CN114209838A - 用于治疗kras突变的胆管癌的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗KRAS突变的胆管癌的药物。具体地，本发明涉及ER抑制剂用于特异性地治疗KRAS突变的胆管癌的方法，以及ER抑制剂在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物的应用。为携带KRAS突变的胆管癌患者提供新的治疗方案，提高患者治疗获益的可能性。

Description

用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物
技术领域
本发明涉及ER抑制剂用于治疗KRAS突变的胆管癌的方法，以及使用ER抑制剂在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物的应用。
背景技术
胆管癌（Cholangiocarcinomas, CCA）包含肝内胆管癌（intrahepaticcholangiocarcinoma, iCCA）、肝门部胆管癌（perhilar/hilar cholangiocarcinoma,pCCA）和肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma, ECCA），发病率和死亡率在世界范围内持续增高，主要是因为ICC的增高。胆管癌是仅次于肝细胞癌的肝胆恶性肿瘤，约占消化道肿瘤的3%。
由于缺乏适当的诊断生物标志物，绝大多数胆管癌患者就诊时已处于疾病中晚期。大多数患者（>65%）为不可切除疾病，少数接受手术的患者其复发率也很高。目前标准治疗方案为吉西他滨联合铂类化合物，中位生存期低于12个月，5年生存率仅为5%-15%。
由于胆管癌的治疗方案有限，且总体预后不佳，因此新的胆管癌治疗方法可以为胆管癌患者带来希望。随着肿瘤基因组的研究的深入，靶向治疗为胆管癌患者带来了更多的获益。2020年4月，Pemazyre成为第一个获美国FDA批准用于治疗胆管癌的靶向FGFR2融合的药物。
胆管癌中KRAS突变频率为9%-40%。KRAS突变与肿瘤神经浸润、分期晚、预后不良有关。KRAS是最重要的肿瘤驱动基因之一，在胆管癌中的发生率仅次于P53和IDH。目前研究发现临床上只有15%患者存在手术切除的可能性，且中位生存期往往小于3年。对于晚期或不可切除的患者，局部和全身化疗是主要的治疗选择，但是疗效欠佳。
尽管已知KRAS突变的频率很高，直接靶向KRAS仍然具有挑战性。目前只有一款靶向KRAS G12C突变的药物获批治疗非小细胞肺癌，尚未有文献报道特异性地针对KRAS突变型胆管癌的治疗方案。
发明内容
本发明人通过对胆管癌患者基因表达与预后数据的分析，发现通过抑制ER可以特异性地抑制KRAS突变型胆管肿瘤的生长，因而抑制ER可能是一种潜在的治疗胆管癌的方案。
首先，在本发明的第一方面，本发明涉及一种在受试者中治疗KRAS突变的胆管癌的方法，包括抑制雌激素受体（ER）的表达或下调雌激素受体的步骤。
在一些实施方案中，所述方法的步骤为，沉默(silencing)、敲除(knock-out)或敲减(knock-down)ESR1基因。进一步地，用siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体进行所述沉默、敲除或敲减。
在另一些实施方案中，所述方法的步骤为：将治疗有效量的ER抑制剂化合物施用于所述受试者。
在优选的实施方案中，所述ER抑制剂选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502，或其药学上可接受的盐。
在进一步优选的实施方案中，所述ER抑制剂选自氟维司群或其药学上可接受的盐。任选地，所述ER抑制剂为氟维司群与下组化合物中一种或多种的组合：他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502，或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，所述KRAS突变包括但不限于下组的一种或多种：p.G12V、p.G12C、p.G12D、p.G12A、p.G12R、p.G12S、p.G12F、pG13A、pG13E、pG13C、pG13R、pG13D、pG13S、pG13V、p.V14I、p.L19F、p.Q22K、p.D33E、p.A59G、p.Q61E、 p.Q61R、p.Q61H、p.Q61L、p.Q61P、p.Q61K、p.S65N、p.A146V、p.A146T、p.A146P、p.K117N。
另一方面，本发明还涉及一种用于治疗KRAS突变的胆管癌的试剂盒，其包含用于抑制雌激素受体表达或下调雌激素受体的试剂。
在一些实施方案中，所述用于抑制雌激素受体表达或下调雌激素受体的试剂优选siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体。
在优选的实施方案中，其中所述siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体靶向ESR1基因。
在另一方面，本发明还涉及ER抑制剂化合物，其用于在受试者中治疗KRAS突变的胆管癌。
在一些实施方案中，所述ER抑制剂化合物选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐；优选氟维司群。
在另一方面，本发明还涉及沉默、敲除或敲减ESR1基因的试剂，其用于在受试者中治疗KRAS突变的胆管癌。
在一些实施方案中，所述试剂其选自靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体。
在一些实施方案中，所述试剂其选自靶向ER蛋白的蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）药物。
在另一方面，本发明还涉及对ER具有抑制作用的物质在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物中的应用。
在一些实施方案中，其中所述物质为抑制雌激素受体的表达或下调雌激素受体的物质。所述物质为用于沉默、敲除或敲减ESR1基因的物质。优选地，所述物质为靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或shRNA。
在另一些实施方案中，所述物质为ER抑制剂化合物，优选选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐；更优选为氟维司群。
在另一方面，本发明涉及氟维司群与第二治疗剂在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的联合药物中的应用。
在一些实施方案中，其中所述第二治疗剂为靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或shRNA或其他ER抑制剂化合物；所述其他ER抑制剂化合物优选选自下组的化合物或其组合：他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，其中所述的KRAS突变包括但不限于下组的一种或多种：p.G12V、p.G12C、p.G12D、p.G12A、p.G12R、p.G12S、p.G12F、pG13A、pG13E、pG13C、pG13R、pG13D、pG13S、pG13V、p.V14I、p.L19F、p.Q22K、p.D33E、p.A59G、p.Q61E、 p.Q61R、p.Q61H、p.Q61L、p.Q61P、p.Q61K、p.S65N、p.A146V、p.A146T、p.A146P、p.K117N。
在另一方面，本发明还涉及一种测定能否使用ER抑制剂与胆管癌肿瘤细胞接触以抑制所述肿瘤细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：测定所述肿瘤细胞中的KRAS基因，其中KRAS基因存在突变则表明所述肿瘤细胞的生长或增殖可被ER抑制剂抑制。
在优选的实施方案中，所述KRAS基因突变包括但不限于以下的一种或多种：p.G12V、p.G12C、p.G12D、p.G12A、p.G12R、p.G12S、p.G12F、pG13A、pG13E、pG13C、pG13R、pG13D、pG13S、pG13V、p.V14I、p.L19F、p.Q22K、p.D33E、p.A59G、p.Q61E、 p.Q61R、p.Q61H、p.Q61L、p.Q61P、p.Q61K、p.S65N、p.A146V、p.A146T、p.A146P、p.K117N；其中所述突变的存在表明所述肿瘤细胞的生长或增殖可被ER抑制剂抑制。
发明详述
在详细解释本发明的实施方案前，应理解本发明非限定在以下所述的内容或实施例中，本发明可有其它实施方案。此外，本文所用的词组和术语是为了描述目的，并不能理解为限制。以下定义和方法为更好地定义并指导本领域技术人员以实施本发明。除非特别指出，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。
RAS原癌基因最初是从大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因，1982年Weinberg等，发现人的膀胱癌细胞中有活化的HRAS基因，引起了对RAS癌基因在人类肿瘤发生发展过程中作用的关注。RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。其中，KRAS对人类癌症影响最大，类似一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常，例如KRAS基因突变时，该基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡从而发生癌变。KRAS基因突变常见于大肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌和胆道癌等。
在本发明的上下文中，激素受体是指可与激素发生特异性结合而形成激素-受体复合物，从而使激素发挥其生物学功能的蛋白质分子。术语“雌激素受体(estrogenreceptor，ER)”，包括两大类：一是经典的核受体，包括雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)和雌激素受体β(estrogen receptor β，ERβ)，均位于细胞核内，介导雌激素的基因型效应，即通过调节特异性靶基因的转录而发挥基因型调节效应；二是膜性受体，包括经典的核受体的膜性成分以及属于G蛋白偶联受体家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X，可介导快速的非基因型效应，通过第二信使系统发挥间接的转录调控功能。ER的作用是为对生殖系统发育和生殖功能有重要影响的雌性激素提供结合位点。ER结合雌性激素后，导致基因表达并控制信号通路的激活，从而调节细胞生长过程，控制细胞周期。ESR1基因位于人类染色体6q25.1区域，全长472929bp，编码ERα（即雌激素受体α），其与免疫之间存在密切关系。
典型地，ER（雌激素受体）抑制剂的非限制例包括但不限于，氟维司群(Fulvetrant)、他莫昔芬(Tamoxifen)、巴多昔芬(Bazedoxifene)、雷洛昔芬(Raloxifene)、托瑞米芬(Toremifen)、拉索昔芬(Lasofoxifene)、奥培米芬(Ospemifene)、艾拉司群(Elacestrant)、Amcenestrant、Giredestrant、Rintodestrant、AZD9833、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPPdihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502等。
本发明首先涉及一种在受试者中治疗KRAS突变的胆管癌的方法，包括抑制雌激素受体（ER）的表达或下调雌激素受体的步骤。
在本发明的上下文中，KRAS突变，是指KRAS基因中发生掺入、替换、或缺失，从而改变其正常功能，激活突变的KRAS蛋白。
在本发明的上下文中，KRAS激活突变，是指KRAS基因中发生掺入、替换、或缺失，从而改变其正常功能，导致突变细胞生长，迁移，转化，侵袭和致癌等能力增加。
如本文所用，术语“受试者”与“患者”可互换使用，指需要治疗的哺乳动物，如宠物（例如，狗、猫等）、牲畜（例如牛、猪、马、绵羊、山羊等）及实验动物（例如大鼠、小鼠、豚鼠等）。优选地，为需要治疗的人类。
本申请使用的术语“治疗”包括缓解、减轻或改善疾病或病症，预防其他症状，抑制疾病或病症，例如预防性和/或治疗性地阻止或延迟疾病或病症的发展、缓解症状、使其消退等。在一些实施方案中，治疗包括延长无进展存活期。在另一些实施方案中，治疗包括与其它治疗方法相比，降低疾病进展的相对风险。在一些实施方案中，其它治疗选择包括但不限于激素治疗（例如，抗雌激素疗法等）。
在一些实施方案中，本发明所述治疗方法中，包括沉默、敲除或敲减ESR1基因的步骤。其中，优选地，通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)或CRISPR基因编辑技术进行所述沉默、敲除或敲减；进一步优选地，利用靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体进行所述沉默、敲除或敲减。
在另一些实施方案中，所述治疗方法包括将治疗有效量的ER抑制剂化合物施用于所述受试者的步骤。
在优选的实施方案中，其中所述ER抑制剂选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502，或其药学上可接受的盐。进一步优选地，所述ER抑制剂选自氟维司群或其药学上可接受的盐；任选地，氟维司群还可与上述的其他ER抑制剂或其药学上可接受的盐组合施用。
术语药物的“组合”、“联合”是指由多于一种活性成分混合或组合产生的产品；包括活性成分的固定和非固定组合。“固定组合”是指，活性成分（例如氟维司群和其他活性药剂）以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。“非固定组合”是指活性成分和其他活性药剂，分别作为单独的实体或剂量，同时、分别或依次施用于患者，其间没有特定的时间间隔的限制。非固定组合也适用于混合疗法(cocktail)，例如三种或更多种活性成分的给药。
在本发明的上下文中，术语“施用”或“给药”是指，在患者体内提供有效水平的所述活性化合物。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以引起目标生物反应的数量。如本领域技术人员理解，本发明化合物的有效量可根据下列因素而改变：如生物学目标、化合物的药代动力学、所治疗的疾病、给药模式及受试者的年龄健康情况和症状。除非另作说明，否则，本文使用的化合物的“治疗有效量”是在治疗疾病、障碍或病症的过程中足以提供治疗益处的量，或使与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状延迟或最小化的量。化合物的治疗有效量是指单独使用或与其它疗法联用时，治疗剂的量，它在治疗疾病、障碍或病症的过程中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可包括改善总体治疗、降低或避免疾病或病症的症状或病因，或增强其它治疗剂的治疗效果的量。
术语“药学上可接受的盐”是指，本发明化合物的盐，其在可靠的医学判断范围内适用于与患者组织接触，不会产生不恰当的毒性、刺激作用、变态反应等。盐可能包括药学上可接受的碱加成盐，通过与金属或胺生成的，例如碱金属与碱土金属氢氧化物或有机胺。用作阳离子的金属的实例有钠、锂、钾、镁、钙等。胺的实例有四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、三乙胺、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。或者可以是从无机酸制备的硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物等。此类盐的实例包括但不限于：氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙磺酸盐等。或者从有机酸制备的盐，例如脂肪族一元与二元羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香族酸、脂肪族与芳香族磺酸等。此类盐的实例包括但不限于：乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盆、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、萘甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还可以是氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。
本发明的药物化合物或其药学上可接受的盐，或其他形式，施用于受试者，可使用任何合适的递送方法，包括表面、经肠、胃肠外、经皮、经黏膜、经由吸入、脑池内、硬膜、阴道内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内及玻璃体内将本文所述的化合物或其药学上可接受的盐施用于受试者。
本发明还涉及用于治疗KRAS突变的胆管癌的试剂盒，其包含用于抑制雌激素受体表达或下调雌激素受体的试剂。进一步地，所述试剂为沉默、敲除或敲减基因的试剂，优选地，所述试剂选自siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体。
另一方面，本发明还涉及ER抑制剂化合物，其用于在受试者中治疗KRAS突变的胆管癌。所述ER抑制剂化合物优选选自选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐；更优选氟维司群。
此外，本发明还涉及对ER具有抑制作用的物质在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物中的应用。其中所述物质优选为抑制雌激素受体的表达或下调雌激素受体的物质。
进一步地，所述物质为用于沉默、敲除或敲减ESR1基因的物质。优选为靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或shRNA。
在另一些实施方案中，其中所述物质为ER抑制剂化合物，优选选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐。
此外，本发明涉及氟维司群在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物中的应用。
如本文所用，氟维司群(Fulvestrant)是一类新的雌激素受体拮抗剂——雌激素受体下调剂类抗乳腺癌治疗药物，已被FDA批准用于ER阳性的晚期乳腺癌治疗，可直接作用于ER，通过抑制ESR1突变的ERα转录达到抑制肿瘤的作用。氟维司群CAS号为129453-61-8，结构如下：
Figure 845526DEST_PATH_IMAGE001
。
在一些实施方案中，其中氟维司群与第二治疗剂联合施用；其中所述第二治疗剂为靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或shRNA或其他ER抑制剂化合物；所述其他ER抑制剂化合物优选选自下组的化合物或其组合：他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPPdihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方案中，其中所述的KRAS突变包括下组的一种或多种：p.G12V、p.G12C、p.G12D、p.G12A、p.G12R、p.G12S、p.G12F、pG13A、pG13E、pG13C、pG13R、pG13D、pG13S、pG13V、p.V14I、p.L19F、p.Q22K、p.D33E、p.A59G、p.Q61E、 p.Q61R、p.Q61H、p.Q61L、p.Q61P、p.Q61K、p.S65N、p.A146V、p.A146T、p.A146P、p.K117N。
在另一方面，本发明还涉及一种测定能否使用ER抑制剂与胆管癌肿瘤细胞接触以抑制所述肿瘤细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：测定所述肿瘤细胞中的KRAS基因，其中KRAS基因存在突变则表明所述肿瘤细胞的生长或增殖可被ER抑制剂抑制。
在优选的实施方案中，所述KRAS基因突变包括但不限于以下的一种或多种：p.G12V、p.G12C、p.G12D、p.G12A、p.G12R、p.G12S、p.G12F、pG13A、pG13E、pG13C、pG13R、pG13D、pG13S、pG13V、p.V14I、p.L19F、p.Q22K、p.D33E、p.A59G、p.Q61E、 p.Q61R、p.Q61H、p.Q61L、p.Q61P、p.Q61K、p.S65N、p.A146V、p.A146T、p.A146P、p.K117N；其中所述突变的存在表明所述肿瘤细胞的生长或增殖可被ER抑制剂抑制。
用于检测生物样品中是否存在KRAS突变的示例性方法包括：从测试个体获得生物样品（例如肿瘤相关组织或体液），并将所述生物样品与能够检测KRAS基因相关的多肽或核酸（例如mRNA、基因组DNA或cDNA）的化合物或试剂接触。本发明的检测方法可用于检测例如体外和体内生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA。mRNA的体外检测技术包括Northern杂交和原位杂交。用于生物标记物蛋白的体外检测技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光等。基因组DNA的体外检测技术包括Southern杂交。mRNA的体内检测技术包括聚合酶链反应(PCR)、Northern杂交和原位杂交。
术语“生物样品”旨在包括从个体分离的组织、细胞、生物流体及其分离物，以及存在于个体内的组织、细胞和流体。
本发明的有益效果：
本发明通过对数据库中胆管癌患者的基因突变数据、基因表达量数据以及生存数据等，发现胆管癌患者中KRAS突变与ESR1基因的关联，确认KRAS突变与雌激素通路活化存在关联。
进一步地，本发明通过iCSDB数据库，查询到胆管癌细胞系经敲除ESR1基因后，相比KRAS野生型，存在KRAS突变的细胞系的生长受到更显著的抑制。
本发明通过细胞活力实验，进而验证了典型的ER抑制剂（氟维司群）能够显著抑制KRAS突变的胆管癌细胞系。表示氟维司群以及众多ER抑制剂或抑制方法可能成为治疗胆管癌患者的新方法。
附图说明
图1：KRAS突变型的胆管癌患者中ESR1表达高（选中患者）与表达低（未选中者）的生存图；
图2：KRAS野生型的胆管癌患者中ESR1表达高（选中患者）与表达低（未选中者）生存图；
图3：iCSDB数据库CRISPR结果；
图4：药物试验结果。
具体实施方式
实施例1：从患者数据库确定KRAS突变与ESR1基因的关联
从领星医学数据库（来自启东领星医学检验实验室有限公司）中获取胆管癌患者的相关数据（包括患者的全外显子突变数据、转录组数据、生存数据等）。
通过AI神经网络算法，对比分析KRAS突变阳性组和野生型组的各个基因的表达量，得出KRAS突变阳性组中存在Causal Signal（因果信号）的一组基因。对这一组基因进行功能聚类分析，得出具有Causal Signal的基因信号通路。
下表1为信号通路聚类分析的结果，是常用的分析方法Gene Set EnrichmentAnalysis (GSEA)的在线分析结果（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/annotate.jsp）。输入有Causal Signal（因果信号）的一组基因后，软件会分析得到列表，将KRAS突变影响最大最相关的一些信号通路，按照p值从小到大排列，获得相应的结果：雌激素相关通路与KRAS突变阳性存在最强的因果关系，换言之，KRAS突变引起了雌激素通路的活化。
表1
Figure 324043DEST_PATH_IMAGE002
领星医学数据库中包含胆管癌患者共131例，KRAS突变的分布更倾向于在女性中富集（表2）。利用领星医学数据库中患者的医疗数据，通过ESR1表达的高低，可以比较相应患者的生存数据。
表2：131例胆管癌患者的临床特征
Figure 16056DEST_PATH_IMAGE003
结果显示，在KRAS突变型的胆管癌患者中，以所有患者ESR1表达量的中位数为分界值，高于该中位数为高表达，低于则为低表达。ESR1（雌激素通路中关键基因）高表达的患者比ESR1低表达的患者生存显著变差（图1），p=0.040，HR=2.760；而KRAS野生组中，ESR1的表达高低与胆管癌患者生存没有关联（图2），p=0.982，HR=0.993。可见，ESR1表达量与KRAS突变的胆管癌患者预后显著相关。
进一步的，在去除无性别/年龄的患者3人后，对剩余128例患者进行COX多因素生存分析（表3）。
表3：胆管癌患者生存多因素分析
Figure 940018DEST_PATH_IMAGE004
在整体水平上，纳入基因表达、KRAS突变情况、性别、年龄，进行多因素分析，发现只有以KRAS突变进行分组的预后有显著差异（p<0.001），年龄有影响预后的趋势；
将患者根据KRAS进行分层后，纳入基因表达、性别、年龄，进行多因素分析，只有在KRAS突变组中，基因表达与预后的关系有统计学差异（p=0.05），在KRAS野生组，基因表达与预后没有相关性。
实施例2：CRISPR数据证明KRAS突变的胆管癌细胞系对ER敲除更敏感
iCSDB是一个人类细胞系CRISPR-Cas9筛选实验的集成数据库，CRISPR-Cas9筛选的两个主要来源：DepMap门户和BioGRIDORCS。iCSDB包含976个人类细胞系的1375个全基因组筛选，涵盖28种组织和70种癌症类型。重要的是，该数据库去除了来自不同CRISPR库的批次效应，并将筛选分数转换为单一指标来估计敲除效率。
使用CRISPR-Cas9敲除基因与使用药物抑制该基因表达应该有类似的效果。因此，利用CRISPR数据可以佐证特定基因对相应细胞生长的影响。
因此，为进一步验证实施例1中的初步结果，观察该数据库中，在KRAS突变型和野生型中敲除ESR1（编码ER的基因）对生长的影响，来判断抑制ESR1是否是KRAS突变型胆管癌的特异性靶点。
通过iCSDB网站（https://www.kobic.re.kr/icsdb/downloads）下载所有细胞系的CRISPR-Cas9结果后，筛选出所有胆管癌细胞系，按照KRAS突变状态可以分为KRAS突变组和KARS野生型组，以CRISPR score为Y轴做小提琴图(Violin Plot)，获得KRAS突变型与野生型中敲除ESR1后的相关数据。
结果：如图3所示相对于KRAS野生型的胆管癌细胞系，ESR1的敲除显著抑制了KRAS突变型细胞系的生长（p = 0.042）。这预示着，抑制ER可以特异性地抑制KRAS突变型的胆管癌细胞系的生长。推测通过抑制ER，沉默、敲除或敲减ESR1可能可以抑制治疗上述的胆管癌细胞生长，从而可能具备治疗所述KRAS突变的胆管癌。
实施例3：细胞活力实验，CellTiter-Glo（CTG）法测定ER抑制剂化合物的药效活性
为进一步验证实施例2中结果，采用典型的ER受体拮抗剂氟维司群(Fulvestrant)进行进一步的细胞活力实验检测。
使用CTG方法检测氟维司群的抗胆管癌的药效活性。使用的细胞系为KRAS突变型的胆管癌细胞系 HUCCT1 和OZ；KRAS野生型胆管癌细胞系HCCC-9810。通过对比KRAS突变型和野生型在药物处理后的生长差异来确定药物治疗胆管癌的疗效。具体步骤如下：
1）将不同的实验细胞系传代分板到96孔板中。96孔板的四周加入100μL的PBS作空白，其中使用的胆管癌细胞系为HUCCT，OZ和HCCC-9810。96孔板中的细胞置于37℃、5%CO2和95%湿度条件下培养过夜。
2）将96孔板中的细胞培养基弃掉，加入100μL含5% Charcoal Stripped FBS的无酚红RPMI1640培养液。
3）将已换液的96孔板中的细胞置于37℃、5%CO2、95%湿度条件下继续培养48小时。
4）将96孔板中的细胞培养基弃掉，加入80μL含5% Charcoal Stripped FBS的无酚红RPMI1640培养液。
5）用相应溶剂溶解被测化合物形成储存液并进行梯度稀释，得到10倍工作浓度溶液。
6）在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μL Fulvestrant药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。被测化合物浓度分别为0μM，1μM，2.5μM，5μM，10μM，15μM和20μM浓度。
7）在已接种细胞的96孔板中每孔加入1nM Estradiol溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。
8）将已加Fulvestrant的96孔板中的细胞置于37℃、5%CO2、95%湿度条件下继续培养168小时。
9）在培养的第11天将CellTiter-Glo试剂和药物处理细胞培养板放置于室温平衡30分钟；每孔加入50μL的CellTiter-Glo试剂；在定轨摇床上振动2分钟使细胞充分裂解；将细胞培养放置于室温平衡10分钟；用EnVision读取化学发光值。
10）所有统计分析均使用GraphPad Prism软件进行，使用单向方差分析，然后进行Dunnett事后检验。
结果：相对于KRAS野生型的胆管癌细胞系，Fulvestrant显著抑制两株KRAS突变型胆管癌细胞系的生长（图4）。1μM Fulvestrant对OZ已经有显著的生长抑制，随着Fulvestrant浓度升高，抑制率也相应的升高。HuCCT1对Fulvestrant的敏感性低于OZ，在高于2.5μM的用药浓度时生长被显著抑制，抑制率较OZ低。与野生型相比，2种KRAS突变型胆管癌细胞系的生长均被显著抑制。这表示，Fulvestrant可能被用于抑制KRAS突变的胆管癌细胞，从而治疗相应的胆管癌。
本发明前文的描述旨在举例说明，而非限制本发明的范围，本领域中的技术人员应当理解，在不背离权利要求书以及本发明范围的条件下可对其进行形式和细节上的各种改变。本文引用的所有公布的专利和专利申请引入本文以供参考。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件和科学文献等引入本文以供参考。

Claims (12)

1.对ER具有抑制作用的物质在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述物质为抑制雌激素受体的表达或下调雌激素受体的物质。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述物质为用于沉默、敲除或敲减ESR1基因的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述物质为靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或shRNA。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述物质为ER抑制剂化合物。
6. 根据权利要求5所述的应用，其中所述物质为选自下组的化合物或其组合：氟维司群、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant 、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的应用，其中所述物质为氟维司群。
8.氟维司群与第二治疗剂在制备用于治疗KRAS突变的胆管癌的联合药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述第二治疗剂为靶向ESR1基因的siRNA、sgRNA或shRNA或其他ER抑制剂化合物。
10. 根据权利要求9所述的应用，其中所述其他ER抑制剂化合物为选自下组的化合物或其组合：他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、巴多昔芬、拉索昔芬、奥培米芬、Amcenestrant、AZD9833、Giredestrant、艾拉司群、LY3484356、ZN-c5、ARV-471、OP-1250、ZB716、D-0502、Rintodestrant、RU 58668、ZK 164015、ICI 182780、MPP dihydrochloride、PHTPP、AZD9496、阿考比芬、SAR439859、Nitromifene、Kaempferol、Brilanestrant、LSZ-102、H3B-5942、OP-1074、Endoxifen、GDC-0927 Racemate、GNE-502或其药学上可接受的盐。
11.测定能否使用ER抑制剂与胆管癌肿瘤细胞接触以抑制所述肿瘤细胞的生长或增殖的方法，所述方法包括：测定所述肿瘤细胞中的KRAS基因，其中KRAS基因存在突变则表明所述肿瘤细胞的生长或增殖可被ER抑制剂抑制。
12. 权利要求11所述的方法，其中KRAS基因突变选自以下的一种或多种：p.G12V、p.G12C、p.G12D、p.G12A、p.G12R、p.G12S、p.G12F、pG13A、pG13E、pG13C、pG13R、pG13D、pG13S、pG13V、p.V14I、p.L19F、p.Q22K、p.D33E、p.A59G、p.Q61E、 p.Q61R、p.Q61H、p.Q61L、p.Q61P、p.Q61K、p.S65N、p.A146V、p.A146T、p.A146P、p.K117N；其中所述突变的存在表明所述肿瘤细胞的生长或增殖可被ER抑制剂抑制。
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