通道6的出口开设在微流控芯片1的右侧边，进液通道5的进口和出液通道6的出口均为直径0.8mm的圆孔，进液通道5和出液通道6的横断截面的深度1mm、宽0.5mm。

光子计数模块包括光子计数器11和多模光纤12，光子计数器11通过多模光纤12与光纤接口7连接。

加样模块包括由四通道注射泵13和四个100μL的微量注射器，每个微量注射器的出口均通过一条所述的导管8与一个进液通道5的进口连接，四个微量注射器分别为第一注射器15、第二注射器16、第三注射器17和第四注射器18，第一注射器15、第二注射器16、第三注射器17和第四注射器18分别用于加入并注射待测样品溶液或标准样品溶液、酶标记物溶液、发光底物溶液和洗涤液。

控制检测模块包括单片机19和上位机PC20，单片机19通过检测光子计数器11产生的脉冲频率信号实现对光子数的检测，单片机19与上位机PC20通过串口通讯实现数据交互。

基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，包括以下步骤：

（1）准备试验材料；

（2）制备待测样品溶液、标准样品溶液、酶标记物溶液、发光底物溶液、洗涤液；

（3）将步骤（2）中制备的各溶液通过四通道注射泵13和四个微量注射器注入到微流控芯片1内，进行真菌毒素检测试验。

步骤（1）中的试验材料包括：

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、1mg/mL的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、1mg/mL的黄曲霉毒素B1酶标抗原；

稀释液：pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）；

包被液：0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）；

浓缩洗涤液：pH 7.4、含0.5%的Tween-20的磷酸盐缓冲液；

封闭液：含1 %BSA的磷酸盐缓冲液；

无菌去离子水；鲁米诺溶液、过氧化氢、纯净小麦样品、含AFB1的样品。

步骤（2）各溶液的具体制备过程为：

A、待测样品溶液：将纯净小麦样品粉碎并进行编号，每组称取4 g，然后加入20 mL甲醇水（7：3）溶液，振摇 15 min，使用滤纸过滤，取 1 mL滤液加入 1 mL纯水进行稀释，即为待测样品溶液；

B、标准样品溶液：用稀释液将1mg/mL的黄曲霉毒素B1酶标抗原分别配制成（0、1、2.5、5、10、12.5、20μg/L）的标准样品溶液；

C、发光底物溶液：将鲁米诺溶液与过氧化氢溶液等比例混合得到；

D、洗涤液：用无菌去离子水将浓缩洗涤液稀释20倍至工作浓度得到；

E、包被AFB1抗体：用包被液将包被原AFB1单克隆抗体稀释至一定浓度，加入50 μL至微反应腔4中，4 ℃恒温箱中包被过夜，用洗涤液洗涤3次，将AFB1抗体包被在微反应腔4中；通入50 μL封闭液，37 ℃恒温箱中孵育1 h，用洗涤液洗涤3次备用。

基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，步骤（3）的具体过程为：

①.使用四通道注射泵13通过第一注射器15将10μL待测样品溶液或者标准样品溶液注入到微反应腔4中；

②.使用四通道注射泵13通过第二注射器16将10μL AFB1酶标记物溶液、即酶标抗原溶液注入到微反应腔4中，与样品溶液中AFB1酶标抗原竞争结合，在微反应腔4上形成包被抗体结合位点，将恒温恒湿箱3温度设置为恒温37 ℃，孵育30 min左右；

③.孵育结束后，使用四通道注射泵13通过第四注射器18中向微反应腔4内注入稀释好的洗涤液，持续通入洗涤液至微反应腔4内以洗涤未结合抗原，待微反应腔4内充满洗涤液后，静置1 min，再项微反应腔4内注射空气排出洗涤液，洗涤液通过出液管9排到废液暂存容器10内；

④.使用四通道注射泵13通过第三注射器17将20μL发光底物溶液注入至微反应腔4，在恒温恒湿箱3内37 ℃避光反应10 min，再与包被抗体结合的酶标抗原上辣根过氧化物酶的催化作用下发光底物产生化学发光；

⑤.在步骤④进行过程中，光子计数器11通过多模光纤12对微反应腔4内的发光强度检测，并通过单片机19串口将光子计数值传输至上位机PC20，上位机PC20显示实时数据与曲线，并保存数据进行分析。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，本实施例中的叙述的各部件的设置位置及相应方向，仅仅便于本领域技术人员对技术方案的理解，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，其特征在于：包括微流控芯片、光子计数模块、加样模块、控制检测模块、暗箱和恒温恒湿箱，微流控芯片设置在暗箱内，暗箱设置在恒温恒湿箱内，加样模块通过导管与微流控芯片连接，微流控芯片的信号输出端与光子计数模块的信号输入端连接，光子计数模块的信号输出端与控制检测模块的信号输入端连接。

2.根据权利要求1所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，其特征在于：微流控芯片内部设有微反应腔，微流控芯片上设有均与微反应腔连通的四条独立的进液通道、一条出液通道和一个光纤接口，四条独立的进液通道的进口均通过一条所述的导管与加样模块连接，出液通道的出液口通过出液管连接有废液暂存容器，光纤接口为微流控芯片的信号输出端。

3.根据权利要求2所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，其特征在于：微流控芯片采用高分子聚合物材料PDMS制作，整体长18mm、宽12mm、厚度为8mm；微反应腔为底面直径8mm、高1mm的腔体，一条出液通道和四条进液通道位于同一平面且该平面平行于微反应腔的底面，四条进液通道的出口与微反应腔的左侧壁连通，四条进液通道的进口均开设在微流控芯片的顶部，出液通道的进口与微反应腔的右侧壁连通，出液通道的出口开设在微流控芯片的右侧边，进液通道的进口和出液通道的出口均为直径0.8mm的圆孔，进液通道和出液通道的横断截面的深度1mm、宽0.5mm。

4.根据权利要求3所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，其特征在于：光子计数模块包括光子计数器和多模光纤，光子计数器通过多模光纤与光纤接口连接。

5.根据权利要求3所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，其特征在于：加样模块包括由四通道注射泵和四个100μL的微量注射器，每个微量注射器的出口均通过一条所述的导管与一个进液通道的进口连接，四个微量注射器分别为第一注射器、第二注射器、第三注射器和第四注射器，第一注射器、第二注射器、第三注射器和第四注射器分别用于加入并注射待测样品溶液或标准样品溶液、酶标记物溶液、发光底物溶液和洗涤液。

6.根据权利要求5所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统，其特征在于：控制检测模块包括单片机和上位机PC，单片机通过检测光子计数器产生的脉冲频率信号实现对光子数的检测，单片机与上位机PC通过串口通讯实现数据交互。

7.采用如权利要求6所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）准备试验材料；

（2）制备待测样品溶液、标准样品溶液、酶标记物溶液、发光底物溶液和洗涤液；

（3）将步骤（2）中制备的各溶液通过四通道注射泵和四个微量注射器注入到微流控芯片内，进行真菌毒素检测试验。

8.根据权利要求7所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，其特征在于：步骤（1）中的试验材料包括：

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、1mg/mL的黄曲霉毒素B1单克隆抗体、1mg/mL的黄曲霉毒素B1酶标抗原；

稀释液：pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）；

包被液：0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液（CBS）；

浓缩洗涤液：pH 7.4、含0.5%的Tween-20的磷酸盐缓冲液；

封闭液：含1 %BSA的磷酸盐缓冲液；

无菌去离子水；鲁米诺溶液、过氧化氢、纯净小麦样品、含AFB1的样品。

9.根据权利要求7所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，其特征在于：步骤（2）各溶液的具体制备过程为：

A、待测样品溶液：将纯净小麦样品粉碎并进行编号，每组称取4 g，然后加入20 mL甲醇水（7：3）溶液，振摇 15 min，使用滤纸过滤，取 1 mL滤液加入 1 mL纯水进行稀释，即为待测样品溶液；

B、标准样品溶液：用稀释液将1mg/mL的黄曲霉毒素B1酶标抗原分别配制成（0、1、2.5、5、10、12.5、20μg/L）的标准样品溶液；

C、发光底物溶液：将鲁米诺溶液与过氧化氢溶液等比例混合得到；

D、洗涤液：用无菌去离子水将浓缩洗涤液稀释20倍至工作浓度得到；

E、包被AFB1抗体：用包被液将包被原AFB1单克隆抗体稀释至一定浓度，加入50 μL至微反应腔中，4 ℃恒温箱中包被过夜，用洗涤液洗涤3次，将AFB1抗体包被在微反应腔中；通入50 μL封闭液，37 ℃恒温箱中孵育1 h，用洗涤液洗涤3次备用。

10.根据权利要求9所述的基于微流控和化学免疫发光的真菌毒素检测系统的检测方法，其特征在于：步骤（3）的具体过程为：

①.使用四通道注射泵通过第一注射器将10μL待测样品溶液或者标准样品溶液注入到微反应腔中；

②.使用四通道注射泵通过第二注射器将10μL AFB1酶标记物溶液、即酶标抗原溶液注入到微反应腔中，与样品溶液中AFB1酶标抗原竞争结合，在微反应腔上形成包被抗体结合位点，将恒温恒湿箱温度设置为恒温37 ℃，孵育30 min左右；

③.孵育结束后，使用四通道注射泵通过第四注射器中向微反应腔内注入稀释好的洗涤液，持续通入洗涤液至微反应腔内以洗涤未结合抗原，待微反应腔内充满洗涤液后，静置1 min，再项微反应腔内注射空气排出洗涤液，洗涤液通过出液管排到废液暂存容器内；

④.使用四通道注射泵通过第三注射器将20μL发光底物溶液注入至微反应腔，在恒温恒湿箱内37 ℃避光反应10 min，再与包被抗体结合的酶标抗原上辣根过氧化物酶的催化作用下发光底物产生化学发光；

⑤.在步骤④进行过程中，光子计数器通过多模光纤对微反应腔内的发光强度检测，并通过单片机串口将光子计数值传输至上位机PC，上位机PC显示实时数据与曲线，并保存数据进行分析。

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