CN114261963B

CN114261963B - 一种功能化石墨片复合物的制备方法

Info

Publication number: CN114261963B
Application number: CN202111274394.6A
Authority: CN
Inventors: 高强; 聂瑞丹; 王静
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN114261963A

Abstract

本发明公开了一种功能化石墨片复合物的制备方法，该方法以石墨粉、芘甲醛或芘丁酸为原料通过超声剥离法制备功能化石墨片复合物，石墨粉可被超声剥离成层石墨片，而芘的化合物可通过π‑π相互作用吸附到石墨片上，因此可制得醛基或羧基功能化的石墨片复合物。在此基础上，进一步将己二胺或含氨基大分子聚乙烯亚胺、含羧基大分子聚丙烯酸或甲基乙烯基醚‑马来酸酐共聚物共价结合到石墨片表面，显著改善了石墨片表面功能基团的密度。本发明获得的功能化石墨片复合物为粉末状，可通过抛撒的方式用于工业化大批量生产修饰印刷电极，此法简单高效，且印刷电极的功能化为后续进行生物分子的固定化提供了便利。

Description

一种功能化石墨片复合物的制备方法

技术领域

本发明属于生物分子固定化技术领域，具体涉及一种功能化石墨片复合物的制备方法。

背景技术

近年来，为了获得良好的生物分子固定化效果和优异的传感器性能，许多新的功能材料被设计作为生物传感界面。碳纳米材料具有高电子迁移率、高比表面积以及良好的导电性，在生物传感领域有着广阔的应用前景，其中石墨烯是应用最多的材料。石墨烯是一种碳原子紧密堆积的呈蜂窝状晶格的二维碳纳米材料，不仅比表面积大，而且组成形态可调，被广泛应用于生物分子的固定化和生物传感界面的修饰。

电化学传感器由于其灵敏度高、特异性强、响应迅速、操作简单等优点，已成为电化学分析检测领域中的重要研究策略。其中，对工作电极表面进行功能化修饰和改性是制备高效、灵敏电化学传感器的关键。目前对电极表面进行修饰常用的方法是吸附法、共价键合法、电化学沉积法等，但其操作流程比较费时，在工业化大批量生产模块也比较难以实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种可通过操作简单的抛撒法修饰电极的功能化石墨片(Graphite Sheets，GSs)复合物的制备方法。

针对上述目的，本发明采用的制备方法包括下述步骤：

步骤1：以石墨粉、芘丁酸为原料通过超声剥离法制备羧基功能化石墨片，或以石墨粉、芘甲醛为原料通过超声剥离法制备醛基功能化石墨片；

步骤2：将羧基功能化石墨片或醛基功能化石墨片与聚乙烯亚胺或己二胺反应，制备氨基功能化石墨片复合物。

上述步骤1中，所述羧基功能化石墨片的制备方法为：将芘丁酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再向其中加入石墨粉，用超声波细胞粉碎机连续超声6～10小时，400～500rpm离心3～5分钟，取上层悬液，再以9000～10000rpm离心15～20分钟，依次用N,N-二甲基甲酰胺、去离子水洗涤沉淀，真空干燥，得到羧基功能化石墨片；所述芘丁酸与石墨粉的质量比为1:7～15，石墨粉的粒径为1100～1300目，超声的功率为20～30W。

上步骤1中，所述醛基功能化石墨片的制备方法为：将芘甲醛溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再向其中加入石墨粉，用超声波细胞粉碎机连续超声6～10小时，400～500rpm离心3～5分钟，取上层悬液，再以9000～10000rpm离心15～20分钟，依次用N,N-二甲基甲酰胺、去离子水洗涤沉淀，真空干燥，得到醛基功能化石墨片；其中，所述芘甲醛与石墨粉的质量比为1:7～15，石墨粉的粒径为1100～1300目，超声的功率为20～30W。

上述步骤2中，所述氨基功能化石墨片复合物的制备方法为：将羧基功能化石墨片加入pH＝5.5的2-(N-吗啉代)-乙基磺缓冲溶液中，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，搅拌活化2～4小时，离心分离，所得沉淀分散到质量浓度为0.1％～0.5％的聚乙烯亚胺乙醇溶液或1～5mg/mL的己二胺乙醇溶液中，搅拌反应4～6小时，再离心分离，沉淀用去离子水洗涤后干燥，得到氨基功能化石墨片复合物；其中，所述羧基功能化石墨片与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、聚乙烯亚胺乙醇溶液或己二胺乙醇溶液的质量体积比为10mg:2～4mg:5～8mg:2～4mL。或者将聚乙烯亚胺或己二胺加入无水乙醇中，然后加入醛基功能化石墨片，搅拌反应4～6小时，离心分离，沉淀用去离子水洗涤后干燥，得到氨基功能化石墨片复合物；其中，所述醛基功能化石墨片与聚乙烯亚胺或己二胺的质量比为4～6:1。

本发明所述的功能化石墨片复合物的制备方法还包含下述步骤3：

步骤3：将氨基功能化石墨片复合物与甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物反应制备酸酐基功能化石墨片复合物，或将氨基功能化石墨片复合物与聚丙烯酸反应制备羧基功能化石墨片复合物。

上述步骤3中，所述酸酐基功能化石墨片复合物的制备方法为：将甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物加入四氢呋喃中，然后加入氨基功能化石墨片复合物，搅拌反应4～6小时，离心分离，沉淀依次用四氢呋喃、去离子水洗涤后干燥，得到酸酐基功能化石墨片复合物；其中，所述氨基功能化石墨片复合物与甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的质量比为1:1～2。

上述步骤3中，所述羧基功能化石墨片复合物的制备方法为：将聚丙烯酸加入N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，搅拌活化2～4小时，再加入氨基功能化石墨片复合物，搅拌反应4～6小时，离心分离，沉淀用去离子水洗涤后干燥，得到羧基功能化石墨片复合物；其中，所述氨基功能化石墨片复合物与聚丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的质量比为10:5～8:3～5:5～8。

本发明的有益效果如下：

1、本发明以石墨粉、芘甲醛或芘丁酸为原料，通过超声剥离法，石墨粉可被超声剥离成层石墨片，而芘的化合物可通过π-π相互作用吸附到石墨片上，获得醛基或羧基功能化石墨片。在此基础上，进一步将醛基或羧基功能化石墨片与己二胺、含氨基大分子聚乙烯亚胺、含羧基大分子聚丙烯酸、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物进行化学反应共价结合到石墨片表面，从而延长碳链并丰富了石墨片表面官能团，显著改善了石墨片表面功能基团的密度。本发明获得的功能化石墨片复合物为粉末状，通过抛撒法对工作电极进行修饰，此方法简单高效，利用活化电极表面的羧基基团或氨基基团等来固定生物分子，可实现批量化生产小型的电化学免疫传感器，且能够对前列腺抗原快速、高灵敏度的检测。

附图说明

图1是实施例1中超声剥离法制备的羧基功能化石墨片的扫描电子显微镜图。

图2是实施例1中超声剥离法制备的羧基功能化石墨片的透射电子显微镜图。

图3是实施例1中超声剥离法制备的羧基功能化石墨片的拉曼光谱图。

图4是实施例1中芘丁酸通过π-π相互作用吸附在GSs表面的紫外可见吸收光谱图。

图5是实施例1中芘丁酸通过π-π相互作用吸附在GSs表面的红外光谱图。

图6是实施例1中制得的PEI@PBA@GSs复合物的XPS表征图。

图7是实施例1中制得的PEI@PBA@GSs复合物的红外光谱图。

图8是实施例1中制得的PEI@PBA@GSs复合物的紫外可见吸收光谱图。

图9是采用实施例1中PEI@PBA@GSs功能化修饰电极制备的电化学免疫传感器检测不同浓度前列腺抗原(PSA)的线性关系图。

图10是采用实施例1中PEI@PBA@GSs功能化修饰电极制备的电化学免疫传感器检测不同浓度前列腺抗原(PSA)的标准曲线图。

图11是实施例4中超声剥离法制备的醛基功能化石墨片的扫描电子显微镜图。

图12是实施例4中芘甲醛通过π-π相互作用吸附在GSs表面的紫外可见吸收光谱图。

图13是实施例4中芘甲醛通过π-π相互作用吸附在GSs表面的红外光谱图。

图14是实施例4中制得的己二胺@PyCHO@GSs复合物的XPS表征图。

图15是实施例4中制得的PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物的Zeta电位表征图。

图16是采用实施例4中PAA@己二胺@PyCHO@GSs功能化修饰电极制备的电化学免疫传感器检测不同浓度前列腺抗原(PSA)的线性关系图。

图17是采用实施例4中PAA@己二胺@PyCHO@GSs功能化修饰电极制备的电化学免疫传感器检测不同浓度前列腺抗原(PSA)的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于以下说明的实施方式。

实施例1

本实施例以石墨粉、芘丁酸为原料通过超声剥离法制备了羧基功能化石墨片，之后与聚乙烯亚胺制得氨基功能化石墨片复合物，具体步骤如下：

步骤1：称取40mg芘丁酸(PBA)加入50mL DMF中，超声将其溶解，再向其中加入600mg石墨粉(1200目)，用超声波细胞粉碎机连续超声7h(功率25W)，然后以500rpm速度离心5min，取上层悬液，再以9000rpm速度离心20min，并分别用DMF、去离子水洗涤沉淀两次，将其放入真空干燥箱中60℃烘干，得到羧基功能化石墨片，记为PBA@GSs。利用扫描电镜对石墨形貌进行了观察，图1左图可看出超声剥离前石墨的粒径在12.5μm，且堆垛程度密集，从右图可以看到超声后许多片状结构明显的纳米片堆叠在一起，表明石墨被成功剥离为石墨片。图2(A)为PBA@GSs复合物在较低倍下的透射电镜形貌，可以看到其是带有呈现纹理褶皱的薄片；图2(B)是PBA@GSs复合物在高倍率下的透射电镜图，大致可以得到GSs的厚度为8nm，层数在几层到几十层之间。图3为石墨粉(Gp)和PBA@GSs的拉曼光谱图，从图中可以看出，与Gp相比，PBA@GSs的D带强度增加，而D波段的强度是平面内缺陷的特征，这表明在超声处理期间，由于尺寸减小以及空位和sp³杂化碳的产生，缺陷密度增加，也证明GSs的形成。图4为PBA、Gp和PBA@GSs复合物的紫外可见吸收光谱图，由图可见PBA的主吸收峰出现在319nm、328nm和345nm处，在PBA@GSs的光谱中也观察到三个PBA的特征吸收峰，而这些特征吸收峰在Gp的光谱中没有出现。图5为PBA、Gp和PBA@GSs的红外光谱图，从图中可以看出，PBA及PBA@GSs均在1275cm^-1和1697cm^-1处存在吸收峰，这两个吸收峰分别为羧酸与羰基上C-OH和C＝O的伸缩振动峰，且在2949cm^-1处出现烷基链上C-H键的吸收峰，而这些峰在Gp的FT-IR光谱中并没有出现，表明已成功制备PBA@GSs复合物。

步骤2：称取200mg PBA@GSs加到50mL 0.1M pH＝5.5的2-(N-吗啉代)-乙基磺(MES)缓冲溶液中，再加入80mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、120mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，搅拌活化3h。然后将该悬浊液以9000rpm速度离心，将离心后的沉淀分散到50mL质量浓度为0.1％的聚乙烯亚胺(PEI，Mw＝25000)乙醇溶液中，搅拌反应6h，再以9000rpm速度离心，并用去离子水洗涤沉淀三次，最后将其放入干燥箱60℃烘干，得到氨基功能化石墨片复合物，记为PEI@PBA@GSs复合物。采用X射线光电子能谱仪(XPS)对制备的PEI@PBA@GSs复合物进行表征，从图6中可以看出，纯石墨与PBA的光谱分别在284.6eV和530eV处出现了C1s和O1s峰，而PEI@PBA@GSs的光谱图在398eV处发现了新的N1s峰，表明在PBA@GSs复合物上引入了-NH₂；此外，还用红外光谱和紫外可见吸收光谱进一步表征了PEI@PBA@GSs复合物。图7中PEI@PBA@GSs的FTIR图在2850cm^-1和2914cm^-1出现了两个峰，对应PEI链上CH₂的伸缩振动，-NH₂/NH在3400cm^-1附近发生伸缩振动，此外，PEI@PBA@GSs在1630cm^-1附近出现了一个新的振动带，与-CO-NH-键相匹配，证明PEI共价结合在PBA@GSs复合物上。图8为PEI和PEI@PBA@GSs的紫外可见吸收光谱图，PEI的吸收峰在208nm处，当PEI组装到PBA@GSs上时，吸收峰从208nm蓝移到202nm，进一步表明PEI成功组装到PBA@CNS上的过程。

实施例2

本实施例以石墨粉、芘甲醛为原料通过超声剥离法制备了醛基功能化石墨片，之后与己二胺制得氨基功能化石墨片复合物，具体步骤如下：

步骤1：称取60mg芘甲醛(PyCHO)溶于30mL DMF中，再向其中加入500mg石墨粉(1200目)，随后置于超声波细胞粉碎机中连续超声7h(功率25W)，然后以500rpm速度离心5min，取上层悬液，再以9000rpm速度离心15min，并分别用DMF、去离子水洗涤沉淀两次，60℃烘干，得到醛基功能化石墨片，记为PyCHO@GSs。

步骤2：称取60mg己二胺溶于30mL无水乙醇中，然后加入300mg PyCHO@GSs，于磁力搅拌器上连续搅拌4h，取出离心，用去离子水洗涤沉淀三次，60℃烘干，得到氨基功能化石墨片复合物，记为己二胺@PyCHO@GSs复合物。

实施例3

本实施例以石墨粉、芘甲醛为原料通过超声剥离法制备了醛基功能化石墨片，之后与己二胺制得氨基功能化石墨片复合物，再与甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物反应，制得酸酐基功能化石墨片复合物，具体步骤如下：

步骤3：称取300mg甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物(Gantrez，Mw＝1080000)加入30mL 四氢呋喃(THF)中，然后向其中加入200mg己二胺@PyCHO@GSs复合物，连续搅拌反应6h，离心，并分别用THF、去离子水洗涤沉淀两次，60℃烘干，得到酸酐基功能化石墨片复合物，记为Gantrez@己二胺@PyCHO@GSs复合物。

实施例4

本实施例以石墨粉、芘甲醛为原料通过超声剥离法制备了醛基功能化石墨片，之后与己二胺制得氨基功能化石墨片复合物，再与聚丙烯酸反应，制得羧基功能化石墨片复合物，具体步骤如下：

步骤1：称取60mg芘甲醛(PyCHO)溶于30mL DMF中，再向其中加入500mg石墨粉(1200目)，随后置于超声波细胞粉碎机中连续超声7h(功率25W)，然后以500rpm速度离心5min，取上层悬液，再以9000rpm速度离心15min，并分别用DMF、去离子水洗涤沉淀两次，60℃烘干，得到醛基功能化石墨片，记为PyCHO@GSs。使用环境扫描电子显微镜(SEM)对制备的PyCHO@GSs复合物的形貌进行了观察，图11左图为石墨粉超声前的原形貌，大多呈块状堆在一起，右图是经过超声剥离后的PyCHO@GSs复合物的形貌，可以明显看到许多略微透明的薄片堆叠在一起，表明石墨被成功剥离为石墨片(GSs)，无明显团聚现象。采用了紫外可见分光光度计对PyCHO@GSs复合物进行分析，光谱图12显示PyCHO的吸收峰出现在363nm、374nm和395nm处，同时，在PyCHO@GSs复合物的光谱中也观察到了三个PyCHO的特征吸收峰，而这些特征峰在纯石墨的光谱中却没有发现。采用了红外光谱仪对PyCHO@GSs复合物进行分析，从图13中可以看出，PyCHO与PyCHO@GSs复合物在1680cm^-1处均存在有吸收峰，此吸收峰为PyCHO中C＝O的伸缩振动峰，此外在2713cm^-1、2862cm^-1处存在有-CO-H的典型双吸收峰，在3100cm^-1处存在有芘环中C-H的伸缩振动峰。这些数据表明，已成功将PyCHO通过π-π相互作用吸附到石墨片上制得PyCHO@GSs复合物。

步骤2：称取60mg己二胺溶于30mL无水乙醇中，然后加入300mg PyCHO@GSs，于磁力搅拌器上连续搅拌4h，取出离心，用去离子水洗涤沉淀三次，60℃烘干，得到氨基功能化石墨片复合物，记为己二胺@PyCHO@GSs复合物。由采用X射线光电子能谱仪(XPS)对制备的己二胺@PyCHO@GSs复合物进行表征，从图14中可以看出，纯石墨与PyCHO的光谱均存在有C1s(284.8eV)峰和O1s(529.2eV)峰，而己二胺@PyCHO@GSs复合物的光谱图在398.1eV处则出现了新的N1s峰，表明在PyCHO@GSs复合物上引入了-NH₂，成功制备了己二胺@PyCHO@GSs复合物。

步骤3：称取120mg聚丙烯酸(PAA，Mw＝2000)加入30mL DMF中，然后向其中加入80mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、120mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，搅拌活化2h后，再加入200mg己二胺@PyCHO@GSs复合物，继续搅拌反应4h，离心，用去离子水洗涤三次，60℃烘干，得到羧基功能化石墨片复合物，记为PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物。使用激光粒度仪对PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物制备的各个过程进行了Zeta电位表征，从Zeta电位图15可以看出，PyCHO@GSs复合物的表面电位为-6.6mV，当结合上带正电荷的PEI时，复合物表面电位变为+31.5mV，而当继续结合上带负电荷的PAA后，复合物表面电位再次变为负值(-31.6mV)。以上结果说明PAA已通过共价结合与静电吸附双重作用牢牢结合在石墨片表面，在石墨片表面引入了高密度的荷负电的羧基功能基团。

为了证明本发明的有益效果，采用上述实施例1制备的PEI@PBA@GSs复合物和4制备的PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物，通过抛撒的修饰方法将其用于印刷碳电极的表面功能化修饰，之后再通过活化氨基或羧基基团固定化生物分子，构建电化学免疫传感器，具体试验如下：

以PET板(0.5mm)为基质材料，将设计好的电极模型贴纸贴在PET板表面，制备了印刷电极的初步底板，接着用木刷将导电碳糊刷在电极上，利用湿润的碳糊的粘性，将PEI@PBA@GSs复合物或PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物均匀抛撒在其表面，先在室温下晾干，再放入40℃的鼓风干燥箱中干燥3h，分别得到PEI@PBA@GSs复合物功能化石墨片修饰电极和PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物功能化石墨片修饰电极。

将上述PEI@PBA@GSs复合物功能化石墨片修饰电极用剪刀剪裁成单根电极后，将电极浸泡在现配的体积浓度为2.5％的戊二醛(GA)水溶液中反应3h以活化电极表面的氨基，之后用去离子水多次冲洗以除去多余的GA。将活化好的电极置于含有少量水的结晶皿中，在电极表面滴涂10μL35μg/mL的PSA抗体(Ab₁)，用保鲜膜封口后放入冰箱中，在湿润的环境中4℃孵育12h。取出后，用PBST洗涤液用力冲洗电极，以移去非特异性吸附在电极表面的PSA抗体，然后将所得电极浸泡在质量浓度为1％的BSA水溶液中1h，用来封闭残留的活性位点，以避免非特异性吸附的影响，再次用PBST洗涤液冲洗电极表面，并用N₂吹干，最终获得电化学免疫传感器。将10μL不同浓度的PSA标准溶液滴涂在所制备的电化学免疫传感器表面，在37℃水浴锅中温育50min，取出后用PBST洗涤液连续冲洗除去物理吸附的PSA。然后将10μL25μg/mLHRP标记的二抗(Ab₂-HRP)滴涂在电极表面，在37℃水浴锅中温育50min，取出后再次用洗涤液冲洗电极。通过抗原与抗体的特异性识别反应，Ab₂-HRP成功结合到传感器表面，由此构建了一个三明治夹心型电化学免疫传感器。之后将制备好的免疫传感器浸泡在0.65mg/mL的PVI-Os水溶液中，于-1.4V恒电位下电沉积30s，形成氧化还原聚合物薄膜作为标记酶HRP的电子介体，最后将传感器转移到10mL PBS(pH＝7.10，10mM)缓冲液中，施加-0.1V(vs.Ag/AgCl)电位进行预电解120s，预电解后开始库仑积分电量600s作为背景电量，用符号C_b表示，电解600s后，在溶液中加入H₂O₂使其浓度为2mM，此时开始测量的电量即为HRP还原H₂O₂的电量(包括背景电量)用符号C_t表示，用加入H₂O₂后得到的电量减去加入前的电量即为HRP还原H₂O₂的电量，此差值可用符号(C_t-2C_b)表示。此电量与标记酶HRP的量有关，因而可用于目标物PSA的定量分析。

按照上述检测方法得到的线性回归方程为：

Q＝-4.01*10^-4logC_PSA(pg/mL)-4.99*10^-4(R＝0.9924)

按照相同的操作检测出待测前列腺抗原对应的电量值Q，代入线性回归方程中即可得到待测前列腺抗原的浓度。由图9、图10可见，图9展示了电量差值(C_t-2C_b)与PSA浓度之间的关系，该图表明电量差值(C_t-2C_b)与PSA的浓度在0.2～100pg/mL范围内是线性相关的，图10展示了其线性回归方程为(C_t-2C_b)＝-4.01×10^-4log C_PSA(pg/mL)-4.99×10^-4，相关系数为0.9924，检出限为0.067pg/mL(S/N＝3)。

将上述PAA@己二胺@PyCHO@GSs复合物功能化石墨片修饰电极用剪刀剪裁成单根电极后，将10μL0.65mg/mL的PVI-Os溶液滴涂在电极表面，放置1h使电极表面静电吸附PVI-Os作为标记酶的电子介体，用去离子水冲洗并用N₂吹干，之后将电极浸泡在现配的EDC-NHS溶液(含20mM EDC、40mM NHS的0.1MpH＝5.5MES缓冲溶液)中活化电极表面修饰的聚丙烯酸的羧基1h，用去离子水冲洗干净并用N₂吹干。将活化好的电极置于含有少量水的结晶皿中，在电极表面滴涂10μL35μg/mL的PSA抗体(Ab₁)，用保鲜膜封口后放入冰箱中，在湿润的环境中4℃孵育12h。取出后，用PBST洗涤液用力冲洗电极，以移去非特异性吸附在电极表面的PSA抗体，然后将所得电极浸泡在质量浓度为0.1％的NH₂-PEG水溶液中1h，用来封闭残留的活性位点，以避免非特异性吸附的影响，再次用PBST洗涤液冲洗电极表面，并用N₂吹干，最终获得电化学免疫传感器。将10μL不同浓度的PSA标准溶液滴涂在所制备的电化学免疫传感器表面，在37℃水浴锅中温育50min，取出后用PBST洗涤液连续冲洗除去物理吸附的PSA。然后将10μL25μg/mLHRP标记的二抗(Ab₂-HRP)滴涂在电极表面，在37℃水浴锅中温育50min，取出后再次用洗涤液冲洗电极。通过抗原与抗体的特异性识别反应，Ab₂-HRP成功结合到传感器表面，由此构建了一个三明治夹心型电化学免疫传感器。然后将传感器转移到PBS(pH＝7.10，10mM)缓冲液中，在0V(vs.Ag/AgCl)电位条件下通过库仑法进行检测，由于H₂O₂在0V处是电惰性的，因此H₂O₂还原产生的电量与传感器表面固定的Ab₂-HRP直接相关。为了同时获得同一传感器的背景电量(C_b)和总电量(C_t)，在电解至30s的瞬间添加H₂O₂，电解至120s停止检测，将加入H₂O₂前(30s处)测得的电量作为背景电量，库仑积电量结束(120s处)时测得的电量作为总电量(包括背景电量)，最后，将总电量减去背景电量所得的即为HRP还原H₂O₂的电量，即C_red＝(C_t-4C_b)。该方法简便易行，不需要在生物分子上标记复杂的电活性物质。

按照上述检测方法得到的线性回归方程为：

Q＝3.30*10^-4logC_PSA+4.50*10^-4(R＝0.9990)

按照相同的操作检测出待测前列腺抗原对应的电量值Q，代入线性回归方程中即可得到待测前列腺抗原的浓度。由图16、图17可见，图16展示了电量差值(C_t-4C_b)与PSA浓度之间的关系，该图表明电量差值(C_t-4C_b)与PSA的浓度在0.05～100ng/mL范围内是线性相关的，图17展示了其线性回归方程为(C_t-4C_b)＝3.30×10^-4log C_PSA(ng/mL)+4.50×10^-4，相关系数为0.9990，检出限为0.017ng/mL(S/N＝3)。

实施例2制备的氨基功能化复合物和实施例3制备的酸酐基功能化复合物皆为粉末状样品，可通过同样的方法抛撒在印刷电极表面进行功能化修饰，之后通过活化基团固定生物分子来构建免疫传感器，最终获得的传感器性能可以达到与实施例1和实施例4相同的效果。

Claims

1.一种可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

步骤1：制备氨基或羧基或酸酐基功能化石墨片复合物粉末；

步骤2：将导电碳糊刷在电极上，将步骤1所述功能化石墨片复合物粉末通过抛撒的方式均匀的涂布于电极表面，利用湿润的碳糊的粘性将功能化石墨片复合物粉末牢固的粘在电极表面，之后在室温下晾干，再放入40℃的鼓风干燥箱中干燥3 h，从而得到表面功能化印刷电极；

所述氨基功能化石墨片复合物粉末的制备方法包括下述步骤：

步骤2：将羧基功能化石墨片或醛基功能化石墨片与聚乙烯亚胺或己二胺反应，制备氨基功能化石墨片复合物粉末；

所述羧基或酸酐基功能化石墨片复合物粉末的制备方法为：将所述氨基功能化石墨片复合物粉末与甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物反应制备酸酐基功能化石墨片复合物粉末，或将氨基功能化石墨片复合物粉末与聚丙烯酸反应制备羧基功能化石墨片复合物粉末。

2.根据权利要求1所述的可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于：所述羧基功能化石墨片的制备方法为：将芘丁酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再向其中加入石墨粉，用超声波细胞粉碎机连续超声6～10小时，400～500 rpm离心3～5分钟，取上层悬液，再以9000～10000 rpm离心15～20分钟，依次用N,N-二甲基甲酰胺、去离子水洗涤沉淀，真空干燥，得到羧基功能化石墨片；所述芘丁酸与石墨粉的质量比为1:7～15，石墨粉的粒径为1100～1300目，超声的功率为20～30W。

3.根据权利要求1所述的可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于：所述醛基功能化石墨片的制备方法为：将芘甲醛溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再向其中加入石墨粉，用超声波细胞粉碎机连续超声6～10小时，400～500 rpm离心3～5分钟，取上层悬液，再以9000～10000 rpm离心15～20分钟，依次用N,N-二甲基甲酰胺、去离子水洗涤沉淀，真空干燥，得到醛基功能化石墨片；其中，所述芘甲醛与石墨粉的质量比为1:7～15，石墨粉的粒径为1100～1300目，超声的功率为20～30W。

4.根据权利要求1所述的可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于，所述氨基功能化石墨片复合物粉末的制备方法为：将羧基功能化石墨片加入pH=5.5的2-(N-吗啉代)-乙基磺缓冲溶液中，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，搅拌活化2～4小时，离心分离，所得沉淀分散到质量浓度为0.1%～0.5%的聚乙烯亚胺乙醇溶液或1～5mg/mL的己二胺乙醇溶液中，搅拌反应4～6小时，再离心分离，沉淀用去离子水洗涤后干燥，得到氨基功能化石墨片复合物粉末；其中，所述羧基功能化石墨片与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、聚乙烯亚胺乙醇溶液或己二胺乙醇溶液的质量体积比为10 mg:2～4 mg:5～8 mg:2～4 mL。

5.根据权利要求1所述的可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于，所述氨基功能化石墨片复合物粉末的制备方法为：将聚乙烯亚胺或己二胺加入无水乙醇中，然后加入醛基功能化石墨片，搅拌反应4～6小时，离心分离，沉淀用去离子水洗涤后干燥，得到氨基功能化石墨片复合物粉末；其中，所述醛基功能化石墨片与聚乙烯亚胺或己二胺的质量比为4～6:1。

6.根据权利要求1所述的可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于，所述酸酐基功能化石墨片复合物粉末的制备方法为：将甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物加入四氢呋喃中，然后加入氨基功能化石墨片复合物粉末，搅拌反应4～6小时，离心分离，沉淀依次用四氢呋喃、去离子水洗涤后干燥，得到酸酐基功能化石墨片复合物粉末；其中，所述氨基功能化石墨片复合物粉末与甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物的质量比为1:1～2。

7.根据权利要求1所述的可批量化制备表面功能化印刷电极的方法，其特征在于，所述羧基功能化石墨片复合物粉末的制备方法为：将聚丙烯酸加入N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，搅拌活化2～4小时，再加入氨基功能化石墨片复合物粉末，搅拌反应4～6小时，离心分离，沉淀用去离子水洗涤后干燥，得到羧基功能化石墨片复合物粉末；其中，所述氨基功能化石墨片复合物与聚丙烯酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的质量比为10:5～8:3～5:5～8。