CN114288461A

CN114288461A - 一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法

Info

Publication number: CN114288461A
Application number: CN202111554119.XA
Authority: CN
Inventors: 安潇; 杨雪晴; 张翔; 王世革
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital; University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114288461B

Abstract

本发明公开了一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，具体是研发出结构稳定、尺寸合适、聚多巴胺包被成像物的栓塞微球，在增强粘附和治疗效果的基础上同时实现了可视化。体外实验证实其生物相容性和X射线成像能力。所述微球也可以负载化疗药物，动物实验验证了其良好的栓塞效果。设计体现了一种优秀的多功能栓塞物合成的新方法。

Description

一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法

技术领域

本发明属于生物材料制备领域，具体涉及一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法。

背景技术

介入手术在临床上已占据举足轻重的地位，聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)颗粒是介入中常用的固体栓塞物，其作用机制是通过吸水膨胀来机械性填塞目标血管，但是PVA先天存在缺乏粘附性及不能在X线下显像的不足。

鉴于目前医疗实践中缺乏影像可视化的粘附性固体栓塞剂，本发明以具备良好生物相容性的PVA为原料，结合高粘附的聚多巴胺(PDA)，同时添加碘(I)等高电子密度物，从而实现新型栓塞材料可视性、粘附性、负载性和永久性的多功能统一，并已行实验验证。

发明内容

为了解决上述技术问题及达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将聚乙烯醇搅拌下分次溶解于去离子水中，置于油浴锅内升温至90℃，搅拌1h，冷却至室温；

S2：将S1中所得溶液逐滴加入含有失水山梨醇单油酸酯的液体石蜡中，S1中所得溶液与液体石蜡体积比为1:5，在50-70℃下搅拌30min；

S3：在S2所得产物中加入25％戊二醛，搅拌10min后，加入1M盐酸溶液，持续搅拌5h；

S4：将S3所得产物离心洗涤，经冻干后获得PVA微球，再通过标准筛网(150目)过滤；

S5：将S4所得PVA微球在I₂/KI(1:2)溶液中室温浸泡12-48h，去除溶液后，水洗3次，冷冻干燥；

S6：多巴胺溶于Tris缓冲液中，再加入S5所得微球，室温搅拌过夜，离心洗涤3次，冷冻干燥，得到所述含碘PVA制备微球。

优选的，所述S1中聚乙烯醇1788型的质量浓度为5％-15％；

优选的，所述S2中失水山梨醇单油酸酯与液体石蜡的质量比为1:40-1:50；

优选的，所述S3中所加入戊二醛的体积是总体积的2％-5％，加入盐酸的体积是总体积的2％-5％；

优选的，所述S4中所得产物在4000-6000rpm的转速下离心5min，分离出沉淀，再用乙醇和去离子水分别清洗3次；

优选的，所述S5中I₂/KI(1:2)水溶液的浓度为0.4mol/L-1.2mol/L；

优选的，所述S6中Tris缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.5。

本发明的有益效果是：所制备产物形态完整光滑，分散性好，尺寸符合栓塞要求；通过控制水相浓度、乳化剂含量与油水相比例，可以得到不同大小的微球。同时在制作过程中能够加入抗肿瘤药物，达到化疗和栓塞的双重作用。本发明的优点在于此方法实现了所制备微球的可视性、粘附性、负载性和永久性的多功能统一。

附图说明

图1A和1D分别为PVA和所述制备微球的扫描电子显微镜(SEM)图像；1B和1E分别显示了PVA和所述制备微球的SEM表面形貌；1C和1F分别为PVA和所述制备微球对应的粒径分布；

图2A为PVA和所述制备微球的傅里叶红外变换光谱(FTIR)图谱；2B为所述制备微球的溶胀率时间变化图；

图3A为所述制备微球培养后的相对细胞活力；3B为所述制备微球与红细胞在37℃下孵育2h的溶血率；3C为细胞毒性试验图片；

图4A为不同浓度所述制备微球的CT体外Hounsfield Unit(HU)值，插图为所述制备微球的体外CT图像；4B为大鼠经门静脉栓塞后体内HU值，插图显示大鼠相应的体内CT图像；

图5A为5-FU的标准曲线；5B为不同5-FU浓度下所述制备微球5-FU负载效率；5C为37℃下负载5-FU的所述制备微球在PBS中的体外释放曲线；

图6为I-PVA@PDA微球栓塞大鼠肝脏；

图7为I-PVA@PDA微球栓塞后2天与14天大鼠肝组织的病理学。

具体实施方式

为了对本发明的方案及效果做出清楚完整的描述，通过以下实施例进行详细说明。

实施例1

以含失水山梨醇单油酸酯(0.9g)的液体石蜡(50mL)为连续相，以10％PVA(1788型)水溶液为分散相。将分散相滴加到60℃的连续相中，磁力搅拌30min获得乳液。

然后，加入戊二醛(1.8mL，25％)搅拌10min，以盐酸溶液(1M，1.5mL)作催化剂交联5h，离心回收PVA微球，用乙醇和蒸馏水分别洗涤3次。

随即，冻干微球，通过标准筛(150目)过滤，在0.8mol/L I₂/KI(1:2)水溶液中室温浸泡24h，去除溶液后用水冲洗3次。

下一步，将0.2g盐酸多巴胺(DA·HCl)溶于Tris缓冲液(40mL，0.01mol/L，pH＝8.5)中，并加入100mg上述所制备物。室温搅拌过夜，离心(5000rpm，5min)获得I-PVA@PDA微球，离心洗涤3次。

最后，将I-PVA@PDA微球冷冻干燥。

实施例2

SEM观察冻干PVA和I-PVA@PDA微球的形貌。从SEM图像中随机抽取100个微球，使用Image J软件分析微球的平均粒径和粒径分布。如图1所示，PVA和I-PVA@PDA微球均球形完整、表面光滑、无团聚，两种微球的形貌非常相似。PVA微球和I-PVA@PDA微球的平均直径分别为133.7±41.9μm和147.9±42.0μm。

FTIR测定PVA和I-PVA@PDA微球的化学键组成。具体将样品与溴化钾充分混合，压片机压片，红外光谱仪测试4000-500cm^-1范围的FTIR谱图。分析图2，在3550-3200cm^-1之间观察到的大波段与分子间和分子内氢键的O-H伸缩振动有所关联。

PVA微球在1140cm^-1处有一个强烈峰，这与碳链的对称C-C或C-O伸缩模式有关。包裹PDA后在1510和1620cm^-1处观察到新的吸收峰，对应于DA的酰胺基团和芳香环的N-H剪切振动，证明含碘PVA微球成功包裹了PDA。

I-PVA@PDA微球在生理盐水中浸泡不同时间后，取出离心，去除多余水分，再次称重，用公式计算溶胀率。微球在初始阶段表现出快速溶胀行为，随后随着浸泡时间的增加溶胀趋势逐渐降低。数据是I-PVA@PDA微球的溶胀率在浸泡20min后为100.68±20.2％，60min时增加到145.8±30.8％。

实施例3

I-PVA@PDA微球的细胞相容性与血液相容性测试。采用L929间接接触法测定I-PVA@PDA微球的细胞毒性，将不同浓度(10mg/mL、20mg/mL和40mg/mL)的I-PVA@PDA微球分散在DMEM中，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h来制备微球提取物。L929以8×10³细胞/孔的密度播种于96孔培养板上，24h后在孔中加入100μL含DMEM微球提取物。

24h后去除培养基，每孔加入10μL CCK-8的DMEM溶液，再孵育2h。酶标仪测定溶液450nm的吸光度，CCK-8法测定细胞相对活力。倒置相差显微镜观察L929细胞的形态和存活情况。检测结果显示，三种不同浓度(10mg/mL、20mg/mL和40mg/mL)的I-PVA@PDA微球组24h细胞相对活力分别为98.1％、97.5％和96.2％，表明细胞生长良好。

小鼠红细胞取自健康小鼠全血1ml，离心及PBS洗涤3次。体外0.2mL小鼠红细胞悬浮液与0.6mL不同浓度的I-PVA@PDA微球在37℃共孵育2h，接受同样体积的蒸馏水和PBS的小鼠红细胞悬浮液分别作为对照。紫外-可见分光光度计在541nm处测定各上清液的吸光度，计算溶血率。如图3所示，不同浓度I-PVA@PDA微球的溶血率均低于3％。各微球组都没有出现溶血迹象，这与阴性对照(PBS)组相似，而阳性对照(蒸馏水)组的溶血作用明显。以上结果表明，I-PVA@PDA微球具有良好的生物相容性。

实施例4

体外评估I-PVA@PDA微球的X线成像性，将I-PVA@PDA微球以不同浓度(0-80mg/mL)分散到琼脂糖中，然后CT扫描。体内则将麻醉的SD大鼠注射5mg PVA颗粒(对照组)或I-PVA@PDA微球。从图4可以看出，随I-PVA@PDA浓度的增加HU值呈线性增大，CT图像显示出明显的浓度依赖性增亮效果，说明所制备的I-PVA@PDA微球具有X线成像能力。

实施例5

I-PVA@PDA微球以及5-FU(50mg/mL、100mg/mL)完全溶解在PBS(1mL，pH＝7.4)中。室温下搅拌24h，5000rpm离心5min；将上清液转移到干净的离心管中，使用紫外-可见光谱仪计算上清液中未加载的5-FU在265nm处的吸光度，5-FU的负载率通过加载量除以总量计算而得到。

将制备的I-PVA@PDA@5-FU(0.1g)分散在PBS(3mL，pH＝7.4)中，加入透析袋。将透析袋浸入离心管中的PBS中，37℃下恒温振荡，然后测定5-FU的浓度。每组进行三次平行试验，计算累积释放量。结果I-PVA@PDA微球中5-FU(100mg/mL)的包封率为53.82±2.76％。如图5所示，I-PVA@PDA@5-FU微球显示出缓慢的药物释放效果。

实施例6

SD大鼠麻醉后置于手术台上，脱毛消毒，切开腹部，暴露盲肠，通过穿刺盲肠静脉注射商品化PVA或所制备I-PVA@PDA微球各5mg进入肝脏，操作步骤见图6，然后止血后关腹，正常喂养。栓塞后14日处死大鼠，取下肝脏，固定包埋染色，拍摄病理照片。

如图7所示，门静脉栓塞后2天，对照组注射商品化PVA的肝脏组织可见少量的肝细胞脂肪变性，胞质中可见大小不一的空泡(红色箭头)。实验组注射I-PVA@PDA微球肝脏组织可见边缘肝细胞片状坏死，坏死区域内可见坏死细胞碎片(黄色箭头)，汇管区周围可见少量的炎性细胞浸润(黑色箭头)。

栓塞后第14天，对照组的肝脏组织可见肝小叶内肝细胞小灶性坏死(黄色箭头)，伴有炎性细胞浸润(黑色箭头)；弥漫性的肝细胞气球样变，核居中，胞质空泡化(红色箭头)。实验组注射I-PVA@PDA微球，大鼠肝脏组织可见肝细胞灶性坏死，坏死灶内可见坏死细胞碎片(黄色箭头)，伴有炎性细胞浸润(黑色箭头)，以及出血(蓝色箭头)；肝小叶内可见多处炎性细胞小灶性浸润(橙色箭头)；弥漫性的肝细胞气球样变，核居中，胞质空泡化(红色箭头)。结果表明所制备的I-PVA@PDA微球的栓塞效果优于商品化PVA。

Claims

1.一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，所述S1中聚乙烯醇1788型的质量浓度为5％-15％。

3.根据权利要求1所述一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，所述S2中失水山梨醇单油酸酯与液体石蜡的质量比为1:40-1:50。

4.根据权利要求1所述一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，所述S3中所加入戊二醛的体积是总体积的2％-5％，加入盐酸的体积是总体积的2％-5％。

5.根据权利要求1所述一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，所述S4中所得产物在4000-6000rpm的转速下离心5min，分离出沉淀，再用乙醇和去离子水分别清洗3次。

6.根据权利要求1所述一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，所述S5中I₂/KI(1:2)水溶液的浓度为0.4mol/L-1.2mol/L。

7.根据权利要求1所述一种新型多功能栓塞物的制备和同步修饰方法，其特征在于，所述S6中Tris缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.5。