CN114200044A - 一种基于uhplc-esi-qtof-ms/ms的五倍子单宁成分的鉴定方法 - Google Patents

一种基于uhplc-esi-qtof-ms/ms的五倍子单宁成分的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于UHPLC‑ESI‑QTOF‑MS/MS的五倍子单宁成分的鉴定方法，属于植物单宁的鉴定技术领域。本发明提供的鉴定方法结合使用超声辅助水浴方式提取五倍子中的单宁成分和使用UHPLC‑ESI‑QTOF‑MS/MS对提取的单宁成分进行鉴定，可以广谱鉴定到五倍子单宁成分中的1‑O‑没食子酰基葡萄糖至14‑O‑没食子酰基葡萄糖及其大量的异构体，实现五倍子单宁成分中大分子量的单宁成分的有效鉴定。

Description

一种基于UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS的五倍子单宁成分的鉴定 方法
技术领域
本发明属于植物单宁的鉴定技术领域，具体涉及一种基于超高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间-质谱联用技术(UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS)的五倍子单宁成分的鉴定方法。
背景技术
五倍子(Galla Chinensis)是五倍子蚜虫(Melaphis chinensis)寄生引起植物叶变态发育形成的虫瘿。依据2020版《中华人民共和国药典》对五倍子的描述，漆树科植物盐肤木(Rhus Chinensis Mill)、青麸杨(R.potaninii Maxim)、红麸杨(R.punjabensisJ.L.Stewart ex Brandis)是五倍子的来源树种。五倍子可被分为角倍和杜倍，角倍蚜(Schlechtendalia Chinensis Bell)在盐肤木上寄生形成的虫瘿被称作角倍，是我国重要的创汇林业资源。五倍子中水解单宁含量丰富，可达到五倍子干重的74.79％，缩合单宁最高可达到五倍子的1.92％，五倍子中富含的单宁类多酚化合物，具备抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒和神经保护等多种生物学效用，在医学、印染、制革、化工等方面应用广泛。
水解单宁通常被分为没食子单宁和鞣花单宁。上世纪初，研究学者就展开了对没食子单宁结构及组分的分析，没食子单宁是多种葡萄糖聚没食子酸酯的混合物，单个物质还具备多个同分异构体。没食子酸与UDP-葡萄糖反应可生成1-O-没食子酰基葡萄糖，该物质进一步酯化反应生成1,2,3,4,6-五-O-没食子酰基葡萄糖(PGG)。具有1～5个没食子酰基基团的葡萄糖聚没食子酸酯通常被称为“简单没食子酰基葡萄糖”，PGG结构上的没食子酰基结合新的没食子酰基，生成没食子单宁的特征基团二没食子酰基(Di-galloyl)，则形成“复杂没食子单宁”，PGG的两个没食子酰基之间以C-C键连接，生成鞣花单宁的特征基团六羟基二苯(HHDP)，则形成鞣花单宁，反应过程如下所示。
Figure BDA0003387524230000021
单宁是一类结构复杂的酚类化合物，分子量最高可达20000Da，大量的酚羟基也易发生氧化和水解反应。除此之外，不同没食子单宁之间结构性质相似，对五倍子中单宁成分的鉴定带来了挑战。单宁中大量的氢供体位点和氢受体位点与有机溶剂产生氢键或者静电引力，导致单宁在有机溶剂中溶解度很低。五倍子中的单宁组分几乎不溶于石油醚和乙醚，而乙醇、水、乙醇-水溶液、丙酮、丙酮水溶液、甲醇、乙酸乙酯都可以用来提取植物中的单宁成分。TIAN F等人将五倍子磨成细粉后过60目筛，之后使用石油醚提取12h，乙醚提取12h，乙酸乙酯再提取12h，提取过滤后的残渣用乙醇(40℃)提取12h，之后用水(40℃)提取12h，并在乙酸乙酯、乙醇提取液中鉴定到1～10-O没食子酰基葡萄糖、在水提取物中鉴定到1～5-O没食子酰基葡萄糖(TIAN F,LI B,JI B等.Antioxidant and antimicrobialactivities of consecutive extracts from Galla chinensis:The polarity affectsthe bioactivities[J].Food Chemistry,2011,113(1):173-179)。HWANG Y H等人基于超高液相色谱-二极管阵列-串联质谱的方法，使用沸水回流的方法提取五倍子粉末，提取3h，滤纸过滤后使用冷冻干燥机冻干，将冻干粉溶于蒸馏水后0.2μm滤膜过滤后进行后续分析，并鉴定到1-O-没食子酰基葡萄糖至8-O-没食子酰基葡萄糖(HWANG Y H,JANG S A,KIM T等.Anti-osteoporotic and Anti-adipogenic Effects of Rhus chinensis Nutgallsin Ovariectomized Mice Fed with a High-fat Diet[J].Planta Medica,2019,85(14-15):1128-1135)。MA S等人使用100℃水溶液提取研磨的五倍子粉末，每次提取1h，重复提取3次，在五倍子水提液中鉴定到1-O-没食子酰基葡萄糖到8-O-没食子酰基葡萄糖(MA S,QIN H,JIANG M等.Identification and Comparison of Tannins in Gall of Rhuschinensis Mill.and Gall of Quercus infectoria Oliv.by High-Performance LiquidChromatography-Electrospray Mass Spectrometry[J].Journal of ChromatographicScience,2020,58(5):403-410)。HUANG X L等人使用烘干后的五倍子粉末，蒸馏水(65℃)搅拌10h，过滤后蒸馏水(65℃)提取10h，之后使用95％乙醇提取，最终在提取物中检测到1-O-没食子酰基葡萄糖到3-O-没食子酰基葡萄糖及多个单宁同分异构体(HUANG X L,LIU MD,LI J Y等.Chemical composition of Galla chinensis extract and the effect ofits main component(s)on the prevention of enamel demineralization in vitro[J].Int J Oral Sci,2012,4(3):146-151)。可以看出，目前对五倍子单宁成分的鉴定分析方法往往需要繁琐的提取流程或者较长的提取时间，且未能有效鉴定到大分子量(1500Da以上)的没食子单宁。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明提供一种基于UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS的五倍子单宁成分的鉴定方法，其包括以下步骤：
1)五倍子单宁成分的提取；
2)标准品溶液的制备；和
3)UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定分析；
其中在步骤1)中，通过超声辅助水浴的方式对五倍子单宁成分进行提取，获得五倍子单宁成分待测液；其中超声辅助水浴提取的温度为65℃以上，提取的时间为30～80min，超声功率为1200～1800W。
在一个优选实施方式中，超声辅助水浴提取的温度可选为65～75℃，提取的时间可选为30～60min，进一步可选为30～45min，更进一步可选为30～40min，超声功率可选为1400～1600W，进一步可选为1500W。
在一个优选实施方式中，步骤3)中所述UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定分析的条件可包括：
色谱条件：柱温35±1℃，进针体积4-6μL；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速：0.25-0.35mL/min；梯度洗脱程序为0～5min，98％A；5～8min，90％A；8～15min，75％A；15～40min，75％A；40～45min，10％A；保持4-6min，后运行3-5min停止；
质谱条件：离子源为ESI负离子源；扫描质量数范围为m/z100～3200；干燥气温度315-325℃；干燥气流速7-9L/min；鞘气温度345-355℃；鞘气流速11-13L/min；雾化器压力38-42psi；负离子模式下，毛细管电压3.5kV；去簇电压380V；采集模式为Full scan AutoMS/MS。
在一个优选实施方式中，步骤2)中所述标准品溶液的制备的具体操作可包括：称取PGG、鞣花酸、没食子酸甲酯、没食子酸和单宁酸，分别使用超纯水配制为1.00mg·mL-1的标准品溶液。
在一个优选实施方式中，步骤1)中对五倍子单宁成分进行提取的具体操作可包括：
11)将五倍子样品研磨，研磨后的五倍子粉末过60目筛均质，称取均质后的粉末分散于纯水中，获得五倍子粉末浆液；
12)将步骤11)获得的五倍子粉末浆液置于超声辅助水浴中进行提取，经提取后的浆液经0.22μm滤膜过滤后，收集滤液，获得五倍子单宁成分待测液。
在一个优选实施方式中，所述五倍子为角倍，鉴定到的单宁成分为1-O-没食子酰基葡萄糖至14-O-没食子酰基葡萄糖。
基于以上技术方案提供的基于UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS的五倍子单宁成分的鉴定方法通过结合超声辅助水浴提取五倍子单宁成分的方法和UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定五倍子单宁成分的方法，两者共同作用可以广谱鉴定到五倍子单宁成分中的1-O-没食子酰基葡萄糖至14-O-没食子酰基葡萄糖及其大量的异构体，实现五倍子单宁成分中大分子量的单宁成分的有效鉴定。另一方面，本发明提供的方法中通过超声辅助水浴提取五倍子单宁成分的操作相对于现有技术更加简便，不仅对提取温度(65℃以上)要求低，而且仅需要30-80min即可提取获得五倍子单宁成分，另外还无需对样品进行预处理和纯化，因此还可以显著提高提取和鉴定效率。
附图说明
图1为五倍子单宁成分待测液在UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS的负离子模式下的总离子流图，其中A、B、C幅分别表示待测液A、B、C的总离子流图；
图2为经UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定的待测液C中的2-O-没食子酰基葡萄糖的8个异构体的二级质谱图(图中a、b、c、d、e、f、g、h幅分别表示一个异构体的二级质谱图)。
具体实施方式
单宁是高度亲水性多酚化合物，含有大量的糖苷和羟基，易与蛋白质、生物碱和多糖等结合形成复合物，现有技术中通常采用多种有机溶剂来提取五倍子中的单宁成分。虽然目前已经有多种方法被用于鉴定五倍子中的单宁成分，但是都存在鉴定范围窄或者不能有效鉴定大分子量的单宁成分的缺陷。例如ZHU F等人公开一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-四极离子阱质谱技术鉴定五倍子中单宁成分的方法，将冻干五倍子磨成细粉后，过24目筛，使用80％甲醇作为提取溶剂，23℃提取5min，直接使用MALDI-QIT-TOF进行物质分析，可以鉴定到4～11-O没食子酰基葡萄糖(ZHU F,CAI Y,XING J,等.Rapididentification of gallotannins from Chinese galls by matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight quadrupole ion trap mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry Rcm,2010,23(11):1678-1682)。该方法利用了基质辅助激光解吸电离的电离法，该电离方法能够有效的电离大分子量化合物，然而，该方法未鉴定到12-O-没食子酰基葡萄糖等物质。除此之外，没食子酰基葡萄糖分子量差异很大，极性也不相同，不同分子量范围的没食子单宁可能溶于不同的提取溶剂，但是分离方法对单宁检测影响较大(TIAN F,LI B,JI B等.Antioxidant and antimicrobialactivities of consecutive extracts from Galla chinensis:The polarity affectsthe bioactivities[J].Food Chemistry,2011,113(1):173-179)，至今还未有统一的标准(例如提取溶剂)和方法对五倍子中的单宁成分进行提取和鉴定，以可以有效鉴定到较宽范围的单宁成分以及大分子量的单宁成分。
基于对文献的调研，本发明人选定了3种提取溶剂：丙酮、乙醇和水，尝试对五倍子中的单宁成分进行提取，并结合UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术(色谱和质谱条件如以下实施例中所述)进行鉴定。然而，在实验的过程中，与水浴(121℃)提取相比，乙醇和丙酮提取并未表现出独特的优势，并在3种五倍子水提物中鉴定到1至8-O-没食子酰基葡萄糖。鉴于水浴提取是一种有效、环保、快捷的提取方式，因此最终选择了水作为最终的提取溶剂，随后，本发明人还结合利用水浴提取(121℃)五倍子中的单宁成分和通过UPLC-ESI-MS/MS对单宁成分进行鉴定，但也只能鉴定到1至8-O-没食子酰基葡萄糖(具体请参见实施例中所述)，并且鉴定到的异构体的数量远不及UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定的方法。
发明人以水作为提取溶剂时，经过大量的试验和验证，惊讶的发现当使用超声辅助水浴(提取条件为65℃以上(优选为65～75℃)，提取30～80min(可选为每次提取约30～60min，进一步可选为每次提取约30min，不重复或重复2次)，超声功率可选为1200W-1800W，可选为1400W-1600W，进一步可选为1500W)的提取方法提取五倍子中的单宁成分，并结合UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术进行成分鉴定时，可以鉴定到1-O-没食子酰基葡萄糖至14-O-没食子酰基葡萄糖，并检测到大量异构体，表现出鉴定范围宽以及能够鉴定到分子量高于1500Da的没食子单宁的特点。
另外，分子量高的没食子单宁通常以双电荷[M-2H]2-形式被检测到，高分子量的没食子单宁难以电离可能是限制检测范围的主要原因，基质辅助激光解吸电离可电离一些较难电离的生物大分子，因此在现有技术中鉴定高分子量没食子单宁中具有一定的优势。然而，尽管基质辅助激光解析电离对高分子量没食子单宁的鉴定有一定的优势，但是阳离子化试剂(Cs+和Na+)的选择对检测质谱影响较大。因此，本发明最终确定以超声辅助水浴提取方法提取五倍子中的单宁成分和通过UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术进行单宁成分鉴定相结合的方式对五倍子中的单宁成分进行鉴定。
下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。
实施例中描述到的各种材料或试剂的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明材料或试剂来源的限制。事实上，所用到的材料或试剂的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的材料或试剂都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例中使用的材料和仪器包括：
1)试验材料
1.1)植物材料实施例中使用的植物材料为盐肤木叶翅上着生的角倍，于2020年8月采于湖北省宜昌市五峰县。角倍采摘后进行清洗，并清除角倍内蚜虫及杂质，液氮速冻后保存在-80℃超低温冰箱，另一部分角倍放于烘箱内，105℃杀青30min，之后80℃下烘干至恒重。
1.2)化学试剂乙醇、丙酮、甲酸(色谱纯)购自Sigma公司；乙腈购自Honeywell；质谱级超纯水(18.2MΩ·cm)由Milli-Q水净化系统制备。
1.3)标准品没食子酸甲酯(CAS：99-24-1)、鞣花酸(CAS：476-66-4)购自普西堂生物有限公司，单宁酸(CAS：1401-55-4)、PGG(CAS：14937-32-7)、没食子酸(CAS：149-91-7)购自索莱宝生物有限公司。
2)试验仪器
试验仪器为Agilent6560Q UHPLC–Q–TOF液质联用系统，美国Agilent公司；PoroshellSB–AqC18(2.1×100mm，2.7μm)色谱柱，美国Agilent公司；Xevo TQD UPLC-MS/MS联用仪(美国Waters公司)，KQ–500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；CPA224S电子天平，德国Sartorius公司；MLS–3750高压蒸汽灭菌锅，日本SANYO；Milli–Q水净化系统，德国MerckKGaA公司
实施例1：五倍子单宁成分的提取和鉴定
1.1、五倍子单宁成分的提取
该步骤中分别采用以下三种方式提取五倍子单宁成分：高压蒸汽灭菌锅(121℃)提取、超声辅助水浴(60℃)提取和超声辅助水浴(65℃)提取，具体包括以下操作：
1.1.1、使用灭菌后的研钵和研磨棒，对烘干后的角倍样品直接进行研磨，冻存的新鲜角倍样品使用液氮破碎，再研磨成细粉。研磨后的角倍粉末过60目筛进行均质，称取均质后的粉末0.100g，然后用少量超纯水冲洗至100mL的烧杯中，取50mL超纯水添加至100mL烧杯中，获得五倍子粉末浆料。
1.1.2、将烧杯中五倍子粉末浆料分别进行以下处理：(1)放入高压蒸汽灭菌锅(121℃)进行提取，提取时间为30min，重复提取2次，作为处理A；(2)使用超声(功率1500W)辅助水浴(60℃)提取30min，重复2次，作为处理B；(3)使用超声(功率1500W)辅助水浴(65℃)提取30min，重复2次，作为处理C；将使用三种处理方法提取好的提取液放置室温后，转移至100mL容量瓶，用10mL超纯水清洗烧杯残渣，转移至100mL容量中，使用超纯水定容，0.22μm滤膜过滤后获得五倍子单宁成分待测液，对应处理A、B、C分别获得的五倍子单宁成分待测液分别命名为待测液A、待测液B和待测液C。
1.2、标准品溶液的制备
称取PGG、鞣花酸、没食子酸甲酯、没食子酸和单宁酸，分别使用超纯水配制为1.00mg·mL-1的标准溶液，用来作对照品溶液，辅助化学物质的鉴定。
1.3、UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定
分别使用上述步骤1.1获得的待测液A、待测液B和待测液C作为进样液，并使用上述这步骤1.2获得的标准品溶液作为对照溶液，利用UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS按照说明书操作分别对待测液A、待测液B和待测液C中的单宁成分进行鉴定分析，其中色谱和质谱条件如下所示：
色谱条件：柱温35℃，进针体积5μL。流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)。流速：0.3mL/min。梯度洗脱程序为0～5min，98％A；5～8min，90％A；8～15min，75％A；15～40min，75％A；40～45min，10％A；保持5min，后运行4min停止。
质谱条件：离子源为ESI负离子源；扫描质量数范围为m/z100～3200；干燥气温度320℃；干燥气流速8L/min；鞘气温度350℃；鞘气流速12L/min；雾化器压力40psi；毛细管电压负离子3500V；去簇电压380V；采集模式为Full scan Auto MS/MS。
1.4、UPLC-ESI-MS/MS鉴定
分别使用上述步骤1.1获得的待测液A作为进样液，并使用上述这步骤1.2获得的标准品溶液作为对照溶液，利用UPLC-ESI-MS/MS按照说明书操作对待测液A中的单宁成分进行鉴定分析，其中色谱条件为：Waters Acquity C18色谱柱(2.1mm×50mm,1.7μm)，检测波长280nm，流速为0.3mL/min，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为0～2min，95％A；2～15min，95％A；15～35min，85％A；35～50min，50％A；50～60min，25％A；60～65min，1％A，进样体积为5μL。质谱条件：离子源模式为ESI负离子源，毛细管电压3.5kV；雾化器压力35psi，去溶剂气体N2，扫描范围m/z 100～1500。
1.5、数据处理
UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS或UPLC-ESI-MS/MS技术均能够提供测定物质的精确分子量和离子裂解碎片信息。在总离子流图的基础上，由提取离子流图和一级高分辨率质谱信息获得相应化合物的保留时间和精确的分子质量，使用软件对采集到的酚类化合物进行定性，产生化合物相应的分子式，对分子离子进行碰撞扫描，获得化合物的特征裂解碎片信息，结合标准品及文献报道数据进行鉴定，并推测化合物可能的裂解途径。使用ChemDraw20.0和Adobe Illustrator 2021软件进行化合物结构绘图分析，以上这些软件的使用和数据处理都在本领域普通技术人员所掌握的范围之内。
结果如图1所示，其中A、B和C幅分别表示由UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定的待测液A、B和C中的单宁成分的总离子流图。可以基于目标化合物的保留时间和高分辨率质谱数据，结合标准品及查阅文献来鉴定目标化合物。
(1)由UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定的待测液C中的单宁成分
如下表1所示，可见：编号为2的化合物的准分子离子峰为m/z331[M-H]-，确定该化合物的分子质量为332Da，经活化碰撞后产生m/z271[M-H-60]-、m/z169[M-H-162]-的裂解碎片，其中，母离子脱去一个特征性的葡萄糖苷(162Da)得到m/z169碎片离子，表明该物质结构包含一个没食子酸的取代基，结合文献数据推测该化合物为1-O-没食子酰基葡萄糖(ZHUT,LIU X,WANG X等.Profiling and analysis of multiple compounds in rhubarbdecoction after processing by wine steaming using UHPLC-Q-TOF-MS coupled withmultiple statistical strategies[J].Journal of Separation Science,2016,39(15):3081-3090)，1-O-没食子酰基葡萄糖的裂解规律主要体现在C2H2O(60Da)的特定中性损失、糖苷的损失。
编号为3、5、6、8、9、11、13、14的化合物的准分子离子峰为m/z 483[M-H]-，确定其分子质量为484Da，主要裂解离子为m/z313[M-H-170]-、m/z271[M-H-170-42]-、m/z211[M-H-170-42-60]-、m/z169[M-H-170-42-60-42]-、m/z151[M-H-170-42-60-42-18]-、m/z125.0243[M-H-170-42-60-42-18-44]-，m/z169的裂解离子表明该化合物存在没食子酸取代结构，m/z125的特征碎片离子是由没食子酸脱去一个羧基(44Da)形成的。该化合物的裂解规律主要体现在没食子酸(170Da)、羧基、H2O(18Da)、C2H2O(60Da)及42Da的中性损失，这种化合物鉴定为2-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为12、16、17、19、20的化合物的准分子离子峰为m/z635[M-H]-，确定其分子质量为636Da，该化合物典型碎片离子有m/z617[M-H-18]-、m/z483[M-H-152]-、m/z465[M-H-18-152]-、m/z331[M-H-152-152]-、m/z313[M-H-18-152-152]-及m/z271、m/z211、m/z169、m/z125等特征性裂解碎片，m/152的特征性损失是化合物脱去一个没食子酰基(152Da)形成的。该化合物的裂解规律主要体现在没食子酰基的连续损失及水分子的损失。这种化合物鉴定为3-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为18、21、22、23的化合物的准分子离子峰为m/z787，确定该化合物的分子质量为788Da，特征裂解碎片包含m/z635[M-H-152]-、m/z617[M-H-152-18]-、m/z465[M-H-152-18-152]-及特征性碎片离子m/z169、m/z125，将这种化合物鉴定为4-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为32的化合物的准分子离子峰为m/z469[M-2H]2-，确定其分子质量为940Da，二级质谱显示碎片离子为m/z787[M-H-152]-，m/z635[M-H-152-152]-、m/z617[M-H-152-152-18]-、m/z465[M-H-152-152-18-152]-及典型碎片离子m/z169，基于标准品的比对鉴定为PGG。m/z787碎片离子是由母离子脱去一个没食子酰基(152Da)形成，继续损失一个没食子酰基则生成m/z635碎片，再丢失一个水分子形成m/z617碎片，继续损失一个没食子酰基，则生成m/z465离子碎片，该碎片离子也可能是由m/z635丢失一个没食子酸形成的，如以下反应过程所示，将这种化合物鉴定为PGG。
Figure BDA0003387524230000091
编号为30的化合物的准分子离子为m/z1091[M-H]-，确定其分子质量为1092Da，该化合物的特征碎片离子为m/z939[M-H-152]-、表2和表3中还显示该化合物具备m/z787[M-H-152-152]-和m/z545[M-H-152-152-152]-碎片离子，该化合物在活化碰撞过程中连续失去没食子酰基，这种化合物被鉴定为6-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为33、34的化合物的准分子离子峰为m/z1243[M-H]-，确定其分子质量为1244Da，经高能活化碰撞产生了m/z1091[M-H-152]-、m/z939[M-H-152-152]-等典型的裂解离子，这种化合物被鉴定为7-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为36的化合物的准分子离子峰为m/z1395[M-H]-、确定其分子质量为1396Da。经活化碰撞产生了裂解碎片m/z1243[M-H-152]-、m/z1091[M-H-152-152]-、m/z621[M-2H-152]2-、m/z545[M-2H-152-152]2-。结合文献信息，这种化合物被鉴定为8-O-没食子酰基葡萄糖(TIAN F,LI B,JI B等.Identification and structure–activity relationship ofgallotannins separated from Galla chinensis[J].LWT-Food Science andTechnology,2009,42(7):1289-1295)。
编号为26的化合物的准分子离子峰为m/z773[M-2H]2-、编号为38的化合物的准分子离子峰为1547[M-H]-，确定两者的分子量为1548Da，二级质谱显示m/z773[M-2H]2-的碎片离子为m/z621[M-2H-152-152]2-、m/z545[M-2H-152-152-152]2-，m/z469[M-2H-152-152-152-152]2-、m/z393[M-2H-152-152-152-152-152]2-。1547[M-H]-的二级质谱中碎片离子为m/z1395[M-H-152]-、m/z1243[M-H-152-152]-、m/z1091[M-H-152-152-152]-、m/z697[M-2H-152]2-、m/z545[M-2H-152-152]2-、m/z301，将这种化合物鉴定为9-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为27的化合物的准分子离子峰为849[M-2H]2-，编号为39化合物的准分子离子峰为m/z1699[M-H]-、确定两者的分子量为1700Da，前者产生了m/z697、m/z621、m/z545、m/z469、m/z393及m/z169等特征性裂解离子，将这种化合物鉴定为10-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为35的化合物的准分子离子峰为m/z925[M-2H]2-，确定该物质的分子量为1852Da，产生的裂解离子为m/z1699[M-H-152]-、m/z1547[M-H-152-152]-、m/z1395[M-H-152-152-152]-、m/z1243[M-H-152-152-152-152]-，并产生了m/z849、m/z697、m/z545等典型双电荷离子，将这种化合物鉴定为11-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为40的化合物的准分子离子峰为m/z1001[M-2H]2-、确定其分子量为2004Da，并产生了m/z1699、m/z1395、m/z849、m/z301、m/z183等特征性裂解离子，将这种化合物鉴定为12-O-没食子酰基葡萄糖。
编号为41的化合物的准分子离子峰为m/z1077[M-2H]2-、确定其分子量为2156Da，化合物42的准分子离子峰为m/z1153[M-2H]2-、确定其分子量为2308Da，两者都产生了m/z925、m/z301、m/z183等特征性裂解离子，这两个化合物被鉴定为13-O-没食子酰基葡萄糖和14-O-没食子酰基葡萄糖(XIANG P,LIN Y,LIN P等.Effect of cationizationreagents on the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrum of Chinese gallotannins[J].Journal of Applied Polymer Science,2007,105(2):859-864)。
负离子模式下，还鉴定到其他类化合物共6个。其中如下表1所示，没食子酸、鞣花酸、没食子酸甲酯是与标准品品比对确定的。表1中编号为1、10的化合物的准分子离子峰为m/z469[M-H]-，并检测到碎片离子m/z451[M-H-18]-、m/z425[M-H-44]-、m/z407[M-H-44-18]-，该化合物的碎片离子主要依赖于水分子和羧基的损失，被鉴定为橡碗酸二内酯(IWAOKA Y,SUZUKI S,KATO N等.TrapaCharacterization and Identification ofBioactive Polyphenols in the Roxb.Pericarp Extract[J].Molecules(Basel,Switzerland),2021,26(19))。
编号为4的化合物被鉴定为没食子酸，该化合物在负离子模式下产生m/z169[M-H]-的准分子离子峰，羧基键能较弱，容易发生断裂，形成稳定性高的m/z125[M-H-44]-离子，之后，m/z125[M-H-44]-脱去一个水分子形成m/z107[M-H-44-18]-，再损失一个CO后形成m/z79[M-H-44-18-28]-。
编号为15的化合物的准分子离子峰为m/z 321、对应的分子量为322Da，产生特征裂解碎片m/z169、m/z125和m/z79，被鉴定为间双没食子酸。
编号为7、24、25、31、43的化合物的准分子离子峰为m/z301[M-H]-，化合物7的特征裂解离子有m/z169、m/z151、m/z123、m/z107、对照标准品鉴定为鞣花酸。除此之外，其他四个化合物的裂解离子为m/z283、m/z257、m/z229、m/z185、m/z145，也被鉴定为鞣花酸。
综上所述，在待测液C中共鉴定到14种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至14没食子酰基葡萄糖)，其中2-O-没食子酰基葡萄糖检测到8个异构体，如图2所示，示出了这8个异构体的二级质谱图，其中a、b、c、d、e、f、g、h分别对应表1中编号为3、5、6、8、9、11、13、14的化合物。3-O-没食子酰基葡萄糖检测到5个异构体，鞣花酸检测到5个异构体，4-O-没食子酰基葡萄糖检测到4个异构体，7-O-没食子酰基葡萄糖、9-O-没食子酰基葡萄糖、11-O-没食子酰基葡萄糖、12-O-没食子酰基葡萄糖分别检测到2个异构体。
表1：待测液C中鉴定到的单宁成分
Figure BDA0003387524230000111
Figure BDA0003387524230000121
注：*表示与标准品对照的化合物。
(2)由UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定的待测液B中的单宁成分
如下表2所示，可见在待测液B中共鉴定到14种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至14没食子酰基葡萄糖)。其中4-O-没食子酰基葡萄糖检测到4个同分异构体。编号为5的化合物对应的准分子离子峰为m/z289[M-H]-，特征裂解离子有m/z261[M-H-28]-、m/z169，鉴定该化合物为儿茶素。
表2：待测液B中鉴定到的单宁成分
Figure BDA0003387524230000122
Figure BDA0003387524230000131
注：*表示与标准品对照的化合物，“-”：未检测到或不存在。
(3)由UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定的待测液A中的单宁成分
如下表3所示，可见在待测液A中共鉴定到8种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至8没食子酰基葡萄糖)。其中1-O-没食子酰基葡萄糖检测到2个同分异构体，3-O-没食子酰基葡萄糖检测到5个同分异构体，4-O-没食子酰基葡萄糖检测到2个同分异构体，6-O-没食子酰基葡萄糖检测到2个同分异构体，7-O-没食子酰基葡萄糖检测到2个同分异构体。编号为6化合物的准分子离子为m/z183，通过标准品比较，鉴定为没食子酸甲酯。
表3：待测液A中鉴定到的单宁成分
Figure BDA0003387524230000132
Figure BDA0003387524230000141
注：*表示与标准品对照的化合物，“-”：未检测到或不存在。
(4)由UPLC-ESI-MS/MS鉴定的待测液A中的单宁成分
如下表4所示，可见在待测液A中共鉴定到8种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至8没食子酰基葡萄糖)，其中，仅4-O-没食子酰基葡萄糖检测到4个异构体成分。
表4：待测液A中鉴定到的单宁成分
Figure BDA0003387524230000142
注：*表示与标准品对照的化合物，“-”：未检测到或不存在。
由以上表1至表3记载的结果可知，虽然处理A、B和C均能够使五倍子中的单宁成分溶于待测液中，但是相对于处理A的高温(121℃)处理方法，处理B和C的超声辅助水浴提取方法更加适合于提取五倍子中的单宁成分，可以鉴定到14种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至14没食子酰基葡萄糖)，即可以鉴定到高分子量的单宁成分，而处理A提取方法获得的待测液A中只能鉴定到8种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至8没食子酰基葡萄糖)，没有鉴定到更高分子量的单宁成分。在处理B和C中，同样采用超声辅助水浴的提取方法，不同之处仅在于提取的温度不同(处理B的提取温度为60℃，处理C的提取温度为65℃)，然而由上表1和表2记载的结果，明显可见，从待测液C中鉴定到的单宁成分的异构体数量明显高于从待测液B中鉴定到的单宁成分的异构体数量，表明处理3的提取方法更加适合本发明鉴定五倍子中的单宁成分。
由以上表3和表4的结果可知，同样以待测液A作为鉴定的进液样品，但是采用不同的鉴定方法，其中表3中采用UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定技术，而表4中采用UPLC-ESI-MS/MS鉴定技术，虽然两种鉴定技术都是本领域所熟知的用于鉴定物质成分的方法，但是在本申请中用于鉴定五倍子中的单宁成分时，使用同样的高温五倍子提取溶液，但UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术较UPLC-ESI-MS/MS技术可以鉴定到更多的没食子单宁同分异构体，即相比较于UPLC-ESI-MS/MS技术用于鉴定五倍子单宁成分，UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术表现出更加优异的鉴定效果。
综上所述，采用UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS技术结合超声辅助水浴提取五倍子中的单宁成分的方法，更加适合用于对五倍子中的单宁成分进行鉴定，不仅能够鉴定到14种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至14没食子酰基葡萄糖)，即可以鉴定到高分子量的单宁成分，而且还可以鉴定到大量的同分异构体成分，表现出更加优异的鉴定效果。
实施例2：五倍子单宁成分的提取温度选择
该实施例按照实施例1中的超声辅助水浴的方法对五倍子中的单宁成分进行提取，不同之处仅在于在该实施例中设置系列温度梯度(50℃、55℃、70℃、75℃)，如下表5所示。随后按照实施例1中的UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定技术对不同温度处理组的单宁成分提取液进行鉴定。
表5：超声辅助水浴提取五倍子中的单宁成分
组别 提取温度(℃) 超声功率(W) 提取时间(min)
A 50 1500 30
B 55 1500 30
C 70 1500 30
D 75 1500 30
结果表明：通过UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定技术在处理组A、B、C、D获得的单宁成分提取液中均鉴定到了14种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至14没食子酰基葡萄糖)。然而在处理组A和B中针对14种没食子酰基葡萄糖鉴定到的异构体的数量明显低于在处理组C和D中针对14种没食子酰基葡萄糖鉴定到的异构体的数量，并明显低于上述实施例1中表1中所示的异构体的数量，并且13/14-O没食子酰基葡萄糖的响应强度均较低，表明超声辅助水浴的温度也是影响最终的单宁成分鉴定结果的主要影响因素之一，在本发明提供的方法中，65℃以上温度条件下的超声辅助水浴提取效果较佳，可选为65～75℃。
综上所述，本发明方法中超声辅助水浴提取能够快速有效提取五倍子中单宁成分，并结合利用UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS系统建立了一种广谱检测五倍子中单宁成分的方法，其中可以鉴定到14种没食子酰基葡萄糖(1-O-没食子酰基葡萄糖至14没食子酰基葡萄糖)，并且还鉴定到了大量的同分异构体成分，可以为五倍子中活性成分的研究与开发提供科学数据。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS的五倍子单宁成分的鉴定方法，其包括以下步骤：
1)五倍子单宁成分的提取；
2)标准品溶液的制备；和
3)UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定分析；
其中在步骤1)中，通过超声辅助水浴的方式对五倍子单宁成分进行提取，获得五倍子单宁成分待测液；其中超声辅助水浴提取的温度为65℃以上，提取的时间为30～80min，超声功率为1200～1800W。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其中超声辅助水浴提取的温度为65～75℃，提取时间为30～60min，超声功率为1400～1600W。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，步骤3)中，所述UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS鉴定分析的条件包括：
色谱条件：柱温35±1℃，进针体积4-6μL；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速：0.25-0.35mL/min；梯度洗脱程序为0～5min，98％A；5～8min，90％A；8～15min，75％A；15～40min，75％A；40～45min，10％A；保持4-6min，后运行3-5min停止；
质谱条件：离子源为ESI负离子源；扫描质量数范围为m/z100～3200；干燥气温度315-325℃；干燥气流速7-9L/min；鞘气温度345-355℃；鞘气流速11-13L/min；雾化器压力38-42psi；负离子模式下，毛细管电压3.5kV；去簇电压380V；采集模式为Full scan Auto MS/MS。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的鉴定方法，步骤2)中所述标准品溶液的制备的具体操作包括：称取PGG、鞣花酸、没食子酸甲酯、没食子酸和单宁酸，分别使用超纯水配制为1.00mg·mL-1的标准品溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的鉴定方法，步骤1)中对五倍子单宁成分进行提取的具体操作包括：
11)将五倍子样品研磨，研磨后的五倍子粉末过筛均质，称取均质后的粉末分散于纯水中，获得五倍子粉末浆液；
12)将步骤11)获得的五倍子粉末浆液置于超声辅助水浴中进行提取，经提取后的浆液经0.22μm滤膜过滤后，收集滤液，获得五倍子单宁成分待测液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的鉴定方法，所述五倍子为角倍，鉴定到的单宁成分为1-O-没食子酰基葡萄糖至14-O-没食子酰基葡萄糖。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140051113A1 (en) * 2012-05-01 2014-02-20 Oxoid Limited Apparatus and methods for microbiological analysis
CN105418693A (zh) * 2015-10-31 2016-03-23 中北大学 一种核桃壳中单宁的提取方法及其所得单宁的应用
CN110455964A (zh) * 2019-10-14 2019-11-15 江西中医药大学 裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140051113A1 (en) * 2012-05-01 2014-02-20 Oxoid Limited Apparatus and methods for microbiological analysis
CN105418693A (zh) * 2015-10-31 2016-03-23 中北大学 一种核桃壳中单宁的提取方法及其所得单宁的应用
CN110455964A (zh) * 2019-10-14 2019-11-15 江西中医药大学 裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
伍云卿 等: "果蔬中单宁测定技术研究", 中国农学通报, vol. 31, no. 11, pages 166 - 169 *
何玉婷: "紫金锭提取物的UHPLC/QTOF-MS分析", 海峡药学, vol. 30, no. 7, pages 65 - 67 *
余先纯;孙德林;李湘苏;: "超声波辅助提取柿子树叶单宁的研究", 化学研究与应用, no. 03 *
余先纯;李湘苏;龚铮午;: "石榴皮单宁的超声波-半仿生法提取及抗氧化性分析", 化学研究与应用, no. 05 *
周本宏;张红盼;郭咸希;姜姗;: "鞣花鞣质类成分研究进展", 中国药师, no. 10 *
朱继孝;文乐;魏春华;慕泽泾;钟国跃;曾金祥;: "无尾果黄酮类化学成分的UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析", 中医药通报, no. 04 *
李苇舟;明建;肖星凝;石芳;李谣;: "飞行时间质谱技术及其在植物多酚鉴定中的应用", 食品与机械, no. 04 *
杨秋明;茹毅;翁惠芬;肖琼;肖安风;张永辉;: "五倍子单宁酸同步提取-酶解工艺的研究", 食品科技, no. 07 *
陈方超;高守红;王志鹏;杨宏;顺庆生;宋新华;徐一新;: "基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定藤梨根的化学成分", 中国药房, no. 14 *
马尚智;秦惠玉;龙飞;于玮;陈海君;欧阳辉;陈文;韩博;: "没食子多酚类化合物的鉴定及其在UPLC-MS/MS中的裂解规律研究", 中草药, no. 22 *

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