CN114225048B - 介孔多巴胺给药系统及其在治疗膝骨关节炎的应用 - Google Patents

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Abstract

一种介孔多巴胺纳米颗粒用于装载化合物、寡聚物或聚合物，通过疏水相互作用吸附化合物、寡聚物或聚合物，使化合物、寡聚物或聚合物得以被均匀释放。以本发明的介孔多巴胺为给药系统装载RCGD423，在28天的缓释期内，大部分加载的RCGD423均匀释放。进一步验证表明，装载RCGD423的介孔多巴胺颗粒不仅能够抑制骨关节炎的病程进展，还因受控释放可以避免在局部大剂量给药时可能存在的潜在毒性。

Description

介孔多巴胺给药系统及其在治疗膝骨关节炎的应用
技术领域
本发明涉及一种用于给药的系统，尤其涉及一种以生物材料制得的介孔纳米颗粒，作为给药系统，用于装载化合物、寡聚物或聚合物，使得药物释放速率更均匀，降低细胞毒性。
背景技术
骨关节炎是老年人关节最常见的慢性退行性疾病，其特征是滑膜炎症、软骨丧失和骨赘形成。严重的关节疼痛影响生活质量，降低劳动能力，给社会和家庭带来沉重负担。骨关节炎治疗的根本问题是控制炎症的进展。目前的疗法包括镇痛药，非类固醇抗炎药物(NSAIDs)，和透明质酸或皮质类固醇的关节注射。终末期前的骨关节炎通常建议使用药物治疗。口服药物有明显的副作用，而关节腔注射则没有此类副作用，是一种高效的临床治疗。然而，注射到关节腔的药物被淋巴系统迅速去除，大大限制了这种方法在治疗骨关节炎的疗效。常用的药物通常作用短，因此他们在漫长的治疗过程中经常反复施用，以减轻疼痛。例如，虽然透明质酸已被用于治疗早期骨关节炎症状，但它是短效的，每周需要多次关节注射，因此患者适应能力较差。此外，频繁注射会增加膝关节感染的风险。
现已为骨关节炎治疗开发了各种可控和长期药物输送的药物载体。然而，大多数纳米载体的生物应用有限。例如：脂质体、胶束和树状大分子通常负荷低，无机多孔材料有毒且降解性不足。聚乳酸(PLGA)是临床研究中常用的药物载体，因为它具有安全性、可靠性、低毒性及诸多理化特性。然而，PLGA药物释放有几个缺点，包括有效装载率低，释放迅速以及降解产生的酸性降解产物，使得其很难实现长期控释。因此，迫切需要一个长期、稳定的药物输送系统来治疗慢性退行性疾病。特别是在骨关节炎中，临床需求是建立长期、稳定的药物输送系统，用于关节腔内的药物释放。这是实现更有效和长期骨关节炎治疗的必要条件。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种介孔多巴胺，作为载体用于装载化合物、寡聚物或聚合物，利于局部给药。
本发明的另一个目的在于提供一种介孔多巴胺，作为载体用于装载化合物、寡聚物或聚合物，调节化合物或聚合物释放的速率，实现长期给药。
本发明的再一个目的在于提供一种介孔多巴胺，作为载体用于装载化合物、寡聚物或聚合物，降低化合物或聚合物的细胞毒性。
本发明的又一个目的在于提供一种介孔多巴胺，作为RCGD423的载体，用于抑制骨关节炎的病程进展。
本发明提供一种介孔多巴胺，具有生物相容性好、装载能力高、基于自聚合合成等优点。与其他纳米粒子相比，这些纳米粒子的合成速度更快、更简便、更经济。装载化合物、寡聚物或聚合物，这些物质的释放更均匀。
相较于无孔多巴胺纳米材料或介孔硅，介孔多巴胺的载药量更高。MPDA的合成是基于启发自贝类的多巴胺(PDA)，它以粘合性能而闻名，能够改善许多材料的吸附性。采用BJH方法利用脱附曲线数据对该物质的孔径分布进行了分析，可以看出该物质上存在较多的介孔分布，且呈现较为明显的双峰型孔径分布形式，介孔尺寸分别集中在2～15nm和15～35nm之间。本发明的MPDA纳米粒子有不规则的小孔(直径<5纳米)，使它们能够形成多孔结构，且成中空腔体结构。MPDA的比表面积为34.5平方米/克。根据其最大吸附压力下的吸附量可计算得到其孔容为0.20cm3/g。
PDA粒子聚合和互连的模式使得MPDA结构中生成了狭缝状的间皮。MPDA的芳香环结构可导π-π堆叠、与小分子RCGD423的疏水相互作用以及随后的多层吸附，从而可能增强药物吸附。
将盐酸多巴胺(如：0.30克)和表面活性剂(如：F127，0.2克)溶解乙醇溶液(如：50v/v％)；混合搅拌后(如：30分钟)，加入三甲苯(如：320微升)，超声(如：10分钟)；随后，加入氨水(如：750微升)；继续在室温下搅拌(如：2小时)；最后离心(如：以13000转/分的速度15分钟)，获得MPDA纳米粒子沉淀。
本发明提供了一种RCGD423给药系统，以介孔多巴胺为载体，使得大部分药物实现均匀释放，降低细胞毒性。
MPDA的相应RCGD423负载量为744μg/mg，载药量为93％。在28天内，83.9％加载的RCGD423中的从RCGD423@MPDA纳米颗粒中释放。大部分RCGD423是在开始缓释后的一个月内从MPDA纳米粒子中释放，在整个缓释期间内以恒定的速度释放。
在28天的缓释期内，大部分加载的RCGD423均匀释放。RCGD423的受控释放可以避免在局部大剂量给药时可能存在的潜在毒性。MPDA展示出对小分子调节剂的高亲和力和保留性，利于防止其过早释放。。
本发明提供的介孔多巴胺纳米粒子，以及RCGD423@MPDA系统，用于注射到关节中。RCGD423@MPDA提供部分保护，抵御IL-6引起的软骨细胞基质降解，显著减少硝普钠引起的凋亡。
根据CCK-8检测，1μg/ml、2μg/ml或5μg/ml MPDA浓度的软骨细胞增殖和生存能力与对照组没有显著差异。同样浓度的RCGD423@MPDA将软骨细胞的活力提升到健康水平。与之前结果一致，即MPDA本身不存在毒性。
RCGD423@MPDA调节IL-6诱导软骨细胞损伤。它减少了骨关节炎的损伤的关键问题，即与凋亡相关的炎症和降解相关因素的产生，而加载的纳米粒子并没有显著影响软骨合成。在体内，RCGD423@MPDA比其他治疗方法(对照组，仅透明质酸组和透明质酸与RCGD423混合组)取得更好的疗效。这些发现验证了MPDA在长期治疗中有效延缓骨关节炎的发生。
MPDA加载RCGD423可以减轻IL-6引起的炎症和减缓骨关节炎的进展。负载中等剂量RCGD423的MPDA纳米粒子能够提供长期和稳定的药物释放，显著促进细胞增殖和减少炎症和凋亡。这些发现表明，MPDA提供有效和持续的药物释放，能改善骨关节炎治疗。以目前的技术，在静脉注射后难以控制纳米粒子的分布。因此，局部的关节内治疗可以最大限度地维持药物留存。
这些结果表明，用药物可以抑制骨关节炎的病程进展，分子控制的释放，通过介孔多巴胺，产生比单纯药物治疗更好的结果。
附图说明
图1为制得的MPDA纳米粒子透射电子显微镜结果图；
图2为制得的MPDA纳米粒子扫描电子显微镜图结果图；
图3为MPDA和RCGD423@MPDA紫外-可见光吸收比较结果图；
图4为RCGD423@MPDA纳米颗粒释放曲线图；
图5为MPDA和RCGD423@MPDA分别对软骨细胞活力影响结果图；
图6为MPDA和RCGD423@MPDA分别对抑制IL-6所致的软骨细胞活力影响结果图；
图7为软骨细胞凋亡速率结果图，其中#表示相比对照组P＜0.05，*表示相比0.5mMSNP对照组P＜0.05，**表示相比0.5mM SNP对照组P＜0.01，***表示相比0.5mM SNP对照组P＜0.001，****表示相比0.5mM SNP对照组P＜0.0001。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下：
1)MPDA纳米粒子的合成
0.30克盐酸多巴胺和0.2克F127溶解在含有去离子水(10mL)和乙醇(10mL)的混合溶液中。混合搅拌30分钟后，加入320微升三甲苯，混合溶液在水浴中超声10分钟。随后，边搅拌边加入750微升氨水。反应混合物在室温下搅拌2小时。随后以13000转/分的速度离心15分钟，获得MPDA纳米粒子沉淀，然后用水和乙醇清洗反复清洗。最终产品重悬在水中供进一步使用。
2)RCGD423@MPDA纳米粒子的合成
5毫克MPDA与0.4毫克/毫升的RCGD423混合于10mL的PBS缓冲液中(pH7.4)。混合物在冰上搅拌48小时。然后离心去除上清液，收集纳米颗粒沉淀。通过高效液相色谱(HPLC)测定RCGD423的浓度。通过从初始溶液中RCGD423的量中减去载药离心后上清液RCGD423的量，计算MPDA的载药能力。
3)药物释放实验
0.5毫克RCGD423装载的纳米颗粒分散在1毫升的PBS磷酸盐缓冲盐中。置于37℃恒温的低速摇床上。在预定时间内(第1、4、7、10、14、21和28天)，溶液从EP管中取出，并使用高效液相色谱分析释放的RCGD423的含量。为了保持体积恒定，每次取样后均添加1mL的PBS介质。RCGD423的平均释放量进行三次重复测量。
4)细胞培养
分离小鼠膝关节软骨细胞。在细胞培养实验中，在DMEM-F12培养基中培养关节软骨细胞，并辅以10％的胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。软骨细胞在含有5％的二氧化碳的37℃加湿培养箱中培养。然后，必要时用50ng/mL小鼠IL-6/IL-6R alpha复合物刺激软骨细胞。
5)细胞毒性检测
CCK-8测试用于评估小鼠关节软骨细胞的细胞毒性和活力。软骨细胞以每孔5×103个细胞被接种到96孔板中，并在37℃下孵育24小时。然后，弃去原培养基，加入含各种浓度的MPDA、MPDA@RCGD423或普通完全培养基。孵育48小时后，移除培养基，加入10微升CCK-8，和100微升的新鲜介培养基，进一步孵育为3小时。最后，使用酶标仪测量其于450nm的吸光度。
6)5-乙酰-2’-脱氧尿素(EdU)染色
EdU染色用于评估软骨细胞增殖。软骨细胞被接种到96孔板中。24小时后，添加载药纳米颗粒，并在37℃下与软骨细胞共同孵育。24小时后，EdU染料被添加到孔中。2小时后，弃去培养基，用4％多聚甲醛溶液固定细胞。Apllo反应溶液和Hoechst3334避光加入空中孵育30分钟，随后用PBS清洗细胞。图像使用倒荧光显微镜拍摄。
7)实时定量PCR
在与RCGD423和50ng/mL IL-6共同培养48小时后，使用RNAiso Plus提取了总细胞mRNA。cDNA使用反向转录试剂盒进行反向转录。所有PCR均使用SYBR green qPCR mix执行，反应体系20uL。GAPDH用作PCR内参。检测降解相关因子ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMp-3、MMP-13和Timp1，并检测合成相关因子Acan和Sox9。
8)流式细胞学分析
软骨细胞按照1×105个细胞/mL的密度接种于6孔板中。当细胞达到75％～85％融合时，我们添加了含有5％血清的培养基，其中含有0.5mmol/L硝普钠(SNP)以及含有或无纳米颗粒。硝普钠用于诱导软骨细胞凋亡，以研究RCGD423@MPDA对软骨细胞的影响。24小时后，收集软骨细胞，以2000转/分钟离心5分钟，去除上清，并在每个离心机管中加入PBS重悬细胞，再次离心。弃去PBS，细胞在100μl 1×结合缓冲中重悬，转移至流式管中。我们在流式管中添加5μl Annexin V-FITC染液和5μl PI染液；室温孵育15分钟。接下来，在流式管中添加400μl 1×结合缓冲溶液。最后使用流细胞仪检测小鼠软骨细胞的凋亡率。
9)动物实验
300-320克Wistar大鼠(八周龄，雄性)，来源于维通利华实验动物技术有限公司。老鼠被放置在一个25℃正常照明(12∶12小时光+暗循环)在房间。动物被随机分成五组：假手术组(n＝6)、骨关节炎组(n＝6)、骨关节炎+透明质钠(n＝6)，骨关节炎+透明质钠+RCGD423(n＝6)，骨关节炎+透明质钠+RCGD423@MPDA(n＝6)。纳米颗粒溶解在0.5％的透明质钠中。向大鼠注射1毫克碘酸钠以诱发骨关节炎。向对照大鼠注射了同样数量的盐水。药物的剂量为20微克/鼠，在碘乙酸钠(MIA)注射造模后的1天加入。
10)组织病理染色
每组有三只动物用于观察大体形态，三只动物用于随后的组织学分析。动物在治疗后四周被安乐死，切除膝关节，于4％多聚甲醛中固定24小时。加入EDTA脱钙液，37℃脱钙5周。膝盖关节脱水并包埋于石蜡中，进行厚度为5μm的连续切片。然后，对切片进行苏木素-伊红(H&E)、甲苯胺蓝和番红固绿染色。使用国际骨关节炎研究协会(OARSI)评分系统评估骨关节炎的严重程度。
11)免疫化学染色
首先，切片脱蜡复水。于98℃下使用柠檬酸钠溶液抗原修复液修复30分钟，冷却至室温。加入3％的过氧化氢中和内源性过氧化酶。切片在含有10％山羊血清的PBS溶液中孵育30分钟，以封闭非特异性抗原。然后添加了MMP-13抗体(8165-1-AP，1∶100，proteintech)置于4℃湿盒中过夜。然后加入二抗，在室温下孵育切片30分钟。DBA显色液显色，光学显微镜拍摄。
12)统计分析
多个组别之间通过单因素方差分析进行比较，P<0.05被视为有统计学意义。结果表示为平均值±标准差。
实施例1 MPDA纳米粒子表征
透射电子显微镜和扫描电子显微镜结果显示，如图1和图2所示，MPDA表现球形颗粒(94.1±11.6nm)。MPDA分子表现出明显的IV型滞后回环结构，说明其具有介孔结构。根据滞后回环的类型可以推测，这种介孔是由于分层板状结构的堆积造成的。通过BET比率表面积测试分析，确定MPDA的比表面积为34.5平方米/克。根据其最大吸附压力下的吸附量可计算得到其孔容为0.20cm3/g。采用BJH方法利用脱附曲线数据对该物质的孔径分布进行了分析，可以看出该物质上存在较多的介孔分布，且呈现较为明显的双峰型孔径分布形式，介孔尺寸分别集中在2～15nm和15～35nm之间。通过计算可知该物质的平均孔径为16.0nm。有第二个孔大小的峰值为23nm(范围15～35nm)，反映了MPDA结构中空心腔体结构的存在。在傅立变换红外光谱结果表明，3391cm-1对应O-H和N-H伸缩振动，2929cm-1对应C-H伸缩振动，1609cm-1对应芳环中N-H弯曲振动，1512cm-1对应N-H弯曲振动，1455cm-1对应C-H弯曲振动，1355cm-1和1287cm-1分别对应苯环上C-OH弯曲和伸缩振动，1110cm-1对应C-O伸缩振动。
实施例2 RCGD423@MPDA微球的合成和表征
将RCGD423加载到MPDA上，在PBS缓冲液(pH 7.4)中评估MPDA载药量。48小时后离心并收集上清液，测得上清液内RCGD423含量为载药前的14％。当RCGD423的孵育浓度为0.4mg/mL时，RCGD423在MPDA上的载药量为744微克/毫克(RCGD423：MPDA，w/w)，此含量的RCGD423@MPDA被用于后续实验，以用于评估载药颗粒的疗效。紫外-可见光吸收光谱证实了RCGD423被负载于MPDA之上。200nm-800nm的范围中于200nm-240nm中观察到了显著的RCGD423吸收峰，见图3。在28天内，83.9％加载的RCGD423中的从RCGD423@MPDA微球中释放，见图4。大部分RCGD423是在开始缓释后的一个月内从MPDA纳米粒子中释放，在整个缓释期间内以恒定的速度释放。
随后评估合成的RCGD423@MPDA纳米颗粒是否对关节软骨细胞的细胞活力造成影响。CCK-8测试表明MPDA在1μg/mL、2μg/mL或5μg/mL下对生存能力没有显著影响，而在10和20μg/mL下有较为明显的影响，见图5。相比之下，RCGD423@MPDA在1μg/mL、2μg/mL和5μg/mL时，细胞活力相对于对照组和同浓度的MPDA组有所提高。Edu染色显示，5毫克/mL的RCGD423@MPDA提高了细胞增殖的比例，而MPDA自身对其并没有显著影响增殖。因此，后续实验选择1μg/mL、2μg/mL和5μg/mL含或者不含RCGD423的MPDA。
实施例3 RCGD423@MPDA可以预防IL-6引起的软骨炎症
IL-6家族成员在软骨生物学和发病机制中的作用得到了广泛的研究。IL-6、OSMLIF和其他IL-6家庭成员已被证明促进骨关节炎，包括作为炎症相关因素以及通过直接调节基质破坏。IL-6的信号转导是通过将IL-6与其特定的α受体相结合诱导的。在与IL-6R的复合体中，IL-6以高亲和力激活信号转导β受体gp130的同源二聚体。β受体由所有IL-6家族成员共有。
阿利新蓝染色表明，50ng/mL的IL-6刺激软骨细胞6天后细胞外基质层中的糖含量下降。CCK-8实验表明，IL-6刺激降低软骨细胞的细胞活力，随后的RCGD423@MPDA使用抑制了这种损伤，表明RCGD423@MPDA部分抑制了IL-6引起的软骨细胞损伤，见图6。
IL-6对ADAMTS、MMP和小鼠软骨细胞中重要的合成代谢和表型基因的表达的影响评估表明：IL-6孵育软骨细胞48小时后，Mmp3、Mmp13、Adamts4、Adamts5和Timp1的mRNA水平上升，而RCGD423@MPDA与IL-6共孵育能降低这些基因表达。IL-6引起的Adampts4的升高在5μg/mLMPDA单独治疗组有所缓解。仅MPDA的加入并没有显著改变IL-6对其他基因mRNA的调节。IL-6没有改变软骨分化相关基因Sox9的mRNA表达，但对编码Aggrecan的合成代谢基因Acan的mRNA表达产生影响。MPDA和RCGD423@MPDA的加入并没有显著改变IL-6诱导的Acan或Sox9的表达。
RCGD423作为一种新的gp130信号小分子调节剂，在以往研究中显著减少了大鼠模型中的软骨损伤。RCGD423主要通过与pSTAT3/MYC相互作用促进活性同源二聚体信号的形成。能够积极对抗IL-6家族细胞因子介导的异构化，从而抑制由ERK12和NF-kB介导的代谢引起的肥大和降解。
实施例4 RCGD423@MPDA能抵抗软骨凋亡
流细胞学显示SNP加入会引发软骨细胞凋亡，其同时促进早期和晚期凋亡，但晚凋亡改变较为明显。当SNP与RCGD423@MPDA共同孵育时，RCGD423@MPDA(5微克/兆升)显著减少细胞凋亡，以晚期凋亡为主。仅加入MPDA并不能显著改变凋亡，见图7。安全剂量范围内的MPDA不会加剧软骨基质降解或软骨细胞凋亡。
实施例5在RCGD423@MPDA微球对大鼠模型中药物诱发的骨关节炎的活体软骨保护作用
通过关节腔内注射MIA构建了大鼠骨关节炎模型。注射后四周收集组织，进行组织病理学和免疫组织化学染色。受骨关节炎影响关节表面软骨损伤和不规则。将RCGD423与RCGD423@MPDA注射到关节腔中可不同程度地减少软骨退变。在骨关节炎组，H&E染色显示关节软骨表面不连续、软骨侵蚀、表面积损失不完整。甲苯胺蓝色和番红固绿染色表明，与假手术组相比，骨关节炎组中的葡萄糖胺多糖含量有所降低。与未经治疗的骨关节炎造模组相比，关节腔内注射RCGD423@MPDA能够抵御炎症引起的关节侵蚀。OARSI评分显示治疗组的得分明显低于未经治疗的骨关节炎组。RCGD423@MPDA缓释治疗比RCGD423单独使用疗效更佳。这些发现揭示了使用MPDA纳米粒子的优势。我们通过对基质金属蛋白酶13(MMP-13)的化学染色，研究了膝关节成分的生化变化。骨关节炎组的MMP-13含量明显高于对照组。透明质酸，透明质酸+RCGD423，透明质酸+RCGD423@MPDA治疗组的MMP-13含量低于未治疗组。

Claims (5)

1.一种载RCGD423的介孔多巴胺纳米颗粒制备方法，包括：
将0.30克盐酸多巴胺和0.2克表面活性剂F127溶解于50v/v％乙醇溶液，混合搅拌30分钟后，加入320微升三甲苯，超声10分钟后，加入750微升氨水，继续在室温下搅拌2小时，最后离心，获得介孔多巴胺纳米颗粒，即MPDA纳米颗粒；
制得的介孔多巴胺的介孔尺寸分别集中在2～15nm和15～35nm之间，具有直径<5纳米孔和中空腔体结构，孔容为0.20cm3/g，所述的RCGD423通过疏水相互作用吸附于介孔多巴胺；
在28天内，83.9％加载的RCGD423从RCGD423@MPDA纳米颗粒中释放，在整个缓释期间内以恒定的速度释放。
2.根据权利要求1所述的介孔多巴胺纳米颗粒制备方法，其特征在于所述的RCGD423负载量为744μg/mg。
3.一种给药系统，包括介孔多巴胺和RCGD423，其特征在于以权利要求1所述的载RCGD423的介孔多巴胺纳米颗粒制备方法制得。
4.根据权利要求3所述的给药系统，其特征在于所述的RCGD423负载量为744μg/mg。
5.根据权利要求3所述的给药系统在制备抑制骨关节炎的药物中的应用。
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