CN114277026A - 核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒 - Google Patents

核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒。用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其包括细胞裂解液、磁珠、洗涤液和洗脱液，磁珠表面修饰有金属配合物，金属配合物为螯合有铸币金属的配合物；洗脱液中含有具有巯基的含硫化合物。本发明磁珠表面修饰的金属配合物螯合有铸币金属，在核酸提取时，能够与巯基发生高度亲和反应，通过特异性的硫‑铸币金属之间的强作用力，从而使得DNA与金属离子的相互作用被打破，从而洗脱时能够快速将DNA从磁珠上脱离，这种脱离方法简单有效，现有常规金属离子是不具备此种效果。加入含硫化合物后还可以打开蛋白内部的双硫键，使得其变性，失去结构特点和活性，可以更好地从DNA上脱落。

Description

核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及了核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒。
背景技术
磁珠法提取核酸一般会利用其与常用的磁珠一般表面是羟基、羧基或氨基。在这些基团与核酸的吸附脱附过程中，需要采用高强度的盐溶液，或者调节pH，使得核酸进行吸附或脱附，是目前应用较多的核酸吸附纯化方法之一。
在大多数的应用场景中，由于DNA常常会和RNA、蛋白一起存在，而上述的DNA纯化过程中，由于三者与DNA的相似性(双性分子)，纯化过程中的DNA纯度往往会包含上述两种物质。如吸附时加入的盐、调节pH都容易使得蛋白质析出，附着于磁珠上。RNA与DNA更是高度相似，在吸附过程中难以分离。而这两种物质的存在，对于提取的DNA的浓度、纯度判定往往会有干扰。对后续的核酸扩增过程也可能带来干扰。为了减少上述干扰，一般的做法是利用多次乙醇或有机溶剂-水混合物来洗涤，或者进行二次沉淀、加入RNA 降解酶等方法。而这些方法不但麻烦，还会导致DNA的收率下降。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其包括细胞裂解液、磁珠、洗涤液和洗脱液，所述磁珠表面修饰有金属配合物，所述金属配合物为螯合有铸币金属的配合物；所述洗脱液中含有具有巯基的含硫化合物。
作为本发明提供的所述用于磁珠法核酸提取的试剂盒的一种优选实施方式，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2-联吡啶-5-甲胺， [2,2'-联吡啶]-5-羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10- 菲罗啉，4-羧基-1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'- 羧基中的一种。
作为本发明提供的所述用于磁珠法核酸提取的试剂盒的一种优选实施方式，所述铸币金属选自铸币金属金银铜的一种或多种。
作为本发明提供的所述用于磁珠法核酸提取的试剂盒的一种优选实施方式，所述含硫化合物为半胱氨酸、巯基乙酸、巯基乙胺和二硫苏糖醇中的一种。
第二方面，核酸提取用磁珠，所述磁珠表面修饰有金属配合物，所述金属配合物为螯合有铸币金属的配合物。
作为本发明提供的所述核酸提取用磁珠的一种优选实施方式，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2-联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5- 羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基 -1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种。
作为本发明提供的所述核酸提取用磁珠的一种优选实施方式，所述铸币金属选自铸币金属金银铜的一种或多种。
作为本发明提供的所述核酸提取用磁珠的一种优选实施方式，所述磁珠表面修饰前为具有羧基、氨基或醛基的磁珠。
第三方面，核酸提取用磁珠的制备方法，其包括以下步骤：(1)取具有羧基、氨基或醛基的磁珠分散于缓冲液中；(2)加入交联剂进行活化；(3)往步骤(2)中加入螯合有铸币金属的配合物，搅拌混合，洗涤。
作为本发明提供的所述的核酸提取用磁珠的制备方法的一种优选实施方式，步骤(3)中，所述螯合有铸币金属的配合物制备过程如下：将配合物溶解于溶剂中，加入铸币金属水合物，加热回流过夜或室温反应3d以上，随后萃取、过柱分离；其中，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2- 联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5-羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基-1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、 [2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种；所述铸币金属为金、银和铜的一种或多种。
本发明具有如下有益效果：
本发明磁珠表面修饰的金属配合物螯合有铸币金属，在核酸提取时，能够与含硫化合物的巯基发生高度亲和反应，通过特异性的硫-铸币金属之间的强作用力(两者之间的作用力近似于共价键)，从而使得DNA与金属离子的相互作用被打破，从而洗脱时能够快速将DNA从磁珠上脱离，这种脱离方法简单有效，特别适合一些不能加入盐或调节pH的吸附纯化场景，现有常规金属离子是不具备此种效果。再者，现有通过弱离子键结合在磁珠上的金属离子，当加入巯基后巯基会与金属离子形成配合物而从磁珠表面脱离，可能存在如下2个问题： (1)与金属离子结合的物质一并脱离；(2)脱离的金属离子会干扰后续反应，尤其是多价离子会干扰核酸二级结构、蛋白-核酸相互作用还有核酸扩增，不利于洗脱，而本发明金属修饰的方式是配合物与铸币金属螯合后得到金属配合物，整个金属配合物再偶联至具有羧基、氨基或醛基的磁珠上，金属通过配体的配位键偶联到磁珠具有较高连接强度，更加紧密，低浓度巯基或高浓度时间短是无法将其从磁珠上剥离的，解决上述两个问题，也有助于洗脱。而且加入含硫化合物后还可以打开蛋白内部的双硫键，使得其变性，失去结构特点和活性，特别是一些核酸结合蛋白，可以更好地从DNA上脱落，从而减少了吸附和对后续的影响。
附图说明
图1为本发明试剂盒利用牛支原体引物进行扩增的曲线图。
具体实施方式
如背景技术描述的，利用多次乙醇或有机溶剂-水混合物来洗涤，或者进行二次沉淀、加入RNA降解酶等方法。而这些方法不但麻烦，还会导致DNA的收率下降。
为此，可采用在磁珠表面螯合金属离子，吸附核酸时，由于表面金属离子的存在，可以通过静电作用强化其对于核苷酸的吸附作用，可以使得其对RNA 进行降解，使得吸附于表面RNA被降解成核苷酸，从而降低其被吸附的水平，以及降低其对后面扩增的影响，可以一步实现蛋白质的纯化和固定化。如中国发明专利公开了一种载金属离子聚丙烯酰胺磁珠及其制备方法和应用，首先利用共沉淀法制得了超顺磁性的纳米四氧化三铁，接着采用过硫酸钾进行改性后在其表面修饰一层聚丙烯酰胺，再通过聚丙烯酰胺中两个相邻的酰胺基团与 Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+等金属离子螯合，得到载金属离子聚丙烯酰胺磁珠。但是本发明人具体实践时发现：上述载金属离子聚丙烯酰胺磁珠金属离子是通过弱离子结合在磁珠上，具体应用时存在容易脱离磁珠的风险，当加入巯基后巯基会与金属离子形成配合物容易将金属离子从磁珠表面脱离，会存在如下2个问题：(1)与金属离子结合的物质一并脱离；(2)脱离的金属离子会干扰后续反应，尤其是多价离子会干扰核酸二级结构、蛋白-核酸相互作用还有核酸扩增，不利于洗脱。再者，现有磁珠表面螯合的是普通金属离子，核酸提取时DNA 脱附速率一般，以及蛋白质的纯化也有待提高。
为了解决上述技术问题，本发明提出了用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其包括细胞裂解液、磁珠、洗涤液和洗脱液，所述磁珠表面修饰有金属配合物，所述金属配合物为螯合有铸币金属的配合物；所述洗脱液中含有具有巯基的含硫化合物。
所述磁珠需要具有羧基、氨基或醛基，以便与配合物反应。
所述配合物需要具备至少1个未被芳香基团占据的位点，便于衍生出偶联基团以偶联羧基、氨基或醛基。所述配合物还需要具备能与铸币金属离子配位的基团。优选地，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2- 联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5-羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基-1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、 [2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种。
所述铸币金属选自铸币金属金银铜的一种或多种，可以理解的是，所述铸币金属可以是铸币金属金、铸币金属银或铸币金属铜，还可以是铸币金属金银，铸币金属金铜，又可以是铸币金属银铜。
所述含硫化合物为半胱氨酸、巯基乙酸、巯基乙胺和二硫苏糖醇中的一种，但可以理解的是，具有巯基的含硫化合物并不局限于上述几种，生化体系中应用的巯基的含硫化合物均可。
本发明磁珠表面修饰的金属配合物螯合有铸币金属，在核酸提取时，能够与含硫化合物的巯基发生高度亲和反应，通过特异性的硫-铸币金属之间的强作用力(两者之间的作用力近似于共价键)，从而使得DNA与金属离子的相互作用被打破，从而洗脱时能够快速将DNA从磁珠上脱离，这种脱离方法简单有效，特别适合一些不能加入盐或调节pH的吸附纯化场景，现有常规金属离子是不具备此种效果。加入含硫化合物后还可以打开蛋白内部的双硫键，使得其变性，失去结构特点和活性，特别是一些核酸结合蛋白，可以更好地从DNA上脱落，从而减少了吸附和对后续的影响。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明将通过以下实施例作进一步说明。所用的试剂均为分析纯或化学纯级。
实施例一
本实施例示出了一种核酸提取用磁珠的制备方法，其包括以下步骤：(1) 取具有羧基、氨基或醛基的磁珠分散于缓冲液中；(2)加入交联剂进行活化；(3)往步骤(2)中加入螯合有铸币金属的配合物，在加热过夜或常温3d以上条件下搅拌混合，洗涤。其中，步骤(3)中，所述螯合有铸币金属的配合物制备过程如下：将配合物溶解于溶剂(如水乙醇等等)中，加入铸币金属水合物，加热回流过夜或室温反应3d以上，随后萃取、过柱分离，即得。所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2-联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5- 羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基 -1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种；所述铸币金属为氯化金、氯化银和氯化铜的一种或多种。
具体地，本实施例通过如下方法制备磁珠：(1)取1mg市售羧基含量为 0.5μm磁珠，分散于5mL pH6.0 100mM MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液。(2)称取一定量的NHS和EDC，用pH6.0100mM MES缓冲液溶解，配制为20mg/ml EDC 和20mg/ml NHS，注意现配现用，先加入NHS 10μl，再加入EDC 5μl，随后 1500rpm、25℃活化30min。(3)加入溶解于250μL DMSO(二甲基亚砜)的3-胺-[2,2’-联吡啶]-金(I)二氯配合物3mg，然后1500rpm搅拌下25℃过夜。最后用pH6.0 100mM MES缓冲液清洗3次，即可得到表面修饰有金属配合物的磁珠。
实施例二
本实施例示出了一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒，包括细胞裂解液、实施例一制备得到的磁珠、洗涤液和洗脱液，所述洗脱液中含有具有巯基的含硫化合物。
在核酸提取时，巯基能够与含铸币金属发生高度亲和反应，通过特异性的硫-铸币金属之间的强作用力(两者之间的作用力近似于共价键)，从而使得DNA 与金属离子的相互作用被打破，从而洗脱时能够快速将DNA从磁珠上脱离，这种脱离方法简单有效，特别适合一些不能加入盐或调节pH的吸附纯化场景，现有常规金属离子是不具备此种效果。再者，加入含硫化合物后还可以打开蛋白内部的双硫键，使得其变性，失去结构特点和活性，特别是一些核酸结合蛋白，可以更好地从DNA上脱落，从而减少了吸附和对后续的影响。
实施例三
为了便于对比说明，下面以二硫苏糖醇为含硫化合物进行具体说明，但可知的是，并不局限于此。所述含硫化合物还可以是半胱氨酸、巯基乙酸、巯基乙胺等具有巯基的含硫化合物中的一种。
具体地，本实施例试剂盒的核酸提取过程如下：取2g搅碎牛肉样品、500μL pH8.010mM TNCa缓冲至1.5mL离心管中，加入350μL 0.2mg/mL蛋白酶K，涡旋混匀后于55℃孵育5min。随后7500rpm离心3分钟，去掉上清，油脂尽量去除。样品加入350μL 0.35mg/mL溶菌酶，涡旋均匀，37℃孵育10分钟。随后将样品加入深孔板上，将深孔板放置于核酸提取仪上，其孔位按下表设置。
Figure BDA0003424756270000061
利用核酸提取仪进行核酸提取过程，参考程序如下表。随后获得完成纯化的核酸。
Figure BDA0003424756270000062
用紫外进行检测，测取其OD260/OD280值。采用普通磁珠时， OD260/OD280＝1.90；采用本实施例铸币金属修饰磁珠时，OD260/OD280＝1.81。表面修饰有铸币金属的磁珠表面吸附的RNA大幅减少，获得的DNA更纯。
利用牛支原体引物，进行扩增，其曲线如图1所示。其中，左侧曲线为利用本方法实施例三方法进行提取并扩增的曲线，其Ct值为25.49；右侧曲线为用普通磁珠进行提取并扩增的曲线，其Ct值为29.45。可见本方法的核酸提取扩增效率更高。
实施例四
制备磁珠：(1)取1mg市售羧基含量为0.5μm磁珠，分散于5mL pH6.0 100mM MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液。(2)称取一定量的NHS和EDC，用pH6.0 100mM MES缓冲液溶解，配制为20mg/ml EDC和20mg/ml NHS，注意现配现用，先加入 NHS 10μl，再加入EDC 5μl，随后1500rpm、25℃活化30min。(3)加入溶解于 250μL DMSO(二甲基亚砜)的5-羧基-1,10-菲罗啉-银(I)二氯配合物3mg，然后1500rpm搅拌下25℃过夜。最后用pH6.0 100mM MES缓冲液清洗3次，即可得到表面修饰有金属配合物的磁珠。
核酸提取过程：取含BSA40mg/mL及小牛胸腺DNA40ng/mL的2000μL pH8.0 10mMTNCa缓冲，加入至1.5mL离心管中；随后将样品加入深孔板上，将深孔板放置于核酸提取仪上，其孔位按下设置。
Figure BDA0003424756270000071
对比试验
本试剂盒的核酸提取过程如下：取含BSA40mg/mL及小牛胸腺DNA40ng/mL 的2000μL pH8.0 10mM TNCa缓冲，加入至1.5mL离心管中加入至1.5mL离心管中；随后将样品加入深孔板上，将深孔板放置于核酸提取仪上，其孔位按下设置。
Figure BDA0003424756270000072
提取完成后，用微量紫外对洗脱溶液进行测试。
Figure BDA0003424756270000073
试验1中，微珠为常规微珠，洗脱液中加有5mM二硫苏糖醇。
试验2中，微珠为实施例一制得的微珠，洗脱液中不添加二硫苏糖醇。
试验3中，微珠为常规微珠，洗脱液中不添加二硫苏糖醇。
试验4中，微珠为实施例一制得的微珠，洗脱液中添加5mM二硫苏糖醇。
OD260越高，说明DNA的回收浓度越高，磁珠对DNA的吸附越好。从试验1、 4可以看到修饰铸币金属的磁珠确实吸附DNA更多。从试验1、3对比以及试验2、 4对比，可知，在洗脱液中添加二硫苏糖醇有助于可以打开蛋白内部的双硫键，使得其变性，失去结构特点和活性，特别是一些核酸结合蛋白，可以更好地从 DNA上脱落，从而减少了吸附和对后续的影响，提高DNA的回收浓度。
OD280越高，说明残留蛋白越多，由于金属也能与蛋白形成结合物，增加了蛋白含量，可以看到铸币金属修饰磁珠会出现蛋白的非特异吸附。
OD260/280的值越接近1.8，说明DNA纯度越好。从试验1、4对比可知，本发明通过所述磁珠表面修饰有螯合有铸币金属的配合物与所述洗脱液中含有具有巯基的含硫化合物，两者协同作用，可以在保障DNA回收率的情况下，减少蛋白非特异性吸附，得到的DNA更纯。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其包括细胞裂解液、磁珠、洗涤液和洗脱液，其特征在于，所述磁珠表面修饰有金属配合物，所述金属配合物为螯合有铸币金属的配合物；所述洗脱液中含有具有巯基的含硫化合物。
2.根据权利要求1所述用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2-联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5-羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基-1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种。
3.根据权利要求1所述用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述铸币金属选自铸币金属金银铜的一种或多种。
4.根据权利要求1所述用于磁珠法核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述含硫化合物为半胱氨酸、巯基乙酸、巯基乙胺和二硫苏糖醇中的一种。
5.核酸提取用磁珠，其特征在于，所述磁珠表面修饰有金属配合物，所述金属配合物为螯合有铸币金属的配合物。
6.根据权利要求5所述核酸提取用磁珠，其特征在于，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2-联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5-羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基-1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种。
7.根据权利要求5所述核酸提取用磁珠，其特征在于，所述铸币金属选自铸币金属金银铜的一种或多种。
8.根据权利要求5所述核酸提取用磁珠，其特征在于，所述磁珠表面修饰前为具有羧基、氨基或醛基的磁珠。
9.核酸提取用磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取具有羧基、氨基或醛基的磁珠分散于缓冲液中；(2)加入交联剂进行活化；(3)往步骤(2)中加入螯合有铸币金属的配合物，搅拌混合，洗涤。
10.根据权利要求9所述的核酸提取用磁珠的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述螯合有铸币金属的配合物制备过程如下：将配合物溶解于溶剂中，加入铸币金属水合物，加热回流过夜或室温反应3d以上，随后萃取、过柱分离或重结晶；其中，所述配合物选自5-氨基-2,2'-联吡啶，[2,2'-联吡啶]-3-胺，2,2-联吡啶-5-甲胺，[2,2'-联吡啶]-5-羧酸，[2,2'-联吡啶]-4-羧酸，[2,2'-联吡啶]-5-乙酸，5-羧基-1,10-菲罗啉，4-羧基-1,10-菲罗啉、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-胺、[2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-羧基中的一种；所述铸币金属为金、银和铜的一种或多种。
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