CN114231459A - 一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用 - Google Patents

一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种治理铅镉污染土壤的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3，拉丁文分类命名为Escherichia coli，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22890。所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3不仅具有高效地解磷作用，能够对土壤中的铅隔进行有效的钝化；此外，在搭配所述第一培养液和所述第二培养液的情况下，除了能实现前期对铅隔的钝化处理，还能够抑制后期出现反溶现象，增强土壤治理的长效稳定性。

Description

一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用
技术领域
本发明涉及微生物及其应用，尤其涉及一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用。
背景技术
世界现代化导致的许多人为活动比如采矿、冶金、电镀等行业一直持续不断的产生大量废物，其中含有惊人的高浓度有毒金属。各种来源排放的大量重金属不断通过各种途径进入食物链，严重影响生物的新陈代谢，最终导致微生物、植物和动物死亡。例如，Cd、Cr、Pb、Hg、Ni和Zn是毒性最强的元素，即使在低浓度下，也已发现会扰乱生物体的新陈代谢，导致人类健康问题。尤其金属中的Cd、Pb是一种及其常见的有毒污染物，产生于金属装饰和电镀工业、冷却塔、制革以及染料和油漆加工业的环境中。因此，迫切需要采取措施来降低土壤重金属污染的环境风险。
可溶性磷酸盐化合物已被广泛应用于修复重金属污染并取得了较高的固定效率，但其不仅比难溶性磷酸盐化合物更为昂贵，而且更容易引起水体富营养化、土壤酸化、植物营养失衡等问题。然而，含磷材料供给自由磷酸根离子的能力又与其钝化修复效率息息相关，不溶性磷酸盐化合物中的低溶解度会限制重金属的固定效率。
现有研究中已经开始采用具有解磷作用的微生物对难溶性磷源进行处理，使其能够对受污染土壤中的相应重金属进行钝化。但是，现有技术中所采用的微生物和治理方法在实际应用性上并不是特别突出，且易出现反溶现象。截止到目前，土壤污染修复的有效性和长效稳定性依然是难以解决的技术难题。
鉴于此，有必要提供一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用，以解决或至少缓解上述土壤治理的有效性和长效稳定性差的技术缺陷。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用，旨在解决现有技术中土壤治理的有效性和长效稳定性差的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种治理铅镉污染土壤的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3，拉丁文分类命名为Escherichia coli，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22890。
本发明还提供一种治理铅镉污染土壤的微生物菌剂，包括如上述任意一项所述的大肠埃希氏菌。
本发明还提供一种如上述任意一项所述的微生物菌剂在治理铅镉污染土壤中的应用。
本发明还提供一种治理铅镉污染土壤的组合物，包括组分A、组分B、以及第一培养液和第二培养液；
其中，所述组分A包括磷源；
所述组分B包括如权利要求2所述的微生物菌剂；
所述第一培养液包括含胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的水溶液；
所述第二培养液包括含葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾的水溶液。
进一步地，所述磷源为磷酸三钙。
本发明还提供一种铅镉污染土壤的治理方法，采用如上述任意一项所述的组合物对铅镉污染土壤进行治理。
进一步地，包括：在第一时间段向待治理的土壤中施加所述组分A、以及含所述组分B和所述第二培养液的第一混合液；
在第二时间段向所述待治理的土壤中施加含所述组分B和所述第一培养液的第二混合液；
其中，所述第二时间段晚于所述第一时间段。
进一步地，还包括：在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待治理的土壤中施加所述第一混合液。
进一步地，在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待处理土壤中多次施加所述第一混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量保持一致；
在所述第二时间段，向所述待处理土壤中多次施加所述第二混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量保持一致。
进一步地，所述第一时间段和所述第二时间段的间隔时长为14-16天。
本发明中所涉及的所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3是从湖南省长沙市湖南先导洋湖再生水有限公司附近某条富营养化河流的底泥中分离出的革兰氏阴性菌，菌落为乳白色，且表面光滑呈圆形，边缘较整齐。所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的适宜生长温度为30℃～35℃，适宜生长PH为6.9-7.2，需氧或兼性厌氧，可生长于所述第二培养液和所述第一培养液中。
所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在所述第二培养液中产酸，可使pH低至4左右，在所述第一培养液中产碱，可使pH高至9左右。所述产气杆菌(Escherichia coli)HQ3的优选磷源为磷酸三钙。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种治理铅镉污染土壤的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3，其不仅具有高效地解磷作用，并且能够对土壤中的铅隔进行有效的钝化和吸收；此外，在搭配所述第一培养液和所述第二培养液的情况下，除了能实现前期对铅隔的钝化处理，还能够抑制后期出现反溶现象，增强土壤治理的长效稳定性。
具体地，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3联合磷酸三钙可在15天内100％钝化铅镉；在土壤试验中，第7天时，产气肠杆菌(Escherichia coli)HQ3复合磷酸三钙的处理使土壤Pb、Cd有效态含量的最高去除率分别为42.3％和39.8％；第15天时，有效态含量的最高去除率分别降至27.5％和21.1％，第30天时，Pb、Cd的有效态含量的去除率再次分别达到44.1％和43.5％，有效抑制了反溶现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为实施例1中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在固体培养基2上培养7天的溶磷圈特征；
图2为实施例1中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的容磷量效果图；
图3为实施例1中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的系统发育树的构建图；
图4为实施例2中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在第15天的处理铅镉的效果图；
图5为实施例2中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3解磷钝化铅镉反应生成物的XRD图；
图6为实施例3中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在不同培养基中的溶磷效果及PH相关性；
图7为实施例4中产大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3第30天的处理铅镉污染土壤的效果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施方式中所有方向性指示(诸如上、下……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
为了完成对铅镉污染土壤的治理，本发明提供了一种大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3是从湖南省长沙市湖南先导洋湖再生水有限公司附近某条富营养化河流的底泥中分离出的革兰氏阴性菌，拉丁文分类命名为Escherichia coli，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCCNo.22890。
所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3具有较优的解磷作用，在7天内，溶磷量可达到629mg/L。微生物的解磷作用能将土壤中难溶性化合态磷转化为可溶性磷，从而用于钝化铅镉，避免直接加入可溶性磷酸盐化合物而引起水体富营养化、土壤酸化、植物营养失衡等问题。因此，使用所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3可以对铅镉污染土壤进行有效地治理。
具体的钝化过程可以包括：所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3和磷酸三钙等难溶性磷源进入受污染的土壤，可以固定重金属(如Pb、Cd、Cu和Zn)并使其形成高度不溶的金属磷酸盐沉淀物，显著降低了Pb和Cd的迁移率和可用性，其中，镉的钝化产物为Ca7.7Cd0.8(PO4)8(H2O)2.4；铅的钝化产物为Pb5(PO4)3Cl。
需了解的是，本发明还对目前现有解磷菌中的一些具有解磷能力的菌株进行了比较研究。例如：在现有研究中，根据《一株高效解磷菌的筛选以及解磷效果验证》中公开的内容，唐岷宸(2020)等人从农田筛选出一株高效解磷菌：经16S r DNA分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，溶磷量达到495.4mg/L，经条件优化后溶磷量可达582.4mg/L。然而，其溶磷效果低于本发明上述实施方式中的HQ3。
为了更好地完成所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的工业化应用，本发明还提供了一种治理铅镉污染土壤的微生物菌剂，包括如上述任意实施方式所述的大肠埃希氏菌。
作为对所述微生物菌剂的补充，为了提高土壤中微生物的多样化，从而提高治理的长效型，所述微生物菌剂中还可以包括用于治理铅镉污染土壤的其他微生物，如：产气克雷伯菌。
鉴于此，本发明还提供了一种如上述任意实施方式所述的微生物菌剂在治理铅镉污染土壤中的应用。
为了便于治理工作的开展，以及进一步提高治理效率，本发明还提供了一种治理铅镉污染土壤的组合物，包括组分A、组分B、以及第一培养液和第二培养液；
其中，所述组分A包括磷源，所述磷源指代的是难溶性磷源，优选可以为磷酸三钙。
所述组分B包括如上述任意实施方式所述的微生物菌剂。
所述第一培养液包括含胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的水溶液。
所述第一培养液的配制过程可以为：将占第一预设质量的40％胰蛋白胨、20％酵母粉、40％氯化钠按质量百分比计算后称取，然后向盛装上述组分的容器中加水定容；其中，所述第一预设质量为向土壤中预计施加的胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的总质量，所述第一预设质量与所述第一培养液的质量体积比可以为2.5g：100ml。
例如：配制100ml第一培养液时，可以向100ml水中加入1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物和1g氯化钠；当然，也可以先称取固体物，再定容至100ml。
所述第二培养液包括含葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾的水溶液。
所述第二培养液的配制过程可以为：将占第二预设质量的48.7％葡萄糖、24.3％氯化镁、1.2％硫酸镁、0.97％硫酸铵、0.49％氯化钾、24.34％磷酸三钙按质量百分比计算后称取葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾，然后向盛装上述称取组分的容器中加水定容；其中，所述第二预设质量为上述葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、及磷酸三钙的质量之和，所述第二预设质量与所述第二培养液的质量体积比可以为2.055g：100ml。
例如：在配制100ml第二培养液时，按计算需在100ml水中加入1g葡萄糖、0.5g氯化镁、0.025g硫酸镁、0.02g硫酸铵、0.01g氯化钾、及0.5g磷酸三钙；但是，由于实际治理过程中预先向土壤中施加了磷酸三钙，因此，所述第二培养液中可以不加入磷酸三钙，可以仅在100ml水中加入1g葡萄糖、0.5g氯化镁、0.025g硫酸镁、0.02g硫酸铵、及0.01g氯化钾；当然，也可以先称取固体物，再定容至100ml。
值得注意的是，虽然铅镉等可以被微生物和难溶性磷源的双重作用下被钝化，但是，虽然随着反应时间的增长，会出现反溶现象，例如：高度不溶的金属磷酸盐沉淀物会生成CdCO3、CdPO4等物质。
需知道的是，经试验研究，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在所述第二培养液中培养时会出现产酸现象和溶磷现象；而在所述第一培养液中培养时会出现产碱现象，并抑制反溶现象的出现。
所以，本技术从反应产物的角度出发，利用微生物在不同组分中培养时的特性，调控pH强度从酸(第二培养液中培养)到碱(第一培养液中培养)，对铅镉进行自然固定稳定化，避免出现反溶，创造性地找到了一种通过pH调控微生物产磷并应用于重金属污染治理的长效机制。
基于所述组合物，本发明还提供了一种铅镉污染土壤的治理方法，其采用如上述任意实施方式所述的组合物对铅镉污染土壤进行治理。
具体地，所述铅镉污染土壤的治理方法包括：在第一时间段向待治理的土壤中施加所述组分A、以及含所述组分B和所述第二培养液的第一混合液；
需注意的是，所述第一混合液可以类比为所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在所述第二培养液中繁殖后的培养液。因具体试验过程中，通常直接在含所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的培养液中取液，而在前期菌种培养时，培养液中会带有部分磷酸三钙，因此，所述第一混合液中也可带有磷酸三钙，并不会影响实际的效果，在具体应用时，本领域技术人员可以根据实际情况选择性地决定是否在所述第二培养液中加入磷酸三钙。
在第二时间段向所述待治理的土壤中施加含所述组分B和所述第一培养液的第二混合液；所述第二混合液可以类比为所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在所述第一培养液中繁殖后的培养液。
其中，所述第二时间段晚于所述第一时间段。
另外，在所述第一时间段和所述第二时间段之间，也可以向所述待治理的土壤中施加所述第一混合液，以维持土壤含水率和菌的活性。
作为对上述实施方式的一种说明：所述第一时间段为起始时间，即在最开始就向所述待治理的土壤中施加所述组分A(包括难溶性磷源)和所述第一混合液(即带有所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的所述第二培养液)，以使土壤中的铅镉出现钝化现象。
所述第一时间段和所述第二时间段的间隔时长可以为14-16天，具体地，所述第二时间段和所述第一时间段的间隔可以为15天，即所述第一时间段的15天后，便可以向所述待治理土壤中施加所述第二混合液，以抑制反溶现象的出现，从而强化钝化效果。
此外，在所述第一时间段和所述第二时间段之间施加所述第二培养液，是为了增强溶磷效率，在促进微生物生长的同时，确保前期产生溶磷效果，以保证铅镉在前期的钝化。
进一步地，在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待处理土壤中多次施加所述第一混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致。在所述第二时间段，向所述待处理土壤中多次施加所述第二混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量一致。
为了便于对本发明做进一步的理解，现举例说明：
实施例1
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3的筛选与鉴定：
1、培养条件：好氧，温度30℃，初始PH＝7(即培养基的初始pH为7)；其中，在液体条件下培养时采用150rpm/min摇床培养。
2、培养基：液体培养基1、液体培养基2、固体培养基2。
其中，液体培养基1的配制过程为：按需配制的容量和固液浓度(25g/L)计算固体成分的质量，然后按占固体成分质量百分比的40％胰蛋白胨、20％酵母粉、40％氯化钠进行称取，并在称取后定容；
液体培养基2的配制过程为：按需配制的容量和固液浓度(20.55g/L)计算固体成分的质量，然后按占固体成分质量百分比的48.7％葡萄糖、24.3％氯化镁、1.2％硫酸镁、0.97％硫酸铵、0.49％氯化钾、24.34％磷酸三钙进行称取，并在称取后定容；
固体培养基2相比于液体培养基2，需额外添加占总体积1.5％的琼脂(质量体积比，即100ml液体培养基2中加入1.5g琼脂)。
3、称取1g取自湖南省长沙市湖南先导洋湖再生水有限公司附近某条富营养化河流的底泥放入灭菌离心管中，加入9ml 0.9％的生理盐水制成10-1的菌悬液，放入150rpm/min的摇床培养箱中震荡20min，取出后静置2h。
4、悬液静置后取上清液接种2％至液体培养基2，然后置于摇床上，恒温30℃，150rpm/min，震荡培养2～3d。培养一段时间后取0.4ml的菌悬液以及4.5ml的超纯水进行梯度稀释，稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的样品菌悬液，10-2、10-4、10-6倍浓度梯度的菌悬液各取200μl，依次均匀的涂布在培养基2上，将涂布好的培养皿倒置放入恒温培养箱中，在30℃条件下恒温培养24h后，观察并记录菌落及溶磷圈的大小，做好菌种标记，筛选出4株解磷菌。
5、将筛选出的4株解磷菌分别在固体培养基2上进行平板划线纯化(在无菌操作台里面挑选出有明显溶磷圈的解磷菌规范平板划线至固体培养基2，放置30℃培养箱中培养一周)，然后进一步挑选出有明显溶磷效果的解磷菌，并记为HQ3；其中，HQ3的溶磷圈特征如图1所示。
6、解磷菌溶磷后定性分析发酵液中的有效磷含量：钼锑抗比色法。
将HQ3的单菌株置于液体培养基2中进行富集培养7天后，取1％的菌悬液于灭菌的离心管中，在10000rpm的条件下离心后取100μL上清液加入50ml比色管，加入至刻度线三分之二的超纯水，然后加入1ml上述配制A液以及2ml上述配制B液，混合均匀并定容至刻度线，静置显色15min后在紫外可见分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm，根据标准曲线计算出对应的有效磷含量。
另外，本实施例还在同等条件下进行无菌的空白对照试验。
7、在测定后得出结论：参考图2所示，空白对照试验中的有效磷浓度远低于HQ3的发酵液中有效磷的浓度，且HQ3以培养基2为营养源时解磷效果极好，在7天内，溶磷量可达到629mg/L，即HQ3是一种高效解磷菌。
8、如上述所述的解磷菌HQ3的鉴定方法为利用引物和对菌株进行扩增和正向测序，通过将序列与NCBI数据库中序列进行对比，其与大肠埃希氏菌相似性达到100％，如图3所示，构建发育树鉴定其为Escherichia coli。
该大肠埃希氏HQ3菌株的16s DNA基因序列测定结果如下：
Gtcgaacggtaacaggaagaagcttgcttctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcttgttggtggggtaacggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgatactggcaagcttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgct
实施例2
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在钝化铅镉中的作用：
1、从HQ3菌株的平板上挑取单菌落到20mL的液体培养基1(同实施例1)中过夜培养，然后转接到100mL的液体培养基1中扩大培养。
2、观察HQ3菌株的生长密度，用紫外分光光度计在600nm的波长下测定它的生长曲线，以确定HQ3菌株的对数生长期和稳定期OD600＝1的时刻用于后续实验。在培养3.5h时，即达到OD600＝1的稳定期。
3、配置铅、镉母液：称取1.5985g硝酸铅、20.317g氯化镉分别溶于盛有500ml超纯水的烧杯，同时用玻璃棒不断搅拌直至溶解，后分别转入1L的容量瓶定容到刻度线，贴上标签备用。
4、设置铅镉溶液实验，在灭菌的液体培养基2(同实施例1)里面通过无菌滤头分别加入1ml铅母液和1ml镉母液(100ml液体培养基2中加入1ml铅母液和1ml镉母液)，同时将扩大培养到OD600在1左右的菌液按1％的接菌量加入，然后在30℃，初始PH＝7，150rpm/min的条件下水浴震荡培养15天，用ICP测定溶液中含有的Pb2+、Cd2+的浓度变化。
此外，本实施例还在同等条件下进行了以下对比试验：(1)无菌的空白对照试验、(2)仅采用解磷菌HQ3，而不联用磷酸三钙的钝化试验。
结果显示：对于HQ3联用磷酸三钙的实验组，在好氧、常压、30℃、初始PH＝7、150rpm/min恒温摇床培养的条件下，第15天时已基本无法检测到Pb2+、Cd2+的存在。参照图4所示，在此条件下解磷菌HQ3联合磷酸三钙可在15天内100％钝化铅镉。
6、对钝化产物的鉴定：为了解铅镉钝化反应结果，通过对15天的反应产物进行离心(离心条件:10000rpm离心10min)，留下反应沉淀物(通过3次超纯水洗涤并离心)放入30度烘箱中干燥一星期，等干燥完全即可研磨成粉进行XRD测试。
结果显示：参照图5理解，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3菌株可生成稳定的螯合物；其中，镉的反应产物为Ca7.7Cd0.8(PO4)8(H2O)2.4；铅的反应产物为Pb5(PO4)3Cl。
实施例3
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在不同培养基中的溶磷特性
注：本实施例所用液体培养基1与实施例1中的等同，并额外加入了与液体培养基2等量的葡萄糖和磷酸三钙；本实施例所用液体培养基2与实施例1中的等同；本实施例所用培养基的初始pH均为7。
吸取1％的HQ3培养菌液分别放入培养基1和培养基2中作为不同营养源培养，置于摇床上恒温30℃，150rpm/min，震荡培养一周，每天在相同时间点于无菌操作台上取3ml样品于5ml离心管中，8000rpm的条件下离心5分钟取上清液，且用钼锑抗比色法测定有效磷的含量变化，并且记录下对应的PH值。
测定后结果显示：参照图6理解，以培养基2为营养源时，解磷效果显著，且培养基溶液体系中PH值由中性急剧下降至4左右；
作为对照试验的培养基1本无溶磷现象，PH值稳定上升至9左右，由此可推断HQ3的解磷效率均与PH值有一定的相关性。
需说明的是，图6中的实线对应的是溶磷量，虚线对应的是PH。
实施例4
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3在铅镉污染土壤中的应用
注：本实施例所用液体培养基1与实施例1中的液体培养基1一致；
本实施例中初次喷洒的大肠埃希氏菌HQ3的菌液中所含的液体培养基2与实施例1中的等同；
在后续间隔喷洒的含HQ3的液体培养基2中，液体培养基2中未加入磷酸三钙，以避免磷酸三钙的持续性加入对土壤造成影响，该液体培养基2的其余成分的量与实施例1中的保持一致。
1、称量风干土壤10g(40目)置于50ml离心管中，并通过直接投放的方式加入磷源(难溶性磷源：磷酸三钙)，然后利用干净塑料棒搅拌，使磷酸三钙在土壤样品中均匀分布；
2、向锥形瓶中喷洒提前配置好的大肠埃希氏菌HQ3的菌液(菌剂在培养基2里面生长至OD600＝1的稳定期或者对数生长期)并搅拌均匀，最终使土壤含水率(菌液)为30％；
3、前15天每隔3天添加含HQ3的培养基2(OD＝1)，使土壤保持30％的含水率，后15天每隔3天添加含HQ3的培养基1(OD＝1)，使土壤保持30％的含水率。投加的磷酸根含量与土壤中Pb、Cd两种重金属元素含量保持一定的比例关系，具体地，磷酸三钙的投加量与土壤中所含Pb(P：HMs＝1：1)、Cd(P：HMs＝5：1)的摩尔质量比相关，最终确定投加量为4mg/g。
另外，本实施例还在同等条件下进行了无菌的空白对照试验。
实验结果显示：参照图7理解，在7天时，微生物HQ3菌剂复合磷酸三钙的处理使土壤Pb、Cd有效态含量的最高去除率分别达到42.3％和39.8％；在15天时，有效态含量的最高去除率分别降至27.5％和21.1％，说明出现了反溶现象；而在30天时，Pb、Cd的有效态含量的去除率再次分别达到44.1％和43.5％，成功地抑制了反溶现象。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。
序列表
<110> 中南大学
<120> 一种大肠埃希氏菌、微生物菌剂、组合物及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1403
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 1
gtcgaacggt aacaggaaga agcttgcttc tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 60
tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 120
aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcggatg tgcccagatg 180
ggattagctt gttggtgggg taacggctca ccaaggcgac gatccctagc tggtctgaga 240
ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtatg aagaaggcct 360
tcgggttgta aagtactttc agcggggagg aagggagtaa agttaatacc tttgctcatt 420
gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 480
ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca 540
gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatctga tactggcaag cttgagtctc 600
gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc 660
ggtggcgaag gcggccccct ggacgaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 720
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gtcgacttgg aggttgtgcc 780
cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 840
aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900
tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cagaactttc cagagatgga 960
ttggtgcctt cgggaactgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1020
aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggtccggc 1080
cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140
atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcgcataca aagagaagcg 1200
acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tgcgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1260
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt 1320
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1380
agcttaacct tcgggagggc gct 1403

Claims (10)

1.一种治理铅镉污染土壤的大肠埃希氏菌，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HQ3，拉丁文分类命名为Escherichia coli，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年7月13日，保藏编号为CGMCC No.22890。
2.一种治理铅镉污染土壤的微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的大肠埃希氏菌。
3.一种如权利要求2所述的微生物菌剂在治理铅镉污染土壤中的应用。
4.一种治理铅镉污染土壤的组合物，其特征在于，包括组分A、组分B、以及第一培养液和第二培养液；
其中，所述组分A包括磷源；
所述组分B包括如权利要求2所述的微生物菌剂；
所述第一培养液包括含胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠的水溶液；
所述第二培养液包括含葡萄糖、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵和氯化钾的水溶液。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述磷源为磷酸三钙。
6.一种铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，采用如权利要求4或5所述的组合物对铅镉污染土壤进行治理。
7.根据权利要求6所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，包括：在第一时间段向待治理的土壤中施加所述组分A、以及含所述组分B和所述第二培养液的第一混合液；
在第二时间段向所述待治理的土壤中施加含所述组分B和所述第一培养液的第二混合液；
其中，所述第二时间段晚于所述第一时间段。
8.根据权利要求7所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，还包括：在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待治理的土壤中施加所述第一混合液。
9.根据权利要求8所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，
在所述第一时间段和所述第二时间段之间，向所述待处理土壤中多次施加所述第一混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量保持一致；
在所述第二时间段，向所述待处理土壤中多次施加所述第二混合液，单次施加量与所述第一时间段中所述第一混合液的总施加量保持一致。
10.根据权利要求7-9任意一项所述的铅镉污染土壤的治理方法，其特征在于，所述第一时间段和所述第二时间段的间隔时长为14-16天。
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