CN114295709A - 一种用于生物样品质谱检测的图案化基底及其制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种用于生物样品质谱检测的图案化基底及其制备工艺，通过现有技术中的制备工艺，可以看出要想实现疏水‑亲水‑疏水的图案化基底，需要经历点覆牺牲层，制备疏水涂层，以及控制疏水聚合物溶液体积，点覆更小疏水层，遗留下中间环状亲水区域的过程。但是通过本申请的方法，在制备得PDMS模板后，只需要将PDMS蘸取疏水性材料，压印于亲水的基底面表上，即可完成疏水‑亲水‑疏水图案化基底的制备，缩短了制备过程的步骤、节约了制备时间，能很好的控制聚合物在基底表面的均一性，极大限度地消除批件重复性的误差，适合大批量的生产。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种用于生物样品质谱检测的图案化基底及其制备工艺。
背景技术
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)因其操作简便、高通量，快速等特点，近年来被应用于临床中微生物、核酸、多肽、蛋白等物质的分析和检测中，成为了一个不可或缺的重要工具之一。但是在实际应用过程中不可控的样品沉积面积、不均匀的基质及样品的共结晶，会严重的影响测试的灵敏度和重现性。除此之外，生物样品预处理过程中污染物也会严重的干扰共结晶的过程，从而影响质谱检测的信号。因此，选择一种合适的生物样品的预处理方法对于MALDI MS的分析至关重要。
生物样品的纯化大部分是采用离线的方式，如：利用功能化的纳米粒子、树脂、HPLC等方法对生物样品进行预先地分离富集。但是，利用离线方法分离得到的样品需要再一次转移到测试的样品靶上，这过程就不可避免的会造成样品的损失、污染物的二次引进，并且整个过程操作复杂，不利于批量化的样品处理。为了克服离线纯化方法的不足，在线样品纯化方法的研发也引起了广大研究者的兴趣。
目前在线样品纯化方法主要是通过在基底表面上修饰上功能分子以此来调节基底表面能，利用分子之间不同的相互作用，来成功实现生物样品在线的纯化和富集。近几年，研究者尝试通过滴涂的方式将疏水性的聚合物，如：聚四氟乙烯、尼龙、石蜡、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等修饰在MALDI质谱的不锈钢靶上(J.Mass Spectrom.2002,37,512-524；Anal.Chem.1997,69,4716-4720；Anal.Biochem.2004,327,222-232；J.Am.Soc.Massspectrom.1994,5,230-237)，再配以水洗步骤用于除去样品中的污染物。由于盐等污染物和疏水性聚合物的作用力很弱，盐等污染物会重新的溶解在水中，通过吸走水溶液的方法，将溶解在其中的盐等污染物也一并带走，而大部分的分析物则依然保留在疏水性聚合物的表面，从而达到去除污染物和富集分析物的目的。但是，额外增加的水洗步骤则会导致不可避免的样品损失，这不利于高通量的质谱检测。
中国授权专利“一种低丰度蛋白靶上一步除盐与富集的方法”(专利号：CN1811407A)提供了一种通过大量基质溶液推洗污染物的方式，来实现生物样品的在线免水洗除盐和富集。但是这个方法需要严格控制样品溶液的沉积体积；另外，需要大量的基质溶液用来溶解和排除污染物，这又会导致分析物的部分损失。2007年，Zhang首次合成了聚砜-聚(环氧乙烷)(PSF-b-PEO)嵌段共聚物(Chem.Commun.2007,4468-4470)，该共聚物中刚性的疏水PSF能够保持膜的机械强度，防止聚合物溶解在乙腈中，同时柔性的亲水PEO部分对于盐有很强的吸附作用，而对于多肽/蛋白则无作用，从而成功实现一步在线免水洗的除盐和多肽/蛋白的富集。但是此聚合物对于PEO含量是很讲究的，它的含量必须大于60％，这大大增加了合成的难度和对于合成经验的要求。
中国授权专利“一种对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法”(Anal.Chem.2012,84,2118-2123；专利号：CN102519779 A)提供了通过原位分子自主装和滴涂的方式，在基底表面上构筑疏水-亲水-疏水环形的图案化，利用基底表面修饰的分子与生物样品中不同分子之间的相互作用，成功地将盐等污染物和分析物转移至图案化的不同区域，从而实现生物样品一步在线免水洗除盐和富集。随后，中国授权专利“一种用于生物样品进行一步富集和除盐的MALDI钢靶及其制备方法“(J.Am.Soc.Mass Spectrom.2017,28,3,428-433；专利号：CN105572270A)对上述的制备方法进行了优化和改进。然而，这两种方法都存在同样的问题：1、通过手动的方式滴涂聚合物，很难把握滴加聚合物的均匀性，不利于大批量的芯片制备；2、如果要进行自动化操作，需要增加额外的点样的设备，这会增加生产成本。
发明内容
本申请中为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于生物样品质谱检测的图案化基底及其制备工艺。
本发明提供了如下的技术方案：一种用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，包括如下步骤：
S1.选取基底，将基底依次放入到丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底干燥，将干燥的基底进行蚀刻，得到中间突柱且突柱上设有环形孔洞的阵列化图案，随后用超纯水冲洗，氮气吹干；
S2.在步骤S1得到的基底上倾倒上PDMS，待PDMS流平整个基底后，使PDMS发生固化，将固化后的PDMS撕下来，即可在PDMS上获得与基底结构完全互补的结构；
S3.选取另一块基底，先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底干燥，再将基底表面进行亲水化处理；
S4.将步骤S2得到的PDMS蘸取疏水性材料分散液；
S5.将步骤S4得到的PDMS压印在步骤S2得到的基底上，随后移除PDMS，即可在基底上留下疏水-亲水-疏水图案。
优选的，在步骤S1中，所述中间突柱的直径为100～800μm；所述环形孔洞的宽度为100～800μm，其深度为50μm～200μm。
优选的，在步骤S2中，将基底置于烘箱中80～150℃的条件下烘2～4h进行固化，控制PDMS的厚度在50μm～200μm。
优选的，在步骤S3中，所述亲水化处理方式为O2-Plasma或在质量比为3:1的浓H2SO4和H2O2混合溶液中80～100℃加热10～30min。
优选的，在步骤S4中，疏水性材料包括疏水聚合物、疏水硅烷偶联剂、疏水纳米粒子或疏水性硫醇试剂，蘸取的时间为10s～10min。
优选的，在步骤S5中，压印时间为10s～30min。
基于上述的制备工艺制备出的图案化基底，包括基底，所述基底表面上附着有内侧疏水区域、亲水裸基底区域以及外侧疏水区域，若干内侧疏水区域阵列在所述基底表面上，每个所述内侧疏水区域的外侧设有环形所述亲水裸基底区域，所述基底表面上所述亲水裸基底区域的外侧为所述外侧疏水区域。
优选的，所述基底的材料包括单晶硅、不锈钢片、石英或玻璃片。
一种上述制备工艺制备出的图案化基底用于生物样品质谱检测，包括如下步骤：
F1.将含盐的0.5～5μL多肽、蛋白或核酸溶液滴加在步骤S5获得的基底表面，在室温下自然干燥，大部分盐和分析物会被分别沉积在基底表面的亲水裸基底区域和内侧疏水区域；
F2.将0.5～5μL基质溶液滴加在步骤F1获得的基底表面，室温下自然干燥，小部分盐会被进一步排到基底中间的亲水裸基底区域，分析物和基质的共结晶则会分布在里面的疏水材料区域；
F3.将步骤F2获得的基底直接放进MALDI-TOF MS仪器中进行分析和检测。
本发明涉及一种用于生物样品质谱检测的图案化基底及其制备工艺，其有益效果在于：
1.简化工艺流程，实现大批量生产：
通过现有技术中的制备工艺，可以看出要想实现疏水-亲水-疏水的图案化基底，需要经历点覆牺牲层，制备疏水涂层，以及控制疏水聚合物溶液体积，点覆更小疏水层，遗留下中间环状亲水区域的过程。但是通过本申请的方法，在制备得PDMS模板后，只需要将PDMS蘸取疏水性材料，压印于亲水的基底表上，即可完成疏水-亲水-疏水图案化基底的制备，缩短了制备过程的步骤、节约了制备时间，能很好的控制聚合物在基地表面的均一性，极大限度地消除批件重复性的误差，适合大批量的生产。
2.模板可重复使用，降低生产成本：
在此发明专利中涉及硅基微纳结构模板和PDMS模板的制备过程，其中制备完成的硅基微纳结构模板可以被用于反复的翻印PDMS模板，而翻印好的PDMS模板，可以被反复用于同一种的疏水性材料的压印，若需要更换疏水性材料，只需要重新用硅基微纳结构翻印PDMS模板即可，因此一次制备完成的模板，可以被重复的利用，能够降低大批量的生产的设备投入成本，如：自动点样仪的投入。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是疏水-亲水-疏水图案化阵列芯片的制备工艺；
图2是生物样品在图案化阵列芯片表面纯化后的EDX能谱图；
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。需要说明的是，如无特殊说明，当某一特征被称为“固定”、“连接”在另一个特征，它可以直接固定、连接在另一个特征上，也可以间接地固定、连接在另一个特征上。此外，本发明中所使用的上、下、左、右等描述仅仅是相对于附图中本发明各组成部分的相互位置关系来说的。
实施例1
将单晶硅【n type,(100)】先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，用高纯氮吹干。将获得的基底进行刻蚀，刻蚀时间为15min，随后将基底进行清洗，氮气吹干，即可在基底上制备出中间为突柱，直径为500μm，且突柱上设有环形孔洞，孔洞的宽度和深度分别为500μm和150μm的阵列化图案。在获得的基底上倾倒上PDMS，待PDMS流平整个基底后，将其置于烘箱中，80℃的条件下烘4h进行固化，控制PDMS的厚度在150μm。随后将已固化的PDMS撕下来，即可在PDMS上获得与基底结构完全互补的结构。另外选取一片单晶硅，将其先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底，将干燥后的基底放入H2SO4(浓):H2O2＝3:1的混合溶液中，100℃下加热10min，用水冲洗，氮气吹干，即可获得羟基化的硅片。将PDMS蘸取疏水聚合物聚苯乙烯分散液，蘸取时间为20s。将蘸取有聚苯乙烯材料的PDMS压印到羟基化的硅片表面，压印的时间为10s，随后移除PDMS，即可在基底上留下疏水-亲水-疏水图案，如图1所示。
实施例2
将玻璃片先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，用高纯氮吹干。将获得的基底进行刻蚀，刻蚀时间为10min，随后将基底进行清洗，氮气吹干，即可在基底上制备出中间为突柱，直径为300μm，且突柱上设有环形孔洞，孔洞的宽度和深度分别为300μm和100μm的阵列化图案。在获得的基底上倾倒上PDMS，待PDMS流平整个基底后，将其置于烘箱中，120℃的条件下烘150min进行固化，控制PDMS的厚度在100μm。随后将已固化的PDMS撕下来，即可在PDMS上获得与基底结构完全互补的结构。另外选取一片玻璃片，将其先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底，用高纯氮吹干。随后利用O2-Plasma以100W的功率，处理2min，使玻璃片表面羟基化，用水冲洗，氮气吹干，即可获得羟基化的玻璃片。将PDMS蘸取氟化二氧化硅纳米粒子分散液，蘸取时间为10s。将蘸取有氟化二氧化硅纳米粒子分散液的PDMS压印到羟基化的玻璃片表面，压印的时间为15min，随后移除PDMS，即可在基底上留下疏水-亲水-疏水图案，如图1所示。
实施例3
将不锈钢片先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，用高纯氮吹干。将获得的基底进行刻蚀，刻蚀时间为20min，随后将基底进行清洗，氮气吹干，即可在基底上制备出中间为突柱，直径为800μm，且突柱上设有环形孔洞，孔洞的宽度和深度分别为800μm和200μm的阵列化图案。在获得的基底上倾倒上PDMS，待PDMS流平整个基底后，将其置于烘箱中，100℃的条件下烘3h进行固化，控制PDMS的厚度在200μm。随后将已固化的PDMS撕下来，即可在PDMS上获得与基底结构完全互补的结构。另外选取一片不锈钢片，将其先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底，将干燥后的基底放入H2SO4(浓):H2O2＝3:1的混合溶液中，80℃下加热30min，用水冲洗，氮气吹干，即可获得羟基化的不锈钢片。将PDMS蘸取十七氟癸基三甲氧基硅烷溶液，蘸取时间为2min。将蘸取有十七氟癸基三甲氧基硅烷溶液的PDMS压印到羟基化的不锈钢表面，压印的时间为30min，随后移除PDMS，即可在基底上留下疏水-亲水-疏水图案，如图1所示。
实施例4
将石英片先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，用高纯氮吹干。将获得的基底进行刻蚀，刻蚀时间为5min，随后将基底进行清洗，氮气吹干，即可在基底上制备出中间为突柱，直径为100μm，且突柱上设有环形孔洞，孔洞的宽度和深度分别为100μm和50μm的阵列化图案。在获得的基底上倾倒上PDMS，待PDMS流平整个基底后，将其置于烘箱中，150℃的条件下烘2h进行固化，控制PDMS的厚度在50μm。随后将已固化的PDMS撕下来，即可在PDMS上获得与基底结构完全互补的结构。另外选取一片石英片，将其先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底，用高纯氮吹干。随后利用O2-Plasma以100W的功率，处理2min，用水冲洗，氮气吹干，使石英片表面羟基化。将PDMS蘸取疏水性硫醇试剂1H,1H,2H,2H-全氟癸硫醇溶液，蘸取时间为10min。将蘸取有1H,1H,2H,2H-全氟癸硫醇溶液的PDMS压印到羟基化的不锈钢表面，压印的时间为30min，随后移除PDMS，即可在基底上留下疏水-亲水-疏水图案，如图1所示。
实施例5
将加入氯化钠(1M)的50fmolμL-1多肽(血管舒缓激肽)溶液滴加在实施例1所得到的疏水-亲水-疏水相间的环形图案化表面。当溶剂完全蒸发，样品中的盐会被排除到中间环形的亲水区域，而多肽样品溶液会被富集到内侧的疏水区域，其EDX能谱图如图2所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1.选取基底，将基底依次放入到丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中超声清洗，再取出基底干燥，将干燥的基底进行蚀刻，得到中间突柱呈阵列化设置的基底，且突柱上设有环形孔洞，随后用超纯水冲洗，氮气吹干；
S2.在步骤S1得到的基底上倾倒上PDMS，待PDMS流平整个基底后，使PDMS发生固化，将固化后的PDMS撕下来，即可在PDMS上获得与基底结构完全互补的结构；
S3.选取另一块基底，先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中超声清洗，取出基底干燥，再将基底表面进行亲水化处理；
S4.将步骤S2得到的PDMS蘸取疏水性材料分散液；
S5.将步骤S4得到的PDMS压印在步骤S2得到的基底上，随后移除PDMS，即可在基底上留下疏水-亲水-疏水图案。
2.根据权利要求1所述的用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，其特征在于，在步骤S1中，所述中间突柱的直径为100～800μm；所述环形孔洞的宽度直径为100～800μm，其深度为50μm～200μm。
3.根据权利要求1所述的用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，其特征在于，在步骤S2中，将基底置于烘箱中80～150℃的条件下烘2～4h进行固化，控制PDMS的厚度在50μm～200μm。
4.根据权利要求1所述的用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，其特征在于，在步骤S3中，所述亲水化处理方式为O2-Plasma或在质量比为3:1的浓H2SO4和H2O2混合溶液中80～100℃加热10～30min。
5.根据权利要求1所述的用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，其特征在于，在步骤S4中，疏水性材料包括疏水聚合物、疏水硅烷偶联剂、疏水纳米粒子或疏水性硫醇试剂，蘸取的时间为10s～10min。
6.根据权利要求1所述的用于生物样品质谱检测的图案化基底的制备工艺，其特征在于，在步骤S5中，压印时间为10s～30min。
7.基于权利要求1至6任一所述的制备工艺制备出的图案化基底，其特征在于，包括基底，所述基底表面上附着有内侧疏水区域、亲水裸基底区域以及外侧疏水区域，若干内侧疏水区域阵列在所述基底表面上，每个所述内侧疏水区域的外侧设有环形所述亲水裸基底区域，所述基底表面上所述亲水裸基底区域的外侧为所述外侧疏水区域。
8.根据权利要求7所述的图案化基底，其特征在于，所述基底的材料包括单晶硅、不锈钢片、石英或玻璃片。
9.基于权利要求7所述的图案化基底用于生物样品质谱检测，其特征在于，包括如下步骤：
F1.将含盐的0.5～5μL多肽、蛋白或核酸溶液滴加在步骤S5获得的基底表面，在室温下自然干燥，大部分盐和分析物会被分别沉积在基底表面的亲水裸基底区域和内侧疏水区域；
F2.将0.5～5μL基质溶液滴加在步骤F1获得的基底表面，室温下自然干燥，小部分盐会被进一步排到基底中间的亲水裸基底区域，分析物和基质的共结晶则会分布在里面的疏水材料区域；
F3.将步骤F2获得的基底直接放进MALDI-TOF MS仪器中进行分析和检测。
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