CN114280053A - 使用光学显微镜对染色的网织红细胞进行成熟度分类 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用光学显微镜对染色的网织红细胞进行成熟度分类。具体地，本发明涉及一种对来自全血样品的网织红细胞进行成熟度分类的方法，包括：利用超活体凝集染色试剂或荧光凝集染料将样品染色；利用光束照射染色的样品以检测网织红细胞；确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；和根据确定的Λ和Γ值将网织红细胞成熟度分类为4个主要成熟度类别中的1个。

Description

使用光学显微镜对染色的网织红细胞进行成熟度分类
技术领域
本发明涉及一种对来自全血样品的网织红细胞(reticulocyte，网状细胞)进行成熟度分类(maturity classifying)的方法，包括：利用超活体凝集染色试剂(supravitalagglutinating dyeing reagent，体外活体凝集染色试剂)或荧光凝集染料(fluorescentagglutinating dye)将样品染色；利用光束照射(illuminate)染色的样品以检测网织红细胞；确定每个网织红细胞的参数：(i)网状组织面积(reticulum area)(Ar)相对于全细胞面积(whole cell area)(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(perimeter of thereticulum)(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；和根据确定的Λ和Γ值，将网织红细胞成熟度分类为4个主要成熟度类别中的1个。
背景技术
红细胞生成的监测对于确定患者的健康状况和对不同治疗的响应至关重要，例如在缺铁性贫血或化疗恢复期中。在红细胞生成过程中，当晚期成红细胞失去其细胞核时，发育的细胞随后被称为网织红细胞，其含有丝状RNA网络，即网状组织。从外周血中获得的网织红细胞易于获取，并通过测定细胞计数和成熟来指示红细胞(RBC)的繁殖率(Piva etal.,2015,Clinics in Laboratory Medicine,35,133-163)。通常使用两种主要的检测网织红细胞的方法，网状组织的凝集荧光染色或超活体染色。两种染色方法都将细丝状RNA链团聚成网络状细丝，这通过显微镜可观察。
虽然与光学显微镜中手动计数的细胞相比，自动化血液学分析仪更精确、准确和再现地测定网织红细胞参数，但每种分析仪使用不同的试剂，这对与RNA和其它细胞成分的结合表现出不同的敏感性。因此，遍及不同的染色方法，不存在用于确定网织红细胞成熟度的通用分类(Van Den Bossche et al.,2002,Clin.Chem.Lab.Med.,40(1),69-73)。通过确定荧光方法的未成熟网织红细胞分数(IRF)来采取统一分类的方法。IRF是较不成熟网织红细胞的数目与网织红细胞总数相比的分数(Heimpel et al.,2010,Med.Klin.,105,538-543)。然而，由于没有为每个类别找到共识，因此IRF也在不同的分析仪之间变化(Riley etal.,2001,J.Clin.Labor.Anal.,15,267-294)。一种不同的分类方法基于20世纪30年代Ludwig Heilmeyer的著作，其定义了4个成熟类别，包括具有稠密网状组织的不成熟网织红细胞(类别1)、具有广泛而松散的网状网络的网织红细胞(类别2)、具有散乱网状组织网络的网织红细胞(类别3)和具有散乱网状组织颗粒的成熟网织红细胞(类别4)(Riley etal.,2001,J.Clin.Labor.Anal.,15,267-294)。
由于不同自动化血液学分析仪之间的差异，在光学显微镜中手动计数仍然是诊断确定网织红细胞成熟类别的黄金标准。对于确定全血细胞计数的所有参数的装置也越来越感兴趣，所述装置光学上类似于光学显微镜。
因此，需要一种标准度量来分析染色的网织红细胞，其可以连接到手动，特别是自动显微镜分析以及衍生的诊断检测。
发明内容
本发明解决了这一需求并且提供了一种对来自全血样品的网织红细胞进行成熟度分类的方法，包括：(a)利用超活体凝集染色试剂或荧光凝集染料将样品染色；(b)在光检测装置(light detection device，光学检测装置)、优选显微镜中，利用优选波长范围为200nm至780nm的光束照射染色的样品，以检测网织红细胞；(c)确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；和(d)根据确定的Λ和Γ值，将网织红细胞的成熟度分类为4个主要成熟度类别中的1个。该方法有利地允许根据标准度量对网织红细胞进行分类，这在很大程度上独立于所使用的平台或装置，并因此允许根据大多数从业者所熟悉的完善的Heilmeyer分类方案来进行网织红细胞的统一分配。根据本发明的新方法进一步允许基于治疗后或疾病过程中网织红细胞数目的时间依赖性变化来改进诊断读数。
在本发明的优选实施方式中，所述方法另外地包括枚举(enumerate，计算)网织红细胞的步骤作为最后一步。特别优选的是，所述枚举是按类别和按样品进行的。
在进一步优选的实施方式中，利用从NMB(新亚甲基蓝)、亮甲酚蓝、结晶紫、甲基紫和尼罗蓝中选择的超活体凝集染色试剂来进行染色。在又另一个优选实施方式中，利用从吖啶橙、金胺O、D-甲基氧杂羰花青(D-methyloxacarbocyanide，D-甲基氧杂碳氰化物)、溴化乙锭(Ethidine bromide)、派洛宁Y(Pyronin Y)、硫磺素-T(Thioflavin-T)和噻唑橙中选择的凝集荧光染料来进行染色。
染色可以任选地进一步包括化学核酸交联(chemical nucleic acidcrosslinking，化学品核酸交联)的步骤，优选利用氮芥、顺式二氯二氨合铂(II)(cis-diamminedichloroplatinum(II))或衍生物、或氯乙基亚硝基脲(chloro ethyl nitrosourea)(CENU)。
在另一实施方式中，利用包括成像模块的装置来进行上述的步骤(c)。优选成像模块被设计为执行形态分割操作(morphological segmentation operation)。
进一步的实施方式涉及一种如上定义的方法，其另外地包括作为步骤(e)的以下步骤：将每个染色的网织红细胞与已经被专家独立地分类的网织红细胞的图像存储库进行形态比较。优选所述分类导致对形态分类不同于步骤(d)的分类的网织红细胞进行标记。
在优选的实施方式中，所述形态比较包括将染色的网织红细胞的图像应用于基于机器学习的方法(machine-learning-based method)，该方法利用网织红细胞的所述图像存储库的图像进行训练。
在根据本发明的方法的一个实施方式中，成熟度分类包括根据比率Λ/Γ将网织红细胞分配至类别1、2、3或4。在优选的实施方式中，Λ/Γ值约>2.5指示为类别1，Λ/Γ值为约1至约2.5指示为类别2，Λ/Γ值为约0.35至约1指示为类别3且Λ/Γ值约<0.35指示为类别4。
在进一步的方面，本发明涉及一种计算机实现的从拍摄自全血样品的一个或多个图像对网织红细胞进行成熟度分类的方法，包括在图像内确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；和根据Λ和Γ值将网织红细胞的成熟度分类为4个主要类别。所述方法优选地另外地包括枚举网织红细胞的步骤。
在另一方面，本发明涉及一种用于监测和确定受试者的健康状况和/或受试者对治疗的反应的体外方法，包括利用从所述受试者获得的一个或多个全血样品进行如上定义的对网织红细胞进行成熟度分类的方法。
在所述用于监测和确定受试者健康状况和/或受试者对治疗的反应的体外方法的优选实施方式中，当初始样品与在2、3、4、5、6、7天或更多天数后从受试者采集的第二或进一步的样品进行比较时，类别2、3或4、优选类别3或4、更优选类别4的网织红细胞数目增加指示了低网织红细胞疾病(low reticulocyte disease)中受试者健康状况有所改善和/或对治疗的积极响应，或指示了高网织红细胞疾病中受试者健康状况恶化和/或对治疗的消极响应(negative response)。
在进一步的方面，本发明涉及一种装置(device，设备)，包括器件(means，装置)，所述器件用于执行如上定义的对网织红细胞进行成熟度分类的方法或如上定义的用于监测和确定受试者健康状况和/或受试者对治疗的反应的体外方法。
在另一方面，本发明涉及一种数据处理装置，包括器件，所述器件用于执行如上定义的从一个或多个图像对网织红细胞进行成熟度分类的计算机实现的方法。
在最后一个方面，本发明涉及一种计算机程序，包括指令，当该程序被计算机执行时，该指令使计算机执行如上定义的包括形态比较步骤的对网织红细胞进行成熟度分类的方法，或本文定义的计算机实现的方法。
应当理解的是，在不背离本发明的范围的情况下，上述特征和下面将要解释的特征不仅可以以所示的相应组合使用，而且可以以其它组合使用或单独使用。
附图说明
图1示出了根据本发明在亮场透射模式下记录的网织红细胞的定量成熟分类。分类基于细胞内染色的网状组织面积与全细胞面积相比的百分比(Λ)以及基于所有RNA片段的周长相对于其面积的分数(Γ)。指示了由Heilmeyer提出的四个网织红细胞分类。类别1(封闭的圆圈(1))是最不成熟的类别，(2)中示出了示例细胞。类别2(具有点的开口圆圈(3))对应于第二最年轻(second youngest，第二最不成熟)的网织红细胞群体((4)中示出了示例细胞)，然后是类别3(开口圆圈(5))，具有示例细胞(6)，和类别4(虚线圆圈(7)；示例细胞(8))为最成熟的群体。
图2示出了染色的网织红细胞的分成单独的RGB(R：红色(10)，G：绿色(11)，B：蓝色(12))8-位图像的亮场透射颜色(9)图像的示例。通过在红色通道上使用Otsu-阈值确定细胞的尺寸。对于网状组织的面积确定，因为细胞壁仅出现在蓝色通道中，因此通过从蓝色通道中减去绿色通道来生成染色的RNA的掩膜。在生成的图像上另外应用ImageJ中的自动阈值，获得染色的网状组织的掩膜(13)。
图3示出了在图1所示的本发明的亮场透射模式下记录的网织红细胞的定量成熟分类的不同描述。在该图中，以与细胞数量(14)相比示出了Λ/Γ比率。该图示出了根据Heilmeyer方案的类别1(封闭的圆圈(1))、类别2(具有点的开口圆圈(3))、类别3(开口圆圈(5))和类别4(虚线圆圈(7))细胞。
具体实施方式
尽管将针对特定实施方式来描述本发明，但这种描述不应解释为限制性的。
在详细描述本发明的示例性实施方式之前，给出了对理解本发明很重要的定义。
除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个”和“一种”还包括相应的复数形式。
在本发明的上下文中，术语“约”表示本领域技术人员将理解仍能确保所讨论特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示与指示数值偏差±25％。在具体的实施方式中，该术语还表示与指示数值偏差±15％、±10％、±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％。
应当理解的是，术语“包含”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由…组成(consisting of)”或“基本上由…组成(essentially consisting of)”被认为是术语“包含(comprising of)”的优选实施方式。如果在下文中组被定义为包含至少一定数量的实施方式，则这意味着还涵盖优选仅由这些实施方式组成的组。
另外，说明书或权利要求中的术语“(i)”、“(ii)”、“(iii)”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”或“第一”、“第二”、“第三”等以及类似用于相似要素之间的区分，并且不一定用于描述相继顺序或时间顺序。
应当理解的是，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方式能够以不同于本文描述或说明的其它顺序进行操作。如果术语与方法、程序或使用的步骤相关，则所述步骤之间没有时间或时间间隔的连贯性，即除非另有说明，否则这些步骤可以同时进行，或者在这些步骤之间可以有数秒、数分钟、数小时、数天、数周等的时间间隔。
应当理解的是，本发明不限于本文描述的特定方法、协议等，因为这些可以改变。还应当理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。
附图应被视为是示意性图示并且附图中所示的要素不一定按比例示出。相反，各种要素被表示为使得它们的功能和通用目的对本领域技术人员变得显而易见。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如上所述，在一个方面，本发明涉及一种对来自全血样品的网织红细胞进行成熟度分类的方法，包括：(a)利用超活体凝集染色试剂或荧光凝集染料将样品染色；(b)在光检测装置、优选显微镜中，利用优选波长范围为200nm至780nm的光束照射染色的样品，以检测网织红细胞；(c)确定每个网织红细胞的参数：(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；和(d)根据确定的Λ和Γ值，将网织红细胞的成熟度分类为4个主要成熟度分类中的1个。
如本文所用的术语“全血样品”涉及通过本领域技术人员已知的合适方法从受试者获得的哺乳动物、优选人类血液样品。在本发明的上下文中使用的样品应优选以临床可接受的方式收集，更优选以保存(preserve)核酸、特别是RNA的方式收集。“全血”主要包含红细胞和前体细胞、白细胞和前体细胞以及悬浮在血浆中的血小板。在某些特定的实施方式中，将样品合并(pooled)。
本发明优选地设想使用非合并样品。在本发明的特定实施方式中，还可以将全血样品的内容物提交给特定的处理步骤。例如，可以将样品稀释或富集。另外，可以添加核酸稳定剂或抗降解剂。在特别优选的实施方式中，设想使用诸如EDTA等抗凝剂。在进一步的特定实施方式中，在染色之前，可以对全血样品进行初始细胞分选或细胞分离步骤。设想此类步骤导致红细胞(包括前体细胞，如网织红细胞)的富集和/或纯化，或网织红细胞的富集和/或纯化。
根据本发明的方法设想了如上定义的使用全血样品的“染色”步骤作为第一步。这一步骤可以使用能够显示出网状组织的面积和周长的任何合适的染色剂进行。因此，染色剂能够至少部分地稳定核酸结构，特别是细胞中的RNA结构，并且能够在合适的光学条件下展示这些结构，优选地当用光照射时。如本文使用的术语“网状组织”是指核酸(特别是RNA，通常是在染色条件下变得可见的核糖体RNA)的网状网络。网状组织是区别网织红细胞与其它血细胞的特定结构。如本文使用的“网织红细胞”涉及没有细胞核的未成熟红细胞。在红细胞生成期间，网织红细胞在骨髓中发育成熟，然后在血流中循环约一天，然后发育成成熟的红细胞。在健康受试者中，成年人血液中的网织红细胞的分数通常为约0.5％至2.5％，并且在婴儿中为约2％至6％。全血样品中的网织红细胞数通常被用作骨髓活动的指标，因为它代表了最近的红细胞生成事件。
由于允许将网织红细胞与成熟红细胞和其它细胞区分开来的网状组织中存在的核酸形式，优选使用提供凝集效应并允许在光学检测程序中提供适当对比的染色剂进行染色。在本发明的优选实施方式中，此种染色方法基于凝集染色试剂。
如本文使用的术语“凝集染色试剂”是指一种染色剂，假定其与细胞内包含核酸的结构、特别是核糖体结合并导致它们结块。在优选的实施方式中，本发明设想使用具有这种功能或能力的所有适合的凝集染色试剂。
在一组优选的实施方式中，凝集染色试剂为超活体凝集染色剂。“超活体”染料通常用于对从生物体中取出的活细胞进行染色。超活体凝集染色剂的优选示例包括NMB(新亚甲基蓝)、亮甲酚蓝、结晶紫、甲基紫和尼罗蓝。进一步设想了使用其任何适合的衍生物或功能等效物。还设想了使用Azure B或其任何适合的衍生物。本发明进一步设想了使用可能尚未开发且满足上述功能的超活体凝集染色试剂。特别优选使用NMB(新亚甲基蓝)。进一步的信息可从合适的文献资源中获得，诸如，例如Samuel M.Rapoport,2019,Thereticulocyte,1st ed.,CRC Press。
在另一组优选的实施方式中，凝集染色试剂为荧光凝集染色剂。这种染料还与含有核酸的结构、特别是核糖体相互作用，并在暴露于合适的激发光时提供荧光效果。此类染色试剂的例子包括吖啶橙、金胺O、D-甲基氧杂羰花青、溴化乙锭、派洛宁Y、硫磺素-T和噻唑橙。进一步设想的是使用其任何合适的衍生物或功能等效物。本发明进一步设想了使用可能尚未开发且满足上述功能的荧光凝集染色试剂。进一步的信息可以从合适的文献资源中获得，诸如，例如Samuel M.Rapoport,2019,The reticulocyte,1st ed.,CRC Press。
可以按照技术人员已知的合适程序进行染色。在某些实施方式中，按照染色试剂制造商建议的程序进行染色。例如，典型的染色程序可以涵盖向本文定义的全血样品与任选的缓冲液(例如PBS)的混合物中添加染色试剂，例如浓度为约1％。随后，将混合物温育一段时间，例如1分钟、2分钟等。温育时间可以根据要使用的染料进行调整。例如，对于使用荧光染料的染色方法，温育时间可能会延长数分钟，优选根据制造商的指示。
对于后续分析，染色的样品可以任何合适的形式提供。例如，可以在液体或溶液中分析样品，例如在染色后直接分析。可替代地，可以将样品存储一段时间直至分析。对于此类存储，例如，染色的样品可以用盖玻片覆盖，或者可以用水性(aqueous，含水)或非水性封固剂(mounting media)封固。如果使用封固剂，样品可以任选地用盖玻片覆盖，特别是如果样品需要长期储存时。这种方法通常允许样品的稳定保存和几乎永久存储。合适的水性封固剂的例子包括aquatex、明胶、甘油、Kaiser甘油明胶和山梨糖醇F液体E420。非水性封固剂的合适例子包括DPX、entellan快速封固剂、M-Glas液体盖玻片和neo-mount无水封固剂。在另外的实施方式中，可以用任何合适的固定方法和试剂固定细胞。例如，可以使用戊二醛。
另外的信息可从合适的文献来源获得，例如临床和实验室标准研究所关于“网织红细胞计数方法(自动血细胞计数器、流式细胞术和超活体染料)；批准指南-第二版(Methods for Reticulocyte Counting(Automated Blood Cell Counters,FlowCytometry,and Supravital Dyes)；Approved Guideline–Second Edition)”的文件H44-A2或任何进一步版本。
在染色和任选的存储之后，可以将混合物放置在合适的载体上用于后续分析步骤，或者可以原位分析，或者可以转移到分析装置。可替代地，可以在进行后续分析的同一分析装置中进行染色。
在一个非常具体的实施方式中，根据本发明的染色程序可以伴随或先于单独的核酸交联。例如，此种交联可以使用本领域技术人员已知的任何适合的交联试剂来进行。此类试剂的例子包括氮芥类，即具有带有可变R基团的双(2-乙基氯)胺核结构的烷化剂，诸如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、乌拉莫司汀、美法仑或苯达莫司汀。进一步的例子包括顺式二氯二氨合铂(II)，即顺铂，其能够形成链内或链间交联。进一步设想了顺铂的变体或衍生物。另一个例子是氯乙基亚硝基脲(CENU)，特别是卡莫司汀(BCNU)。还设想了其它交联剂，诸如补骨脂素或丝裂霉素C。使用交联步骤之后可以是可以同时进行的染色步骤。在进一步的实施方式中，交联试剂的使用也可以与使用非凝集染料(例如非凝集超活体染料或非凝集荧光染料)的染色结合。
在染色步骤之后，照射染色的样品。使用光检测装置中的光束来进行照射。设想了使用200nm至780nm范围内的光。光的波长可以适应一个或多个因素，例如染料的性质及其激发波长、光检测装置的形式及其功能光谱。如本文使用的术语“光检测装置”涉及能够检测和可视化样品(特别是样品中的细胞，例如网织红细胞)反射光的任何光学系统。在优选的实施方式中，光检测系统是显微镜或显微系统，其能够可视化和/或荧光表征细胞。其可以包括光源或连接到光源，该光源可以是激光或用于视觉检测的光源。特别地，激光可以是允许刺激荧光染色试剂、优选如本文所述的荧光染色试剂的激光。因此，显微系统可以是能够进行荧光显微镜检查的系统。显微系统可以从样品(例如待分析的细胞)接收视觉反射形式和/或对刺激的荧光反应。显微镜可以进一步包含本领域技术人员已知的元件，诸如，例如可设计为透镜的聚焦光学元件和/或光圈。显微系统还可以连接到评估模块、成像捕获模块、AI模块或神经元网络、计算机系统、计算机网络或接口、数据库、图像存储库或实验室或医院系统。在特定的实施方式中，显微系统可以包括或基本上建立在流式细胞仪或包含流式细胞仪功能的系统上，特别是当使用荧光染料时。本发明设想的流式细胞术系统的例子包括Siemens ADVIA 2120i、Sysmex XN-系列、Sysmex XE-系列、Abbott DiagnositicsCell-DYN Sapphire和Beckman Coulter HmX。特别优选使用Siemens ADVIA 2120i系统。在进一步的实施方式中，这些系统可以与其它系统或其它系统的组件或单元、或单独的另外的组件或单元组合。
在照射染色的样品之后，网织红细胞内的网状组织或网状网络结构变得可检测。这种结构可以具有不同的形式、面积大小、周长和不同的光密度，这取决于网织红细胞的发育状况。典型地，可以根据以下4类(Heilmeyer)将网织红细胞分类：类别1＝具有稠密网状组织的不成熟网织红细胞，类别2＝具有广泛而松散的网状网络的网织红细胞，类别3＝具有散乱网状组织网络的网织红细胞和类别4＝具有散乱网状组织颗粒的成熟网织红细胞。图1中提供了根据Heilmeyer的类别1至4的例子。
在本发明的方法的进一步中心步骤中，对于每个网织红细胞，确定允许对网织红细胞的类别得出度量无偏决定(metric,non-biased decision)并由此允许对网织红细胞的发育状况得出度量无偏决定的参数。这些参数是网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)。
网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)可以确定为：
Figure BDA0003288309920000121
其中，Ar,i是所有各个(all individual，所有单独的)染色的核酸区域的面积，即一个网织红细胞内网状组织或网状网络的所有各个部分的面积；并且其中，Ac是在其中测量面积Ar,i和测量分数Γ的整个网织红细胞的面积。
网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)可以确定为：
Figure BDA0003288309920000122
其中，Ur,i是所有各个染色的核酸区域的周长，即一个网织红细胞内网状组织或网状网络的所有各个部分的周长；并且其中，Ar,i是所有各个染色的核酸区域的面积，即在其中测量Ur,i和测量分数Λ的网织红细胞内网状组织或网状网络的所有各个部分的面积。
将相应获得的值保存在例如计算机系统和/或评价模块和/或数据库等中，以用于后续的对比或评价处理。
典型地，在本发明的背景下，可能无法检测到小于约200nm的网状组织部分或网状网络的部分，特别是当使用如本文所述的显微镜技术时。因此，网状组织面积的可检测性限制可以设定为约0.15μm2。
在后续步骤中，将网织红细胞成熟度分类为1至4个主要成熟度类别。根据如上定义的确定的Λ和Γ值来进行这种分类。
有利地，计算所有核酸片段(特别是RNA片段)的周长Ur并除以网状组织面积Ar允许显著增加将网织红细胞分类为如上定义的类别1至4的准确性。另外，在所述式中使用周长(即用于成熟度分类)有利地允许将具有较少网状组织面积较大的颗粒的细胞与具有较多面积较小的颗粒的细胞区分开来。因此，这种新的方法首次提供了一个合适的度量标准，它将Heilmeyer的形态观察转化为一种可自动化算法，从而实现非常准确的网织红细胞成熟度分类。因此，本发明提供了一种定量分析法，然而形态学方法是定性的，因此传达了强烈的主观偏见，从而降低了它们的可比性。
在特别优选的实施方式中，网织红细胞的成熟度分类基于使用的Λ/Γ值。这个比率结合了两个分数值，并允许适当地转换为独特的值，如可以从图3中得出的。因此，成熟度分类包括根据比率Λ/Γ，将网织红细胞分配为Heilmeyer类别1、2、3或4。
Λ/Γ比率可以有不同的值，这些值受几种因素的影响，例如使用的光检测系统、使用的染色协议、检查的细胞的质量和年龄、潜在的预处理步骤等。这种差异可以用本领域技术人员已知的合适的校准方法来补偿。例如，校准可以包括使用预定数目的网织红细胞、在不同的光检测系统等中进行分析的标准染色条件。在某些实施方式中，可以将市售的校准溶液用于校准和参考目的。相应设想的校准溶液的示例是Streck,Inc.制造的Cal-Chex、Cal-Chex A Plus或Retic-Chex等。
在更优选的实施方式中，可以使用Λ/Γ比率以根据下列值来对网织红细胞进行分类：
Λ/Γ比率约>2.5指示类别1网织红细胞，即具有稠密网状组织的不成熟网织红细胞。因此，约2.5的值构成了类别1和类别2之间的边界值，类别2显示出低于约2.5的Λ/Γ比率。
约1至约2.5的Λ/Γ值指示类别2网织红细胞，即具有广泛而松散的网状网络的网织红细胞。因此，约1的值构成了类别2和类别3的边界值，类别3显示出低于约1的Λ/Γ比率。
约0.35至约1的Λ/Γ值指示类别3网织红细胞，即具有散乱网状组织网络的网织红细胞。因此，约0.35的值构成了类别3和类别4之间的边界值，类别4显示出低于约0.35的Λ/Γ比率。
约<0.35的Λ/Γ值指示类别4网织红细胞，即具有散乱网状组织颗粒的成熟网织红细胞。
因光学测量公差(例如不同分析设备的测量公差)，或因染色差异，或因基于不同程序或算法的网状组织或细胞分割的差异等原因，所指示的边界值可通过±25％的容差因子而略有变化，优选容差因子为±15％、±10％，更优选容差因子为±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％。
本发明进一步设想了提供类别1和2之间、2和3之间、3和4之间的边界类。这些边界可以包含例如由于对应于所提及的边界值的Λ/Γ值而导致无法或不能明确分类为类别1或2、2或3、或者3或4的网织红细胞。可以在上面提供的类定义上应用上面提到的容差因子的基础上，进一步建立边界类。进一步设想，例如在校准或比较实验以及考虑了网织红细胞染色和检测的光学和化学差异进行计算之后，可以在合适的校准因子的帮助下将边界类与类别1至4重新连接。可以从合适的文献源来获得进一步的信息，诸如Samuel M.Rapoport,2019,The reticulocyte,1st ed.,CRC Press。
本发明进一步涉及一种方法，包括枚举网织红细胞的步骤。如本文使用的术语“枚举(enumerating)”是指对每个限定的区域(area，面积)、体积、时间段或其它适合的单元(优选每个限定的体积，例如样品体积)的网织红细胞的数目进行计数并求和。在某些实施方式中，可以对如本文定义的每一网织红细胞类别进行枚举。例如，可以对样品的类别1、2、3和/或4中的所有网织红细胞进行计数。在进一步的特定实施方式中，枚举可以进一步包括对样品中的非网织红细胞进行计数，优选对红细胞(erythrocyte，红血球)进行计数。可以进一步将相应的数目与网织红细胞数，类别1、2、3或4中网织红细胞的数目、和/或(例如同一受试者)的先前的计数结果、同一受试者的不同样品、来自数据库的参考值、本文提及的校准参考、教科书或其它文献来源的参考值、来自独立确定的健康或患病受试者参考值等进行比较。提供了另外的细节的适合在线资源的例子可以进一步访问https://apps.who.int/iris/handle/10665/61756(上次访问时间为2020年9月28日)。
在进一步特别优选的实施方式中，本发明设想了一种如上定义的方法，其中使用包含成像模块的装置来进行步骤(c)，即确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)。
如本文所用的术语“成像模块”是指能够进行图像处理程序的单元。因此，本发明设想了获取存在于如本文所述样品中的网织红细胞或其它细胞成分的图像，优选存在于如本文所述样品中的染色的网织红细胞的图像。此图像获取可以进一步包括预处理或缩放活动(scaling activities)。
此外，本发明具体地设想了对所述获得的图像进行图像处理。如本文使用的术语“图像处理”涉及将图像转换为数字形式并对其执行操作以增强图像和/或提取有用或所需信息的一般方法。图像处理的输出可以是修改后的图像或与图像相关的特征或值。
根据本发明的成像模块被设计成能够进行图像处理，在一些实施方式中，与其它模块、程序、数据库、图像存储库或网络等一起。
图像处理可包括以下一项或多项活动、功能或程序：图像增强，包括亮度或对比度调整；小波和多分辨率处理，包括图像细分和金字塔形表示；压缩活动，包括用于减少保存图像所需的存储空间或传输图像的带宽的技术；形态学处理，包括提取表示或描述细胞或细胞成分的形状、面积信息或周长信息所需的图像参量(image component，图像分量)；分割，即将图像分割成其组成部分或对象；分割步骤中提供的数据的表示；描述，即从分段数据中提取属性，包括提供定量数据，允许将一类对象与另一类对象区分开来；对象识别，即基于对象的描述为对象分配标签。这些活动、功能或程序可以优选地以自动或程序化的方式执行，例如基于适合计算机程序或AI模块的使用。特别优选的是，成像模块被设计成执行形态分割操作，即提取图像参量并将它们划分成组成部分或对象，例如网状组织结构、网状网络结构、细胞周长、细胞面积、网状组织面积、网状组织周长、网状组织内的染色强度、网状组织内染色强度的差异等。
在本发明进一步优选的实施方式中，上述方法包括作为另外的步骤的步骤(e)，包括每个染色的网织红细胞与已被专家独立地分类的网织红细胞的图像存储库的形态比较。如本文使用的术语“形态比较”涉及一种有关与细胞(特别是样品中存在的网织红细胞，或更优选亚细胞部分，例如网状组织或网状网络)相关的结构、形状、形式、大小、存在的模式、光学/视觉表现、对比度、颜色或染色密度等特征中一个或多个的匹配和对比活动。所述比较包括图像(优选已经在如本文所述的成像模块中进行处理的图像)与已由专家根据Heilmeyer事先或替代地分类为类别1至4并且已与分类信息一起存储在图像存储库中的图像或数据进行匹配和对比。这些存储的图像可以进一步进行图像处理，其处理方式与使用根据本发明的方法获得的网织红细胞图像进行的图像处理类似或相同。
特别优选的是，所述形态比较包括将染色的网织红细胞的图像应用至基于机器学习的方法。在本发明的上下文中使用的“机器学习”的概念通常依赖于两步法：第一，训练阶段；和第二，预测阶段。在训练阶段，使用训练技术和训练数据设置机器学习模型(MLM)的一个或多个参数的值。在预测阶段，经过训练的MLM对测量数据进行操作。MLM的示例参数包括：人工神经网络(ANN)如卷积神经网络(CNN)给定层中神经元的权重；分类器内核的内核值等。
构建MLM可以包括确定参数值的训练阶段。特别优选的是，使用网织红细胞的图像存储库的图像进行训练。如上所述，存储库的所述图像有利地被专家独立地分类。例如，专家可以是组织学家或血液学家。在进一步的实施方式中，专家也可以是一组调整或协调其主观分类的专家。然后将相应的结果，即将网织红细胞图像标注为类别1、2、3或4例如与图像一起存储在图像存储库中。MLM可以检索这些信息并将其用作训练集。
构建MLM通常还可以包括确定一个或多个超参数的值。通常，MLM的一个或多个超参数的值在训练阶段被设置并且不会改变。因此，超参数的值可以在外循环迭代中改变；而MLM的参数值可以在内循环迭代中改变。有时，可以有多个训练阶段，以便可以测试或甚至优化一个或多个超参数的多个值。大多数MLM的性能和准确性强烈取决于超参数的值。
示例超参数包括：卷积神经网络中的层数、分类器内核的内核大小、ANN的输入神经元、ANN的输出神经元、每层神经元数量、学习速率等。
在本发明的上下文中可以使用各种类型和种类的MLM。例如，可以采用新的检测器MLM/异常检测器MLM，或分类器MLM，例如二元分类器。例如，可以采用深度学习(DL)MLM：此处，DL MLM检测到的特征可以不是预定义的，而是由模型在训练期间可以学习的各个参数值设置的。
可以使用多种技术来建立MLM。例如，训练的类型可以根据MLM类型来改变。另外，所采用的训练类型可因不同的实现而异。例如，可以使用迭代优化，其使用针对一个或多个误差信号定义的优化函数。
然后将上述每个染色的网织红细胞的形态比较操作的结果与根据如上定义的根据本发明的Λ和Γ度量方法的分类结果相比较。如果两种分类方法一致，则不需要特定的标记或警告或备注。在某些实施方式中，一致性可以存储为“通过形态学确认的度量分类”等。如果Λ和Γ度量方法的结果与形态学方法不一致，在检测到差异的网织红细胞的图像(例如实时或存储的图像)上附上标记。这种标记可以进一步向操作员发出警报或消息，以进一步分析获得的结果。可替代地，可以重新运行度量和形态分析以确认结果。标记还可以包含根据测量的差异的内部分类。例如，如果通过度量方法定义的Heilmeyer类与由形态学方法定义的类相差1，例如度量定义的类别＝2，形态学定义的类别＝1，反之亦然等，则向标记附上内部值1(＝差异度)。如果通过度量方法定义的Heilmeyer类与由形态学方法定义的类相差超过1，例如2，例如度量定义的类别＝3，形态定义的类别＝1，反之亦然，则向标记附上内部值2(＝差异度)。可根据差异程度进行进一步的分析和/或控制操作，其中还可包括检查设备、光学装置、图像存储库等。
对于差异度为1的发散分类(diverging classification)，在特定的一组实施方式中，本发明设想选择度量获得的结果。对于差异度为2的发散分类，在特定的一组实施方式中，本发明设想选择在度量和形态学定义的类别之间的分类。对于发散分类，本发明进一步设想对包含发散结果的样品进行标记并进行样品的独立分析，或使用不同的分析或制备方法(例如基于血涂片)对同一受试者的其它(例如平行)样品进行独立分析。
在进一步的方面，本发明涉及一种计算机实现的方法，用于根据如上定义的从全血样品拍摄的一个或多个图像对网织红细胞进行成熟度分类。所述方法包括在图像内确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；和根据Λ和Γ值将网织红细胞的成熟度分类为4个主要类别。在一些实施方式中，所述方法进一步包括枚举网织红细胞的步骤，优选如上文所定义。所述方法包括如上文定义的图像采集和图像处理步骤。在某些实施方式中，还可以实现和执行图像与上文定义的网织红细胞的图像存储库的形态比较。所述方法可以在任何合适的存储或计算机平台上实现，例如基于云、基于互联网、基于内联网或存在于本地计算机或手机上等的平台。
在进一步的方面，本发明涉及一种数据处理装置，包括用于执行如上定义的计算机实现的方法的器件。装置包括用于执行如上文所述的本发明的计算机实现的方法的任何一个或多个步骤的器件。因此，任何本文所述的计算机实现的方法可以全部或部分地使用包含一个或多个处理器的计算机系统来执行，所述处理器可以被配置为执行所述步骤。因此，一些本发明的实施方式涉及配置用于执行任何本文所述计算机实现的方法的步骤的计算机系统，潜在地具有执行各个步骤或各组步骤的不同组件。可以进一步在相同时间或以不同顺序执行方法的相应步骤。此外，这些步骤的一部分可以与来自其它方法的其它步骤的一部分一起使用。另外，步骤的全部或一部分可以是任选的。此外，任何所述方法的任何步骤可以使用用于执行这些步骤的模块、电路或其它器件来执行。
还设想了一种计算机程序，其包括指令，当该程序被计算机执行时，所述指令促使计算机执行本文定义的任何本发明的计算机实现的方法，或如本文所述的本发明方法的任何一个或多个可计算机化的步骤。
还设想提供一种计算机可读存储介质，包含如上定义的计算机程序产品。计算机可读存储介质可以连接至服务器元件，或存在于云结构中，或通过互联网或内联网连接到一个或多个数据库结构或客户端数据库等。
例如，使用传统或面向对象的技术，使用任何合适的计算机语言，例如，诸如Java、Python、Javascript、VB.Net、C++、C#、C、Swift、Rust、Objective-C、Ruby、PHP或Perl，任何本文所述的软件组件或计算机程序或函数均可以实现为由处理器执行的软件代码。软件代码可以作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上用于存储和/或传输，适合的介质包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁介质如硬盘驱动器或光学介质诸如光盘(CD)或DVD(数字多功能盘)、闪存等。计算机可读介质可以是此类存储或传输设备的任意组合。此类程序还可使用适于通过符合各种协议的有线、光学和/或无线网络(包括互联网)传输的载波信号进行编码和传输。因此，可以使用利用这样的程序编码的数据信号来创建根据本发明的计算机可读介质。用程序代码编码的计算机可读介质可以与兼容装置一起打包或与其它装置分开提供(例如，通过互联网下载)。任何此类计算机可读介质可以存在于单个计算机程序产品(例如硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)上或内，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机程序产品上或内。计算机系统可以包括监视器、打印机或其它合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。
在进一步的方面，本发明涉及一种用于监测和确定受试者的健康状况和/或受试者对治疗的反应的体外方法。该方法包括执行如本文定义的对来自受试者的全血样品的网织红细胞进行成熟度分类的方法。特别优选的是，该方法包括对整个样品和/或按本文定义的类别对网织红细胞进行枚举的步骤。在对样品中的网织红细胞进行分类和任选地枚举之后，可以将获得的结果与一个或多个参考值或数字进行比较。例如，可以将获得的每样品体积或每样品体积中每一类别的网织红细胞数与从正常或健康受试者获得的数进行比较。此外，它们可以与从被诊断患有特定疾病的受试者获得的数进行比较，例如通常对红细胞生成、血细胞循环或血细胞数量有影响的疾病，例如贫血或骨髓疾病。在进一步的实施方式中，这些数可以与来自数据库、教科书、文献来源、医院文件等的参考数进行比较。
如本文所用的术语“健康状况”是指受试者中存在或不存在疾病，例如与健康个体相比。在某些实施方式中，该术语可进一步涉及健康发展趋势，例如医疗状况或疾病状况的恶化或改善。
在某些实施方式中，用于监测或确定受试者的健康状况的方法可以提供样品中网织红细胞的总数作为结果，该总数低于健康受试者的参考样品中的网织红细胞数，或者其提供类别1中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数低于健康受试者的参考样品中相同类别1中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别2中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数低于健康受试者的参考样品中相同类别2中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别3中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数低于健康受试者的参考样品中相同类别3中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别4中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数低于健康受试者的参考样品中相同类别4中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别1和2中、或类别2和3中、或类别3和4中、或类别1、2和3中、或类别2、3和4中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数低于健康受试者的参考样品中相应类别中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字。这些结果可以被认为是指示了骨髓衰竭，例如由于药物、肿瘤、放射治疗或感染引起；肝硬化；贫血，可能是由于铁含量低或者维生素B12或叶酸含量低引起；或慢性肾病。在本发明的上下文中，这些疾病被理解为“低网织红细胞疾病”。
在某些实施方式中，用于监测或确定受试者的健康状况的方法可以提供样品中网织红细胞的总数作为结果，该总数高于健康受试者的参考样品中的网织红细胞数，或者其提供类别1中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数高于健康受试者的参考样品中相同类别1中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别2中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数高于健康受试者的参考样品中相同类别2中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别3中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数高于健康受试者的参考样品中相同类别3中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别4中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数高于健康受试者的参考样品中相同类别4中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字；或者其提供类别1和2中、或类别2和3中、或类别3和4中、或类别1、2和3中、或类别2、3和4中的网织红细胞数作为结果，该网织红细胞数高于健康受试者的参考样品中相应类别中的网织红细胞数，而其它类别在检查样品和参考样品中显示出相似数字。这些结果可被认为指示了贫血，可能是由于红细胞比正常情况更早被破坏引起(即溶血性贫血)；出血；胎儿或新生儿的血液疾病(胎儿成红细胞增多症)；或肾脏疾病，带有促红细胞生成素的产生增加。在本发明的上下文中，这些疾病被理解为“高网织红细胞疾病”。
如本文所用的术语“对治疗的反应”是指受试者对疾病治疗的积极或消极响应，所述疾病可能对于红细胞生成有影响或者与任何上述疾病或者在同一疾病上诊断出的进一步其它疾病有关。
在某些实施方式中，所设想的用于监测和确定受试者的健康状况和/或受试者对治疗的反应的方法包括：使用从受试者获取的多于一个样品进行本发明的方法。例如，可以在初始时间点采集样品，随后可以在某一时间段后采集进一步的样品。所述时间段可以是本领域技术人员认为适合的任何时间段。所述时间段可由受试者的疾病或治疗、其住院状况、受试者的健康状况或任何其它与诊断相关的因素控制。在某些实施方式中，在2、3、4、5、6、7天或更多天的时间段后从受试者采集进一步的样品。还设想了10天、14天、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。
使用在不同时间从受试者采集的样品进行枚举和分类程序的比较可以提供如下结果：类似数目和/或类别分布的网织红细胞，或总体上或者一个或多个类别内增加的网织红细胞数，或总体上或者一个或多个类别内降低的网织红细胞数。然后可以将相应的结果用于诊断结论的归因。
例如，在低网织红细胞疾病的情况下，诸如骨髓衰竭(例如由于药物、肿瘤、放射治疗或感染引起)、肝硬化、贫血(可能是由于铁含量低或者维生素B12或叶酸含量低引起)或慢性肾病，当将初始样品和随后采集的样品进行比较时，总体上或者类别2、3或4的网织红细胞数增加指示了受试者健康状况改善和/或对治疗的积极响应。
类似地，在高网织红细胞疾病的情况下，诸如溶血性贫血、出血、胎儿或新生儿的血液疾病(胎儿成红细胞增多症)、或带有促红细胞生成素产生增加的肾脏疾病，当将初始样品和随后采集的样品进行比较时，总体上或者类别2、3或4的网织红细胞数增加指示了受试者健康状况恶化和/或对治疗的消极响应。
在进一步的实施方式中，在高网织红细胞疾病的情况下，诸如溶血性贫血、出血、胎儿或新生儿的血液疾病(胎儿成红细胞增多症)、或带有促红细胞生成素产生增加的肾脏疾病，当将初始样品和随后采集的样品进行比较时，总体上或者类别2、3或4的网织红细胞数降低指示了受试者健康状况改善和/或对治疗的积极响应。
在另一实施方式中，在低网织红细胞疾病的情况下，诸如骨髓衰竭(例如由于药物、肿瘤、放射治疗或感染引起)、肝硬化、贫血(可能是由于铁含量低或者维生素B12或叶酸含量低引起)或慢性肾病，当将初始样品和随后采集的样品进行比较时，总体上或类别2、3或4的网织红细胞数降低，指示了受试者的健康状况恶化和/或对治疗的消极响应。进一步的细节可以从合适的文献或互联网资源中获得，诸如，例如https://www.statpearls.com/kb/viewarticle/28438(上次访问时间为2020年9月28日)。
在进一步的方面，本发明涉及一种包含用于执行根据本发明方法的器件的装置。因此，所述装置可以包含能够进行如上文定义的染色活动的模块。染色模块可以包含用于细胞制备、细胞分选、细胞纯化、化学处理、染色、洗涤等以及可选的存储功能的元件。例如，该模块可以由机器人实体或功能组成。该装置可以进一步包含能够照射染色的样品的模块。该模块可以具有显微镜或显微系统的形式，并且可以包含可以设计为透镜和/或光圈的聚焦光学元件。在具体的实施方式中，显微系统可以另外地包含或基本上建立在流式细胞仪或包含流式细胞仪功能的系统之上，特别是当使用荧光染料时。显微镜模块可以进一步连接至能够确定如本文所述网织红细胞内参数Λ和Γ的评估模块。这一评估模块可以例如被实现为或连接到上文定义的成像模块，即能够使用获取的如本文所述样品中存在的网织红细胞或其它细胞成分的图像(优选如本文所述样品中存在的染色的网织红细胞的图像)执行图像处理程序的单元。还设想了存在成熟度分类模块，其能够将测量的网织红细胞参数Λ和Γ值归因于根据Heilmeyer所述的类别1至4。例如，这一模块可以是基于计算机的模块或AI模块或神经元网络、计算机系统、计算机网络或接口，并且可以任选地连接至数据库、图像存储库或实验室或医院系统。
实施例
实施例1
网织红细胞检测
用于网织红细胞检测的材料和方法
样品.在知情同意和经爱尔兰根大学伦理委员会(Ethikkommission der
Figure BDA0003288309920000251
Erlangen)申请316_14B批准的程序下，从健康供体抽取外周血。将每个样品的血液收集在4.7ml EDTA涂覆的管中。所有样品均在采集6小时内进行处理。
通过使用超活体染料实现确定未成熟的红细胞，所述超活体染料将细胞质RNA沉淀成网状组织状网络。我们使用碱性(basic)新亚甲基蓝(NMB,c＝0.5％,Sigma-Aldrich)染料处理网织红细胞。将染料溶液加入全血中1分钟。生成血液涂片允许在光学显微镜下可视化这种丝状网络。
光学配置.使用安装在DMi8 Leica倒置显微镜上的相机(Apex 3-CMOS基于棱镜的RGB相机,JAI)，通过40x物镜(HP PL APO 40x/0.95CORR PH2,Leica)在透射模式下记录亮场图像，从而实现网织红细胞的识别。
统计分析.使用ImageJ分析图像。通过将彩色图像转换为RGB-灰度图像，实现染色的网状组织的分割。在绿色通道中应用自动阈值算法来确定网状组织的面积和周长。
出于说明性目的提供附图(图1、图2、图3)。因此，应当理解，这些图不应被解释为限制。本领域技术人员将显然能够设想对本文阐述的原理进行进一步修改。

Claims (15)

1.一种对来自全血样品的网织红细胞进行成熟度分类的方法，包括：
(a)利用超活体凝集染色试剂或荧光凝集染料将所述样品染色；
(b)在光检测装置、优选显微镜中，利用优选具有200nm至780nm波长范围的光束照射染色的样品，以检测网织红细胞；
(c)确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于所述网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；以及
(d)根据确定的Λ和Γ值，将网织红细胞的成熟度分类为4个主要成熟度类别中的1个。
2.根据权利要求1所述的方法，另外包括以下步骤作为最后一步：枚举所述网织红细胞，其中，所述枚举优选地按类别和按样品进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，利用选自NMB(新亚甲基蓝)、亮甲酚蓝、结晶紫、甲基紫和尼罗蓝的超活体凝集染色试剂进行所述染色；其中，所述染色任选地进一步包括化学核酸交联的步骤，所述交联优选地利用氮芥、顺式二氯二氨合铂(II)或衍生物、或氯乙基亚硝基脲(CENU)来进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，利用选自吖啶橙、金胺O、D-甲基氧杂羰花青、溴化乙锭、派洛宁Y、硫磺素-T和噻唑橙的凝集荧光染料进行所述染色，其中，所述染色任选地进一步包括化学核酸交联的步骤，所述交联优选地利用氮芥、顺式二氯二氨合铂(II)或衍生物、或氯乙基亚硝基脲(CENU)来进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，利用包括成像模块的装置进行步骤(c)，所述成像模块优选地是被设计以执行形态分割操作的成像模块。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述方法另外地包括以下步骤作为步骤(e)：将每个染色的网织红细胞与被专家独立地分类的网织红细胞的图像存储库进行形态比较，优选地导致对形态分类与步骤(d)的分类不同的网织红细胞进行标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述形态比较包括将所述染色的网织红细胞的图像应用至基于机器学习的方法，所述基于机器学习的方法利用所述网织红细胞的图像存储库的图像进行训练。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述成熟度分类包括：根据比率Λ/Γ将网织红细胞分配至类别1、2、3或4。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，约>2.5的Λ/Γ值指示为类别1，约1至约2.5的Λ/Γ值指示为类别2，约0.35至约1的Λ/Γ值指示为类别3，并且约<0.35的Λ/Γ值指示为类别4。
10.一种用于根据从全血样品拍摄的一个或多个图像对网织红细胞进行成熟度分类的计算机实现的方法，包括在图像内确定每个网织红细胞的参数(i)网状组织面积(Ar)相对于全细胞面积(Ac)的分数(Λ)和(ii)网状组织的周长(Ur)相对于所述网状组织面积(Ar)的分数(Γ)；以及根据Λ和Γ值将所述网织红细胞的成熟度分类为4个主要类别，优选另外地包括枚举所述网织红细胞的步骤。
11.一种用于监测和确定受试者的健康状况和/或受试者对治疗的反应的体外方法，包括利用从所述受试者获得的一个或多个全血样品执行权利要求1至10中任一项所述的方法。
12.根据权利要求11所述的体外方法，其中，当初始样品与在2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天数后从所述受试者采集的第二或另外的样品进行比较时，类别2、3或4的网织红细胞数目的增加，优选类别3或4的网织红细胞数目的增加，更优选类别4的网织红细胞数目的增加在低网织红细胞疾病中指示所述受试者的健康状况的改善和/或对所述治疗的积极响应，或者在高网织红细胞疾病中指示所述受试者的健康状况的恶化和/或对所述治疗的消极响应。
13.一种包括用于执行权利要求1至9、11或12中任一项所述的方法的器件的装置。
14.一种包括用于执行权利要求10所述的方法的器件的数据处理装置。
15.一种计算机程序，包括指令，当由计算机执行所述程序时，所述指令使得所述计算机执行权利要求6、7或10的所述方法。
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