CN114286686A - 与cd63激动剂相关的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供了治疗细胞增殖性疾病的方法。在一些实施例中，这些方法包括向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂，其中向所述受试者施用所述CD63激动剂以增强对所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞的T细胞应答。在一些实施例中，这些方法包括向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂和治疗有效量的T细胞激活剂。还提供了例如在实践本公开的方法中使用的药物组合物和试剂盒。

Description

与CD63激动剂相关的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年7月24日提交的美国临时专利申请第62/878,069号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明内容

提供了治疗细胞增殖性疾病的方法。在一些实施例中，所述方法包括向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂，其中向所述受试者施用所述CD63激动剂以增强对所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞的T细胞应答。在一些实施例中，所述方法包括向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂和治疗有效量的T细胞激活剂。还提供了例如在实践本公开的方法中使用的药物组合物和试剂盒。

附图说明

图1：示出了使用第一抗CD63抗体激动剂通过CD63和CD3共刺激人T细胞的图。

图2：示出了使用第二抗CD63抗体激动剂通过CD63和CD3共刺激人T细胞的图。

图3：示出了人卵巢癌中T细胞上CD63表达水平的流式细胞术数据。

图4：示出了人类头颈癌患者肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上相对于血液的CD63表达水平的流式细胞术数据。

图5：证明CD63激动剂治疗癌症的体内功效的数据。

具体实施方式

在更详细地描述本公开的方法、组合物和试剂盒之前，应当理解的是，方法、组合物和试剂盒不限于所描述的特定实施例，因为此类方法、组合物和试剂盒当然可以改变。还应当理解的是，因为方法、组合物和试剂盒的范围将仅由所附权利要求书限定，所以本文中所使用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。

在提供取值范围的情况下，应当理解的是，在所述范围的上限与下限之间的每个插入值(到下限的十分之一单位，除非上下文清楚地另外指明)以及在所陈述范围内的任何其它所陈述的值或插入值均被涵盖在方法、组合物和试剂盒之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包含在更小范围之内，并且也被涵盖在方法、组合物和试剂盒之内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限制。在所陈述的范围包含限制中的一者或两者的情况下，排除了所包含的限制中的任一者或两者的范围也被包含在方法、组合物和试剂盒之内。

本文提供了某些范围，其中数值前面出现术语“约”。术语“约”在本文用于为其后面出现的精确数字以及接近或靠近所述术语后面的数字的数提供文字性支持。在确定数字是否接近或靠近具体叙述的数字时，接近或靠近的未叙述的数字可以为这样的数字，其在出现的上下文中，提供具体叙述的数字的基本等同形式。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与所述方法、组合物和试剂盒所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含有。尽管与本文所述的方法、组合物和试剂盒类似或等同的任何方法、组合物和试剂盒也可以用于实践或测试所述方法、组合物和试剂盒，但现在描述代表性的说明性方法、组合物和试剂盒。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每篇单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入本文一样，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的材料和/或方法。任何出版物的引用均为其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本方法、组合物和试剂盒无权先于此类出版物，因为所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，所述实际出版日期可能需要独立确认。

应当指出的是，除非上下文另外清楚地指明，否则如本文中以及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。另外注意，权利要求可以撰写为排除任何可选的要素。因此，本声明旨在充当对于此类与权利要求要素的叙述相结合的排除性术语(如“单独地”、“仅”等)的使用或“否定型”限制的使用的先行基础。

应当理解的是，为清除起见而在单独实施例的上下文中描述的方法、组合物和试剂盒的某些特征还可以以组合形式提供于单个实施例中。相反，为清除起见而在单个实施例的上下文中描述的方法、组合物和试剂盒的各种特征也可以分开提供或以任何合适的子组合形式提供。实施例的所有组合均被明确涵盖在本公开中，并且在本文中公开，如同每种组合被单独和明确地公开一样，只要这种组合包括可操作的过程和/或组合物。另外，描述这些变量的实施例中列出的所有子组合也被明确地涵盖在本方法、组合物和试剂盒中，并且在本文中公开，如同每个此类子组合在本文中单独和明确地公开一样。

当阅读了本公开，对本领域技术人员显而易见，本文描述和阐释的每个单个实施例具有分开的组分和特征，其可以容易与任何其它数个实施例的特征分开或结合，而不背离本发明的精神或范围。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

方法

本公开的方面包括治疗细胞增殖性疾病的方法。根据一些实施例，这些方法包括向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂，其中向所述受试者施用所述CD63激动剂以增强对所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞的T细胞应答。本公开的方法至少部分基于发明人的惊人发现，即CD63激动剂增强了对细胞增殖性疾病(例如，癌症)的异常增殖细胞的T细胞应答，无论异常增殖细胞是否过表达CD63。因此，在某些实施例中，向受试者施用CD63激动剂，与细胞增殖性疾病的异常增殖细胞上CD63的表达水平无关。根据一些实施例，所述方法包含向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂，其中在所述施用时，并未怀疑所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞表现出CD63过表达。“并未怀疑表现出CD63过表达”意指与第二细胞群(例如，与异常增殖细胞具有相同组织类型的非异常增殖(例如，非癌)细胞)相比，并未怀疑CD63在异常增殖细胞(例如，癌细胞)上以更高水平表达。在某些实施例中，在所述施用时，已经确定所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞不过表达CD63。根据一些实施例，该方法包括做出这样的决定。在某些实施例中，施用CD63激动剂的受试者正在接受T细胞激活疗法。这种T细胞激活疗法的非限制性实例是免疫检查点抑制剂疗法，例如，受试者正在接受PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、VISTA、B7-H3等抑制剂中一种或多种的疗法。本公开的方法可以进一步包括向受试者施用T细胞激活疗法。因此，本公开的方面包括治疗细胞增殖性疾病的方法，该方法包括给患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂和治疗有效量的T细胞激活剂。现在将描述关于本公开的方法的实施例的细节。

四跨膜蛋白是在造血细胞的细胞表面和颗粒膜上表达的完整膜蛋白，是具有特定整合素的多分子复合物的组成部分。四跨膜蛋白CD63(也称为LAMP-3、黑色素瘤相关抗原ME491、TSPAN30、MLA1和OMA81H)是一种溶酶体膜糖蛋白，在血小板激活后易位至质膜。CD63(UniProtKB-P08962)用作TIMP1的细胞表面受体，在ITGB1的激活和整合素信号传导中发挥作用，从而导致AKT、FAK/PTK2和MAP激酶的激活。CD63在激活的血小板、单核细胞和巨噬细胞上表达，并且在粒细胞、T细胞和B细胞上弱表达。其位于嗜碱性颗粒膜以及淋巴细胞和粒细胞的质膜上。CD63是白细胞糖蛋白的TM4超家族(包含CD9、CD37和CD53)的成员，这些白细胞糖蛋白包含四个跨膜区。CD63可能在吞噬细胞和细胞内溶酶体-吞噬体融合事件中发挥作用。CD63缺乏症与Hermansky-Pudlak综合征有关。

可以将CD63激动剂施用于多个受试者中的任何一个受试者。在某些实施例中，受试者是“哺乳动物”或“哺乳动物类”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物类别内的生物体，包含食肉动物(例如，狗和猫)、啮齿目动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类动物(例如，人类、黑猩猩和猴子)。根据一些实施例，受试者是人。在某些实施例中，受试者是细胞增殖性疾病(例如，癌症)的动物模型(例如，小鼠模型、灵长类动物模型等)。

如上文所概述的，受试者患有细胞增殖性疾病。“细胞增殖性疾病”意指其中多细胞生物中的一个或多个细胞亚群发生不希望的细胞增殖，从而导致伤害(例如，疼痛或生物体预期寿命缩短)的疾病。细胞增殖性疾病包含但不限于癌症、癌症前期、良性肿瘤、血管增殖性疾病(例如，关节炎、再狭窄等)、纤维化疾病(例如，肝硬化、动脉粥样硬化等)、银屑病、表皮囊肿和皮样囊肿、脂肪瘤、腺瘤、毛细血管瘤和皮肤血管瘤、淋巴管瘤、痣病变、畸胎瘤、肾瘤、肌纤维瘤病、成骨肿瘤、发育不良性肿块、系膜细胞增殖性疾病等。

在一些实施例中，受试者患有癌症。由于所获得的增强的抗癌T细胞应答，本主题的方法可以用于治疗多种癌症。在一些实施例中，受试者患有疑似通过例如选择一个或多个免疫检查点通路来逃避免疫系统(例如，效应T细胞)的癌症。如本文所用，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞的生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。可以使用本主题方法治疗的癌症的实例包含但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。这种癌症的更具体的实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、各种类型的头颈癌等。在某些方面，受试者患有选自以下的癌症：黑素瘤、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌(RCC)、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施例中，受试者患有已经由美国食品和药物管理局(FDA)和/或欧洲药物管理局(EMA)批准施用T细胞激活剂(例如，免疫检查点抑制剂(例如，CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、LAG-3抑制剂、TIM-3抑制剂、IDO抑制剂、TIGIT抑制剂、VISTA抑制剂、B7/H3抑制剂等)、T细胞共刺激受体的激动剂、T细胞抑制信号的拮抗剂等)来治疗癌症来治疗(单独或与第二种抗癌剂组合使用)的癌症。

“CD63激动剂”是指确定具有刺激CD63的活性的试剂。用于确定CD63结合剂是否为CD63激动剂的示例性测定是这样一种测定，其中针对板结合的CD63激动剂和相应的可溶性CD63激动剂评估CD4 T细胞的共刺激。当与板结合而非可溶时，试剂发生的共刺激(或与可溶时相比，当与板结合时，试剂的共刺激更大)表明试剂是CD63激动剂，例如，因为板结合型试剂能够将CD63分子集中在细胞表面，从而促进通过CD63的信号传导。

在某些方面，例如使用用于筛选小分子(例如，通过筛选小分子的组合文库)、抗体(例如，通过抗体文库的噬菌体或酵母展示)、配体等的合适方法鉴定CD63激动剂结合CD63的能力和随后筛选刺激CD63的能力。

本文所述的CD63激动剂中的任何一个均可以特异性结合CD63。如果这种CD63激动剂以例如大于或等于约10⁵M^-1的亲和力或K_a(即，与1/M为单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)结合或缔合CD63，则其“特异性结合”CD63。在某些实施例中，CD63激动剂结合CD63的K_a大于或等于约10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或10¹³M^-1。“高亲和力”结合是指以至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少10¹³M^-1或更大的K_a进行结合。替代地，亲和力可以定义为以M单位(例如，10^-5M至10^-13M，或更小)进行的特定结合相互作用的平衡解离常数(K_D)。在某些方面，特异性结合是指CD63激动剂与CD63结合的K_D小于或等于约10^-5M、小于或等于约10^-6M、小于或等于约10^-7M、小于或等于约10^-8M、或者小于或等于约10^-9M、10^-10M、10^-11M或10^-12M或更小。CD63激动剂与CD63的结合亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如，通过竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)、平衡透析，通过使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如，BIAcore 2000仪器，使用制造商概述的一般程序)和通过放射免疫测定法等。

使用直接结合或竞争性结合测定的方法可用于测量候选CD63激动剂对在细胞(例如，T细胞)表面表达的CD63的亲和力。在直接结合测定中，可以使用缀合到荧光团或放射性同位素的候选抗CD63激动剂或含有供标记抗体检测的N端或C端表位标签的候选CD63激动剂来测量平衡结合常数(K_D)。如果标记或标签不可行或不合需要，则可以使用竞争性结合测定来确定半数最大抑制浓度(IC₅₀)，即可检测到标记的竞争剂的最大信号的50％的未标记候选CD63激动剂的量。然后可以从测得的IC₅₀值计算出K_D值。当在较低浓度范围内测量高亲和力相互作用时，配体耗竭将更为明显，并且可以通过减少实验中添加的细胞数量或通过增加结合反应体积来避免配体耗竭或使配体耗竭最小化。

施用于受试者的CD63激动剂可以不同。在某些方面，CD63激动剂是小分子。如本文所用，“小分子”是分子量为1000原子质量单位(amu)或更小的化合物。在一些实施例中，小分子是750amu或更低、500amu或更低、400amu或更低、300amu或更低、或200amu或更低。在某些方面，小分子不是由重复的分子单元(诸如存在于聚合物中)制成的。在一些实施例中，CD63激动剂是已知结合CD63的小分子。在其它方面，例如使用用于筛选小分子的合适的方法，例如通过筛选小分子的组合文库，来鉴定小分子CD63激动剂。

在一些实施例中，CD63激动剂是肽或多肽。当CD63激动剂是肽或多肽时，激动剂可以是CD63配体。所关注的CD63配体包括但不限于金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1；UniProtKB-P01033)、整合素β1(ITGB1；UniProtKB-Q5T3E5)或其CD63结合衍生物，包括其CD63结合片段。如本文所用，“衍生物”肽或多肽CD63激动剂(例如，配体、抗体等)是指结合并刺激CD63但具有比野生型/亲本CD63激动剂更少或更多的氨基酸、相对于野生型/亲本CD63激动剂具有一个或多个氨基酸取代、或其任意组合的肽或多肽。

在某些方面，CD63激动剂是特异性结合CD63的抗体。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包含任何同种型的抗体或免疫球蛋白(例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgE、IgD、IgA、IgM等)、完整抗体(例如，由四聚体构成的抗体，所述四聚体又由重链和轻链多肽的两个二聚体构成)；单链抗体；保持与CD63特异性结合的抗体片段(例如，全链或单链抗体片段)，所述抗体片段包含但不限于Fv、单链Fv(scFv)、Fab、F(ab')₂、Fab'、(scFv')₂和双抗体；嵌合抗体；单克隆抗体、人抗体、人源化抗体(例如，人源化完整抗体、人源化抗体片段等)；以及融合蛋白，包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白或其片段，例如，抗体Fc区或其片段。可以用例如体内显像剂等将抗体可检测地标记。抗体可以进一步缀合至其它部分，诸如，如聚乙二醇(PEG)等。融合至抗体Fc区(或其片段)、缀合至PEG等可用于例如在向受试者给药时增加抗体的血清半衰期。

CD63激动剂可以是已知的CD63结合剂。例如，在一些实施例中，CD63激动剂是已知特异性结合CD63并被确定为CD63激动剂的抗体。在一个非限制性实例中，CD63激动剂可以是具有MX-49.129.5抗人CD63单克隆抗体(来自圣克鲁斯生物技术公司)的结合特性的抗体。例如，CD63激动剂可以是与MX-49.129.5抗人CD63抗体竞争结合人CD63的抗体。可以使用本领域已知的竞争性结合测定法很容易地确定第一抗体是否与第二抗体“竞争”结合该化合物。例如，可以通过抗体竞争测定来鉴定竞争抗体。例如，第一抗体的样品可以结合到固体载体上。然后，添加怀疑能够与这种第一抗体竞争的第二抗体的样品。两种抗体的一种被标记。如果标记的抗体和未标记的抗体结合到化合物上分离的和离散的位点，则无论是否存在可疑的竞争抗体，标记的抗体都将结合到相同的水平。然而，如果相互作用的位点相同或重叠，则未标记的抗体就会竞争，那么与抗原结合的标记的抗体的量会降低。如果未标记的抗体过量存在，那么将结合很少标记的抗体(如果有的话)。

出于本公开的目的，竞争性抗体是将抗体与化合物的结合降低约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、或约99％或更多的抗体。进行这种竞争测定的程序的详情在本领域中是众所周知的，并且可以在例如Harlow和Lane，《抗体技术实验指南》(Antibodies,A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1988，567-569，1988，ISBN 0-87969-314-2中找到。可以通过使用纯化的抗体对此类测定进行定量。可以通过针对自身滴定一种抗体来建立标准曲线，即相同的抗体同时用于标记和竞争者。可以滴定未标记的竞争抗体抑制标记抗体与板结合的能力。可以绘制结果，并且可以比较实现所需的结合抑制程度所需的浓度。

可以使用本领域已知的多种技术(包含使用杂交瘤、重组、噬菌体展示技术或其组合)制备特异性结合CD63的抗体(例如，例如人CD63；UniProtKB-P08962)。例如，可以使用噬菌体展示的方法来制备和分离抗体。噬菌体展示用于蛋白质相互作用的高通量筛选。噬菌体可以用于展示从库或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用CD63(例如，使用结合或捕获到固体表面或珠粒上的标记的CD63)选择或鉴定表达结合CD63的抗原结合结构域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包含从噬菌体中用Fab、Fv(来自轻链或重链的单个Fv区)表达的fd和M13结合结构域，或与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的二硫键稳定的Fv抗体结构域。示例性方法阐述于以下文献中：例如，美国专利第5,969,108号，Hoogenboom、H.R.和Chames，《今日免疫学》(Immunol.Today)2000，21:371；Nagy等人，《自然医学》(Nat.Med.)2002，8:801；Huie等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2001，98:2682；Lui等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)2002，315:1063，所述文献中的每一个文献均通过引用并入本文。一些出版物(例如，Marks等人，《生物/技术》(Bio/Technology)1992，10:779-783)已经描述了通过链改组以及组合感染和体内重组产生高亲和力人抗体作为构建大噬菌体文库的策略。在另一个实施方案中，核糖体展示可以用于替代噬菌体作为展示平台(参见，例如，Hanes等人，《国家生物技术》(Nat.Biotechnol)2000，18:1287；Wilson等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2001，98:3750；或Irving等人，《免疫学方法杂志》(JImmunol.Methods)2001，248:31)。可以对细胞表面文库进行抗体筛选(Boder等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)2000，97:10701；Daugherty等人，《免疫学方法杂志》(J Immunol.Methods)2000，243:211)。此类程序提供了传统杂交瘤技术的替代性方法，用于分离和随后的克隆单克隆抗体。

选择噬菌体之后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区，并用于产生完整抗体(包含人抗体或任何期望的抗原结合片段)，并在任何期望的宿主(包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达所述抗体编码区。例如，可以使用本领域中已知的方法，采用重组产生Fv、scFv、Fab、F(ab')₂和Fab'片段的技术。

如上所述，被施用治疗有效量的CD63激动剂的受试者可能正在接受T细胞激活疗法。在某些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用这种T细胞激活疗法。根据一些实施例，将CD63激动剂施用于受试者以增强T细胞激活疗法。“T细胞激活疗法”是指包括向受试者施用T细胞激活剂的疗法。如本文所用，“T细胞激活剂”是刺激T细胞或T细胞群中的免疫应答的试剂。此种免疫应答涉及存在于T细胞表面的T细胞受体(TCR)与非共价地存在于抗原呈递细胞(APC)表面的小型肽抗原通过主要组织相容性复合物(MHC；在人体中也被称为人类白细胞抗原(HLA)复合物)结合。这种结合表示免疫系统的靶向机制，并且是T细胞激活和效应子功能所必需的分子相互作用。在靶向表位特异性细胞后，通过将APC上的共刺激蛋白与T细胞上的对应共刺激蛋白结合，对靶向的T细胞进行激活。这两种信号—表位/TCR结合以及APC共刺激蛋白与T细胞共刺激蛋白的结合—均是驱动T细胞特异性和激活所必需的。TCR对给定的表位具有特异性；然而，共刺激蛋白不是表位特异性的，而是通常在所有T细胞或大的T细胞亚群上表达。

可以使用各种测定，以便确定是否已经在T细胞或T细胞群中刺激了免疫应答，即，T细胞或T细胞群是否已经被“激活”。在某些方面，可以通过测量T细胞的抗原诱导的细胞因子的产生来确定T细胞中免疫应答的刺激。在一些实施例中，可以通过测量T细胞的抗原诱导的IFNγ、IL-4、IL-2、IL-10、IL-17和/或TNFα的产生来确定T细胞中免疫应答的刺激。在一些实施例中，可以通过细胞内细胞因子染色然后通过流式细胞术来测量T细胞的抗原产生的细胞因子的产生。在一些实施例中，可以通过表面捕获染色然后通过流式细胞术来测量T细胞的抗原诱导的细胞因子的产生。在一些实施例中，可以通过确定激活的T细胞培养物的上清液中的细胞因子浓度来测量T细胞的抗原诱导的细胞因子的产生。在一些实施例中，可以通过ELISA进行这种测量。

在一些实施例中，可以通过ELISPOT测定来测量T细胞的抗原产生的细胞因子的产生。通常，ELISPOT测定所采用的技术非常类似于夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)技术。将抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)无菌地涂覆在PVDF(聚偏二氟乙烯)支持的微板上。根据抗体对所讨论的细胞因子的特异性选择抗体。将板封闭(例如，用与测定中的任何抗体不反应的血清蛋白)。将所关注的细胞与抗原或有丝分裂原一起以不同的密度铺板，并且然后置于潮湿的37℃下的CO₂培养箱中，持续指定的时间段。通过高表面积PVDF膜上的包被抗体局部地捕获激活细胞分泌的细胞因子。在洗涤孔以去除细胞、碎片和培养基组分之后，将特异于细胞因子的二抗(例如，生物素化的多克隆抗体)加入孔中。这种抗体与靶细胞因子的独特表位发生反应，并且因此被用于检测捕获的细胞因子。在洗涤以去除任何未结合的生物素化抗体后，然后使用抗生物素蛋白-HRP和沉淀底物(例如，AEC、BCIP/NBT)使检测到的细胞因子可视化。有色的终产物(斑点，通常是深蓝色)通常表示单个产生细胞因子的细胞。可以手动对斑点进行计数(例如，使用解剖显微镜)或使用自动读取器对斑点进行计数，以捕获微孔图像并分析斑点的数量和大小。在一些实施例中，每个斑点与单个产生细胞因子的细胞相关。

在一些情况下，由T细胞激活剂激活的T细胞对存在于细胞增殖性疾病基础上的异常增殖细胞(例如，患有癌症的个体中的癌细胞)上的表位具有特异性，并且使此类T细胞与T细胞激活剂接触增加了T细胞对异常增殖细胞的细胞毒性活性、增加了此类表位特异性T细胞的数量，或其组合。在一些实施例中，CD63激动剂进一步增强细胞毒活性的增加。

可以将多种试剂用作T细胞激活剂。在某些实施例中，T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。如本文所用，“免疫检查点抑制剂”是防止抑制免疫系统中任何组分(如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号传导)的任何试剂(例如，小分子、核酸、蛋白质(例如，抗体))。根据一些实施例，免疫检查点抑制剂选自细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)抑制剂、T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)、B7-H3抑制剂及其任何组合。

根据一些实施例，T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的激动剂。这种激动剂的非限制性实例包括OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂和CD40激动剂。

在某些实施例中，T细胞激活剂是T细胞抑制信号的拮抗剂。

针对T细胞抑制剂(如PD-1或CTLA-4)的抑制性抗体可增加T细胞的激活。这些抑制性T细胞信号不仅在对自身抗原的自然耐受中发挥作用，而且可以在限制T细胞对肿瘤抗原的功能方面发挥作用。因此，当向携带肿瘤的宿主施用阻断性抗体时，这些抗体会增加T细胞激活/对肿瘤的应答，从而导致免疫介导的肿瘤破坏增加。

根据一些实施例，T细胞激活剂是细胞因子。在本公开的上下文中，所关注的细胞因子是促进T细胞激活(例如，IL-1等)、促进激活的T细胞(例如，IL-2等)的增殖等的细胞因子。可以与CD63激动剂一起施用的细胞因子的非限制性实例包含IL-1、IL-2、IL-4、IL-15及其任何组合。

在某些实施例中，T细胞激活剂是阻断免疫抑制细胞因子的试剂。这种T细胞激活剂的非限制性实例是TGF-β受体抑制剂。

在一些实施例中，T细胞激活剂是抑制性免疫受体的拮抗剂。在某些方面，此种拮抗剂直接结合到抑制性免疫受体，从而例如通过防止受体结合到其配体来阻断抑制性免疫受体的激活。在其它方面，此种拮抗剂结合到抑制性免疫受体的配体，从而通过防止受体结合到其配体来阻断抑制性免疫受体的激活。可以与CD63激动剂一起施用的抑制性免疫受体的拮抗剂包含但不限于TGF-β。

在某些实施例中，被施用CD63激动剂的受试者正在接受先天免疫系统刺激剂疗法。根据一些实施例，该方法进一步包括向受试者施用先天免疫系统刺激剂疗法。任选地，在施用(例如，初始施用CD63激动剂、T细胞激活剂或两者(如果存在于单个制剂中))时，并未怀疑细胞增殖性疾病的异常增殖细胞表现出CD63过表达。

如本文所用，“先天免疫系统刺激剂”是在受试者中刺激先天免疫系统应答的试剂。可用于刺激先天免疫系统的试剂的实例包括但不限于结合一种或多种Toll样受体(TLR)，例如一种或多种TLR1-TLR9的试剂。大多数哺乳动物物种有10-13种类型的TLR，并且每种受体都能识别特定的配体并诱导广泛的炎症级联反应。

在一些实施例中，先天免疫系统刺激剂是包括未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。现在了解到，细菌DNA的免疫刺激作用是特定碱环境(CpG基序)中存在未甲基化的CpG二核苷酸的结果，这在细菌DNA中常见，但在脊椎动物DNA中是甲基化的且代表性不足(Krieg等人，1995《自然》(Nature)374:546-549；Krieg，1999《生物化学与生物物理学报》(Biochim.Biophys.Acta)93321:1-10)。细菌DNA的免疫刺激作用可以用含有这些CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(ODN)模拟。这种CpG ODN对以下具有高度刺激作用：人和鼠白细胞，其诱导B细胞增殖；细胞因子和免疫球蛋白分泌；自然杀伤(NK)细胞裂解活性和IFN-γ分泌；和激活树突细胞(DC)和其他抗原呈递细胞以表达共刺激分子并分泌细胞因子，尤其是Th1样细胞因子，该细胞因子对促进Th1样T细胞反应的发展是重要的。天然磷酸二酯骨架CpGODN的这些免疫刺激作用是高度CpG特异性的，因为如果CpG基序被甲基化、改变为GpC或以其他方式被消除或改变，则所述作用显著降低(Krieg等人，1995《自然》(Nature)374:546-549；Hartmann等人，1999《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)96:9305-10)。

CD63激动剂以及如果也施用的话，T细胞激活剂和/或先天免疫系统刺激剂以治疗有效量施用。“治疗有效量”意指足以产生期望的结果的剂量，例如，与对照相比，足以实现有益或期望的治疗(包含预防)结果(如使增殖性疾病的症状减轻)的量。当细胞增殖性疾病是癌症时，在一些实施方案中，治疗有效量足以减慢肿瘤的生长、减小肿瘤的大小等。可以以一次或多次施用的方式来施用有效量。

当所述方法包括施用CD63激动剂和第二试剂(例如，T细胞激活剂和/或先天免疫系统刺激剂)的组合时，可以同时施用CD63激动剂和第二试剂(例如，在相同或不同的制剂中)、顺序施用或两者兼有。例如，根据某些实施例，在施用CD63激动剂之前、与施用CD63激动剂同时或两者兼有，向个体施用第二试剂。在一些实施例中，在施用第二试剂之前、与施用第二试剂同时或两者兼有，向个体施用CD63激动剂。

根据一些实施例，所述方法包括将CD63激动剂施用于已经施用了T细胞激活剂(例如，免疫检查点阻断剂(例如PD1抑制剂等)或其他T细胞激活剂)的受试者，并且施用CD63激动剂以增强先前施用的T细胞激活剂的功效。这种增强作用的非限制性实例在下面的实验部分中进行了说明。

在某些实施例中，根据批准用于个体用途的给药方案来施用一种或多种试剂。在一些实施例中，与在不施用CD63激动剂的情况下施用第二试剂时所使用的给药方案相比，施用CD63激动剂允许根据涉及一种或多种较低和/或较少频率的剂量和/或减少的周期数的给药方案来施用第二试剂。在一些实施例中，与在不施用第二试剂的情况下施用CD63激动剂时所使用的给药方案相比，施用第二试剂允许根据涉及一种或多种较低和/或较少频率的剂量和/或减少的周期数的给药方案来施用CD63激动剂。

如上文所指出，在某些实施例中，同时施用一剂或多剂的CD63激动剂和第二试剂；在一些这种实施例中，可以以相同的药物组合物形式施用此类试剂。然而，在一些实施例中，CD63激动剂和第二试剂以不同组合物和/或在不同时间施用于个体。例如，可以在施用第二试剂之前(例如，在特定周期中)施用CD63激动剂。可选地，可以在施用CD63激动剂之前(例如，在特定周期中)施用第二试剂。待施用的第二试剂的施用时间可以始于施用CD63激动剂之后至少1小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时或长达5天或更久。

在一个实例中，在施用第二试剂之前将CD63激动剂施用给个体达期望的时间段。在某些方面，此种方案“引发”免疫系统例如以通过T细胞激活剂使T细胞激活和/或通过先天免疫系统刺激剂刺激先天免疫系统。在另一个实例中，在施用CD63激动剂之前，将第二试剂施用给个体达期望的时间段。在某些方面，此种方案“引发”免疫系统以通过CD63激动剂使T细胞激活。

在一些实施例中，相对于另一种试剂的施用，对一种试剂的施用进行具体地定时。例如，在一些实施例中，施用第一试剂，以便观察到特定效果(或预期观察到特定效果，例如基于示出给定的给药方案与所关注的特定效果之间的相关性的群体研究)。

在某些方面，可以根据经验(例如使用离体、体内和/或体外模型)评估或确定以组合形式施用的试剂的期望的相对给药方案；在一些实施例中，在体内进行此种评估或经验性确定、在患者群体中进行此种评估或经验性确定(例如，以便建立相关性)或者可替代地在所关注的特定受试者中进行此种评估或经验性确定。

例如，可以在施用T细胞激活剂和/或先天免疫系统刺激剂后一段时间施用CD63激动剂。可以将时间段选择为与分别由T细胞激活剂和/或先天免疫系统刺激剂引起的T细胞激活和/或先天免疫系统刺激的增加相关联。在一些实施例中，分别与施用T细胞激活剂和/或先天免疫系统刺激剂之前(或施用时)观察到的T细胞激活和/或先天免疫系统刺激相比，相关时间段允许(例如，与之相关)T细胞激活和/或先天免疫系统刺激增加10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、100％或更多、150％或更多、200％或更多、250％或更多、300％或更多、350％或更多、400％或更多、450％或更多或500％或更多。

在一些实施例中，根据包含至少两个周期的间歇性给药方案施用CD63激动剂和第二试剂。当两种或超过两种试剂组合施用且每种试剂通过这种间歇的周期性方案施用时，不同试剂的单独剂量可以彼此相互交叉。在某些方面，在第一试剂的一个剂量之后的一段时间施用第二试剂的一个或多个剂量。在一些实施例中，在第一试剂的一个剂量之后的一段时间施用第二试剂的每个剂量。在某些方面，在施用第二试剂的一个剂量一段时间之后，接着施用第一试剂的每个剂量。在一些实施例中，在第二试剂的至少一对剂量之间施用第一试剂的两个或更多个剂量；在某些方面，在第一试剂的至少一对剂量之间施用第二试剂的两个或更多个剂量。在一些实施例中，相同试剂的不同剂量以共同的时间间隔分开；在一些实施方案中，相同试剂的不同剂量之间的时间间隔变化。在某些方面，不同试剂的不同剂量以共同的时间间隔彼此分开；在一些实施例中，不同试剂的不同剂量以不同的时间间隔彼此分开。

用于使两种间歇的周期性给药方案(例如，用于增强CD63激动剂、T细胞激活剂或两者的效果)相互交叉的一个示例性方案可以包含：(a)第一给药期，在此期间向个体施用治疗有效量的第一试剂；(b)第一休息期；(c)第二给药期，在此期间向个体施用治疗有效量的第二试剂和任选的第三试剂；以及(d)第二休息期。

在一些实施例中，第一休息期和第二休息期可以对应于相同的小时数或天数。可替代地，在一些实施例中，第一休息期和第二休息期是不同的，第一休息期比第二休息期长，或者反之亦然。在一些实施例中，休息期中的每一个对应于120小时、96小时、72小时、48小时、24小时、12小时、6小时、30小时、1小时或更短时间。在一些实施例中，如果第二休息期长于第一休息期，则可以将其定义为数天或数周而不是数小时(例如1天、3天、5天、1周、2周、4周或更长时间)。

如果第一休息期的长度是由特定的生物学事件或治疗事件的存在或发展确定的(例如，增加的T细胞活性)，则第二休息期的长度可以根据不同的因素，单独或组合地确定。示例性的此类因素可以包含施用试剂所针对的癌症的类型和/或阶段；第一试剂的特性和/或性质(例如，药代动力学性质)；和/或患者对用第一试剂疗法的响应的一个或多个特征。在一些实施例中，可以根据所施用的试剂中的一种或另一种试剂(或两者)的药代动力学性质(例如，通过血浆浓度水平评估的药代动力学性质)来调节一个或两个休息期的长度。例如，当相关试剂的血浆浓度低于约1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml或0.001μg/ml时，任选地在对个体响应的一个或多个特征进行评估或其它考虑时，可以认为相关的休息期完成了。

在某些方面，可以凭经验确定施用特定试剂的周期数。而且，在一些实施例中，与一个或多个其它周期相比，一个或多个周期所遵循的精确方案(例如，剂量的数量、剂量的间隔(例如，相对于彼此或相对于另一个事件，如施用另一种疗法)、剂量的量等)可以是不同的。

可以通过独立地选自口服、肠胃外(例如，通过静脉内、动脉内、皮下、肌内或硬膜外注射)、局部或鼻内施用的施用途径来施用CD63激动剂和第二试剂(如果也施用的话)(例如T细胞激活剂和/或先天免疫系统刺激剂)。根据某些实施例，同时(在同一药物组合物或单独的药物组合物中)或按顺序地经肠胃外施用CD63激动剂和第二试剂两者。

如上所述，本公开的方面包括用于治疗细胞增殖性疾病(例如，癌症)的方法。治疗意指至少改善一种或多种与个体的细胞增殖性疾病相关联的症状，其中改善是广义上的，是指至少降低与所治疗的细胞增殖性疾病(例如，癌症)相关联的参数(例如，症状)的幅度。因此，治疗还包含完全抑制细胞增殖性疾病或与其相关联的至少一种或多种症状的情况，例如，防止疾病或症状发生或停止(例如，终止)所述疾病或症状，从而使得个体不再患有细胞增殖性疾病，或者至少不再患有表征细胞增殖性的症状。当受试者患有癌症时，“治疗”癌症可以包括减缓受试者中肿瘤的生长速度。

组合物

如上文所概述的，本公开的方面包含药物组合物。在某些实施例中，本公开的药物组合物包含CD63激动剂(例如，上述任何CD63激动剂)和药学上可接受的赋形剂。根据一些实施例，本公开的药物组合物包含CD63激动剂(例如，上文所述的CD63激动剂中的任何一种)、T细胞激活剂(例如，上文所述的T细胞激活剂中的任何一种)和药学上可接受的赋形剂。在某些实施例中，本公开的药物组合物包含CD63激动剂(例如，上文所述的任何CD63激动剂)、先天免疫系统刺激剂(例如，上文所述的任何先天免疫系统刺激剂)和药学上可接受的赋形剂。

应当理解的是，本公开的药物组合物可以包含上文在与本主题的方法相关的部分中描述的任何试剂和特征，出于简洁的目的，本文不再详细重复。

在一些实施例中，药物组合物中存在的CD63激动剂是小分子。在某些方面，药物组合物中存在的CD63激动剂是肽或多肽。当CD63激动剂是肽或多肽时，CD63激动剂可以是CD63配体、特异性结合CD63的抗体等。当CD63激动剂是抗体时，所述抗体可以选自IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')2和Fab'。

当本公开的药物组合物包含T细胞激活剂时，在某些实施例中，所述T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。当T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂时，根据一些实施例，免疫检查点抑制剂选自细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)抑制剂、T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)、B7-H3抑制剂及其任何组合。

当本公开的药物组合物包括T细胞激活剂时，在某些实施例中，所述T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的激动剂，例如但不限于OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂、CD40激动剂等。

当本公开的药物组合物包括T细胞激活剂时，在一些实施例中，所述T细胞激活剂是T细胞抑制信号的拮抗剂、细胞因子、阻断免疫抑制性细胞因子的试剂(例如，TGF-β受体抑制剂)和/或抑制性免疫受体的拮抗剂。在一些实施例中，本公开的药物组合物CD63激动剂和T细胞激活剂的组合(即，两种或多种)，包括但不限于本文所述的T细胞激活剂的任何组合。

可以将CD63激动剂、T细胞激活剂或两者掺入多种调配物中以用于治疗性施用。更具体地说，一种或多种试剂(即，CD63激动剂和/或T细胞激活剂)可以通过与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、注射剂、吸入剂和气溶胶。

用于向受试者施用的试剂的调配物(例如，适合于人类施用的调配物)通常是无菌的，并且可以进一步不含可检测的热原或根据选定的施用途径禁止向患者施用的其它污染物。

在药物剂型中，一种或多种试剂可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者所述一种或多种试剂也可以单独使用或以适当的关联以及组合形式与其它药学活性化合物一起使用。以下方法和载剂/赋形剂仅仅是实例，而决不是限制性的。

对于口服制剂，一种或多种试剂可以单独使用或以组合形式与适当的添加剂一起使用，以制备片剂、粉剂、颗粒或胶囊，例如，与常规添加剂(如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉)一起使用；与粘合剂(如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶)一起使用；与崩解剂(如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠)一起使用；与润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)一起使用；并且如果需要的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂一起使用。

可以配制用于肠胃外(例如，静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、鞘内、皮下等)施用的一种或多种试剂。在某些方面，通过将一种或多种试剂溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(如植物油或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中来配制用于注射的一种或多种试剂；并且如果需要的话，使用如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂等常规添加剂。

可以通过将具有期望纯度的一种或多种试剂与任选的生理学上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张力剂混合来制备包含所述一种或多种试剂的药物组合物。可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或其组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其它碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂，如EDTA；糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如Tween、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。

药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中在施用之前用无菌溶液重构冻干制剂。重构冻干组合物的标准程序是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间移除的体积)；然而，包括抗菌剂的溶液可以用于产生用于肠胃外施用的药物组合物。

可以在pH缓冲溶液中，例如，在约4.0到约7.0、或约5.0到约6.0、或可替代地约5.5的pH范围下，制备一种或多种试剂的水性制剂。适合于此范围内pH的缓冲液的实例包含磷酸盐-、组氨酸-、柠檬酸盐-、琥珀酸盐-、乙酸盐-缓冲液和其它有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以为约1mM到约100mM或约5mM到约50mM，这取决于例如缓冲液和制剂的所需张力。

可以包含张力剂来调节制剂的张力。示例张力剂包含氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸、糖以及其组合的组的任何组分。在一些实施例中，水性制剂是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能是合适的。术语“等渗”表示具有与其比较的一些其它溶液相同的张力的溶液，如生理盐溶液或血清。可以以约5mM到约350mM的量使用张力剂，例如以100mM到350mM的量使用。

还可以将表面活性剂添加到制剂中以减少聚集和/或使所述制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。表面活性剂实例包含聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。合适的聚氧乙烯山梨糖醇酐-脂肪酸酯的实例是聚山梨醇酯20(以商标Tween 20^TM销售)和聚山梨醇酯80(以商标Tween 80^TM销售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的实例是以名称

F68或Poloxamer 188^TM销售的聚乙烯-聚丙烯共聚物。合适的聚氧乙烯烷基醚的实例是以商标Brij^TM销售的聚氧乙烯烷基醚。表面活性剂的实例浓度范围可以为约0.001％到约1％w/v。

也可以添加冻干保护剂以保护CD63激动剂和/或T细胞激活剂在冻干过程中免受不稳定条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包含糖(包含葡萄糖和蔗糖)、多元醇(包含甘露醇、山梨醇和甘油)和氨基酸(包含丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。可以包含约10mM到500nM的量的冻干保护剂。

在一些实施例中，药物组合物包含CD63激动剂和/或T细胞激活剂，以及上述组分(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂)中的一种或多种，并且基本上不含一种或多种防腐剂，如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯铵及其组合。在其它实施例中，制剂中包含防腐剂，例如，以约0.001到约2％(w/v)的浓度范围。

试剂盒

如上文所概述的，本公开提供了试剂盒。试剂盒可用于例如实践本公开的方法。根据一些实施例，本主题的试剂盒包括药物组合物，该药物组合物包括CD63激动剂，例如本文别处描述的任何CD63激动剂。在某些方面，提供了包含本文所述的药物组合物中的任何一种的试剂盒，所述试剂盒包含上文在与本公开的组合物相关的部分中描述的药物组合物中的任何一种。本公开的试剂盒可以包含用于向患有细胞增殖性疾病(例如，癌症)的受试者施用所述药物组合物的说明书。在一些实施例中，本公开的试剂盒包含用于向受试者施用所述药物组合物以增强对所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞的T细胞应答的说明书。说明书可包括用于将药物组合物施用于受试者的说明书，而与细胞增殖性疾病的异常增殖细胞上CD63的表达水平无关。在某些实施例中，本公开的试剂盒包含用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述药物组合物的说明书，其中并未怀疑所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞表现出CD63过表达。根据一些实施例，本公开的试剂盒包括用于将药物组合物施用于接受T细胞激活疗法的受试者的说明书，以例如增强T细胞激活疗法。

在一些实施例中，提供了试剂盒，所述试剂盒包含CD63激动剂、T细胞激活剂以及用于向患有细胞增殖性疾病(例如，癌症)的受试者施用所述CD63激动剂和T细胞激活剂的说明书。所述说明书可以进一步包含上述试剂盒说明书中的任何一个说明书，例如，用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述药物组合物以增强对细胞增殖性疾病(例如，癌症)的异常增殖细胞的T细胞应答，用于向受试者施用所述药物组合物等，而与细胞增殖性疾病的异常增殖细胞上CD63的表达水平无关。所述CD63激动剂和T细胞激活剂可以存在于同一容器中，或者可以存在于不同容器中。当CD63激动剂和T细胞激活剂存在于不同容器中时，试剂盒可以包括在施用T细胞激活剂(例如，免疫检查点阻断剂(如PD1抑制剂等)或其他T细胞激活剂)之前和/或之后施用CD63激动剂来增强T细胞激活剂的功效。

本主题的试剂盒可以包含以单位剂量(例如，安瓿)或多剂量形式存在的一定量的组合物。因此，在某些实施例中，试剂盒可以包含一种或多种(例如，两种或两种以上)单位剂量(例如，安瓿)的组合物，所述组合物包含CD63激动剂、T细胞激活剂或两者。如本文中所使用的，术语“单位剂量”是指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含按足以产生期望效果的量计算的预定量的组合物。单位剂量的量取决于各种因素，如用于受试者的特定CD63激动剂和/或T细胞激活剂、要达到的效果以及与CD63激动剂和/或T细胞激活剂相关的药效学。在又其它实施例中，试剂盒可以包含单个多剂量的组合物。

应当理解的是，本公开的试剂盒可以包含上文在与本主题的方法和组合物相关的部分中描述的任何试剂和特征，出于简洁的目的，在此引入了这些试剂和特征，本文不再详细重复。

在一些实施例中，试剂盒中存在的CD63激动剂是小分子。在某些方面，试剂盒中存在的CD63激动剂是肽或多肽。当CD63激动剂是肽或多肽时，CD63激动剂可以是CD63配体、特异性结合CD63的抗体等。当CD63激动剂是抗体时，所述抗体可以选自IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')2和Fab'。

当本公开的试剂盒包括T细胞激活剂时，在某些实施例中，所述T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。当T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂时，根据一些实施例，免疫检查点抑制剂选自细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)抑制剂、T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)、B7-H3抑制剂及其任何组合。

当本公开的试剂盒包括T细胞激活剂时，在某些实施例中，所述T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的激动剂，例如但不限于OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂、CD40激动剂等。

当本公开的试剂盒包括T细胞激活剂时，在一些实施例中，所述T细胞激活剂是T细胞抑制信号的拮抗剂、细胞因子、阻断免疫抑制性细胞因子的试剂(例如，TGF-β受体抑制剂)和/或抑制性免疫受体的拮抗剂。在一些实施例中，本公开的试剂盒包括CD63激动剂和T细胞激活剂的组合(即，两种或多种)，包括但不限于本文所述的T细胞激活剂的任何组合。

在一些实施例中，试剂盒中存在的CD63激动剂是小分子。在某些方面，试剂盒中存在的CD63激动剂是肽或多肽。当CD63激动剂是肽或多肽时，CD63激动剂可以是CD63配体、特异性结合CD63的抗体等。当CD63激动剂是抗体时，所述抗体可以选自IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')2和Fab'。

当本公开的试剂盒包含T细胞激活剂时，在某些方面，所述T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。所关注的免疫检查点抑制剂包含但不限于T细胞共刺激受体的激动剂、T细胞抑制信号的拮抗剂等。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂选自：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂、OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关型蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂和CD40激动剂。当本公开的试剂盒包含T细胞激活剂时，在某些方面，所述T细胞激活剂是细胞因子。在一些实施例中，当本公开的试剂盒包含T细胞激活剂时，所述T细胞激活剂是抑制性免疫受体的拮抗剂。在某些方面，本公开的试剂盒包含本文所描述的任何T细胞激活剂的组合(即，两种或超过两种)。

试剂盒的组分可以存在于不同容器中，或者多个组分可以存在于单一容器中。合适的容器包含单个管(例如，小瓶)、安瓿、板(例如，96孔板、384孔板等)的一个或多个孔等。

试剂盒中包含的说明书(例如，使用说明书(IFU))可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或次包装有关联)等。在其它实施例中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，便携式闪存驱动器、DVD、CD-ROM、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在又其它实施例中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于从远程源，例如通过因特网，获得说明书的手段。该实施例的一个实例是包括网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。

以下实施例以说明性方式而不是以限制性方式提供。

实验

实例1—通过CD63和CD3共刺激人T细胞

可以将作用于TCR(如抗CD3抗体)的结合剂和作用于潜在的共刺激靶标的结合剂串联提供给纯化的T细胞。可以将所得的T细胞增殖量化并用于测量共刺激靶标的功效。图1是示出了使用抗CD3和抗人CD63共刺激抗体(克隆MX-49.129.5)的T细胞共刺激测定结果的图。抗OX40(普罗维登斯，9B12)用作阳性对照并且1％BSA/DPBS用作阴性对照。

从冷冻的PBMC中对CD4⁺T细胞进行纯化，并将其重悬于补充有青霉素、链霉素、谷氨酰胺、非必需氨基酸、HEPES缓冲液和丙酮酸钠的RPMI培养基中。将PHA-L(2μg/ml)和IL2(60IU/ml)添加到培养基中以使细胞激活，然后将所述细胞在37℃下、5％的CO₂中孵育96小时。用山羊抗小鼠IgG对96孔板进行涂覆，并且然后用BSA封闭。在1％BSA/DPBS中以2ng/ml制备小鼠抗人CD3(OKT3)，并将其添加到平板中。然后，以160ng/ml至1.25ng/ml之间的连续两倍稀释度添加小鼠抗人CD63或320ng/ml至2.5ng/ml之间的连续两倍稀释度添加小鼠抗人OX40。然后将激活的CD4⁺T细胞以每孔50000个细胞的量添加到200μl培养基中的每个孔中，并且然后在37℃下孵育48小时。然后按照制造商的说明书，使用Click-it DNA标记试剂盒(英杰公司(Invitrogen))用终浓度为10μM的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)标记细胞，持续18小时。然后用活死染色剂(E450；eBioscience公司(eBiosciences))对细胞进行处理，并且使用Alex647试剂(英杰公司)进行显影。然后通过流式细胞术对增殖细胞进行定量。

如图1所示，MX-49.129.5抗CD63克隆以剂量依赖性方式刺激CD4⁺T细胞的增殖，在低至2.5ng/ml的抗CD63的浓度下观察到增殖。相比之下，在低至10-20ng/ml的浓度下观察到通过经典CD4 T细胞共刺激因子OX40的增殖。

使用抗小鼠CD63抗体MA5-24169(赛默飞世尔科技公司)的第二项研究中(体内小鼠研究中使用的抗体如下文所述，如图5所示)，使用阴性选择试剂盒富集了C57Bl/6小鼠的小鼠脾细胞中的CD4 T细胞。用250ng/ml的CD3和在0.125μg/ml至2μg/ml范围内的CD63激动剂(MA5-24169抗体)处理细胞。然后按照制造商的说明书，使用Click-it DNA标记试剂盒(英杰公司(Invitrogen))用终浓度为10μM的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)标记细胞。用IL-2(50U)处理细胞，并在第3天收获。然后用活死染色剂(E450；eBioscience公司(eBiosciences))对细胞进行处理，并且使用Alex647试剂(英杰公司)进行显影。然后通过流式细胞术对增殖细胞进行定量。结果示于图2中。

数据表明，MX-49.129.5和MA5-24169抗CD63抗体在与抗CD3共培养时均导致CD4⁺T细胞的剂量依赖性共刺激/刺激(有丝分裂)，从而证明与CD63激动剂的共刺激增加了T细胞增殖。

实例2—癌症中CD63的表达水平

通过流式细胞术评估肿瘤环境中T细胞上CD63的表达水平。图3示出了流式细胞术数据，该数据显示了人卵巢癌中T细胞上CD63的表达水平。T细胞上CD63水平的增加与肿瘤中常规CD4⁺、Treg、CD8⁺和CD14⁺细胞上HLA-DR表达的增加相关。

图4示出了流式细胞术数据，该数据显示了人类头颈癌患者肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上相对于血液的CD63表达水平。与来自同一患者的血液相比，在TIL中可以观察到CD63的上调。

实例3—CD63激动剂治疗癌症的体内功效

在本实例中，小鼠在第0天皮下接种了4e5 MCA205肿瘤细胞。每周测量肿瘤大小2到3次。图5的A组示出了CD63激动剂在作为单一治疗剂施用时的轻微功效。在第9、12和15天，用200μg仓鼠IgG对照抗体或抗小鼠CD63 i.p.(赛默飞克隆(MA5-24169)以50μg、100μg或200μg的剂量水平治疗小鼠。用抗CD63进行单药治疗的0/5小鼠排斥其肿瘤。图5的B组示出了当从第12天开始在抗PD1治疗后施用时，CD63治疗使得11/15小鼠排斥肿瘤的清除率增强。单独施用抗-PD1治疗使得3/15治愈，证明CD63激动剂增强了抗-PD1治疗。没有用对照IgG治疗的小鼠排斥其肿瘤。

因此，以上仅说明本公开的原理。应当理解的是，本领域技术人员能够设计各种布置，尽管未在本文明确描述或示出，但所述各种布置体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而贡献的概念，并且被解释为不限于这些具体列举的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施例以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，预期此类等同物包括当前已知的等同物以及未来开发的等同物，即，开发的不论结构如何执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并不旨在限于本文示出和描述的示范性实施例。

Claims (69)

1.一种治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括：

向患有细胞增殖性疾病的受试者施用治疗有效量的CD63激动剂，

其中向所述受试者施用所述CD63激动剂以增强对所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞的T细胞应答。

2.根据权利要求1所述的方法，其中向所述受试者施用所述CD63激动剂，与细胞增殖性疾病的异常增殖细胞上CD63的表达水平无关。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中施用所述CD63激动剂的所述受试者正在接受T细胞激活疗法。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述T细胞激活疗法是免疫检查点抑制剂疗法。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中将所述CD63激动剂施用于所述受试者以增强所述T细胞激活疗法。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用T细胞激活剂。

7.一种治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括：

向患有细胞增殖性疾病的受试者施用：

治疗有效量的CD63激动剂；以及

治疗有效量的T细胞激活剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中向所述受试者施用所述CD63激动剂以增强对所述细胞增殖性疾病的异常增殖细胞的T细胞应答。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述CD63激动剂是小分子。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述CD63激动剂是肽或多肽。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CD63激动剂是CD63配体。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述CD63激动剂是特异性结合CD63的抗体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述特异性结合CD63的抗体选自由以下组成的组：IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂和Fab'。

14.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)抑制剂、T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)、B7-H3抑制剂及其任何组合。

16.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的激动剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述T细胞激活剂选自由以下组成的组：OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂和CD40激动剂。

18.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活剂是T细胞抑制信号的拮抗剂。

19.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活剂是细胞因子。

20.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活剂是阻断免疫抑制性细胞因子的试剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述阻断免疫抑制性细胞因子的试剂是TGF-β受体抑制剂。

22.根据权利要求6至13中任一项所述的方法，其中所述T细胞激活剂是抑制性免疫受体的拮抗剂。

23.根据权利要求6至22中任一项所述的方法，其中同时施用所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂。

24.根据权利要求6至22中任一项所述的方法，其中按顺序施用所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述T细胞激活剂在所述CD63激动剂施用。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。

27.一种药物组合物，其包括：

CD63激动剂；

T细胞激活剂；以及

药学上可接受的赋形剂。

28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述CD63激动剂是小分子。

29.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述CD63激动剂是肽或多肽。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述CD63激动剂是CD63配体。

31.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述CD63激动剂是特异性结合CD63的抗体。

32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述特异性结合CD63的抗体选自由以下组成的组：IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')2和Fab'。

33.根据权利要求27到32中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。

34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3(TIM-3)抑制剂、吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)抑制剂、T细胞激活的V域Ig抑制剂(VISTA)、B7-H3抑制剂及其任何组合。

35.根据权利要求27至32中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的激动剂。

36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂选自由以下组成的组：OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂和CD40激动剂。

37.根据权利要求27至32中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂是T细胞抑制信号的拮抗剂。

38.根据权利要求27至32中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂是细胞因子。

39.根据权利要求27至32中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂是阻断免疫抑制性细胞因子的试剂。

40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述阻断免疫抑制性细胞因子的试剂是TGF-β受体抑制剂。

41.根据权利要求27至32中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞激活剂是抑制性免疫受体的拮抗剂。

42.一种试剂盒，其包括：

包含CD63激动剂的药物组合物；以及

用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述药物组合物的说明书。

43.根据权利要求42所述的试剂盒，其包括用于向接受T细胞激活疗法的受试者施用所述药物组合物的说明书。

44.根据权利要求43所述的试剂盒，其包括用于向所述受试者施用所述CD63激动剂以增强所述T细胞激活疗法的说明书。

45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述药物组合物进一步包括T细胞激活剂。

46.一种试剂盒，其包括：

权利要求27至41中任一项所述的药物组合物；以及

用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述药物组合物的说明书。

47.根据权利要求42至46中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一个或多个单位剂量的所述药物组合物。

48.根据权利要求42至46中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括两个或超过两个单位剂量的所述药物组合物。

49.根据权利要求42至48中任一项所述的试剂盒，其包括用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述药物组合物的说明书，而与所述细胞增殖性疾病的所述异常增殖细胞上CD63的表达水平无关。

50.一种试剂盒，其包括：

CD63激动剂；

T细胞激活剂；以及

用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂的说明书。

51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一个或多个单位剂量的所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂。

52.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括两个或超过两个单位剂量的所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂。

53.根据权利要求50至52中任一项所述的试剂盒，其中所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂存在于不同容器中。

54.根据权利要求50至53中任一项所述的试剂盒，其中所述说明书用于向患有细胞增殖性疾病的受试者施用所述CD63激动剂和所述T细胞激活剂，而与所述细胞增殖性疾病的所述异常增殖细胞上CD63的表达水平无关。

55.根据权利要求42至54中任一项所述的试剂盒，其中所述CD63激动剂是小分子。

56.根据权利要求42至54中任一项所述的试剂盒，其中所述CD63激动剂是肽或多肽。

57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中所述CD63激动剂是CD63配体。

58.根据权利要求56所述的试剂盒，其中所述CD63激动剂是特异性结合CD63的抗体。

59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述特异性结合CD63的抗体选自由以下组成的组：IgG、Fv、scFv、Fab、F(ab')₂和Fab'。

60.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂是免疫检查点抑制剂。

61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)抑制剂、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3(抑制剂、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)抑制剂和吲哚胺(2,3)-双加氧酶(IDO)抑制剂。

62.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的激动剂。

63.根据权利要求62所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂选自由以下组成的组：OX40激动剂、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、CD137激动剂和CD40激动剂。

64.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂是T细胞共刺激受体的拮抗剂。

65.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂是细胞因子。

66.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂是阻断免疫抑制性细胞因子的试剂。

67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中所述阻断免疫抑制性细胞因子的试剂是TGF-β受体抑制剂。

68.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒，其中所述T细胞激活剂是抑制性免疫受体的拮抗剂。

69.根据权利要求42至68中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。

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