CN114225040A - 逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的药物及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的药物及其筛选方法。本发明确定了抑制RAC1和/或RAC3表达可提高头颈鳞癌对西妥昔单抗的敏感性,且RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP‑016与西妥昔单抗的联合用药可以逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性,本发明为提升西妥昔单抗药效和应用范围提供了新的方法和思路。
Description
技术领域
本发明涉及逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的药物及其筛选方法。
背景技术
头颈鳞癌是一类起源于口腔、咽部(鼻咽、口咽、下咽)、喉部等上呼吸道黏膜上皮细胞的恶性肿瘤,占头颈肿瘤的90%以上。头颈部解剖复杂,各类器官密集,且多为重要器官。因此头颈鳞癌的发生极大危害着患者外貌和基本生理功能(咀嚼、吞咽、呼吸等)、感觉功能(味觉、嗅觉、听觉)和语言功能。头颈鳞癌的致病因素不明,其发生主要与吸烟、饮酒、嚼食槟榔等不良生活习惯相关,EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)和人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染分别是鼻咽癌和口咽癌的危险致病因素。目前,手术和放化疗是头颈鳞癌的主要治疗手段。尽管手术方式及放化疗技术在不断地改进,但头颈鳞癌的5年生存率仅为40%-50%,且绝大部分患者在初次治疗后会出现局部复发或远处转移。
头颈鳞癌靶向治疗策略极度匮乏,西妥昔单抗是NCCN指南中建议用于口腔鳞癌一线治疗的唯一靶向药物,与放疗联合治疗局部晚期头颈鳞癌,或与铂类化疗联合治疗复发和/或转移性头颈鳞癌。尽管西妥昔单抗联合治疗改善了头颈鳞癌的临床预后,但用药过程中产生的耐药增加了肿瘤复发率并限制了西妥昔单抗临床疗效。值得注意的是,西妥昔单抗在头颈癌治疗中的治疗疗效较低,单药治疗组的客观缓解率为13%,联合化疗组为36%。尽管持续维持西妥昔单抗治疗,在使用EXTREME治疗方案的头颈鳞癌患者从初次使用直到治疗失败的时间也仅为5个月左右。更为重要的是,文献报道大约仅有10-20%的晚期癌症患者在使用药物阻断EGFR通路后能实现肿瘤生长抑制,且大多数最初对西妥昔单抗有反应的患者最终也会表现出耐药。这些研究表明,西妥昔单抗的耐药性可能是导致其治疗失败的主因。因此,深入解析头颈鳞癌西妥昔单抗耐药过程中的关键事件和耐药机制,进而挖掘逆转西妥昔单抗耐药性的联合用药策略,对于提高头颈鳞癌患者对西妥昔单抗的治疗反应率,扩大西妥昔单抗的临床应用范围至关重要。
逆转靶向药物的耐药性一直是肿瘤研究的热点,更是实现癌症精准治疗的关键。越来越多的研究已揭示出,肿瘤异质性是药物临床应答率低和患者耐药的根源。头颈鳞癌作为一种在解剖学及生物学上均具有异质性的恶性肿瘤,更存在着普遍的瘤内异质性。肿瘤内异质性不仅表现为相同肿瘤不同组织区域的不同,还表现为肿瘤用药过程中发生的异质性克隆演进。肿瘤内某些数量稀少的异质性克隆亚群在用药过程中发生着动态演进,携带与肿瘤发生、发展以及耐药密切相关的关键性驱动事件,最终会促使肿瘤复发和治疗抵抗。
然而,目前的西妥昔单抗耐药性研究均是从肿瘤组织整体层面出发,没有聚焦肿瘤组织内部复杂的异质性以及肿瘤内部异质性克隆在药物选择压力下的动态演进,因此并不能从本质上找到驱动耐药的关键事件,从而实施联合用药策略。例如,2018年,Brandon等从基于乳腺癌中抑制BRD4表达可逆转PI3K和HER2抑制剂耐药这一规律,猜测在头颈鳞癌中抑制BRD4可能会逆转西妥昔单抗耐药,进而通过实验证实。此外,同年Jinlong等发现在头颈鳞癌耐药肿瘤中p-Smad1/5/8表达水平高于癌旁组织,他们尝试阻断 BMP信号转导,发现可逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性。这些挖掘逆转西妥昔单抗耐药性的方法都忽视了头颈鳞癌的异质性特征,尤其是肿瘤内部异质性克隆在药物压力下的演化轨迹,都止步于基础研究,难以进一步走向临床转化应用。
目前报道的挖掘逆转西妥昔单抗耐药性的策略分为以下两种:1)其他肿瘤类型的耐药研究,在头颈鳞癌中进行重现。这一模式是盲目而极具有偶然性的,由于不同肿瘤具有完全不同的分子遗传、疾病表型以及肿瘤微环境等特征,这种模式发现的逆转耐药策略在头颈鳞癌中常常是不可复制的。2)基于耐药后某一靶标或某一信号通路的异常,进行干预,期待实现逆转耐药。由于肿瘤发生、发展、耐药是多步骤多通路的协同作用,只干预随机发现的一条异常通路即使实现了短暂的肿瘤抑制,也可能会迅速出现耐药和肿瘤复发。鉴于此,目前挖掘逆转西妥昔单抗耐药性的方法,都忽视了肿瘤的异质性特征,既包括不同肿瘤类型的异质性,也包括耐药过程中肿瘤内部异质性克隆的动态变化特性。
发明内容
本发明将以肿瘤异质性为切入点,通过建立能够涵盖肿瘤多维度异质性的人源性异种移植瘤模型(patient derived xenograft,PDX),来聚焦头颈鳞癌在西妥昔单抗药物压力下诱导成耐药肿瘤的演进轨迹,挖掘其中可干预的驱动事件,实施联合用药,进而逆转西妥昔单抗的耐药性。
因此,本发明要解决的技术问题是克服头颈鳞癌对西妥昔单抗存在耐药性的问题,提供一种可以突破西妥昔单抗耐药性难题的方案。
一方面,本发明提供了RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂在制备提升头颈鳞癌对西妥昔单抗的敏感性的药物中的应用。
另一方面,本发明提供了RAC1/RAC3双靶点抑制剂在制备提升头颈鳞癌对西妥昔单抗的敏感性的药物中的应用。
再一方面,本发明提供了RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂在制备用于逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性的药物中的应用。
又一方面,本发明提供了RAC1/RAC3双靶点抑制剂在制备用于逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性的药物中的应用。
还一方面,本发明提供了RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂联合西妥昔单抗在制备头颈鳞癌防治药物中的应用。
又一方面,本发明提供了RAC1/RAC3双靶点抑制剂联合西妥昔单抗在制备头颈鳞癌防治药物中的应用。
还一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含:RAC1抑制剂和/或 RAC3抑制剂;和西妥昔单抗。
再一方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含:RAC1/RAC3双靶点抑制剂;和西妥昔单抗。
本发明中,所述RAC1抑制剂是指能够抑制RAC1蛋白功能的分子,其实例包括但不限于RAC1小干扰RNA、小分子抑制剂、单克隆抗体以及反义寡核苷酸等。
本发明中,所述RAC3抑制剂是指能够抑制RAC3蛋白功能的分子,其实例包括但不限于RAC3小干扰RNA、小分子抑制剂、单克隆抗体以及反义寡核苷酸等。
本发明中,所述RAC1/RAC3双靶点抑制剂是指能够同时抑制RAC1和 RAC3蛋白功能的分子,其实例包括但不限于EHOP-016、EHT-1864-2HCl、 RAC1/RAC3双靶点小干扰RNA、双靶点抗体药物等。在一个实施方式中,所述RAC1/RAC3双靶点抑制剂可以是EHOP-016。
另一方面,本发明提供了一种筛选逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的药物的方法,包括以下步骤:
(1)获取患者肿瘤组织,以利用免疫缺陷鼠构建头颈鳞癌PDX模型;
(2)构建头颈鳞癌PDX模型队列,开展西妥昔单抗PDX模型临床替代性试验:随机筛选头颈鳞癌PDX模型入组,将每例活体保存的PDX移植瘤样本接种至裸鼠皮下(每个模型接种30-50mm3),待PDX模型肿瘤体积达到约100-200mm3后,将每个PDX病例随机分为对照组(例如,n=3)或西妥昔单抗单药治疗组(例如,n=3),开始药物治疗中,PDX模型分别用PBS 或西妥昔单抗(例如,剂量10mg/kg,一周两次)腹腔注射,对小鼠进行肿瘤体积和体重测量(例如,每周两次);
(3)PDX模型临床替代性试验中西妥昔单抗药效评估:评估对西妥昔单抗的药物响应情况,利用PDX模型中移植瘤用药前后的体积变化来评估药物反应,根据每例PDX模型的药效差异区分出,西妥昔单抗敏感PDX模型、原发耐药PDX模型和继发耐药PDX模型;
(4)对PDX模型临床替代性试验中继发耐药的PDX模型,选取该PDX 模型给药前、给药过程中、给药后耐药的样本,进行全外显子组和转录组测序;
(5)西妥昔单抗药物压力下的肿瘤克隆演进轨迹重建:使用Pyclone和 CITUP计算和定义每个模型中不同亚克隆,计算亚克隆在治疗阶段中的出现先后次序及富集情况,重建每个PDX模型不同时间节点的克隆进化树,对耐药后新生的亚克隆进行基因功能分析和通路富集分析;
(6)耐药重复进化轨迹分析:采用一种基于迁移学习的人工智能算法 REVOLVER,通过整合继发耐药模型给药前及耐药样本的单核苷酸变异和拷贝数变异数据,计算出重复的进化轨迹模型,关注在耐药克隆中重复出现的目标;
(7)在转录组水平检测了耐药克隆不同通路的持续变化,确认在耐药克隆中呈现异常激活及在耐药克隆中表现出高表达的目标;
(8)抑制上述目标显著提高西妥昔单抗敏感性:选取在耐药克隆中显著激活的目标为靶标,在体外实验中利用慢病毒介导的shRNA敲减所述目标表达,通过Western blot和qRT-PCR进行检测敲减效率,并比较敲减组和对照组对西妥昔单抗的敏感性差异,确认敲减目标基因表达能否显著提高西妥昔单抗敏感性以及逆转耐药性;
(9)逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性:利用针对所述目标的抑制剂与西妥昔单抗进行联合用药以检测可逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的目标;
(10)体内评估针对所述目标的抑制剂与西妥昔单抗联合用药方案的药效:选择西妥昔单抗耐药PDX模型(例如,PDX_ACR1,PDX_ACR2)用于评价西妥昔单抗和针对所述目标的抑制剂在体内的联合治疗效果。
优选地,分析步骤(5、6、7)中重复出现的异常变异及表达的基因及信号通路,表明其在西妥昔耐药中基因水平和转录组水平持续激活,该目标则与西妥昔单抗的耐药性高度相关,靶向抑制该目标具有逆转西妥昔单抗耐药性的潜力。
优选地,步骤(9)中,在体外实验中选取西妥昔单抗耐药的商品化细胞系例如PE/PC-PJ15和HN6,分别进行浓度梯度的西妥昔单抗、针对所述目标的抑制剂单药处理及联合用药,72小时后检测各组细胞增殖能力,更优选地,其中,设置了9x 9的浓度矩阵,进行药物联用指数(CI)评分,以及其中,检测了联合用药对于克隆形成能力的影响。
优选地,步骤(10)中,每例PDX模型构建30只子代模型,待肿瘤体积达到100-200mm3后选择24只小鼠进行分组,分别分到西妥昔单抗单药组、针对所述目标的抑制剂单药组、西妥昔单抗和针对所述目标的抑制剂联合用药组、对照组中。
本发明确定了抑制RAC1或RAC3表达可提高头颈鳞癌对西妥昔单抗的敏感性,且RAC1/RAC3抑制剂EHOP-016与西妥昔单抗的联合用药可以逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性,本发明为提升西妥昔单抗药效和应用范围提供了新的方法和思路。
同时,本发明是基于患者肿瘤组织来源的小鼠移植瘤PDX模型进行相关耐药研究,充分聚焦了肿瘤耐药过程中的异质性克隆演进,结合了全外显子组测序和转录组测序,发现了可以逆转西妥昔单抗耐药性的方法。本发明可根据试验需求,入组适宜的PDX模型入组,开展临床替代性试验,进行PDX 模型药效测试和样本获取,可实现单药给药和按照试验需求取材。大大节约了开展临床研究的时间和经济成本,缩短了大量临床患者用药取材过程中伦理审批的周期。总体而言,利用PDX模型临床替代性试验,进行耐药机制研究和逆转耐药策略筛选,是一种简单高效的方法。
在上文中已经详细地描述了本发明,但是上述实施方式本质上仅是例示性,且并不欲限制本发明。此外,本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明,在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明,在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外,本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如,数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰,不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确;大约或合理地接近该值;近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解,则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如,“大约”可以包括小于或等于10%,小于或等于5%,小于或等于4%,小于或等于3%,小于或等于2%,小于或等于1%或者小于或等于0.5%的变化。
附图说明
图1显示本发明实施例1提供的涵盖49例PDX模型的西妥昔单抗临床替代性试验中PDX模型对西妥昔单抗的药物响应情况分布。
图2显示本发明实施例2提供的6例继发耐药PDX模型的克隆进化树。
图3显示本发明实施例2提供的继发耐药PDX模型重复的进化轨迹模型。
图4显示本发明实施例2提供的继发耐药PDX模型转录组水平耐药克隆激活通路富集情况。其中,A图表示GSEA分析表明耐药组中显著富集RAS 通路激活;B图表示相比于给药前样本,给药过程及耐药克隆中RAC1和 RAC3显著高表达。
图5显示本发明实施例3提供的在头颈鳞癌细胞中敲减RAC1或RAC3 表达后进行的蛋白水平和mRNA转录水平的检测。其中,A图表示在头颈鳞癌细胞系CAL27细胞中敲减RAC1或RAC3后,进行的Western Blot检测及定量分析;B图表示在头颈鳞癌细胞系CAL27细胞中敲减RAC1或RAC3 后,进行的qRT-PCR检测及定量分析。图中shRAC1_1,shRAC1_2,shRAC1_3代表三个靶向干扰RAC1表达的短反向重复序列;shRAC3_1,shRAC3_2, shRAC3_3代表三个靶向干扰RAC3表达的短反向重复序列。***代表 p<0.001。
图6显示本发明实施例3提供的抑制RAC1或RAC3表达后头颈鳞癌细胞系对西妥昔单抗敏感性检测。其中,A图表示敲减RAC1细胞与质粒对照组细胞及空白组细胞的西妥昔单抗敏感性比较,敲减RAC1后头颈鳞癌细胞对西妥昔单抗敏感性显著提高;B图表示敲减RAC3细胞与质粒对照组细胞及空白组细胞的西妥昔单抗敏感性比较,敲减RAC3后头颈鳞癌细胞对西妥昔单抗敏感性显著提高。
图7显示本发明实施例4提供的RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP-016 逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性展示。其中,A图表示在头颈鳞癌细胞 PE/CA-PJ15细胞中EHOP-016单药、西妥昔单抗单药以及两者联合用药后,细胞增殖活力的检测,结果显示相比于单药处理组,联合用药可显著抑制 PE/CA-PJ15细胞增殖;B图表示在头颈鳞癌细胞HN6细胞中EHOP-016单药、西妥昔单抗单药以及两者联合用药后,细胞增殖活力的检测,结果显示相比于单药处理组,联合用药可显著抑制HN6细胞增殖。
图8显示本发明实施例4提供的RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP-016 与西妥昔单抗联合用药在头颈鳞癌细胞中的药物联用指数评分。其中,A图表示在头颈鳞癌细胞PE/CA-PJ15细胞中9x 9浓度矩阵处理后肿瘤细胞增殖抑制率的情况,显示在PE/CA-PJ15中西妥昔单抗和EHOP-016具有良好的协同抑制效果;B图表示在头颈鳞癌细胞HN6细胞中9x 9浓度矩阵处理后肿瘤细胞增殖抑制率的情况,显示在HN6中西妥昔单抗和EHOP-016具有良好的协同抑制效果。
图9显示本发明实施例4提供的RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP-016 与西妥昔单抗联合用药在头颈鳞癌细胞中显著抑制克隆形成的展示。
图10显示本发明实施例5提供的体内评估RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP-016与西妥昔单抗联合用药方案药效情况展示。其中,A图表示在头颈鳞癌西妥昔单抗耐药PDX模型PDX_ACR1中,西妥昔单抗单药组、 EHOP-016单药组、西妥昔单抗+EHOP-016联合用药组、对照组的肿瘤生长曲线,显示联合用药组相比于单药组和空白对照组,在耐药模型PDX_ACR1中可显著抑制肿瘤生长;B图表示在牺牲小鼠后,各组的肿瘤图片;C图表示在牺牲小鼠后,各组的肿瘤重量统计,显示联合用药组相比于单药组和空白对照组肿瘤明显更少;D图表示在头颈鳞癌西妥昔单抗耐药PDX模型 PDX_ACR2中,在长时间的给药过程中,西妥昔单抗单药组、EHOP-016单药组、西妥昔单抗和EHOP-016联合用药组、对照组的肿瘤生长曲线,显示联合用药组相比于单药组和空白对照组,在耐药模型PDX_ACR2中不仅可以抑制耐药PDX模型的肿瘤生长更能延缓肿瘤复发。*代表p<0.05,**代表p<0.01,***代表p<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
实施例
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本实施例中的用到的EHOP-016购自MedChemExpress,RAC1和RAC3 抗体购自Abcam,Cell Counting Kit-8(CCK8)购自上海碧云天生物技术有限公司,全自动多功能酶标仪购自Biotek。
本实施例中用以构建PDX模型的小鼠为雌性BALB/c-nu裸鼠,6-8周龄,购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部(动物许可证号:SCXK(沪) 2018-0006)。小鼠饲养符合SPF级条件下分笼饲养。保持室温18-25℃,相对湿度40%-60%,专用鼠笼、垫料,饲料及饮水经121℃,30min高压灭菌。每周至少1次更换垫料。
实施例1.头颈鳞癌PDX模型队列的构建及西妥昔单抗药效评价
本实施例构建PDX模型对应的患者,记录其临床信息,包括基本资料(性别、年龄、烟酒史等)、临床病理诊断(肿瘤大小及位置、TNM分期、HPV 感染情况)、既往治疗史(手术、放化疗情况)、复发和转移等预后信息等。收集患者的肿瘤、癌旁及血液样本。对肿瘤样本进行病理组织形态学鉴定和遗传学信息鉴定。
肿瘤组织经手术切除后,观察组织颜色、形态、质地,切除坏死组织,选择病灶中央部分进行取材。因头颈鳞癌一般生长于口腔、鼻腔黏膜等污染部位,因此样本接种移植到小鼠前需要用0.05%次氯酸钠除菌,1%青霉素- 链霉素双抗的PBS快速清洗30秒。轻轻刮除组织样本外周组织,将肿瘤切成1~2mm3大小的小块,在无菌条件下将患者组织移植到免疫缺陷小鼠血供、淋巴结较丰富的区域(如双侧腋窝)构建皮下PDX模型,或接种于动物双侧颌下间隙构建原位PDX模型。为提高接种成功率,可将Matrigel胶与患者肿瘤组织混合后接种,每个患者组织接种3-5只小鼠。建模1-2周后开始追踪 PDX模型生长轨迹,当肿瘤体积超过800mm3或肿瘤体积两周无明显增长时,对移植瘤进行序列传代,一般移植瘤传代至3代以上时认为该模型可以稳定传代。
根据对应患者的临床信息,筛选49例头颈鳞癌PDX模型入组,构建PDX 模型发现队列。将每例活体保存的PDX移植瘤样本接种至裸鼠皮下(每个模型接种30-50mm3),用于后续西妥昔单抗临床替代性试验。在第一轮给药试验中,实验组PDX模型腹腔注射西妥昔单抗Cetuximab(Merck),剂量10mg/kg,一周两次;对照组腹腔注射PBS,一周两次。持续测量模型肿瘤体积及体重直到21天或肿瘤体积达到1000-1500mm3。若小鼠在实验开始14天以内出现不良反应,应处死并移除出组。
西妥昔单抗(Cetuximab)药效评估标准以及药效特征性模型的筛选:如下式所示,通过PDX模型中移植瘤用药前后的体积变化评估药物反应 (Response):
在上式中,ΔVolt表示肿瘤体积变化,Vt表示给药第t天肿瘤体积,Vinitial表示给药第0天肿瘤体积。
如下,根据ΔVolt评估肿瘤疗效:
1.改良完全缓解(mCR):ΔVolt<-40%;
2.改良部分缓解(mPR):-40%<ΔVolt<-20%;
3.改良疾病稳定(mSD):-20%<ΔVolt<30%;
4.改良疾病进展(mPD):ΔVolt>30%。
根据以上标准,以第21天为节点将mPD模型定义为原发耐药模型;其他模型继续监测其肿瘤体积及体重到第90天;以第90天作为第二节点,将 mCR模型定义为敏感模型;在90天内复发且未达到mCR标准的模型进入继发耐药研究中。待复发模型肿瘤体积达到100-200mm3,腹腔注射西妥昔单抗 Cetuximab,剂量10mg/kg,一周两次,治疗3周后评估药物反应情况,mPD 模型定义为继发耐药模型。在第一轮治疗中出现复发但在继发耐药研究给药中表现为mPR或mCR的模型定义为可逆的药物耐受持久性(drug-tolerant persister,DTP)状态。试验结束后牺牲小鼠并保留样本进行后续测序及验证工作。
结果如图1所示,在涵盖49例PDX模型发现队列的药效试验中,给药后肿瘤疾病进展(mPD)定义为原发耐药(n=21)占比42.86%,肿瘤完全缓解(mCR)且90天内未复发定义为敏感(n=9)占比18.37%,给药后肿瘤控制(mCR+mPR+mSD)并在90天内复发则再次给药,再次给药后肿瘤疾病进展(mPD)定义为继发耐药(n=8)占比16.33%,再次给药后肿瘤mPR 或mCR的模型定义为可逆的药物耐受持久性状态(n=3)占比6.12%,另有 4例组由于组内差异较大无法进行药效区分占比8.16%,以及4例由于各种因素如裸鼠实验中死亡、裸鼠状态不佳、副反应严重等停止给药占比8.16%。在本次PDX模型治疗队列中,18.37%的完全缓解率与西妥昔单抗临床应用中13%的应答率相吻合,反映出该PDX模型治疗队列能准确模拟临床治疗,具有极高的耐药机制研究和干预策略挖掘价值。
实施例2.西妥昔单抗药物压力下的肿瘤克隆演进轨迹重建
本实施例在PDX模型发现队列中收集的样本均从小鼠身上获取后进行液氮速冻保存,并送样至测序公司进行了全外显子组测序和转录组测序。
全外显子测序:液氮速冻的患者肿瘤及PDX样本使用Illumina Novaseq 6000平台进行全外显子测序,患者肿瘤样本测序深度为200X,PDX样本为 100X。对于PDX样本需要去除鼠源性基因,通过Burrows-Wheeler Aligner (BWA)将人类与小鼠杂交基因组(hs37d5and mm10)映射到测序数据中,使用SAMtools、Genome Analysis Toolkit(GATK-UnifiedGenotyper)与FreeBayes (Garrison and Marth)过滤人源性突变。
RNA测序:使用Illumina Hiseq平台进行RNA建库,通过Hisat2 v2.0.5 将测序reads映射到人类及小鼠基因组中并使用Cufflinks v2.2.1组装转录本,估计转录本的丰度及差异表达分析。
Pyclone和CITUP重建进化树:计算和定义每个模型中不同亚克隆,计算亚克隆在治疗阶段中的出现先后次序及富集情况,以此重建每个PDX模型不同时间节点的克隆进化树。结果显示所有继发耐药样本均存在多个克隆亚簇,包括治疗前即预先存在的克隆亚群,以及药物处理过程中从预先存在的克隆亚簇中进化后的子克隆,该结论与当前经典肿瘤分支进化理论相吻合。本实施例重点关注在耐药发生过程中新出现、逐步丢失以及持续存在的克隆群体,尤其是新出现的克隆群体很大概率与西妥昔单抗耐药的发生相关,而逐步丢失的克隆群体很可能与西妥昔单抗敏感相关。本实施例通过对耐药样本中新出现、逐步丢失的克隆进行通路富集分析,发现主要富集于多个肿瘤相关通路,其中RAC1 GTP酶循环通路被显著富集,而RAC1在RAS激活的情况下可促进细胞的恶性转化。比如在PDX_308治疗后样本中,RAC1 通路中的TAGAP基因发生突变并归类与新出现的亚克隆7中;在PDX_500 模型中,PAK6(RAC1激活激酶6)在给药前及复发样本中均为野生型,而在耐药样本中出现突变;本实施例还发现在PDX_500模型中,RAC1通路中的抑癌基因DLC1被归于随着治疗逐渐丢失的克隆7中。以上结果证实 RAC1通路的异常激活可能是导致头颈癌西妥昔单抗耐药的潜在因素。(图2)
REVOLVER寻找重复耐药轨迹:为寻找多个继发耐药样本之间从给药前至继发耐药过程中的重复的进化轨迹,本发明采用了一种基于迁移学习的人工智能算法REVOLVER。通过整合继发耐药模型给药前及耐药样本的单核苷酸变异和拷贝数变异数据,REVOLVER计算出一系列进化轨迹模型。本实施例发现耐药模型的5条进化轨迹均归一至相同的终点分子事件,即LPR1B 突变伴随着AKAP9或ZFHX3突变,说明耐药样本克隆演进路径的后期分子事件指向了RAS通路的激活。(图3)
耐药过程的转录组动态分析:使用耐药PDX模型的转录组测序数据,对序列取材模型PDX_362、PDX_500、PDX_549不同亚簇的基因表达进行聚类分析,本实施例发现“RAS通路激活”、“TP53转录调控”、“EGFR酪氨酸激酶活性抑制”通路在西妥昔单抗的耐药样本中被富集,进一步揭示RAS通路激活可能与西妥昔的耐药相关。(图4)
实施例3.体外实验证实抑制RAC1或RAC3表达提高头颈鳞癌细胞对西妥昔单抗敏感性
质粒构建:利用在线shRNA设计软件,设计出RAC1或RAC3的shRNA 序列,并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成出目的shRNA序列,具体 shRNA序列见表1,通过将慢病毒表达载体和RAC1或RAC3的shRNA片段酶切连接后转入大肠杆菌感受态细胞中,在含有氨苄青霉素的琼脂板上挑选出阳性克隆,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行一代测序验证。
表1 shRNA序列
目标基因 | shRNA名称 | 靶向序列(5'->3') |
RAC1 | shRAC1_1 | CAGCTGGACAAGAAGATTATG |
RAC1 | shRAC1_2 | GAGTCCTGCATCATTTGAAAA |
RAC1 | shRAC1_3 | GTCCCTTGGAACCTTTGTACG |
RAC3 | shRAC3_1 | GCTTGCTGATCAGCTACACGA |
RAC3 | shRAC3_2 | GACGGGAAACCAGTCAACTTG |
RAC3 | shRAC3_3 | GAGAATGTTCGTGCCAAGTGG |
病毒包装:在10cm的细胞培养皿上接种大约50%-70%HEK-293T细胞过夜后,转染前将培养基换成无血清的培养基,然后将RAC1或RAC3的 shRNA慢病毒表达质粒(10μg),病毒包装质粒psPAX2(5μg)和病毒包膜质粒pMD2.G(2μg)用转染试剂共同转染到HEK-293T细胞中,4个小时后换成10%FBS的培养基。48小时后收集培养上清液,用0.45μm的滤膜过滤病毒液,冻存在-80℃冰箱中备用。
病毒感染:感染病毒的第一天将头颈鳞癌细胞接种于6孔板中,第二天将适量表达RAC1或RAC3的shRNA病毒液加入培养基中,同时加入终浓度为8mg/mL的polybrene。第三天去除病毒液,换上新的培养基并观察荧光确定感染效率,随后加入puromycin进行筛选,获得病毒感染后的细胞株,用于后续实验。
蛋白免疫印迹:在裂解细胞后,进行BCA蛋白定量,随后加入SDS loading buffer,95℃加热10分钟变性,然后将10-50μg蛋白样品进行 SDS-PAGE电泳。电泳后将PAGE胶上的蛋白通过转膜系统转移到PVDF膜上,分别进行一抗和二抗孵育。使用的抗体包括:Anti-RAC1、anti-RAC3、 anti-GAPDH,进而检测在头颈鳞癌中敲减RAC1或RAC3的效率。(图5)
实时荧光定量PCR:为了检测RAC1或RAC3的敲减效率,本实施例将提取各组细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得检测RAC1或RAC3基因的表达水平。(图5)
细胞增殖实验:将RAC1敲减细胞、RAC3敲减细胞、对照质粒细胞以及空白头颈鳞癌细胞以3000细胞/孔的密度接种到96孔板中,培养箱培养过夜。随后用西妥昔单抗进行药物处理,72小时后用Cell Counting Kit-8检测细胞增殖情况。结果显示,相比于治理对照组细胞和空白组细胞,西妥昔单抗显著抑制了RAC1敲减细胞或RAC3敲减细胞增殖,表明抑制RAC1或 RAC3表达可提高头颈鳞癌细胞对西妥昔单抗敏感性。(图6)
实施例4.体外实验证实RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP-016逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性
本实施例选取在耐药克隆中显著上调的RAC1/RAC3为靶标,利用 RAC1/RAC3双靶点小分子抑制剂EHOP-016(购自MedChemExpress)与西妥昔单抗在临床前研究模型中进行联合用药逆转治疗抵抗的研究。在体外实验中选取西妥昔单抗耐药的商品化细胞系PE/PC-PJ15和HN6,分别进行浓度梯度的西妥昔单抗、EHOP-016单药处理及联合用药,72小时后检测各组细胞增殖能力。结果显示单药西妥昔单抗或EHOP-016均无明显的细胞增殖抑制效果,而联合用药则可显著抑制头颈鳞癌细胞增殖。(图7)
本实施例设置了9x 9的浓度矩阵,进行协同作用评估。EHOP-016与西妥昔单抗的协同作用借助Loewe模型计算药物联用指数(combination index, CI),如CI值小于0.75则认为具有协同效应,高于1.5认为有拮抗作用。结果显示西妥昔单抗和EHOP-016在两种头颈鳞癌细胞上均具有良好的协同抑制效果,在PE/PC-PJ15细胞中12.5μg/ml西妥昔单抗与5μMEHOP-016联合抑制头颈鳞癌细胞活力的协同效应最强;在HN6细胞中12.5μg/ml西妥昔单抗与10μM EHOP-016联合抑制头颈鳞癌细胞活力的协同效应最强。(图 8)
本实施例还检测了联合用药对于克隆形成能力的影响,PE/CA-PJ 15和 HN6细胞以1000密度接种于6孔板,培养24小时后加入含不同浓度的西妥昔、EHOP-016及西妥昔-EHOP-016联合药物,每三天更换含化合物培养基。细胞培养12天后用10%中性福尔马林试剂固定,用0.05%结晶紫试剂染色,冲洗后拍照分析。结果显示单药西妥昔单抗或EHOP-016均无法抑制头颈鳞癌克隆形成,当西妥昔单抗与5μM EHOP-016联用时则可显著抑制克隆形成,且协同效应随着西妥昔单抗浓度递增而增强。(图9)
实施例5.体内评估RAC1/RAC3双靶点抑制剂EHOP-016与西妥昔单抗联合用药方案药效
选择两例西妥昔单抗耐药PDX模型(PDX_ACR1,PDX_ACR2)用于评价西妥昔单抗和EHOP-016在体内的联合治疗效果。每个PDX模型构建30 只子代模型,待肿瘤体积达到100-200mm3后选择24只小鼠进行分组,分别分到西妥昔单抗单药组、EHOP-016单药组、西妥昔单抗和EHOP-016联合用药组、对照组。
给药方案如下:
①西妥昔单抗单药组,腹腔注射西妥昔单抗,10mg/kg,一周两次。
②EHOP-016单药组,腹腔注射EHOP-016,20mg/kg,一周两次。
③西妥昔单抗和EHOP-016联合用药组:腹腔注射西妥昔单抗,10mg/kg 以及EHOP-016,20mg/kg,一周两次。
④对照组:腹腔注射PBS,一周两次。
PDX_ACR1生长速度较快,给药后根据体积变化评估药物反应。在 PDX_ACR1模型中西妥昔单抗与EHOP-016联合用药组相比于西妥昔单抗单药组、EHOP-016单药组或对照组均显著抑制了肿瘤生长。而单独的 EHOP-016治疗组或西妥昔治疗组则无法抑制肿瘤增殖。
PDX_ACR2生长较慢,本实施例则进行长期给药并监测肿瘤体积和体重变化,评估药效反应。在超过4个月的监测后,本实施例确证联合治疗方案可以有效的抑制肿瘤生长并相比于西妥昔单抗单药组还可抑制肿瘤复发。(图 10)。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120> 逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的药物及其筛选方法
<130> DI22-0009-XC37
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRAC1_1靶向序列
<400> 1
cagctggaca agaagattat g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRAC1_2靶向序列
<400> 2
gagtcctgca tcatttgaaa a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRAC1_3靶向序列
<400> 3
gtcccttgga acctttgtac g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRAC3_1靶向序列
<400> 4
gcttgctgat cagctacacg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRAC3_2靶向序列
<400> 5
gacgggaaac cagtcaactt g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRAC3_3靶向序列
<400> 6
gagaatgttc gtgccaagtg g 21
Claims (10)
1.RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂在制备提升头颈鳞癌对西妥昔单抗的敏感性的药物中的应用。
2.RAC1/RAC3双靶点抑制剂在制备提升头颈鳞癌对西妥昔单抗的敏感性的药物中的应用。
3.RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂在制备用于逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性的药物中的应用。
4.RAC1/RAC3双靶点抑制剂在制备用于逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗的耐药性的药物中的应用。
5.RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂联合西妥昔单抗在制备头颈鳞癌防治药物中的应用。
6.RAC1/RAC3双靶点抑制剂联合西妥昔单抗在制备头颈鳞癌防治药物中的应用。
7.一种药物组合物,其包含:RAC1抑制剂和/或RAC3抑制剂;和西妥昔单抗。
8.一种药物组合物,其包含:RAC1/RAC3双靶点抑制剂;和西妥昔单抗。
9.根据权利要求2所述的应用,根据权利要求4所述的应用,根据权利要求6所述的应用,或根据权利要求8所述的药物组合物,其中,所述双靶点抑制剂是EHOP-016。
10.一种筛选逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的药物的方法,包括以下步骤:
(1)获取患者肿瘤组织,以利用免疫缺陷鼠构建头颈鳞癌PDX模型;
(2)构建头颈鳞癌PDX模型队列,开展西妥昔单抗PDX模型临床替代性试验:随机筛选头颈鳞癌PDX模型入组,将每例活体保存的PDX移植瘤样本接种至裸鼠皮下,待PDX模型肿瘤体积达到约100-200mm3后,将每个PDX病例随机分为对照组或西妥昔单抗单药治疗组,开始药物治疗中,PDX模型分别用PBS或西妥昔单抗腹腔注射,对小鼠进行肿瘤体积和体重测量;
(3)PDX模型临床替代性试验中西妥昔单抗药效评估:评估对西妥昔单抗的药物响应情况,利用PDX模型中移植瘤用药前后的体积变化来评估药物反应,根据每例PDX模型的药效差异区分出,西妥昔单抗敏感PDX模型、原发耐药PDX模型和继发耐药PDX模型;
(4)对PDX模型临床替代性试验中继发耐药的PDX模型,选取该PDX模型给药前、给药过程中、给药后耐药的样本,进行全外显子组和转录组测序;
(5)西妥昔单抗药物压力下的肿瘤克隆演进轨迹重建:使用Pyclone和CITUP计算和定义每个模型中不同亚克隆,计算亚克隆在治疗阶段中的出现先后次序及富集情况,重建每个PDX模型不同时间节点的克隆进化树,对耐药后新生的亚克隆进行基因功能分析和通路富集分析;
(6)耐药重复进化轨迹分析:采用一种基于迁移学习的人工智能算法REVOLVER,通过整合继发耐药模型给药前及耐药样本的单核苷酸变异和拷贝数变异数据,计算出重复的进化轨迹模型,关注在耐药克隆中重复出现的目标;
(7)在转录组水平检测了耐药克隆不同通路的持续变化,确认在耐药克隆中呈现异常激活及在耐药克隆中表现出高表达的目标;
(8)抑制上述目标显著提高西妥昔单抗敏感性:选取在耐药克隆中显著激活的目标为靶标,在体外实验中利用慢病毒介导的shRNA敲减所述目标表达,通过Western blot和qRT-PCR进行检测敲减效率,并比较敲减组和对照组对西妥昔单抗的敏感性差异,确认敲减目标基因表达能否显著提高西妥昔单抗敏感性以及逆转耐药性;
(9)逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性:利用针对所述目标的抑制剂与西妥昔单抗进行联合用药以检测可逆转头颈鳞癌对西妥昔单抗耐药性的目标;
(10)体内评估针对所述目标的抑制剂与西妥昔单抗联合用药方案的药效:选择西妥昔单抗耐药PDX模型用于评价西妥昔单抗和针对所述目标的抑制剂在体内的联合治疗效果。
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