CN114259511A

CN114259511A - 苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用

Info

Publication number: CN114259511A
Application number: CN202111644941.5A
Authority: CN
Inventors: 齐素华; 崔雯雯; 罗兰; 蓝婷; 黄琳燕; 王婉; 王凯旋; 叶丛
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114259511B

Abstract

本发明公开苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用，将苦瓜外泌体与大鼠心肌细胞(H9C2)共培养并进行放射处理，MTT实验显示5‑25μg/ml的苦瓜外泌体都能促进放射后H9C2心肌细胞的细胞活力，并挑选10μg/ml作为苦瓜外泌体的使用浓度。在苦瓜外泌体10μg/ml的条件下，通过Ki‑67荧光染色证明苦瓜外泌体能促进放射后H9C2心肌细胞的增殖。通过Annexin V‑PE/7‑AAD流式凋亡实验和凋亡蛋白cleaved‑caspase3免疫印迹验证苦瓜外泌体能降低放射后H9C2心肌细胞的凋亡。DNA损伤标志物γ‑H2A.X的免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹表明苦瓜外泌体能减少放射后H9C2心肌细胞的DNA损伤。

Description

苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用。

背景技术

随着癌症发病率的增加，放疗已经逐渐成为治疗癌症的重要手段。而流行病学调查研究显示胸部放疗癌症患者心血管疾病风险增高。心脏经过照射后会对心脏瓣膜，血管，心室壁及心肌细胞等多方面产生影响。心脏中，内皮细胞受到刺激后活化并分泌大量趋化因子和黏附分子从而引起白细胞浸润，形成炎症微环境，最终引起细胞外基质沉积增加，造成心脏纤维化。新的研究表明辐射会引起细胞DNA损伤、氧化应激、线粒体功能障碍最终抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

为了解决放射治疗所带来的问题，研究人员已经开发出包括化学物、合成物，天然物及植物源的辐射防护剂。但由于化学和合成物具有一定的副作用和毒性，临床使用上存在局限性。植物因其成本低、可获得性高、毒性小而受到人们的关注，成为研发放射保护剂的理想材料。苦瓜作为一种常见的蔬菜，具有食用和药用的价值。已经有研究证明，苦瓜具有抗氧化、抗炎及抗肿瘤等多重保护作用。在我们前期实验中，发现从苦瓜中提取的外泌体具有抑制肿瘤增殖的作用，而苦瓜外泌体做为放射保护剂的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明提供苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用。

具体的，所述应用为苦瓜外泌体在促进放射后H9C2心肌细胞的细胞活力中的应用。

具体的，所述应用为苦瓜外泌体在促进放射后H9C2心肌细胞的增殖中的应用。

具体的，所述应用为苦瓜外泌体在降低放射后H9C2心肌细胞的凋亡中的应用。

具体的，所述应用为苦瓜外泌体在减少放射后H9C2心肌细胞的DNA损伤中的应用。

将苦瓜外泌体与大鼠心肌细胞(H9C2)共培养并进行放射处理，MTT实验显示5-25μg/ml的苦瓜外泌体都能促进放射后H9C2心肌细胞的细胞活力，并挑选10μg/ml作为苦瓜外泌体的使用浓度。在苦瓜外泌体10μg/ml的条件下，通过Ki-67荧光染色证明苦瓜外泌体能促进放射后H9C2心肌细胞的增殖。通过Annexin V-PE/7-AAD流式凋亡实验和凋亡蛋白cleaved-caspase3免疫印迹验证苦瓜外泌体能降低放射后H9C2心肌细胞的凋亡。DNA损伤标志物γ-H2A.X的免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹表明苦瓜外泌体能减少放射后H9C2心肌细胞的DNA损伤。

有益效果：本发明提取的苦瓜外泌体能够明显的提高放射后H9C2心肌细胞的增殖并抑制放射后H9C2心肌细胞的凋亡和DNA损伤，从而达到减轻放射带来的心脏损伤的效果。

附图说明

图1为本发明H9C2心肌细胞与不同浓度苦瓜外泌体(0,0.5,5,10,25μg/ml)共培养并进行16Gy X-ray照射，48小时后用MTT实验检测细胞活力结果；图中IR代表16Gy X-ray照射，MCELNs代表苦瓜外泌体处理；

图2-图3为本发明H9C2心肌细胞的Ki-67免疫荧光实验结果图；图2中IR代表16GyX-ray照射，MCELNs代表10μg/ml苦瓜外泌体处理；图3是Ki-67阳性细胞比例的统计图；

图4-图5为本发明H9C2心肌细胞的蛋白质印迹法检测结果图；图4中IR代表16GyX-ray照射，MCELNs代表10μg/ml苦瓜外泌体处理，图4是cleaved-caspase3蛋白质印迹检测结果图，图5是cleaved-caspase3的统计图；

图6-图7为本发明H9C2心肌细胞的Annexin V-PE/7-AAD流式凋亡实验结果图；图6中IR代表16Gy X-ray照射，MCELNs代表10μg/ml苦瓜外泌体处理，图6是流式凋亡结果图，图7是流式凋亡结果统计图；

图8为本发明H9C2心肌细胞的γ-H2A.X免疫荧光实验结果图；图中IR代表16Gy X-ray照射，MCELNs代表10μg/ml苦瓜外泌体处理；

图9-图10为本发明H9C2心肌细胞的蛋白质印迹法检测结果图；图9中IR代表16GyX-ray照射，MCELNs代表10μg/ml苦瓜外泌体处理，图9是γ-H2A.X蛋白质印迹检测结果图，图10是γ-H2A.X的统计图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

(1)实验材料和药品

1实验药品：DMEM培养基，小牛血清，无外泌体血清，0.25％胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液，苦瓜外泌体，MTT试剂盒，4％多聚甲醛，DAPI，Annexin V-PE/7-AAD流式凋亡试剂盒，蛋白印迹试剂盒。

2实验仪器和材料：二氧化碳培养箱，超净台，X-RAD 225XL辐照仪，酶标仪，共聚焦显微镜，流式细胞仪，培养皿，巴氏吸管，离心管，牛鲍计数板，加样枪，一次性枪头，96孔板，6孔板，共聚焦皿，H9C2细胞(购自于中国科学院上海细胞库)。

(2)实验步骤

1细胞胰酶消化

1.1细胞操作之前用，打开生物安全柜紫外灭菌30分钟，细胞培养基、胰酶等放于37℃水浴箱预热，所有物品进入生物安全柜前75％酒精喷洒于表面消毒。

1.2打开本生灯，将所有的瓶口消毒。

1.3弃去培养皿中培养基，适量的磷酸盐缓冲液清洗细胞2次以去除死细胞。

1.4每个培养皿加入1ml胰酶，使胰酶均匀布满培养皿，37℃培养箱消化1分钟，细胞变圆，加入1ml新鲜培养基终止消化。反复吹打直至培养皿上的细胞脱落，将脱落的细胞收集到15ml离心管中，1000g离心3分钟。

2牛鲍计数板计数

2.1离心后弃去离心管中培养基，加入新鲜培养基并反复吹打混匀，用移液器吸取10μl的细胞悬液转移至血细胞计数板一侧的边缘，使细胞悬液均匀分布在计数板中，重复同样的操作，将另一侧的计数室也均匀的充满。

2.2将细胞计数板放于显微镜载物台上，10倍镜下找到视野，然后转至20倍镜进行计数，遵循数上不数下，数左不数右的压线细胞原则，计数4个大方格内的细胞总数，一侧计数完成后，按照同样的方法，计数另一侧的细胞总数。

2.3细胞数＝细胞计数总数/大方格数×稀释倍数×10⁴。

3、细胞MTT检测

3.1在96孔板中每孔加入5×10³个细胞，放于培养箱过夜。

3.2用无外泌体培养基重悬苦瓜外泌体，使苦瓜外泌体的浓度为0，0.5，5，10，25μg/ml。

3.3弃去孔中培养基，磷酸盐缓冲液轻轻冲洗1遍，每孔加入100μl配置好的含苦瓜外泌体的无外泌体培养基(每个浓度做5个复孔)。

3.4细胞用辐照仪按照200cGy/min，总剂量16Gy X-ray照射，照射后放于培养箱培养48小时(37℃，5％CO₂)。

3.5弃去孔中培养基，磷酸盐缓冲液轻轻冲洗1遍，加入新鲜培养基，向每孔加入10μl的MTT一液，将培养板放在培养箱中孵育4小时后每孔加入100μlMTT二液，将培养板放在培养箱内过夜孵育(14小时)。

3.6用酶标仪测定在570nm处的吸光度。

3.7结果处理：用Graphpad Prism8软件制作OD值曲线。独立重复实验3次。统计学分析：*为P<0.05，**为P<0.01。

4细胞免疫荧光染色实验

4.1根据细胞计数将细胞配成6×10⁴/ml的浓度，每个共聚焦皿中加入1ml的细胞悬液，放于培养箱中过夜。

4.2用无外泌体培养基重悬苦瓜外泌体，使苦瓜外泌体的浓度为10μg/ml。

4.3弃去共聚焦皿中的培养基，磷酸盐缓冲液轻轻冲洗掉死细胞，每孔加入10μg/ml苦瓜外泌体培养基1ml。

4.4细胞16Gy X-ray照射后，在二氧化碳培养箱中孵育48小时。

4.5弃去培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗3次

4.6每皿加入4％的多聚甲醛固定15分钟。倒掉4％多聚甲醛，磷酸盐缓冲盐冲洗3次，每次5分钟。

4.7每皿加入0.5％Triton通透15分钟，倒掉Triton，磷酸盐缓冲盐冲洗3次，每次5分钟。

4.8每皿加入3％BSA封闭30分钟，倒掉BSA，磷酸盐缓冲盐冲洗3次，每次5分钟。

4.9一抗孵育。

4.9.1参考一抗的说明书(Ki-67，γ-H2A.X)，按照1:100的比例用配好的BSA稀释一抗。

4.9.2每皿加入稀释好的一抗，使一抗均匀分布在共聚焦皿中央，4℃孵育过夜。

4.9.3弃去一抗，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5分钟。

4.10荧光二抗孵育。

4.10.1按照1:200的比例用配好的BSA稀释荧光二抗。

4.10.2每皿加入稀释好的荧光二抗，室温避光孵育1小时。

4.10.3弃去二抗，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5分钟。

4.11参考说明书用磷酸盐缓冲液稀释DAPI成合适的浓度，每皿加入适量稀释好的DAPI，室温避光孵育15分钟，弃去DAPI，磷酸盐缓冲液3次，每次5分钟。

4.12每皿加入适量的磷酸盐缓冲液，用共聚焦显微镜观察。

4.13结果处理：统计Ki-67阳性细胞数量百分比，并用Graphpad Prism8软件制作统计图。独立重复实验3次。统计学分析：***为P<0.001，*为P<0.05。

5流式凋亡(Annexin V-PE/7-AAD)实验

5.1六孔板每孔加入1.8×10⁵个细胞，二氧化碳培养箱过夜培养。

5.2用无外泌体培养基重悬苦瓜外泌体，使苦瓜外泌体的浓度为10μg/ml。

5.3弃去六孔板中的培养基，磷酸盐缓冲液轻轻冲洗，每孔加入10μg/ml苦瓜外泌体培养基1ml。

5.4细胞16Gy X-ray照射后，在二氧化碳培养箱中孵育48小时。

5.5弃去培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗3次。

5.6每孔加入0.25％胰酶400μl，培养箱孵育1分钟，加入等量新鲜培养基终止消化，反复吹打使细胞脱落，将脱落的细胞收集至离心管，1000g离心3分钟。弃去上清，用磷酸盐缓冲液吹打混匀，再离心，重复三次。

5.7弃去上清，每管加入100μl Binding buffer重悬细胞，每管分别加入5μlAnnexin V-PE和7-AAD染料混匀，室温避光孵育15分钟。

5.8每管加入200μl Binding buffer混匀，转移至流式管中，流式上机检测。

5.9结果处理：用FlowJo_V10处理结果，并用Graphpad Prism8软件制作统计图。独立重复实验3次。统计学分析：****为P<0.0001，***为P<0.001。

6蛋白质印迹

6.1电泳。

6.1.1SDS-PAGE凝胶配制：参考试剂盒说明书配置12％的浓缩胶。

6.2样品处理：在提取好的蛋白样品中加入5×loading buffer，并将所有样本稀释至同一浓度，100℃金属浴加热10分钟，以充分变性蛋白。

6.3上样与电泳。

6.3.1样本冷却后，即可加入样本孔内。

6.3.2电泳时恒压200V，30分钟即可结束电泳。

6.4转膜：根据胶的大小裁取相同大小的0.22μm的PVDF膜，采用半干转的方法，转膜条件设置为恒压25V，1A，25分钟。

6.5转膜结束后，直接将条带放于配好的5％牛奶中，摇床上缓慢晃动，室温封闭2小时。

6.6牛奶回收，加入洗涤剂快速晃动，洗涤10分钟，共三次。

6.7一抗孵育。

6.7.1参考一抗的说明书(cleaved-caspase3，γ-H2A.X)按照1:1000的比例用抗体稀释液稀释抗体。

6.7.2条带用滤纸吸去表面的水渍，立即加入稀释好的一抗中，4℃孵育过夜。

6.7.3回收一抗，加入洗涤剂，摇床上快速洗涤10分钟，共洗三次。

6.8二抗孵育。

6.8.1参考二抗说明书，按照1:5000的比例用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。

6.8.2用滤纸吸去条带表面的水渍，立即加入稀释好的二抗，室温在摇床上缓慢孵育2小时。

6.8.3回收二抗，加入洗涤剂，摇床上快速洗涤10分钟，共洗三次。

6.9蛋白检测：将ECL曝光液均匀分布在条带上孵育1分钟，使用bio-rad伯乐ChemiDoc MP化学发光凝胶成像系统/全能型成像仪曝光。

6.10用Image Club处理结果，并用Graphpad Prism8软件制作统计图。独立重复实验3次。统计学分析：**为P<0.01，****为P<0.0001。

(3)实验结果

MTT结果如图1所示，苦瓜外泌体浓度在5，10，25μg/ml的条件下，均对放射后H9C2心肌细胞的活性有保护作用，并且选取了10μg/ml的苦瓜外泌体作为后续实验的浓度。

Ki-67细胞免疫荧光实验如图2-3所示，H9C2心肌细胞在照射条件下，Ki-67表达明显降低，而苦瓜外泌体处理的H9C2心肌细胞Ki-67表达增加，表明苦瓜外泌体可以恢复照射后H9C2心肌细胞的增殖能力。

cleaved-caspase3的蛋白质印迹实验结果如图4-5所示，H9C2心肌细胞照射后，cleaved-caspase3的表达显著增加，苦瓜外泌体的使用减少了cleaved-caspase3的表达，表明苦瓜外泌体能减轻照射后H9C2心肌细胞的凋亡。

流式凋亡实验结果如图6-7所示，照射后H9C2心肌细胞的凋亡比率显著提升，而10μg/ml的苦瓜外泌体明显降低了照射后H9C2心肌细胞的凋亡比率。

γ-H2A.X的细胞免疫荧光染色和蛋白质印迹实验结果如图8-10所示，H9C2心肌细胞经过照射后γ-H2A.X表达增加，苦瓜外泌体的使用降低了照射后H9C2心肌细胞的γ-H2A.X蛋白表达，表明苦瓜外泌体可以减少照射后H9C2心肌细胞的DNA损伤。

Claims

1.苦瓜外泌体在放射心脏损伤保护中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，苦瓜外泌体在促进放射后H9C2心肌细胞的细胞活力的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，苦瓜外泌体在促进放射后H9C2心肌细胞的增殖中的应用。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，苦瓜外泌体在降低放射后H9C2心肌细胞的凋亡中的应用。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，苦瓜外泌体在减少放射后H9C2心肌细胞的DNA损伤中的应用。