CN114271425A - 一种乳酸链球菌素改性物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸链球菌素改性物的制备方法及应用，属于食品防腐技术领域。上述乳酸链球菌素改性物的制备方法，包括以下步骤：先分别将乳酸链球菌素和三聚磷酸钠溶解在酸溶液中，分别得到乳酸链球菌素酸溶液和三聚磷酸钠溶液，再将三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于乳酸链球菌素酸溶液，搅拌后放置12h，最后进行真空冷冻干燥，得到乳酸链球菌素改性物。本发明所制备的改性乳酸链球菌素，抑菌活性高，与未改性的乳酸链球菌素相比，抑菌时间延长50％，同时增强了酸性条件下对酶的稳定性。

Description

一种乳酸链球菌素改性物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及食品防腐技术领域，特别是涉及一种乳酸链球菌素改性物的制备方法及应用。

背景技术

乳酸链球菌素肽来源于食品级的乳酸链球菌，展现出较广的抗菌范围。乳酸链球菌素作为一种天然、无毒的防腐剂，在食品工业中的应用相当广泛，如乳制品、肉制品、酿酒、果汁饮料、焙烤食品等，迄今为止，乳酸链球菌素已在全世界70多个国家和地区被用作防腐剂。

合成抗菌剂对人类具有潜在的毒性，但在发展中国家，仍被广泛应用于食品领域。而天然的抗菌剂，如天然活性成分、精油和抗菌肽等，由于其生物相容性和无毒性等特点，越来越受到大家的关注。其中抗菌肽因其低分子量，水溶性好和对人类无毒副作用，常常被广泛应用于食品行业。然而在食品行业只有很少的抗菌肽能被用作食品抗菌剂，乳酸链球菌素肽更是少数抗菌肽中唯一被允许应用在食品领域的抗菌剂。

现有技术通过制备脂质体运输体系来包埋乳酸链球菌素肽提高其抗菌活性，在制备过程中采用了有机试剂及高成本的磷脂和粒径不可控，存在缺陷。现有技术还公开了生物聚合物纳米颗粒，用于装载、保护和运输乳酸链球菌素肽，主要基于海藻酸钠，壳聚糖和壳聚糖-g-PGA等原材料制备纳米体系来运输。但是以上方案的方法复杂，产品的生物活性也不尽人意。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳酸链球菌素改性物的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，使制备得到的乳酸链球菌素改性物具有良好的稳定性，抑菌活性显著提高，抑菌时间延长50％，增强了低浓度时的杀菌效果，以及酸性条件下对酶的稳定性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种乳酸链球菌素改性物的制备方法及其应用；

技术方案一：一种乳酸链球菌素改性物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将乳酸链球菌素溶解在酸溶液中，调节pH至2～4，搅拌后得到乳酸链球菌素酸溶液；(2)将三聚磷酸钠溶于酸溶液中，超声处理5min，得到三聚磷酸钠溶液；(3)将三聚磷酸钠溶液滴加于乳酸链球菌素酸溶液，搅拌后放置12h，得到乳酸链球菌素改性物溶液；(4)将乳酸链球菌素改性物溶液进行真空冷冻干燥，得到乳酸链球菌素改性物。

进一步地，步骤(1)中乳酸链球菌素与酸溶液的质量体积比为5～ 25mg：1～10mL；所述乳酸链球菌素酸溶液的质量浓度为12mg/mL～20 mg/mL。

进一步地，步骤(2)中三聚磷酸钠与酸溶液的质量体积比为5～25mg： 1～10mL；所述三聚磷酸钠溶液的质量浓度为12mg/mL～20mg/mL。

进一步地，步骤(1)和步骤(2)中，所述酸溶液均为乙酸溶液，所述乙酸溶液的体积分数为1％～3％。

根进一步地，步骤(2)中超声的频率为25～59kHz。

进一步地，步骤(3)中乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为1～4：1～2。

进一步地，步骤(4)中真空冷冻干燥的条件为：在-80～-50℃，真空度5～10Pa的环境中干燥2～4天。优选的，温度为-80～-50℃，优选为-80～ -60℃，更优选为-70℃，干燥时长优选为48～72h，更优选为56h。所述冷冻干燥的真空度优选为5～10Pa，更优选为8Pa。

技术方案二：本发明还提供了一种由以上制备方法制备得到的乳酸链球菌素改性物。

技术方案三：本发明还提供了乳酸链球菌素改性物在抗菌产品中的应用，所述抗菌产品为抗菌剂。

本发明的乳酸链球菌素改性物具有高效抑菌活性，包括但不限于对金黄色葡萄球菌的抑制。乳酸链球菌素改性物可被用作食品防腐剂。在具体的实施方案中，食品包括但不限于方便食品、农产品、乳制品、肉制品、海产品、糖果、烘焙食品、罐头、调味品、谷物、饮料、酒类等。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的方法使用酸溶液溶解乳酸链球菌素避免使用有机试剂，并且采用允许在食品中添加的三聚磷酸钠对其进行改性，改性途径绿色、健康、对环境无污染且成本低。改性后乳酸链球菌素能维持高效的抑菌活性，而且稳定性明显得到改善。本发明所制备得到的乳酸链球菌素改性物具有良好的稳定性，较未改性的乳酸链球菌素，抑菌活性显著提高，抑菌时间延长50％。本发明所制备得到的乳酸链球菌素改性物提高了在低浓度时的杀菌效果和酸性条件下对酶的稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1和实施例4的乳酸链球菌素改性物溶液在不同超声频率下的荧光光谱扫描结果；

图2为实施例1和实施例5的乳酸链球菌素改性物溶液的荧光光谱扫描结果；

图3为胃蛋白酶处理后乳酸链球菌素和实施例1所制备得到的乳酸链球菌素改性物的稳定性研究；

图4为乳酸链球菌素和实施例1所制备得到的乳酸链球菌素改性物对金黄色葡萄球菌抗菌性效果的测定；

图5为流式细胞仪检测不同浓度乳酸链球菌素和实施例1所制备得到的乳酸链球菌素改性物对金黄色葡萄球菌抗菌效果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

目前，乳酸链球菌素(nisin)展现出较广的抗菌范围。然而其在实际应用中稳定性并不高，此外，乳酸链球菌素在使用中，容易部分或全部丧失生物活性。现有技术已经通过各种方法来提高nisin的活性，但其在制备过程中使用有机试剂，基于海藻酸钠、壳聚糖和壳聚糖-g-PGA等原材料制备纳米体系来运输nisin。但是这些方法比较复杂，产品的生物活性也不尽人意。

本发明不仅避免使用有机试剂，还采用允许在食品中添加的三聚磷酸钠对其进行改性，改性途径绿色、健康、对环境无污染且成本低。改性后乳酸链球菌素能维持高效的抑菌活性，而且改善了稳定性。

下面结合实施例对本发明提供的一种乳酸链球菌素改性物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

按照如下步骤制备乳酸链球菌素改性物：

(1)将16mg乳酸链球菌素溶解于1mL体积分数为1％的乙酸溶液中，将100μL的1mol/L的NaOH加入体系调整溶液pH为3；然后以200rpm 的速度搅拌20min，使其分散均匀，得到浓度为16mg/mL的乳酸链球菌素酸溶液；(2)将16mg三聚磷酸钠溶于1mL体积分数为1％的乙酸溶液中，25℃超声处理5min，超声频率为25kHz，得到浓度为16mg/mL三聚磷酸钠溶液；(3)将三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于乳酸链球菌素酸溶液，然后在20℃搅拌反应，反应结束后20℃放置12小时，得到乳酸链球菌素改性物溶液；上述乳酸链球菌素溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为2：1；(4) 将乳酸链球菌素酸改性物溶液放在真空度为8Pa以下，温度为-70℃环境中真空干燥56h，得到乳酸链球菌素改性物粉末。

实施例2

按照如下步骤制备乳酸链球菌素改性物：

(1)将12mg乳酸链球菌素溶解于1mL体积分数为2％的乙酸溶液中，将500μL的1mol/L的NaOH加入体系调整溶液pH为4；然后以300rpm 的速度搅拌30min，使其分散均匀，得到浓度为12mg/mL的乳酸链球菌素酸溶液；(2)将12mg三聚磷酸钠溶于1mL体积分数为2％的乙酸溶液中，25℃超声处理5min，超声频率为35kHz，得到浓度为12mg/mL三聚磷酸钠溶液；(3)将三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于乳酸链球菌素酸溶液，然后在20℃搅拌反应，反应结束后20℃放置12小时，得到乳酸链球菌素改性物溶液；上述乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为4：1； (4)将乳酸链球菌素改性物溶液放在真空度为10Pa以下，温度为-80℃环境中真空干燥72h，得到乳酸链球菌素改性物粉末。

实施例3

按照如下步骤制备乳酸链球菌素改性物：

(1)将20mg乳酸链球菌素溶解于1mL体积分数为3％的乙酸溶液中，将1500μL的1mol/L的NaOH加入体系调整溶液pH为5；然后以 500rpm的速度搅拌40min，使其分散均匀，得到浓度为20mg/mL的乳酸链球菌素酸溶液；(2)将20mg三聚磷酸钠溶于1mL体积分数为3％的乙酸溶液中，25℃超声处理5min，超声频率为59kHz，得到浓度为20mg/mL 三聚磷酸钠溶液；(3)将三聚磷酸钠溶液缓慢滴加于乳酸链球菌素酸溶液，然后在20℃搅拌反应，反应结束后20℃放置12小时，得到乳酸链球菌素改性物溶液；上述乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为1：2； (4)将乳酸链球菌素改性物溶液放在真空度为5Pa以下，温度为-50℃环境中真空干燥48h，得到乳酸链球菌素改性物粉末。

实施例4

按照如下步骤制备乳酸链球菌素改性物：

与实施例1不同的地方在于，本实施例在制备乳酸链球菌素改性物的过程中，将步骤(2)中超声频率替换为33KHz、40KHz、59KHz，其他条件同实施例1。

将实施例1和实施例4所制得的乳酸链球菌素改性物溶液分别使用荧光分光光度计测定荧光强度。其中，实施例1和实施例4的乳酸链球菌素改性物溶液的荧光强度，详见图1。具体操作为：取不同超声频率制备的乳酸链球菌素改性物溶液，用荧光光谱扫描仪检测溶液在280nm激发波长下的荧光强度。如图1可见，不同超声频率制备的乳酸链球菌素改性物荧光强度在345nm处不同，说明超声频率对乳酸链球菌素改性物影响较大，为获得较好的改性效果，选取25KHz的超声频率为最优超声条件。

实施例5

按照如下步骤制备乳酸链球菌素改性物：

与实施例1不同的地方在于，本实施例在制备乳酸链球菌素改性物的过程中，将步骤(3)中的乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比替换为4:1、1:1、1:2、1:3，其他条件同实施例1。

将实施例1和实施例4所制得的乳酸链球菌素改性物溶液分别使用荧光分光光度计测定荧光强度，以不经过改性的Nisin为对照。其中，实施例1和实施例4的乳酸链球菌素改性物溶液的荧光强度，详见图2。具体操作为：取不同乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比制备的乳酸链球菌素改性物溶液，用荧光光谱扫描仪检测溶液在280nm激发波长下的荧光强度。如图2可见，相比于纯乳酸链球菌素，不同乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液制备的乳酸链球菌素改性物荧光强度在345nm处均出现变化，说明乳酸链球菌素改性成功。

对上述实施例1制备得到的乳酸链球菌素改性物进行胃蛋白酶稳定性测定，具体的操作方法为：分别对Nisin溶液，经胃蛋白酶处理的Nisin溶液、经胃蛋白酶处理的实施例1中的改性物进行胃蛋白酶稳定性测定。具体操作为：乳酸链球菌素改性物制备好后，采用双层平板法测定抗菌活性。即先在无菌平板里倒入10mL左右的MRS固体培养基，作为下层以弥补平板自身不平的缺陷；待冷却凝固后，倾注5mL含5％金黄色葡萄球菌菌悬液的改良MRS培养基，作为上层。凝固后等间距放置牛津杯，使其由于重力作用而自然沉降5min后，分别注入Nisin溶液，经胃蛋白酶处理的 Nisin溶液、0.1mL经胃蛋白酶处理的实施例1所制备得到的改性物，水平放置10min后，于37℃正置培养24h，观察并记录结果。同时做一组平行实验，结果如图3所示。

如图3可见，与Nisin溶液相比，胃蛋白酶处理后的Nisin溶液抑菌圈显著变小，说明胃蛋白酶处理后的Nisin溶液抑菌效果逐渐减弱。与之相反，实施例1所制备得到的改性物的胃蛋白酶稳定性较好，并没有出现抑菌效果减弱的现象。这可能是由于Nisin本身为蛋白质多肽，胃蛋白酶处理后其发生水解，造成其抗菌活性的下降，而实施例1所制备的乳酸链球菌素改性物经过改性后，可以增加对胃蛋白酶处理的抗性，维持原有的抑菌效果，可见，本发明所制备的乳酸链球菌素改性物稳定性较高。

对上述实施例1制备得到的乳酸链球菌素改性物进行抗菌活性的测定，具体操作为：将25g LB肉汤固体粉末加入1000mL的蒸馏水中，煮沸制备液体培养基，并以每根试管12～15mL的量分装。将100μL金黄色葡萄球菌接种到液体培养基中，在37℃、120r/min的摇床中培养6h。设置三个平行组。分别将1mL的1％醋酸溶液、Nisin溶液、实施例1所制备得到的改性物添加到上述配置好的接种有金黄色葡萄球菌的培养基中，放入 37℃、120r/min的摇床中培养。在1-10天内，每天取200μL菌液于96孔板中，通过酶标仪测量其在600nm下的吸光度值。所有实验均在无菌环境下操作。试验结果如图4所示。

由图4可知，在1％醋酸溶液的对照组中，金黄色葡萄球菌的数量持续显著上升，排除了醋酸对抗菌效果的影响。在Nisin溶液实验组中，从第三天开始，Nisin溶液实验组进入生长迅速的对数期，说明Nisin溶液对金黄色葡萄球菌的抑制效果在第三天开始逐渐消失。而实施例1所制备得到的改性物抑制金黄色葡萄球菌持续到第六天，抑菌时间延长50％，说明将乳酸链球菌素制备为乳酸链球菌素改性物后，能显著增强其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，延长了其抑菌时间。

对上述实施例1制备得到的乳酸链球菌素改性物进行金黄色葡萄球菌的破坏作用，具体操作为：进行流式细胞仪检测：通过流式细胞术分别检测不同浓度(0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL)的乳酸链球菌素、乳酸链球菌素改性物处理后的金黄色葡萄球菌的凋亡情况。处理步骤与本实施例中抗菌活性测定方法相同，具体的，是在4℃下用10000g离心分离处理后细菌悬浮液随后收集金黄色葡萄球菌细胞，用无菌盐水(0.85％w/v) 洗涤三次，然后将细胞重新悬浮在2mL无菌盐水(0.85％w/v)中。用无菌盐水将再悬浮液稀释至1000倍，然后将1mL稀释液与3μL碘化丙啶(PI) 在棕色离心管中混合，并在4℃的暗室中培养15min。最后，通过流式细胞术(BD FACS AriaIII，BD Biosciences，USA)检测金黄色葡萄球菌细胞凋亡率。试验结果如图5所示。PI可以通过死亡细胞的破细胞膜进入细胞内部，与DNA结合并发出红色荧光。分用0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025 mg/mL的乳酸链球菌素处理6h后，金黄色葡萄球菌细胞的荧光强度显著增加，死亡率分别为90.5％、63.0％、43.8％。说明随着乳酸链球菌素浓度降低，金黄色葡萄球菌的死亡率显著下降，处理6h后0.025mg/mL的乳酸链球菌素仅造成43.8％金黄色葡萄球菌死亡。

然而，由图5可知，在不同浓度的乳酸链球菌素改性物实验组中，0.025 mg/mL的乳酸链球菌素改性物处理6h后金黄色葡萄球菌的死亡率达到 72.7％，金黄色葡萄球菌的死亡率显著高于未改性的乳酸链球菌素。

上述结果说明，本发明所制备的乳酸链球菌素改性物能够对金黄色葡萄球菌的抑制效果进一步增强，本发明制备的乳酸链球菌素改性物能够显著增强对金黄色葡萄球菌抑菌效果。

综上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种乳酸链球菌素改性物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将乳酸链球菌素溶解在酸溶液中，搅拌后得到乳酸链球菌素酸溶液；所述酸溶液的pH值为2～4；

(2)将三聚磷酸钠溶于酸溶液中，超声处理5min，得到三聚磷酸钠溶液；

(3)将三聚磷酸钠溶液滴加于乳酸链球菌素酸溶液，搅拌后放置12h，得到乳酸链球菌素改性物溶液；

(4)将乳酸链球菌素改性物溶液进行真空冷冻干燥，得到乳酸链球菌素改性物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中乳酸链球菌素与酸溶液的质量体积比为5～25mg：1～10mL；所述乳酸链球菌素酸溶液的质量浓度为12mg/mL～20mg/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中三聚磷酸钠与酸溶液的质量体积比为5～25mg：1～10mL；所述三聚磷酸钠溶液的质量浓度为12mg/mL～20mg/mL。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述酸溶液均为乙酸溶液，所述乙酸溶液的体积分数为1％～3％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中超声的频率为25～59kHz。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中乳酸链球菌素酸溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为1～4：1～2。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所步骤(4)中真空冷冻干燥的条件为：在-80～-50℃，真空度5～10Pa的环境中干燥2～4天。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的制备方法得到的乳酸链球菌素改性物。

9.权利要求8所述的乳酸链球菌素改性物在抗菌产品中的应用，其特征在于，所述抗菌产品为抗菌剂。

Images