CN114208817A - 胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用 - Google Patents

胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用 Download PDF

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CN114208817A CN202210055845.5A CN202210055845A CN114208817A CN 114208817 A CN114208817 A CN 114208817A CN 202210055845 A CN202210055845 A CN 202210055845A CN 114208817 A CN114208817 A CN 114208817A
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Abstract

本发明提供了一种胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用，0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的精子活力和精子活率，提高了鸡精液冻后中的精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性，提高了鸡精液冻后中的抗氧化性能，即提高了超氧化物歧化酶的含量，降低了丙二醛的含量，胆固醇和大豆卵磷脂联合作用时，冷冻稀释液的成分包括：谷氨酸钠、果糖、醋酸钠、柠檬酸钾、氯化镁和二甲基乙酰胺；故在鸡精液冷冻中，Lake’s稀释液中联合添加0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂时，可降低精子氧化损伤，提高精子冻后品质。

Description

胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
背景技术
精液超低温保存是畜禽遗传资源收集和保护中最有价值的技术之一。精液的冷冻保存就是利用干冰、液氮或者其他制冷的设备作为冷源，将精液进行特殊处理之后，保存在极低温度下，抑制精子的代谢活动，使精子处于休眠状态，在合适的温度下复苏精子仍具有受精能力的冷冻保存技术。它被广泛应用于许多哺乳动物的种质资源保护和商业化。在家禽中，虽然精液冷冻用于保护其种质资源，但由于冻后精子存活率低、卵子孵化率低，因此实际应用中技术上还需要进一步优化[1]。精子冷冻技术一方面可以最大限度地利用遗传优良的雄性，另一方面对保护家禽种质资源具有重要意义。由于家禽精子的特殊结构，对冻融过程的温度变化较为敏感[2]，还需进一步优化该技术。
胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，占质膜脂类的20％以上。精子在冷冻过程中，由于温度的变化，会使精子内部液体形成冰晶，造成一系列不可逆损伤，这会导致精子的活力、活率下降。精子细胞膜主要是由脂质和蛋白质组成，脂质主要为磷脂和胆固醇。胆固醇作为膜功能的调节剂起着多重作用[3]，对细胞膜的流动性和渗透压都有着一定的影响。有研究表明，当温度低时，胆固醇可以干扰细胞的有序性，阻止液晶的形成，降低了膜所转换的温度，使膜保持流动的状态，从而减少了精子的低温温度打击[4]。冷冻过程中精子膜上磷脂和胆固醇的外泄是造成精子冻后活力活率降低、存活时间短的重要原因之一[5]。据报道，在低温保存期间，50％的猪精液会丢失约为28％的胆固醇。由于膜胆固醇的丢失会使精子失去活力，从而导致精子失活。胆固醇量对维持细胞的完整性和精子获能有很大的关系[6]，E A M Amorim在公牛精液中添加胆固醇可以有效提高精子细胞冻后存活率[7]。因此，冷冻前，在基础稀释液中添加少量的胆固醇能够有效地减少精子质膜中的质膜的外泄，提高精子冻后活力活率[8]。
卵黄是精液冷冻保存过程中最常用的非渗透性冷冻保护剂，能够有效保护精子免受低温打击。但卵黄来源于禽类，可能携带病原微生物，如沙门氏菌、禽流感等，从而影响精子品质。近年来，用于禽流感、疯牛病等大规模畜禽传染病的影响，精液稀释液中的动物源成分也可能造成疫情的传播、交叉感染，甚至可能产生新型疫情[9]。且卵黄可与精子中的一种蛋白凝固酶发生凝集反应，不利于精子生存[11]。正由于卵黄等动物源性稀释液诸多的不可控因素，近年来非动物源性冷冻保护剂作为替代剂已成为国内外相关学者研究的热点。大豆卵磷脂是从植物源性大豆中提取的一类基础物质，其核心成分为磷脂酰胆碱。磷脂存在于动植物的细胞中，是构成细胞膜的重要组成部分。大豆卵磷脂能够有效稳定和替代卵黄对精子细胞膜的保护作用，增强精子在冷冻过程中对低温的耐受性[12]。在羊精液稀释液中的卵黄由大豆卵磷脂取代后，可有效地保护精子免受冷冻打击[13]。在孙玲伟[14]的实验中，添加纳米级大豆卵磷脂能有效提高鸡精液冻后的质量。P Gogol等将稀释液中的卵黄替代为大豆卵磷脂在山羊的精液冷冻中也取得了较高的冻后活率P[15]。但在家禽精液冷冻稀释液中非动物源性冷冻保护剂研究甚少，因此它对家禽精子功能特性的影响尚需要进行进一步探索。
基于此，本实验在Lake’s稀释液的基础上设置添加不同浓度的胆固醇和大豆卵磷脂，以及联合作用，比较其对鸡精子冻后活力、活率以及存活时间等的影响，从而筛选最佳胆固和大豆卵卵磷脂的添加浓度，为后续鸡的种质资源收集与保护奠定基础。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
具体地，0.25wt％胆固醇和0.5wt％大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
优选地，0.25wt％胆固醇和0.5wt％大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的精子活力和精子活率。
优选地，0.25wt％胆固醇和0.5wt％大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性。
优选地，0.25wt％胆固醇和0.5wt％大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的抗氧化性能。
优选地，0.25wt％胆固醇和0.5wt％大豆卵磷脂提高了超氧化物歧化酶的含量。
优选地，0.25wt％胆固醇和0.5wt％大豆卵磷脂降低了丙二醛的含量。
优选地，胆固醇和大豆卵磷脂联合作用时，冷冻稀释液的成分包括：谷氨酸钠、果糖、醋酸钠、柠檬酸钾、氯化镁和二甲基乙酰胺。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
当胆固醇和大豆卵磷脂添加浓度为0.25wt％H+0.5wt％SL时，解冻后精子活率、活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性最高，分别达到56.69％、54.35％、54.71％、53.52％、54.23％，其精子活率与添加浓度为0.25wt％H+0.25wt％SL(54.46％)组别无显著差异(P>0.05)，与其他组别差异显著(P<0.05)；活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性显著高于胆固醇、大豆卵磷脂以及胆固醇和大豆卵磷脂联合实验的其他组别(P<0.05)。胆固醇和大豆卵磷脂联合添加浓度为0.25wt％H+0.5wt％SL时，解冻后精子的超氧化物歧化酶(SOD)(152.73％)含量最高，丙二醛(MDA)(5.65％)含量最低。故在鸡精液冷冻中，Lake’s稀释液中胆固醇和大豆卵磷脂联合添加浓度为0.25wt％H+0.5wt％SL时，可降低精子氧化损伤，提高精子冻后品质。
附图说明
图1为本发明的实施例1中不同浓度胆固醇的添加对鸡精液解冻后活率和活力的影响。
图2为本发明的实施例1中不同浓度大豆卵磷脂的添加对鸡精液解冻后活率活力的影响。
图3为本发明的实施例1中不同浓度胆固醇和大豆卵磷脂的联合添加对鸡精液解冻后活率活力的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1公鸡来源
本研究使用的6只公鸡来源于上海市农业科学院庄行综合试验站，品种为广西容县霞烟鸡，2-30周龄，健康状况良好，精液质量稳定。
1.1.2主要试剂
除特殊说明外，所有试剂均购于Sigma公司。
1.2实验设计
1.2.1稀释液的配制
基础稀释液分别为Lake’s[9]稀释液，主要成分为：1.92g谷氨酸钠、1g果糖、0.815g醋酸钠、0.128g柠檬酸钾、0.068g氯化镁，双蒸水定容至100mL，调节渗透压至333mOsm/Kg，pH至7.0。冷冻稀释液为在基础稀释液的基础上添加终浓度6wt％二甲基乙酰胺(DMA)[14]。
1.2.2实验组设定
实验组分为胆固醇组、大豆卵磷脂组、胆固醇和大豆卵磷脂联合实验组；胆固醇添加组：A1：0wt％、A2:0.125wt％、A3:0.25wt％、A4:0.5wt％、A5:1wt％、A6:1.5wt％；大豆卵磷脂添加组：B1：0wt％、B2:0.25wt％、B3:0.5wt％、B4:1wt％、B5:1.5wt％、B6:2wt％；大豆卵磷脂和胆固醇联合添加组：A3：0.25wt％、A3+B2:0.25wt％+0.25wt％；A3+B3:0.25wt％+0.5wt％、A3+B4:0.25wt％+1wt％、A3+B5:0.25wt％+1.5wt％。分别配置成一液，再添加终浓度为6wt％的DMA配置成二液，进行鸡精液冷冻保存试验。
1.2.3精液的稀释与平衡
采用两步法稀释精液，首先将镜检合格精液混合(每次试验混合不少于5只)，测量体积后按照实验分组分为若干等分，在按照1:2的稀释比例加入等温预热的基础稀释液，用10层纱布包裹，避光放入4℃冰箱中平衡1h[15]，再1:1加入4℃预冷的冷冻稀释液，继续平衡10min后装管冷冻。
1.2.4精液冷冻
将灌装封口的0.5mL细管放入程序冷冻仪(Planer公司，型号：Kryo 560-16)中并设定：5-(-35)℃时降温速率为7℃/min，从-35℃到-120℃时，降温速率为9℃/min[16]进行冷冻，待冷冻结束后迅速投入到液氮中保存。
1.2.5精液解冻
将装有精液的0.5mL细管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中30s水浴解冻，解冻后用对应的37℃基础稀释液1:1稀释，并按照试验设计的不同保存温度和时间进行各项精液指标检测。
1.3统计分析
每组试验至少重复三次，每次每组至少解冻两管。本试验的数据用SPSS 22.0软件进行数据分析，结果表示为“平均值±标准误”(Mean±SEM)，P<0.05表示差异显著。
以下进行精子质量检测。在以Lake’s为基础稀释液的冻精稀释液中添加最终浓度为0wt％、0.125wt％、0.25wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％的胆固醇和终浓度为0wt％、0.25wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％的大豆卵磷脂以及终浓度为0.25wt％H、0.25wt％H+0.25wt％SL、0.25wt％H+0.5wt％SL、0.25wt％H+1wt％SL、0.25wt％+1.5wt％SL的胆固醇和大豆卵磷脂联合添加，冷冻-解冻后分别对精子活力、活率、质膜完整性、顶体完整性、线粒体活性、抗氧化指标进行检测。
实施例1：
精子活率与活力检测
取10μL解冻后精液制片，使用精液自动分析仪在显微镜下随机选取五个视野观察，计算冻后精子的活率和活力。
不同浓度胆固醇对鸡精液冻后活力活率的影响：
由图1可知，添加0.25wt％浓度的胆固醇组解冻后精子的质量最高，其精子活率、精子活力显著高于其他组分。在活率方面，胆固醇浓度为0.25wt％时，精子活率最高为54.53％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随着胆固醇浓度的增加，精子冻后活率依次降低；在活力方面，胆固醇浓度为0.25wt％时，精子活力最高为50.78％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随着胆固醇浓度的增加，精子冻后活力依次降低。
不同浓度大豆卵磷脂对鸡精液冻后活力活率的影响：
由图2可知，添加1wt％浓度的大豆卵磷脂组解冻后精子的质量最高，其精子活率、精子活力显著高于其他组分。在活率方面，大豆卵磷脂浓度为1wt％时，精子活率最高为55.30％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随着大豆卵磷脂浓度的增加，精子冻后活率依次降低；在活力方面，大豆卵磷脂浓度为1wt％时，精子活力最高为50.27％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随着大豆卵磷脂浓度的增加，精子冻后活力依次降低。
大豆卵磷脂-胆固醇联合作用对鸡精液冻后活力、活率的影响：
由图3可知，添加0.25wt％浓度的胆固醇和0.5wt％浓度的大豆卵磷脂联合作用解冻后精子的质量最高，其精子活率、精子活力显著高于其他组分。在活率方面，添加0.25wt％浓度的胆固醇和0.5wt％浓度的大豆卵磷脂联合作用时，精子活率最高为56.69％，与0.25wt％浓度的胆固醇和0.25wt％浓度的大豆卵磷脂联合作用时的差异不显著(P>0.05)，且随着大豆卵磷脂浓度的增加，精子冻后活率依次降低；在活力方面，胆固醇浓度为0.25wt％，大豆卵磷脂的浓度为0.5wt％时，精子活力最高为54.35％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随着大豆卵磷脂浓度的增加，精子冻后活力依次降低。
实施例2：
精子质膜完整率检测：
采用低渗肿胀法(HOST)检测精子质膜完整性[17]。配制HOST低渗溶液，取10μL精液样品添加到100μL等温HOST低渗溶液中，37℃水浴10min，在光学显微镜下随机观察不少于4个视野，统计精子数不少于200个，计算弯尾精子数与总精子数的比例。
精子顶体完整率检测：
吉姆萨染色法测定精子顶体完整率[18]，取适量解冻后精子涂片，风干。甲醛固定15min后冲洗干净，吉姆萨溶液染色12h，冲洗干净，风干后镜检。精子顶体结构明显染色，顶体完整、外形正常或顶体轻微膨胀为顶体完整精子，顶体严重膨胀或顶体脱落为顶体畸形精子[19]，在光学显微镜下随机观察不少于4个视野，统计精子数不少于200个，计算顶体完整率。
精子线粒体活性检测：
采用罗丹明(Rh123)染色法检测线粒体活性。取50μL的精液样本加入终浓度为100nmol/L的染料，在暗处于37℃处理30min。精子尾部呈现绿色荧光有线粒体活性，在荧光相差显微镜下观察不少于4个视野，统计精子数不少于200个，精子尾部呈现绿色荧光为有线粒体活性，计数荧光精子数百分率。
不同浓度胆固醇对鸡冻精线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性的影响：
表1为不同浓度胆固醇的添加对鸡精液解冻后线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性的影响。由表1可知，添加0.25wt％浓度的胆固醇组解冻后精子的质量最高，其精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性均显著高于其他组分。当胆固醇添加浓度为0.25wt％时，鸡精液冻后线粒体活性最高为51.29％；质膜完整性最高为50.23％；顶体完整性最高为51.51％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随着胆固醇浓度的增加，精子冻后线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性依次降低。
表1不同浓度胆固醇对鸡精子冻后质量的比较
组 线粒体完整性(％) 质膜完整性(％) 顶体完整性(％)
对照组 42.14±0.19c 37.57±0.11c 39.18±0.52c
0.125wt％H 45.71±0.31bc 43.21±0.19b 44.73±0.37b
0.25wt％H 49.29±0.44a 48.23±0.44a 49.51±0.42a
0.5wt％H 47.11±0.64ab 43.38±0.40b 44.63±0.95b
1wt％H 45.38±0.52bc 42.50±0.68b 42.64±1.05bc
1.5wt％H 40.44±0.82c 34.15±0.19d 36.33±0.64c
1同一列中不同字母的数值表示差异显着(P<0.05).
不同浓度大豆卵磷脂对鸡冻精线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性的影响：
表2为不同浓度大豆卵磷脂的添加对鸡精液解冻后线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性的影响。由表2可知，添加1wt％浓度的大豆卵磷脂组解冻后精子的质量最高，其精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性均显著高于其他组分。当大豆卵磷脂添加浓度为1wt％时，鸡精液冻后线粒体活性最高为53.129％；质膜完整性最高为44.28％；顶体完整性最高为51.16％，显著高于其他组分(P<0.05)，且随大豆卵磷脂浓度的增加，精子冻后线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性显著降低。
表2不同浓度大豆卵磷脂对鸡精子冻后质量的比较
组 线粒体完整性(％) 质膜完整性(％) 顶体完整性(％)
对照组 39.66±0.94c 36.46±0.87de 38.06±0.27c
0.5wt％SL 47.09±0.92b 40.62±0.79cd 45.20±1.41b
1wt％SL 53.12±0.85a 44.28±0.89bc 51.16±1.06a
1.5wt％SL 36.83±1.12c 36.31±1.15e 35.16±1.37d
2wt％SL 29.85±1.79 31.13±1.02 29.76±2.20
不同浓度大豆卵磷脂和胆固醇联合作用对鸡冻精线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性的影响：
表3为不同浓度大豆卵磷脂和胆固醇的联合添加对鸡精液解冻后线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性的影响。由表3可知，添加0.5wt％浓度的大豆卵磷脂和0.25wt％浓度的胆固醇组解冻后精子的质量最高，其精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性均显著高于其他组分。当大豆卵磷脂添加浓度为0.5wt％、胆固醇添加浓度为0.25wt％时，鸡精液冻后线粒体活性最高为54.23％；质膜完整性最高为53.52％；顶体完整性最高为54.71％，显著高于其他组分(P<0.05)。当大豆卵磷脂浓度为0.5wt％、胆固醇浓度为0.25wt％时，与不添加大豆卵磷脂组差异不显著(P>0.05)。且随大豆卵磷脂浓度的增加，精子冻后线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性显著降低。
表3不同浓度大豆卵磷脂与胆固醇联合作用对鸡精子冻后质量的比较
组 线粒体完整性(％) 质膜完整性(％) 顶体完整性(％)
0.25wt％H 47.73±1.64b 48.38±0.40b 48.63±0.35b
0.25wt％SL+0.25wt％H 48.23±1.21b 49.90±0.60b 49.44±0.49b
0.5wt％SL+0.25wt％H 54.23±1.21a 53.52±0.42a 54.71±0.33a
1wt％SL+0.25wt％H 37.61±0.34c 39.90±0.60c 40.44±0.49c
1.5wt％SL+0.25wt％H 28.51±0.55d 27.11±0.33d 29.41±0.37d
实施例3：
精子抗氧化指标检测：
分别使用碧云天的丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测冻后精子的抗氧化指标。
不同浓度胆固醇对鸡精子冻后抗氧化指标检测：
表4为不同浓度胆固醇的添加对鸡精液解冻后MDA、SOD的影响。由表4可知，添加0.25wt％浓度的胆固醇组解冻后精子的抗氧化指标最优。当胆固醇添加浓度到0.25wt％时，解冻后精子的MDA值为6.47，与胆固醇浓度为0wt％、0.125wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％没有显著性差异(P>0.05)，与添加胆固醇浓度为2wt％和2.5wt％鸡精液冻后MDA值存在显著性差异(P<0.05)。当胆固醇浓度添加浓度到0.25wt％时，解冻后精子的SOD值为124.41，与胆固醇浓度添加到0.5wt％时的SOD值没有显著性差异(P>0.05)，与其他浓度存在显著性差异(P<0.05)。
表4不同浓度胆固醇对鸡精子冻后MDA、SOD水平的影响
Figure BDA0003476447550000071
不同浓度大豆卵磷脂对鸡冻精抗氧化指标检测：
表5为不同浓度大豆卵磷脂的添加对鸡精液解冻后MDA、SOD的影响。由表5可知，添加1wt％浓度的大豆卵磷脂组解冻后精子的抗氧化指标最优。当大豆卵磷脂添加浓度到1wt％时，解冻后精子的MDA值为6.13，与添加大豆卵磷脂浓度为0.5wt％鸡精液冻后的MDA值没有显著性差异(P>0.05)，与添加大豆卵磷脂浓度为0wt％、1.5wt％、2wt％鸡精液冻后MDA值存在显著性差异(P<0.05)。当大豆卵磷脂浓度添加浓度到1wt％时，解冻后精子的SOD值为141.14，与不添加大豆卵磷脂和添加大豆卵磷脂浓度为0.5wt％、1.5wt％、2wt％时的SOD值存在显著性差异(P<0.05)。
表5不同浓度大豆卵磷脂对鸡精子冻后MDA、SOD水平的影响
Figure BDA0003476447550000081
不同浓度大豆卵磷脂和胆固醇联合作用对鸡冻精抗氧化指标检测：
表6为不同浓度大豆卵磷脂和胆固醇的联合添加对鸡精液解冻后MDA、SOD的影响。由表6可知，添加0.5wt％浓度的大豆卵磷脂和0.25wt％浓度的胆固醇组解冻后精子的抗氧化指标最优。当大豆卵磷脂添加浓度为0.5wt％、胆固醇添加浓度为0.25wt％时，解冻后精子的MDA值为5.65，与其他组别差异显著(P<0.05)。当大豆卵磷脂添加浓度为0.5wt％、胆固醇添加浓度为0.25wt％时，解冻后精子的SOD值为152.73，与添加大豆卵磷脂浓度为0wt％、0.25wt％、1.5wt％、2wt％时的SOD值存在显著性差异(P<0.05)。
表6不同浓度大豆卵磷脂与胆固醇联合作用对鸡精子冻后氧化指标检测
Figure BDA0003476447550000082
综上所述，精液中添加浓度为0.25％的胆固醇时，对精液冻后活力、活率具有促进效果，保护了膜和顶体完整性，提高了线粒体活性，增强了抗氧化能力；精液中添加大豆卵磷脂浓度为0.5％时，对精液冻后活力、活率具有促进效果，保护了膜和顶体完整性，提高了线粒体活性，增强了抗氧化能力；基于胆固醇和大豆卵磷脂的添加在精液中均起到的促进作用，本实验结合胆固醇和大豆卵磷脂，当添加胆固醇浓度为0.25％，大豆卵磷脂浓度为0.5％时，精液冻后活力、活率相对单独添加时均显著提高，对膜和顶体完整性起到保护作用，提高了线粒体活性，增强了抗氧化能力。
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最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.胆固醇和大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
2.0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂的联合作用在鸡精液冻后中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的精子活力和精子活率。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的精子线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂提高了鸡精液冻后中的抗氧化性能。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂提高了超氧化物歧化酶的含量。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：0.25wt%胆固醇和0.5wt%大豆卵磷脂降低了丙二醛的含量。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：胆固醇和大豆卵磷脂联合作用时，冷冻稀释液的成分包括：谷氨酸钠、果糖、醋酸钠、柠檬酸钾、氯化镁和二甲基乙酰胺。
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