CN114195882A - Tcr及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及T细胞受体(TCR)及其用途。具体涉及一种分离或纯化的TCR或其功能性变体，其对与自身脂质(优选(mLPA)或其衍生物)相关的CD1c分子具有抗原特异性，涉及相关多肽，蛋白质，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群，抗体和药物组合物。本发明还涉及所述TCR和相关产品的用途，特别是用于治疗和/或预防血液病症。

Description

TCR及其用途
技术领域
本发明涉及对与自身脂质(优选(mLPA)或其衍生物)相关的CD1c分子具有抗原特异性的TCR或其功能性变体，涉及相关多肽，蛋白质，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群，抗体和药物组合物。本发明还涉及所述TCR和相关产品的用途，特别是用于治疗和/或预防血液病症。
发明背景
免疫系统通过感测致癌过程中产生的抗原差异在控制恶性细胞的生长中起关键作用。肿瘤特异性T细胞和抗原在癌症免疫治疗中得到积极利用，这种治疗可以达到治疗效果并且副作用很小。识别由CD1分子呈递的脂质抗原的T细胞的发现为基础和翻译免疫学开辟了新的视角。四种CD1a-d同种型是非多态性抗原呈递分子，其沿着不同的细胞内运输途径来调查内吞途径并交叉多种脂质Ag。CD1限制性T细胞的特征在于与MHC限制性T细胞相比的显著的自身反应性以及直接识别CD1表达细胞。最近发明人表明，CD1自反应T细胞占循环T细胞库的相当部分。他们假设这种CD1“自反应”T细胞响应可能参与肿瘤免疫监视，其中自身抗原是免疫响应的目标。发明人已经发现急性白血病母细胞表达不同的CD1同种型并且具有能够以CD1依赖性方式识别白血病细胞的分离的T细胞克隆，这表明癌症起源的脂质抗原可以是特异性响应的靶标。此外，他们已经分离并分子表征了白血病衍生的脂质抗原，该抗原被受限于CD1c的自身反应性T细胞克隆所识别，CD1c是由急性髓性白血病(AML)和B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)频繁表达的CD1同种型。由于CD1分子基本上仅在成熟白细胞上表达，因此使系统性GVHD的风险最小化，从而利用CD1限制性T细胞对自身脂质抗原的响应是白血病的过继免疫疗法的有力选择。此外，它们不是多态的，因此相同的CD1同种型将在所有个体中呈递相同的脂质抗原。考虑到在造血干细胞移植背景下的过继免疫治疗策略(成功治疗血液恶性肿瘤)，这具有进一步的优点，因为相同的异体CD1自反应T细胞可以用于治疗不同患者的白血病。
本发明人进一步显示，在免疫缺陷小鼠模型中，mLPA特异性T细胞限制体内白血病进展，表明利用这些T细胞进行CD1c+急性白血病的过继免疫治疗的可能性。为了产生大量用于过继免疫疗法的肿瘤反应性T细胞，有可能产生表达重组抗原特异性T细胞受体(TCR)的T淋巴细胞。TCR以两种形式存在，如αβ异二聚体或γδ异二聚体。这四条链显示由“免疫球蛋白V区样”(V)N端结构域连接到“免疫球蛋白C区样”(C)第二结构域所组成的特征性结构。
每个这些结构域都有一个特征性域内二硫桥。
V区由V区段与J或D区段重排形成，并且是赋予T细胞抗原特异性的分子的一部分。CD1c自反应性TCR也由α链和β链形成，每个α链和β链由V区组成，它们共同赋予对CD1c分子和C区结合的脂质抗原的特异性。有可能将由CD1c自反应性T细胞克隆表达的TCR进行克隆并转移到多克隆T细胞中以将它们重定向至针对白血病细胞。
每个TCR肽含有可变互补决定区(CDR)以及框架区(FR)和恒定区。αβT细胞的序列多样性很大程度上取决于a和β链可变结构域的第三互补决定区(CDR3)环的氨基酸序列，所述多样性是分别位于β链基因座中的可变(Vb)、多样性(Db)和连接(Jb)基因区段之间以及α链基因座中的类似Va和Ja基因区段之间的重组的结果。在TCRα和β链基因座中存在多个这样的基因区段，这允许编码大量不同的CDR3序列。在TCR基因重排过程中，通过在Vb-Db，Db-Jb和Va-Ja连接处独立添加和删除核苷酸，CDR3序列多样性进一步增加。在这方面，免疫活性反映在TCR的多样性中。
发明内容
本发明人发现CD1c自反应性T细胞识别新型的自身脂质，鉴定为甲基溶血磷脂酸，其积累在白血病细胞中。原发性急性髓性和B细胞急性白血病母细胞表达CD1分子。甲基溶血磷脂酸特异性T细胞有效地杀伤CD1c+急性白血病细胞，很少识别未转化的表达CD1c的细胞，并且保护免疫缺陷型小鼠免于CD1c+人类白血病细胞。白血病细胞中积累的免疫原性自体脂质抗原的鉴定以及脂质特异性T细胞在体内观察到的白血病控制为白血病免疫监视和可能的免疫治疗提供了新的概念框架。
在本发明中，从健康供体和白血病患者中分离出不同的CD1c自反应性T细胞克隆，其选择性识别新型自身脂质肿瘤相关抗原(TAA)，所述抗原代表新型免疫疗法的潜在靶标。具体地，TAA是甲基溶血磷脂酸(mLPA)，C16-甲基溶血磷脂酸(C16-mLPA)或C18-甲基溶血磷脂酸(C18-mLPA)，属于一类新型脂质，仅当由CD1c+细胞呈递时其可作为T细胞-刺激抗原。已经从五个独立的CDlc自反应T细胞克隆中克隆了TCR。TCR可用于过继免疫治疗，细胞治疗，治疗白血病，预防造血干细胞移植(HSCT)后的白血病复发(目前无可用治疗)和改善HSCT疗效。
然后，本发明提供了分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其包含：
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRa1)氨基酸序列：SEQ.ID NO:25,31,37,43和49，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRa2)氨基酸序列：SEQ.ID NO:26,32,38,44和50，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRa3)氨基酸序列：SEQ.ID NO:27,33,39,45和51，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRb1)氨基酸序列：SEQ.ID NO:28,34,40,46和52，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRb2)氨基酸序列：SEQ.ID NO:29,35,41,47和53，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRb3)氨基酸序列：SEQ.ID NO:30,36,42,48和54。
优选地，分离或纯化的T细胞受体(TCR)包含：
-与SEQ ID NO：25具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：26具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：27具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：28具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：30具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：31具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：32具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：33具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：34具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：35具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：36具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：37具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：38具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：39具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：40具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：41具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：42具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：43具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：44具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：45具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：46具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：47具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：48具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：49具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：50具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：51具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：52具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：53具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：54具有至少80％相同性的氨基酸序列。
优选地，分离或纯化的T细胞受体(TCR)包含：
-与SEQ ID NO：25具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：26具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：27具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：28具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：30具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：31具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：32具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：33具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：34具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：35具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：36具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：37具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：38具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：39具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：40具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：41具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：42具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：43具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：44具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：45具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：46具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：47具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：48具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：49具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：50具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：51具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：52具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：53具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：54具有至少80％相同性的氨基酸序列。
优选地，分离或纯化的T细胞受体(TCR)包含：
-SEQ ID NO:25,和SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28,和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，或
-SEQ ID NO:31,和SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34,和SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，或
-SEQ ID NO:37,和SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40,和SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，或
-SEQ ID NO:43,和SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46,和SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，或
-SEQ ID NO:49,和SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52,和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54。
还优选分离或纯化的TCR包含(a)与选自SEQ ID NO：1、3、5、7或9的序列具有至少80％相同性的氨基酸序列，和(b)与选自SEQ ID NO：2、4、6、8或10的序列具有至少80％相同性的氨基酸序列。
还优选分离或纯化的TCR或功能性变体包含与SEQ ID No.1具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.2具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.3具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.4具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.5具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.6具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.7具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.8具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.9具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.10具有至少80％相同性的氨基酸序列。
其优选包含：
-SEQ ID NO:1,和SEQ ID NO:2或
-SEQ ID NO:3,和SEQ ID NO:4或
-SEQ ID NO:5,和SEQ ID NO:6或
-SEQ ID NO:7,和SEQ ID NO:8或
-SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
优选地，分离或纯化的TCR包含恒定区的鼠、人或人源化氨基酸序列。这意味着任何上面指出的序列都可以被人源化。本发明的TCR可以包含鼠序列和人序列，仅包含人序列或仅包含鼠序列，或者包含人或鼠序列与人源化序列的组合。
优选地，所述分离或纯化的TCR包含与SEQ ID No.11具有至少80％相同性的氨基酸序列或与SEQ ID No.12具有至少80％相同性的氨基酸序列，其优选包含与SEQ ID No.13具有至少80％相同性的氨基酸序列或与SEQ ID No.14具有至少80％相同性的氨基酸序列。
优选地，分离或纯化的TCR为多聚体形式。优选地，它对与自身脂质相关的CD1c分子具有特异性。优选地，自身脂质是甲基溶血磷脂酸或其衍生物。甲基溶血磷脂酸优选自甲基溶血磷脂酸(mLPA)，C16-甲基溶血磷脂酸(C16-mLPA)或C18-甲基溶血磷脂酸(C18-mLPA)或其衍生物。
本发明还提供了包含编码如上定义的TCR的核苷酸序列的分离或纯化的核酸。优选地，核苷酸序列是密码子优化的。优选地，核苷酸序列包含a)与选自SEQ ID NO：15、17、19、21或23的序列具有至少80％相同性的核苷酸序列，和b)与选自SEQ ID NO：16、18、20、22或24的序列具有至少80％相同性的核苷酸序列。
本发明还提供了包含如上定义的本发明的核酸的重组表达载体。
本发明还提供了包含本发明重组表达载体的分离的宿主细胞，优选宿主细胞是T细胞，优选它是哺乳动物T细胞，优选人T细胞。
本发明还提供了包含如上所定义的TCR，核酸，重组表达载体，宿主细胞和药学上可接受的运载体的药物组合物。
优选地，组合物还包含甲基溶血磷脂酸(mLPA)。
本发明还提供了如上定义的本发明的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，核酸，重组表达载体，宿主细胞或药物组合物，用于治疗和/或预防血液病症。
优选地，血液病症的特征在于来源于造血前体的未成熟和异常细胞的血液和骨髓积聚。
优选地，血液病症为急性白血病，优选原发性急性髓性白血病或B细胞急性白血病。
优选地，用于如上所述用途的分离或纯化的T细胞受体(TCR)、核酸、重组表达载体、宿主细胞或药物组合物还包含给予试剂或治疗处理，所述试剂优选是甲基溶血磷脂酸(mLPA)或优选治疗处理是造血干细胞移植(HSCT)或化疗处理，所述化疗处理优选自：天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱，氮杂胞苷。
本发明还提供如上所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，核酸，重组表达载体，宿主细胞或药物组合物，其用于在造血干细胞移植(HSCT)后防止血液病症复发的方法中。优选地，该方法还包括给予mLPA。
本发明还提供如上所述用于诊断血液病症的方法中的用途的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，优选所述血液病症的特征在于来自造血前体的未成熟和异常细胞的血液和骨髓积聚，优选所述血液病症为急性白血病，优选原发性急性髓性白血病或B细胞急性白血病。
优选地，该方法包括加入甲基溶血磷脂酸(mLPA)。
优选地，TCR为可溶性和/或多聚体形式。
本发明还提供了用于产生如上所述的宿主细胞的方法，其包括用如上所述的TCR或如上所述的核酸或如上所述的载体转导所述宿主细胞的步骤。
优选地，所述方法进一步包括扩增所述宿主细胞，优选在甲基溶血磷脂酸(mLPA)存在下扩增所述宿主细胞，例如用抗CD3和抗CD28珠在人重组细胞因子如IL-2和/或IL-7和/或IL-15存在下扩增所述宿主细胞。
本发明还涉及如上定义的TCR的功能性变体。
本发明进一步提供了相关的多肽和蛋白质，以及相关的核酸，重组表达载体，宿主细胞和细胞群体。本发明进一步提供了抗体或其抗原结合部分，以及涉及本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)的药物组合物。
本发明进一步提供了检测白血病细胞的方法和治疗或预防哺乳动物血液病症的方法。本发明的检测白血病细胞的方法包括(i)使包含白血病细胞的样品与本文所述的任何本发明TCR(包括其功能部分和功能性变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群、或抗体或其抗原结合部分接触，由此形成复合物，和(ii)检测该复合物，其中复合物的检测指示白血病细胞的存在。
本发明的治疗或预防哺乳动物血液病症的方法包括给予哺乳动物本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能性变体)、多肽或蛋白质，包含编码本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能性变体)、多肽、蛋白质的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，或者包含编码本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能性变体)、多肽或蛋白质的重组载体的任何宿主细胞或宿主细胞群，其量可有效治疗或预防哺乳动物的血液病症。
本发明提供了分离或纯化的T细胞受体(TCR)及其功能性部分和功能性变体，其对与CD1c分子相关的mLPA具有抗原特异性。
在本发明的一个实施方案中，分离或纯化的TCR对mLPA具有抗原特异性。mLPA是一种脂质肿瘤相关抗原(TAA)，只有经CDlc+细胞呈递时才能充当T细胞刺激性抗原。
可溶形式的TCR是其中恒定区的跨膜和胞内序列被消除以允许单体分泌的TCR分子。TCR可能是重组的。
当多个可溶性TCR单体分子(优选重组)通过它们的截短恒定区结合至确定的基质(例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，蛋白多糖，纳米颗粒)并且通过抗原结合可变区段自由地结合其靶标(mLPA结合CD1c)时，TCR处于多聚体形式。
本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)提供了许多优点，包括用于过继性细胞转移或治疗时。例如，通过靶向在CD1c+细胞背景下呈递的mLPA，本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)可以治疗患有由本发明的TCR识别的CD1c+白血病细胞的患者。CDlc经常由AML和B-ALL表达。因此，本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)有利地大大扩展了可治疗的患者群体。另外，不受特定理论的约束，据信由于mLPA由特定细胞表达，本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)有利地提供了特异性破坏这些细胞的能力，并且因此治疗或预防白血病的能力。另外，不受特定理论的约束，据信由于实质(parenchimatous)器官不表达CDlc表达和/或因为mLPA是主要在肿瘤细胞中表达的白血病抗原，所以本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)有利地靶向破坏癌细胞，同时最小化或消除正常非癌细胞的破坏，由此减少(例如通过最小化或消除)毒性并使移植物抗宿主病(GVHD)最小化。
如本文所用的短语“抗原特异性”意指TCR可以以高亲合力特异性结合并免疫识别与CD1c组合的mLPA。例如，如果表达TCR的T细胞与表达CD1c并含有天然mLPA的白血病细胞一起培养时或与表达CD1c并加载有合成的mLPA的哺乳动物细胞一起培养时，该T细胞表达定义的膜标记物(例如CD69，HLA-DR，CD137)，则可认为TCR对mLPA具有“抗原特异性”。或者或此外，如果表达TCR的T细胞与表达CD1c并含有天然mLPA的白血病细胞一起培养时或与表达CD1c并加载有合成mLPA的哺乳动物细胞一起培养时，该T细胞产生细胞因子(例如IL-2，IFNγ，IL-4)，则可认为TCR对mLPA具有“抗原特异性”。或者或此外，如果表达TCR的T细胞杀伤表达CD1c并含有天然mLPA的白血病细胞或表达CD1c并加载有合成mLPA的哺乳动物细胞，则可认为TCR对mLPA具有“抗原特异性”。
本发明的TCR(包括其功能部分和功能性变体)能够以人CD1c+限制性方式识别mLPA。如本文所用，“CD1c+限制性方式”意指TCR在CDlc+靶细胞的情况中结合mLPA后引发免疫响应。
本发明提供了包含两种多肽(即多肽链)的TCR，例如TCR的α(a或α)链，TCR的β链，TCR的γ链，TCR的δ链或其组合。本发明的TCR的多肽可以包含任何氨基酸序列，条件是在CD1c限制性T细胞的情况下，TCR对mLPA具有抗原特异性。
在本发明的一个实施方案中，TCR包含两条多肽链，每条多肽链包含含有TCR的互补决定区(CDR)CDR1、CDR2和CDR3的可变区。在本发明的一个实施方案中，TCR包含下述TCRα序列中加下划线的包含CDR1(α链的CDR1)，CDR2(α链的CDR2)和CDR3(α链的CDR3)CDR序列的第一多肽链以及包含CDR1(β链的CDR1)，CDR2(β链的CDR2)和CDR3(β链的CDR3)的第二多肽链。CDR序列在下面的TCRb序列中加下划线。就此而言，本发明的TCR可以包含选自SEQ IDNO：3至10中的任何一个或多个的任何一个或多个氨基酸序列。
或者或此外，TCR可以包含含有上述CDR的TCR的可变区的氨基酸序列。
可选地或另外地，TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明TCR的α链和β链中的每一个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，a链包含如上所述的α链的可变区。这种类型的α链可以与TCR的任何β链配对。优选地，本发明的TCR的β链包含如上所述的β链的可变区。
包括在本发明范围内的是本文所述的本发明TCR的功能性变体。如本文所用术语“功能性变体”指与亲本TCR、多肽或蛋白具有大量或显著序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白，其中功能性变体保留作为其变体形式的TCR、多肽或蛋白的生物活性。功能性变体包括例如以与亲本TCR、多肽或蛋白质相似的程度、相同的程度或更高程度保留特异性结合mLPA(亲本TCR对其具有抗原特异性或者亲本多肽或蛋白质对其特异性结合)的能力的本文所述的TCR、多肽或蛋白质(亲本TCR、多肽或蛋白质)的那些变体。关于亲本TCR、多肽或蛋白质，功能性变体的氨基酸序列与亲本TCR、多肽或蛋白质具有例如至少约30％，50％，75％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99％或更多的相同性。
功能性变体可以例如包含具有至少一个保守性氨基酸取代的亲本TCR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中具有某种物理和/或化学性质的一个氨基酸被替换成具有相同化学或物理性质的另一个氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是被另一酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)取代的酸性氨基酸，被另一具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala，Gly，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Val等)取代具有非极性侧链的氨基酸，被另一碱性氨基酸(Lys，Arg等)取代的碱性氨基酸，被另一个具有极性侧链的氨基酸(Asn，Cys，Gln，Ser，Thr，Tyr等)取代的具有极性侧链的氨基酸等。
或者或另外，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本TCR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。在这样的情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能性变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能性变体的生物活性，从而相较于亲本TCR、多肽或蛋白质，功能性变体的生物活性增加。
与本发明的TCR类似，本文所述的功能性变体包含两条多肽链，每条多肽链包含含有TCR的CDR1，CDR2和CDR3的可变区。在下面报道的序列中优选的CDR序列用下划线表示。优选的CDR可以包含此类序列或其功能片段。就此而言，本发明的TCR的功能性变体可以包含选自SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列。
或者或此外，TCR的功能性变体可以包含TCR可变区的经取代的氨基酸序列，所述TCR可变区包含下文所述的CDR组。
或者或此外，TCR的功能性变体可以包含经取代的TCRα链和TCRβ链。本发明TCR的α链和β链中的每一个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，取代的α链包含如上所述的α链的经取代的可变区。本发明的这种类型的经取代的α链可以与TCR的任何β链配对。优选地，本发明的TCR的β链包含如下所述的β链的可变区。在本发明的一个实施方案中，TCR(或其功能性变体)可以包含人恒定区。在这方面，TCR(或其功能性变体)可以包含人恒定区，其包含SEQ ID NO：13(α链的人恒定区)，SEQ ID NO：14(β链的人恒定区)，SEQ ID NO：13和14。优选地，TCR(或其功能性变体)包含SEQ ID NO：13和14两者。
在本发明的另一个实施方案中，TCR(或其功能性变体)可以包含人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体)。在这方面，TCR(或其功能性变体)可以包含小鼠恒定区，其包含SEQ IDNO：11(α链的小鼠恒定区)，SEQ ID NO：12(β链的小鼠恒定区)，或SEQ ID NO：11和12。优选地，TCR(或其功能性变体)包含SEQ ID NO：11和12两者。
本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含上述任何CDR。就此而言，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含选自SEQ IDNO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
或者或此外，人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含上述任何可变区。就此而言，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含α链的经取代的可变区的经取代的氨基酸序列，β链的可变区，β链的经取代的可变区的经取代的氨基酸序列，α链的可变区。或者或此外，人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可包含TCR(或其功能性变体或功能部分)的α链和TCR(或其功能性变体或功能部分)的β链。本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)的α链和β链中的每一个可以独立地包含任何氨基酸序列。优选地，α链包含如上所述的α链的可变区。就此而言，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含下文报道的氨基酸序列。本发明的此类型的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以与TCR的任何β链(或其功能性变体或功能部分)配对。优选地，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)的β链包含如上所述的β链的可变区。就此而言，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含下文报道的氨基酸序列。因此，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能性变体或功能部分)可以包含SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列或其组合。
本发明还提供了包含本文所述的任何TCR或功能性变体的功能部分的多肽。如本文所用的术语“多肽”包括寡肽，并且是指通过一个或多个肽键连接的单链氨基酸。
关于本发明的多肽，功能部分可以是包含其作为一部分的TCR(或其功能性变体)的连续氨基酸的任何部分，条件是该功能部分特异性结合与CDlc相关的mLPA。当涉及TCR(或其功能性变体)时使用的术语“功能部分”是指本发明的TCR(或其功能性变体)的任何部分或片段，所述部分或片段保留包含其作为一部分的TCR(或其功能性变体)(亲本TCR或其亲本功能性变体)的生物学活性。功能部分涵盖例如以与亲本TCR(或其功能性变体)达到相似程度、相同程度或更高程度保留与mLPA特异性结合(例如以CD1c限制性方式)或检测、治疗或预防血液病的能力的TCR(或其功能性变体)的那些部分。关于亲本TCR(或其功能性变体)，功能部分可以包含亲本TCR(或其功能性变体)的例如约10％，25％，30％，50％，68％，80％，90％，95％或更多。功能部分可在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含其他氨基酸，所述其他氨基酸未在亲本TCR或其功能性变体的氨基酸序列中发现。有利的是，其他氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如特异性结合至与CDlc关联的mLPA；和/或具有检测血液病症、治疗或预防血液病症等的能力。更理想的是，与亲本TCR或其功能性变体的生物学活性相比，其他氨基酸增强生物学活性。
该多肽可以包含本发明的TCR或其功能性变体的α链和β链中任一个或两个的功能部分，如包含本发明的TCR或其功能性变体的α链和/或β链的可变区的一个或多个CDR1、CDR2和CDR3的功能部分。在这方面，多肽可以包含功能部分，所述功能部分包含α链的CDR1，α链的CDR2，α链的CDR3，β链的CDR1，β链的CDR2和β链的CDR3的氨基酸序列或其组合。或者或此外，本发明多肽可以包含例如本发明TCR或其功能性变体的可变区，其包含上述CDR区的组合。
或者或此外，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR之一或其功能性变体的a或β链的全长。在这方面，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列。或者，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能性变体的α链和β链。
本发明还提供了包含至少一种本文所述多肽的蛋白质。“蛋白质”是指包含一个或多个多肽链的分子。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质可以包含含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10的氨基酸序列的第二多肽链。
例如，本发明的蛋白质可以包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第二多肽链。在这种情况下，本发明的蛋白质可以是TCR。或者，如果例如蛋白质包含含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的单一多肽链，或者如果蛋白质的第一和/或第二多肽链还包含其他氨基酸序列，例如编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，那么本发明的蛋白质可以是融合蛋白。就此而言，本发明还提供了融合蛋白，其包含至少一种本文所述的本发明多肽以及至少一种其他多肽。其他多肽可以作为融合蛋白的单独多肽存在，或者可以作为与本文所述的本发明多肽之一框内(串联)表达的多肽一起存在。其他多肽可以编码任何肽或蛋白质分子或其部分，包括但不限于免疫球蛋白，TCR恒定γ，TCR恒定δ，CD3，CD28，CD137，CD4，CD8，MHC分子，CD1分子，例如CD1a，CD1b，CD1c，CD1d等。
融合蛋白可以包含本发明多肽的一个或多个拷贝和/或其他多肽的一个或多个拷贝。例如，融合蛋白可以包含本发明多肽和/或其他多肽的1,2,3,4,5或更多拷贝。制备融合蛋白的合适方法是本领域已知的，并且包括例如重组方法。例如参见Choi等,Mol.Biotechnol.31:193-202(2005)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR(及其功能部分和功能性变体)，多肽和蛋白质可以表达为包含连接α链和β链的接头肽的单一蛋白质。就此而言，包含SEQ ID NO：1-10的本发明的TCR(和其功能性变体及其功能部分)、多肽和蛋白可以进一步包含接头肽。接头肽可有利地促进宿主细胞中重组TCR(包括其功能部分及其功能性变体)，多肽和/或蛋白质的表达。在通过宿主细胞表达包含接头肽的构建体后，接头肽可被切割，得到单独的α链和β链。
本发明的蛋白质可以是包含本文所述的至少一种本发明多肽的重组抗体。如本文所用，“重组抗体”是指重组(例如基因工程)蛋白质，其包含至少一种本发明多肽和抗体的多肽链或其部分。抗体的多肽或其部分可以是抗体的重链，轻链，重链或轻链的可变区或恒定区，单链可变片段(scFv)或Fc，Fab或F(ab)2'片段等。抗体的多肽链或其部分可以作为重组抗体的单独多肽存在。
或者，抗体的多肽链或其部分可以以与本发明的多肽框内(串联)表达的多肽的形式存在。抗体的多肽或其部分可以是任何抗体或任何抗体片段的多肽，包括本文所述的任何抗体和抗体片段。
TCR(或其功能性变体)、多肽或蛋白质可以基本上由一种或多种本文所述的特定氨基酸序列组成，使得TCR(或其功能性变体)、多肽或蛋白质的其他组分，例如其它氨基酸不实质上改变TCR(或其功能性变体)、多肽或蛋白质的生物学活性。在这方面，本发明的TCR(或其功能性变体)、多肽或蛋白质可以例如基本上由SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列组成。
本发明的TCR、多肽和蛋白质(包括其功能性变体)可以具有任何长度，即可以包含任意数量的氨基酸，条件是TCR、多肽或蛋白质(或其功能性变体)保留其生物学活性，例如与富含mLPA的CD1c表达细胞特异性结合；检测哺乳动物的血液病症；或治疗或预防哺乳动物中的癌症的能力等。例如，多肽可以在约50至约5000个氨基酸长的范围内，例如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。就此而言，本发明的多肽还包括寡肽。
本发明的TCR，多肽和蛋白质(包括其功能性变体)可以包含合成氨基酸代替一种或多种天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸，正亮氨酸，α-氨基正癸酸，高丝氨酸，S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸，反式-3-和反式-4-羟基苯丙氨酸，4-氨基苯丙氨酸，4-硝基苯丙氨酸，4-氯苯丙氨酸，4-羧基苯丙氨酸，β-苯基丝氨酸，β-羟基苯丙氨酸，苯基甘氨酸，α-萘基丙氨酸，环己基丙氨酸，环己基甘氨酸，二氢吲哚-2-羧酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，氨基马来酸，氨基马来酸单酰胺，N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸，N',N'-二苄基-赖氨酸，6-羟基赖氨酸，鸟氨酸，α-氨基环戊烷羧酸，α-氨基环己烷羧酸，α-氨基环庚烷羧酸，α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸，α,γ-二氨基丁酸，α,β-二氨基丙酸，高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的TCR、多肽和蛋白质(包括功能性部分和功能性变体)可以进行糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、环化，例如通过二硫桥，或转化成酸加成盐和/或任选的二聚化或聚合，或共轭。
本发明的TCR，多肽和/或蛋白质(包括其功能性变体)可以通过本领域已知的方法获得。从头合成多肽和蛋白质的合适方法描述于参考文献中，例如Chan等，《Fmoc固相肽合成》(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis)，牛津大学出版社，牛津，英国，2005；《肽和蛋白质药物分析》(Peptide and Protein Drug Analysis)，Reid,R.编，Marcel Dekker公司，2000；《表位映射》(Epitope Mapping)，Westwood等编，牛津大学出版社，牛津，英国，2000；和美国专利号5,449,752。而且，可以使用标准重组方法使用本文所述的核酸重组产生多肽和蛋白质。参见例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)(第3版)，纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社，2001；和Ausubel等，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约，格林出版联合公司和约翰韦利父子公司，1994。
此外，本发明的一些TCR，多肽和蛋白质(包括其功能性变体)可以从来源如植物，细菌，昆虫，哺乳动物例如大鼠，人等中分离和/或纯化。分离和纯化方法在本领域中是众所周知的。或者，本文所述的TCR，多肽和/或蛋白质(包括其功能性变体)可由公司如Synpep公司(加利福尼亚州都柏林)，肽技术公司(Peptide Technologies)(马里兰州盖瑟斯堡)和多肽系统公司(Multiple Peptide Systems)(加利福尼亚州圣迭戈)商业合成。在这方面，本发明的TCR(包括其功能性变体)，多肽和蛋白质可以是合成的，重组的，分离的和/或纯化的。
包括在本发明范围内的是包含任何本发明TCR，多肽或蛋白质(包括其任何功能性变体)，核酸，重组表达载体，宿主细胞，宿主细胞群体，或抗体或其抗原结合部分的偶联物，例如生物偶联物。偶联物以及通常合成偶联物的方法在本领域中是已知的(参见，例如Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298:209-223(2005)和Kirin等,Inorg Chem.44(15):5405-5415(2005))。
本文所用“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常表示DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或获得自(例如，分离的和/或纯化的)天然来源的，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接，如氨基磷酸酯连接或硫逐磷酸酯连接，而不是存在于未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。通常优选该核酸不包括任何插入、缺失、转化和/或取代。然而，如本文所讨论的，在一些情况中，核酸包括一个或多个插入、缺失、转化和/或取代。
优选地，本发明的核酸是重组的。本文所用术语“重组”是指这样的分子，(i)通过将天然或合成的核酸片段连接至可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或(ii)由(i)中描述的那些复制而得的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应构建核酸。参见，例如，Sambrook等,同上，以及Ausubel等,同上。例如，使用天然产生的核苷酸或各种修饰的核苷酸可以化学合成核酸，所述修饰的核苷酸被设计成增强分子的生物稳定性或增强杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如，硫逐磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的示例包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、a-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、五步苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。或者，可从诸如Macromolecular Resources公司(科罗拉多州柯林斯堡)和Synthegen公司(得克萨斯州休斯敦市)的公司购买一种或多种核酸。
核酸可以包含编码本文所述的任何TCR，多肽，蛋白质或其功能性变体的任何核苷酸序列。例如，核酸可以包含核苷酸序列SEQ ID NO：15至24中的任何一个或多个或其组合，或由其组成或基本上由其组成。
本公开还提供了核酸，其包括与本文所述任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或在严格条件下与本文所述任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选在高度严格条件下杂交。述及“高度严格条件”表示核苷酸序列与靶序列(本文所述任何核酸的核苷酸序列)以比非特异性杂交可检测强的量特异性杂交。高度严格条件包括这样的条件，该叫天将区分多核苷酸与精确互补序列或仅含有来自随机序列的几个分散的错配的序列，该随机序列恰好与该核苷酸序列匹配的几个小区域(例如，3-10个碱基)。这种具有互补性的小区域比14-17个碱基或更多碱基的全长互补体更容易融解，并且高度严格杂交使其更容易区分。相对高度严格条件将包括，例如，低盐和/或高温条件，如由约0.02-0.1M NaCl或等同物在约50-70℃的温度下提供。这种高度严格条件极少(若存在)允许核苷酸序列和模板或靶链之间的错配，并且特别适合用于检测本文所述任何TCR(包括其功能部分和功能性变体)的表达。通常认为，通过加入增加量的甲酰胺可以使条件变得更加严格。
本发明还提供了包含与本文所述的任何核酸至少约70％或更多，例如约80％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95，约96％，约97％，约98％或约99％相同的核苷酸序列的核酸。
本发明的核酸可以掺入重组表达载体中。就此而言，本发明提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。出于本文的目的，术语“重组表达载体”表示这样的遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当该构建体包括编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列时，其允许通过宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽，并且载体与细胞在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽表达于细胞中的条件下接触。本文所述载体不是整体上天然产生的。然而，载体的部分可以是天然产生的。本文所述重组表达载体可以包括任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分获自天然来源的，并且其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包括天然产生的、非天产生的核苷酸间连接，或两种类型的连接。优选地，非天然产生的或改变的核苷酸或核苷酸间连接并不妨碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计为用于增殖或扩增或用于表达或用于以上两种目的的那些，例如质粒和病毒。载体可以选自如下：pUC系列(fermentas生命科学公司(Fermentas Life Sciences))、pBluescript系列(司查塔基公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉荷亚)、pET系列(诺瓦基公司(Novagen)，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(药物生物技术公司(Pharmacia Biotech)，新泽西州皮斯卡塔韦)和pEX系列(克隆泰克公司(Clontech)，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。也可使用噬菌体载体，如λΘΤΙΟ、λσΠΙ、ZapII(司查塔基公司)、EMBL4和λNMI 149。植物表达载体的示例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(克隆泰克公司)。动物表达载体的示例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(克隆泰克公司)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
可使用标准DNA技术制备本发明的重组表达载体，参见例如Sambrook等同上和Ausubel等同上。环形或线形的表达载体构建体可制备为包含原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可来源于，例如，CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。优选地，重组表达载体包括调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对将导入该载体的宿主细胞类型(如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，在适当时考虑该载体是基于DNA还是基于RNA。
该重组表达载体可包括一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主细胞。标志物基因包括杀生物剂抗性，例如，对抗生素、重金属等的抗性，其在营养缺陷型宿主细胞中互补以提供原养型，等等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包括天然或非天然启动子，其可操作地连接编码TCR、多肽或蛋白(包括其功能性变体)的核苷酸序列，或连接与编码TCR、多肽或蛋白质(包括其功能性变体)的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择(例如强、弱、可诱导、组织特异性和发育特异性)是在本领域公知常识的范围内。类似地，将核苷酸序列与启动子合并也在本领域公知常识的范围内。该启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
本发明的重组表达载体可设计为瞬时表达、稳定表达或上述两种表达。同样地，重组表达载体可制备为用于组成型表达或可诱导表达。此外，可以制备重组表达载体以包括自杀基因。
本文所用术语“自杀基因”指这样的基因，其导致表达该自杀基因的细胞死亡。自杀基因可以是这样的基因，其将对试剂(例如，药物)的敏感性赋予该自杀基因表达的细胞，并且当细胞与试剂接触或暴露于试剂时，导致该细胞死亡。自杀基因是本领域已知的(参见，例如，《自杀基因疗法：方法和评论(Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews)》,施普林格公司(Springer),Caroline J.(英国萨里萨顿的癌症研究所癌症治疗英国癌症研究中心(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute ofCancer Research,Sutton,Surrey,UK)),胡马纳出版社(Humana Press),2004)并且包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶二胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
本发明另一实施方式还提供了包含本发明所述重组表达载体中任一种的宿主细胞。本文中，术语“宿主细胞”指能够含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。该宿主细胞可以是真核细胞(例如，植物、动物、真菌或藻类)，或者可以是原核细胞(例如，细菌或原生动物)。该宿主细胞可以是培养的细胞或初级细胞，即直接从生物体(例如，人)中分离。该宿主细胞可以是粘附性细胞或悬浮的细胞，即悬液形式生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的且包括例如DH5α、大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，该宿主细胞优选是原核细胞，例如DH5α细胞。出于生产重组TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选是哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞是人类细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来源于任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段，但宿主细胞优选是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。最优选地，宿主细胞是T细胞。
出于本发明目的，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，初级T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞(例如，Jurkat、SupT1等)或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，那么可由许多来源获得T细胞，包括但不限于，血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或流体。还可以针对T细胞富集或纯化。优选地，T细胞是人T细胞。更优选地，T细胞是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞，例如，Th1和Th2细胞、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、CD3+T细胞、自然杀伤细胞T(NKT)、肿瘤浸润细胞(TIL)、记忆T细胞(例如中枢记忆T细胞和效应记忆T细胞)、初级T细胞等。
本公开还提供了包括本文所述的至少一种宿主细胞的细胞群。该细胞群可以是异源的群体，其包括宿主细胞以及至少一种其它细胞，例如宿主细胞(例如，T细胞)或除了T细胞以外的细胞，其中所述宿主细胞包括所述重组表达载体中的任何一种，所述一种其它细胞不包括任何重组表达载体，所述粗了T细胞以外的细胞是例如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以基本上是同源的群体，其中该群体主要包括(例如，基本上由…组成)包含重组表达载体的宿主细胞。该群体也可以是细胞的克隆群体，其中该群体的所有细胞是包括重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，因此该群体的所有细胞包括该重组表达载体。在本发明的一个实施方式中，细胞群是包含含有本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群。
本发明进一步提供了与本文所述的任何TCR(或其功能性变体)的功能部分特异性结合的抗体或其抗原结合部分。优选地，功能部分与癌抗原特异性结合，例如功能部分包含下述的氨基酸序列：α链的CDR1、α链的CDR2、α链的CDR3、β链的CDR1、β链的CDR2、β链的CDR3，a链的可变区，β链的可变区或其组合，例如，在一个优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分结合至由全部6个CDR(α链的CDR1-3和β链的CDR1-3)形成的表位。抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是任何同种型，例如IgA，IgD，IgE，IgG，IgM等。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物例如小鼠，兔，山羊，马，鸡，仓鼠，人等分离和/或纯化的抗体。或者，抗体可以是基因工程抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是单体或聚合物形式。而且，抗体可以对本发明的TCR(或其功能性变体)的功能部分具有任何水平的亲和力或亲合力。有利地，抗体对本发明的TCR(或其功能性变体)的功能部分是特异性的，从而与其他肽或蛋白质具有最小的交叉反应。
测试抗体结合本发明TCR的任何功能部分或功能性变体的能力的方法是本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如放射免疫测定(RIA)，ELISA，Western印迹，免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见例如Janeway等，以及美国专利申请公开号2002/0197266A1)。
制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于例如Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976)，Harlow和Lane(编)，《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，CSH出版社(1988)和C.A.Janeway等(编)，《免疫生物学》(Immunobiology)，第5版，Garland发行公司，纽约，(2001))。或者，其他方法，如EBV-杂交瘤方法(Haskard和Archer，J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)和Roder等，Methods Enzymol.，121,140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见例如Huse等，Science,246,1275-81(1989))是本领域已知的。此外，在例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公开号2002/0197266A1中描述了在非人动物中产生抗体的方法。
此外，噬菌体展示可用于产生本发明的抗体。就此而言，可使用标准分子生物学和重组DNA技术产生编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库(参见例如Sambrook等(编)《分子克隆：实验室手册》第3版，冷泉港出版社，纽约冷泉港(2001))。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体用于与所需抗原的特异性结合，并且完整或部分抗体经重构包含所选可变区。编码重构抗体的核酸序列被引入合适的细胞系，例如用于杂交瘤生产的骨髓瘤细胞中，使得具有单克隆抗体特征的抗体由细胞分泌(参见例如Janeway等，同上，Huse等，同上，和美国专利6,265,150)。
抗体可以由就特定重链和轻链免疫球蛋白基因而经转基因的转基因小鼠产生。这样的方法在本领域中是已知的，并且在例如美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等(同上)中进行了描述。产生人源化抗体的方法在本领域中是公知的，并且在例如Janeway等(同上)，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利0239400B1和英国专利2188638中详细描述。人源化抗体也可以使用抗体表面重修技术生产，例如美国专利5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中所述。本发明还提供了本文所述任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分，如Fab，F(ab')2，dsFv，sFv，双体和三体。
可以使用常规重组DNA技术技术(参见例如Janeway等，同上)产生由截短的Fab片段组成的单链可变区片段(sFv)抗体片段，所述截短的Fab片段包含经由合成肽与抗体轻链的可变(V)结构域连接的抗体重链的V结构域。类似地，可以通过重组DNA技术制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)(参见例如Reiter等，Protein Engineering，7,697-704(1994))。然而，本发明的抗体片段不限于这些示例类型的抗体片段。
此外，可以修饰抗体或其抗原结合部分以包含可检测标记，例如放射性同位素，荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。
可以分离和/或纯化本发明的TCR，多肽，蛋白质(包括其功能性变体)，核酸，重组表达载体，宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)。本文所用术语“分离的”表示已从其天然环境中移出的。如本文所用的术语“纯化的”意指已经增加了纯度，其中“纯度”是相对术语，并且不一定被解释为绝对纯度。例如，纯度可以是至少约50％，可以大于60％，70％，80％，90％，95％或可以是100％。
本发明的TCR，多肽，蛋白质(包括其功能性变体)，核酸，重组表达载体，宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)，所有这些统称为“本发明的TCR材料”并可以配制成组合物，例如药物组合物。就此而言，本发明提供了包含任何TCR，多肽，蛋白质，功能部分，功能性变体，核酸，表达载体，宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)，以及药学上可接受的运载体的药物组合物。含有任何本发明的TCR材料的本发明的药物组合物可以包含多于一种本发明的TCR材料，例如多肽和核酸，或两种或更多种不同的TCR(包括其功能部分和功能性变体)。或者，所述药物组合物还包含本发明TCR材料与其它药物活性试剂或药物的组合，所述其它药物活性试剂或药物例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱等。
优选地，运载体是药学上可接受的运载体。就药物组合物而言，运载体可以是通常用于所考虑的特定的本发明的TCR材料的运载体中的任何一种。这样的药学上可接受的运载体对于本领域技术人员来说是公知的并且公众容易获得。药学上可接受的运载体优选为在使用条件下不具有有害副作用或毒性的运载体。
运载体的选择将部分由特定的本发明的TCR材料以及用于施用本发明的TCR材料的特定方法来确定。因此，有多种本发明药物组合物的合适制剂。合适的制剂可以包括用于口服，气雾剂，肠胃外，皮下，静脉内，肌内，动脉内，鞘内或腹膜内给药的任何制剂。可以使用多于一种的途径来施用本发明的TCR材料，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一种途径更快速和更有效的响应。
优选地，本发明的TCR材料通过注射施用，例如静脉内施用。当本发明的TCR材料是表达本发明的TCR(或其功能性变体)的宿主细胞时，用于注射用细胞的药学上可接受的运载体可以包括任何等渗运载体，例如生理盐水(约0.90％w/v NaCl水溶液，约300mOsm/LNaCl水溶液或约9.0g NaCl/L水)，NORMOSOL R电解质溶液(伊利诺伊州芝加哥，雅培公司)，PLASMA-LYTE A(伊利诺伊州迪尔菲尔德，Baxter公司)，约5％右旋糖水溶液，或乳酸林格氏液。在一个实施方案中，药学上可接受的运载体补充有人血清白蛋白。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以进一步包含另一种治疗剂例如化学治疗剂。
为了本发明的目的，施用的本发明的TCR材料的量或剂量(例如，当本发明的TCR材料是一种或多种细胞时的细胞数量)应该足以在合理的时间范围内在受试者或动物中实现例如治疗或预防响应的效果。例如，本发明的TCR材料的剂量应该足以在给药后约2小时或更长，例如12至24或更多小时的时间段内与血液抗原结合或者检测、治疗或预防血液病症。在某些实施例中，时间段可能更长。剂量将由特定的本发明的TCR材料的效力和动物(例如人)的状况以及待治疗的动物(例如人)的体重来确定。
用于确定施用剂量的许多测定法是本领域已知的。为了本发明的目的，可以使用测定来确定给予哺乳动物的起始剂量，所述测定包括：将给定剂量的这种T细胞给予哺乳动物后，比较靶细胞裂解程度或由表达本发明TCR(或其功能性变体或功能部分)、多肽或蛋白质的T细胞分泌IFN-γ或IL-6的程度，其中每种哺乳动物给予不同剂量的T细胞。可以通过本领域已知的方法测定在施用一定剂量后靶细胞裂解或IFN-γ或IL-6分泌的程度。
本发明的TCR材料的剂量还将由可能伴随施用特定的本发明TCR材料的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师将考虑各种因素，例如年龄，体重，一般健康状况，饮食，性别，待施用的本发明TCR材料，给药途径以及所治疗病症的严重程度，来决定用于治疗每个个体患者的本发明TCR材料的剂量。在其中本发明的TCR材料是细胞群体的实施方式中，每次输注施用的细胞数目可以变化，例如约1×106至约1×1011个细胞或更多。
本领域的普通技术人员将容易理解，本发明的本发明TCR材料可以以任何方式进行修饰，使得本发明TCR材料的治疗或预防功效通过该修饰而增加。例如，本发明的TCR材料可以直接或间接地通过桥偶联至靶向部分。将化合物(例如，本发明TCR材料)偶联至靶向部分的实践是本领域已知的。参见例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:111(1995)，和美国专利5,087,616。如本文所用的术语“靶向部分”是指特异性识别并结合至细胞表面受体的任何分子或试剂，使得靶向部分指导本发明TCR材料递送至在表面上表达受体的细胞群。靶向部分包括但不限于与细胞表面受体结合的抗体或其片段，肽，激素，生长因子，细胞因子和任何其它天然或非天然配体(例如上皮生长因子受体(EGFR)，T细胞受体(TCR)，B细胞受体(BCR)，CD28，血小板衍生生长因子受体(PDGF)，烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)。如本文所用，术语“桥”是指将本发明的TCR材料连接到靶向部分的任何试剂或分子。本领域的普通技术人员认识到，本发明的TCR材料上的位点(对于本发明的TCR材料的功能来说不必要的)是用于连接桥和/或靶向部分的理想位点，条件是，一旦附着于本发明的TCR材料，桥和/或靶向部分不干扰本发明的TCR材料的功能，即与mLPA结合的能力；或检测，治疗或预防血液病症的能力。
预期本发明的药物组合物，TCR(包括其功能性变体)，多肽，蛋白质，核酸，重组表达载体，宿主细胞或细胞群可用于治疗或预防血液病症的方法中。不受具体理论的束缚，认为本发明的TCR(及其功能性变体)特异性结合至mLPA，使得当由细胞表达时TCR(或相关的本发明的多肽或蛋白质及其功能性变体)能够介导针对表达mLPA的靶细胞的免疫响应。就此而言，本发明提供了治疗或预防哺乳动物血液病症的方法，包括给予哺乳动物本文所述的任何药物组合物，TCR(及其功能性变体)、多肽或蛋白质，包含编码本文所述的任何TCR(及其功能性变体)、多肽、蛋白质的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，或包含编码本文所述的任何TCR(和其功能性变体)、多肽或蛋白质的重组载体的任何宿主细胞或细胞群，其量可有效治疗或预防哺乳动物的血液病症。
在本发明的一个实施方式中，治疗或预防血液疾病的本发明方法可进一步包括向哺乳动物共同施用MHC I类限制性TCR或编码MHC I类限制性TCR的多肽、蛋白质、核酸或重组表达载体，或表达MHC I类限制性TCR的宿主细胞或细胞群体。
在本发明的一个实施方式中，治疗或预防血液疾病的本发明方法可进一步包括向哺乳动物共同施用CD1d限制性非变体NKT细胞TCR或编码CD1d限制性非变体NKT细胞TCR的多肽、蛋白质、核酸或重组表达载体，或表达CD1d限制性非变体NKT细胞TCR的宿主细胞或细胞群体。
本文中，术语“治疗”和“预防”及其衍生词不必表示100％或完全治疗或预防。相反，本领域普通技术人员认识到不同程度的治疗或预防具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明的方法可以提供对哺乳动物癌症的任何量的任何水平的治疗或预防。
此外，本发明的方法提供的治疗或预防可包括待治疗或预防的疾病的一种或多种病症或症状，例如癌症。同样，出于本发明所述目的，“预防”可包括延迟疾病或其相关症状或病症的发生。
还提供了检测哺乳动物中血液病症的存在的方法。方法包括(i)使包含血液病症细胞的样品与任何本发明的TCR(及其功能性变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、或抗体或其抗原结合部分接触，由此形成复合物，并且检测复合物，其中复合物的检测指示哺乳动物中存在血液病症。
关于检测哺乳动物血液病症的本发明方法，癌症细胞样品可以是包含全细胞，其裂解物或全细胞裂解物的级分的样品，例如核或细胞质级分，全蛋白质级分或核酸级分。
为了本发明的检测方法的目的，接触可以相对于哺乳动物体外或体内发生。优选地，接触是体外的。
此外，复合物的检测可以通过本领域已知的许多方式进行。例如，本文所述的本发明的TCR(及其功能性变体)，多肽，蛋白质，核酸，重组表达载体，宿主细胞，细胞群或抗体或其抗原结合部分可用可检测标记进行标记，所述可检测标记例如放射性同位素，荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。
出于本发明方法中给予宿主细胞或细胞群的目的，细胞可以是与哺乳动物同种异体或自体同源的细胞。优选地，细胞与哺乳动物是自体同源的。
本发明方法中提到的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文所用术语“哺乳动物”指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目哺乳动物，如兔。乳动物优选来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或者奇蹄目，包括马科(马)。最优选的是，哺乳动物是灵长目、Ceboid或Simoid(猴)或类人猿目(人类和猿)。特别优选的哺乳动物是人。
附图说明
通过参考附图和非限制性实施例阐述本发明。
图1.用CD1c自反应TCR DN 4.99转导的外周血来源的T细胞有效地再靶向表达CD1c的急性白血病细胞系THP1。(A)携带与小鼠TCR Ca或CβcDNA融合的来自mLPA特异性T细胞克隆DN4.99的嵌合TCR V-(D)-J片段的双顺反子慢病毒载体pHR-SINEGFP的图。两条链均由内部脾脏焦点形成病毒(SSFV)启动子表达。
(B)用(A)中描述的慢病毒转导多克隆T细胞后体外产生mLPA特异性T细胞系。在第0天和第15天以及分选后由转导(TrT，蓝线)和未转导(UTrT，红线)T细胞的TCR表达。使用小鼠Cβ特异性(mTCRβ)mAb检测TCR表达。数据代表3次实验。
(C)通过用DN4.99 TCR转导的T细胞(TrT)识别ClR-CDlc LCL，但不通过未转导的T细胞(UTrT)识别。在抗-CD1c阻断性mAb存在(α-CD1c)或不存在(ctrl)的情况下，采用或不用(没有APC)C1R-CD1c培养T细胞。柱表示一式三份的IFN-γ生产的平均值±标准差。
图2.用CDlc自反应TCR DN 4.99转导的CD4和CD8外周血来源的T细胞有效识别表达CD1c的急性白血病细胞系THP1。用抗-CD3/CD28珠加IL-2和IL-7体外活化T细胞，并用编码嵌合人V-小鼠C TCR DN 4.99的慢病毒转导。A.根据CD4或CD8共同受体的表达分选表达或不表达嵌合TCR(mTCRβ)的转导T细胞。B.测定分选的CD4+T细胞对CD1c+或WT THP1细胞的识别，如在共培养12小时后通过ELISA的特异性释放IFNg所确定的。C.测定分选的CD8+T细胞对CD1c+或阴性(WT)THP1细胞的识别，如在共培养12小时后通过ELISA的特异性释放IFNg所确定的。D.在72小时共培养测定中测试分选的CD8+T细胞对CD1c+或WT THP1细胞的特异性杀伤。箭头表示含有THP1细胞的象限，由CD33的表达检测。CDlc+THP1细胞(而不是WTTHP1细胞)仅在与TCR转导的CD8+T细胞共培养中消失，表明由用CDlc自反应TCR转导的T细胞的特异性杀伤。
图3.用CD1c自反应性TCR转导的Jurkat 76细胞识别K562-CDlc AML细胞系。(A)用抗mTCR mAb通过流式细胞术确定的转导和未转导的Jurkat 76上的嵌合CD1c自反应性TCR的表达(B)评估用CDlc自反应性TCR转导的Jurkat 76细胞的反应性。以2.5:1效应T细胞:白血病靶细胞(E:T＝效应T细胞:靶细胞(即白血病细胞))的比率将转导的Jurkat 76细胞接种于含有4×105个CDlc+K562-CD1c细胞的96U底孔中，加载或不加载mLPA(黑色条)。使用K562 WT细胞作为阴性对照(白色条)。体外过夜培养后，通过流式细胞术测量Jurkat 76细胞上的CD69表达。
图4。用CD1c自反应性TCR转导的Jurkat 76β2m-细胞识别K562-CDlc AML细胞系。(A)用抗mTCRβmAb通过流式细胞术测定嵌合CD1c自反应TCR在转导和未转导Jurkat76β2m-上的表达。(B)评估用CDlc自反应性TCR转导的Jurkat 76细胞的反应性。以E:T＝2.5:1的比率将转导的Jurkat 76细胞接种于含有4×105个CDlc+K562-CDlc细胞的96u底孔中，加载或不加载mLPA(黑色条)。使用K562 WT细胞作为阴性对照(白色条)。过夜培养后，通过流式细胞术测量Jurkat 76细胞上的CD69表达。
图5.TCR对mLPA的亲和力。(A)用抗-mTCRp mAb通过流式细胞术所测定，在用于(B)中报道的mLPA滴定的转导的和未转导的Jurkat 76β2m-细胞上CD1c自反应性TCR的表达。(B)脂质滴定测定。响应载有所示mLPA稀释液的K562-CD1c细胞，TCR转导的Jurkatβ2m-细胞上的CD69表达的插值曲线。
图6.用mLPA特异性TCR转导的初级T细胞识别白血病细胞系。(A)通过CD3+细胞门控，用抗小鼠TCRb mAb通过流式细胞术测定转导的和未转导的初级T细胞上的TCR表达。(B，C)用mLPA特异性TCR转导的初级T细胞的反应性。以E:T＝2.5:1比率将转导的初级T细胞接种在含有4x105 THP1(B)或K562(C)的96U底孔中，其表达(黑色条)或不表达(白色条)CDlc。24小时后，通过ELISA测定测量上清液中分泌的IFNγ。
图7.用前导的mLPA特异性TCR DN4.99转导的初级T细胞识别并杀伤THP1-CD1cAML细胞系。在TCR转导后第10天分选CD4+或CD8+T细胞，并用抗CD3/CD28免疫磁珠和细胞因子再刺激。(A-B)以E:T＝1:1的比率将TCR转导的或空白转导的T细胞接种在具有105THP1-CD1c或THP1 WT细胞的96u底孔中。24小时后，收集上清液并通过ELISA测定法测量IFNγ产生。(C-D)在共培养72小时后，通过流式细胞术评估TCR转导的或空白转导的CD8+或CD4+T细胞对THP1-CD1c或THP1 WT AML细胞的杀伤。
图8.用前导mLPA特异性TCR DN4.99转导的初级T细胞杀伤初级CD1c+AML母细胞。(A)初级循环急性髓性白血病母细胞(AML-04)上的CD1c表达。(B)以E:T比率10:1共培养72小时后通过TCR DN4.99转导的初级T细胞对初级CD1+AML-04母细胞的杀伤(CD33+，箭头)。
图9.前导的mLPA特异性T细胞克隆DN4.99识别来自复发患者的表达CD1c的母细胞。(A)首次诊断(左)和移植后疾病复发(右)时初级循环AML母细胞(AML-34)的CD1c表达。(B)在首次诊断(左)和复发(右)时与初级母细胞共培养24小时后由DN 4.99T细胞产生的IFNγ。
图10.针对由mLPA特异性TCR的识别进行检测的磷脂的结构。
图11.与载有4μg/ml所示脂质的K562-CD1c AML细胞过夜共培养后，用mLPA特异性TCR DN4.99和DN4.2转导的Jurkat 76细胞上CD69表达的定量。
发明详述
材料和方法
TCRα构建体和在慢病毒载体中克隆
编码CD1c自反应性T细胞克隆的TCRα和β链的cDNA由GeneArt合成并经密码子优化用于在真核细胞中表达。编码与小鼠Cα序列(SEQ ID NO.11)框内融合的TCR Vα部分的序列之后是2A肽(EGRGSLLTCGDVEENPGP，SEQ ID NO.57)，然后是与鼠Cβ片段(SEQ ID NO.12)框内融合的编码TCRβ链V区的序列，其以终止密码子结尾。将嵌合构建体克隆到pHR-SIN-BX-IRES-Em LV载体(由E.Cerundolo惠赠，牛津大学和Lepore M.等，J Exp Med.2014Jun 30；211(7):1363-77.doi:10.1084/jem.20140410)，其中IRES-GFP盒允许鉴定表达构建体的细胞，并且可以通过NotI/NotI消化容易地切除。
在293T细胞中产生慢病毒
在转染之前24小时将9x106 293T细胞(HEK-293，
Figure BDA0003360078780000231
CRL-1573TM)接种在含L-谷氨酰胺、10％FBS和100U/ml青霉素-链霉素的20ml IMDM的15cm培养皿中。转染前2小时更换培养基。通过在终体积1125μl的TE 0.1X/H2O(2:1；H2O)中混合32μg转移载体质粒加9μgpMD2.G-ENV(Addgene质粒#12259)、16.25μg的CMVΔR8.74(Addgene质粒#22036)和6.25μg的pRSV-REV(Addgene质粒#12253，Dull T,Zufferey R,Kelly M,Mandel RJ,Nguyen M,Trono D,Naldini L.J Virol.1998Nov.72(11):8463-71)质粒来制备DNA混合物。向质粒混合物中加入125μl的2.5M CaCl2，并通过向DNA-TE-CaCl2混合物中逐滴加入1250μl的HBS 2X溶液来形成沉淀。立即将沉淀物加入到293T细胞中。14小时后，每个培养皿中的培养基换成16ml新鲜的完全培养基，再过30小时后，收集含有病毒的上清液，通过超速离心浓缩并储存在-80℃。
在Jurkat 76细胞中进行慢病毒滴定
通过转导不表达内源性TCR的Jurkat 76细胞来滴定慢病毒。将25×105个Jurkat76细胞接种到48孔板中并用来自包装293T细胞的7种系列稀释的上清液转导，所述293T细胞在终体积200μl的RPMI培养基1640+GlutaMAXTM，10％FBS，100U/ml青霉素-链霉素，1mM丙酮酸钠和0.1mM MEM NEAA中包含产品慢病毒(10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8)。转导后24小时加入新鲜培养基至每孔1ml终体积。在转导4天后，用抗小鼠TCR CβmAb(Biolegend公司)或GFP通过流式细胞术检测嵌合TCR的表达。为了计算病毒效价(转导单位(TU)/ml)，使用下列方程式：
TU/ml＝(感染的细胞数)(阳性细胞百分比/100)(稀释因子)/(接种体积(ml))
为了对慢病毒滴度进行可靠的估计，考虑5-30％之间的阳性细胞范围。
用慢病毒载体转导Jurkat 76细胞
5x105 Jurkat 76细胞(Hart DP,Xue SA,Thomas S,Cesco-Gaspere M,TranterA,Willcox B,Lee SP,Steven N,Morris EC,Stauss HJ.Gene Ther.2008Apr；15(8):625-31)接种在48孔板中的终体积200μl的RPMI培养基1640+GlutaMAXTM，10％FBS，100U/ml青霉素-链霉素，1mM丙酮酸钠和0.1mM MEM NEAA中。Jurkat 76细胞用MOI 100转导，并在转导后24小时加入新鲜培养基至终体积每孔1ml。转导后4天，通过流式细胞分析用抗小鼠TCR CβmAb来检测嵌合TCR的表达。
用慢病毒载体转导Jurkat 76β2m-细胞
5x105 Jurkat 76细胞接种在48孔板中的终体积200μl的RPMI培养基1640+GlutaMAXTM，10％FBS，100U/ml青霉素-链霉素，1mM丙酮酸钠和0.1mM MEM NEAA中，并用MOI100转导。转导后4天，通过流式细胞分析用抗小鼠TCR CβmAb对细胞染色来检测嵌合TCR的表达。
初级人类T细胞用慢病毒载体转导
从健康供体中纯化外周血单核细胞。使用珠:T细胞比率＝3:1，将CD3+细胞活化并用
Figure BDA0003360078780000241
人T-活化剂CD3/CD28扩增。培养48小时后，将5x105T细胞接种于48孔板中的终体积为200μl RPMI培养基1640+GlutaMAXTM、10％FBS、100U/ml青霉素-链霉素、1mM丙酮酸钠、0.1mM MEM NEAA、100U/ml rhIL2和10ng/ml hrIL-7中。用MOI 100转导T细胞并在24小时后加入新鲜培养基至终体积每孔1ml。使用抗小鼠TCR CβmAb通过流式细胞术在4天后验证转导的TCR的表达。在转导后14天分选表达或不表达转导的TCR的CD4+和CD8+T细胞。以珠:T细胞比率＝1:10和10U/ml rhIL2和10ng/ml hrIL-7将分选的T细胞用
Figure BDA0003360078780000244
人T-活化剂CD3/CD28再扩增。
通过TCR转导的Jurkat 76细胞识别白血病细胞系
将4x104 THP1-CD1c或K562-CD1c(由D Branch Moody博士惠赠，哈佛大学，波士顿，美国，de Jong A,
Figure BDA0003360078780000245
V,Cheng TY,Clark RA,Van Rhijn I,Moody DB.NatImmunol.2010年12月；11(12):1102-9)靶细胞或THP1(
Figure BDA0003360078780000242
TIB-202TM)或K562(
Figure BDA0003360078780000243
CCL243TM)WT细胞接种到96U底孔中的完全培养基中(RPMI 10％FCS+1％P/S+1％NEAA+1％NaPyr,2-ME)。当指出时，THP1-CD1c或K562-CD1c细胞也用4μg/ml的mLPA在37℃下预加载4小时。将105个表达转导的TCR的Jurkat 76细胞加入靶细胞中，终体积为100μl的完全培养基。在37℃过夜(ON)后，用抗CD69 mAb(Biolegend公司)通过流式细胞术分析CD69的表达。
通过转导的Jurkat 76细胞识别THP1细胞的测定
将4x104 THP1-CD1c靶细胞或阴性对照THP1 WT细胞接种在96U底孔中的50μl完全培养基中(RPMI 10％FCS+1％P/S+1％NEAA+1％NaPyr,2-ME)。当指出时，THP1-CD1c细胞也用4μg/ml的mLPA在37℃脉冲4小时。将105个表达转导的TCR的Jurkat 76细胞加入靶细胞中，终体积为100μl的完全培养基。在37℃过夜后，用抗CD69 mAb(Biolegend公司)通过流式细胞术分析CD69的表达。
TC转导的初级人T细胞识别白血病细胞系
对于初级T细胞识别，将105THP1-CD1c或K562-CD1c靶细胞或阴性对照THP1和K562WT细胞接种在96U底孔中的完全培养基中(RPMI 10％FCS+1％P/S+1％NEAA+1％NaPyr,2-ME)。将表达或不表达转导的TCR的105个T细胞加入到100μl完全培养基中的靶细胞中，并在37℃下孵育过夜。当指出时，在测定之前通过细胞分选将TCR转导的CD4+或CD8+T细胞分离。收集来自每种条件的50μl等分试样的上清液，并通过ELISA测量分泌的IFNγ。共培养另外4天后，通过流式细胞分析，通过用DAPI、抗mTCR Cβ和抗CD33对细胞染色以确定CD33+白血病细胞的消除来评估靶细胞的杀伤。
通过转导的人T细胞识别THP1细胞的测定
对于初级T细胞识别，将105THP1-CD1c靶细胞或阴性对照THP1 WT细胞接种在96U底孔中的50μl的完全培养基中(RPMI 10％FCS+1％P/S+1％NEAA+1％NaPyr,2-ME)。将表达或不表达转导的TCR的105个CD4+或CD8+T细胞加入到100μl完全培养基中的靶细胞中，并在37℃下孵育。过夜后收集来自每种条件的50μl等分试样的上清液，并通过ELISA测量分泌的IFNγ。共培养另外4天后，通过流式细胞分析用DAPI、抗mTCR Cβ和抗hCD33对细胞染色来评估靶细胞的杀伤。
杀伤测定
以10:1的效应T细胞:靶白血病细胞使用单独孵育的或与T细胞(2×104细胞/ml)一起孵育的初级AML母细胞(获自圣拉斐尔生物库(San Raffaele Biobank))，在存在或缺少CD1c封闭性抗体抗CD1c mAb(克隆M241，圣克鲁斯，加利福尼亚州)的情况下进行杀伤测定。72小时后，通过流式细胞术鉴定残留的活的靶细胞并将其定量为DAPI-/CD33+/CD3-。
T细胞活化测定
通过存在或不存在抗CD1c(克隆M241，圣克鲁斯，加利福尼亚州)封闭性单克隆抗体的情况下将指定数目的靶细胞与T细胞(20×104/孔)共培养来进行T细胞活化测定。48小时后收集上清液并通过ELISA测量IFN-γ。
在图11中，4x104 THP1-CD1c靶细胞接种在96U底孔中的50ul完全培养基中(RPMI10％FCS+1％P/S+1％NEAA+1％NaPyr,2-ME)。THP1-CD1c细胞也用4μg/ml的所示脂质在37℃脉冲4小时。合成的PS18:1,LPE16:0,LPE18:0,LPE18:1获自Matthew Skaley博士，美国俄克拉荷马市奥克拉荷马大学健康科学中心。合成的mLPA获自Gennaro De Libero教授，瑞士巴塞尔大学。将105个表达转导的TCR的Jurkat 76细胞加入靶细胞中，终体积为100μl的完全培养基。在37℃过夜后，用抗CD69 mAb(Biolegend公司)通过流式细胞术分析CD69的表达。
Figure BDA0003360078780000261
Figure BDA0003360078780000271
Figure BDA0003360078780000281
Figure BDA0003360078780000291
Figure BDA0003360078780000301
Figure BDA0003360078780000311
Figure BDA0003360078780000321
Figure BDA0003360078780000331
Figure BDA0003360078780000341
Figure BDA0003360078780000351
Figure BDA0003360078780000361
Figure BDA0003360078780000371
Figure BDA0003360078780000381
Figure BDA0003360078780000391
Figure BDA0003360078780000401
Figure BDA0003360078780000411
Figure BDA0003360078780000421
Figure BDA0003360078780000431
Figure BDA0003360078780000441
Figure BDA0003360078780000451
SEQ ID NO.25YDTSESDYY
SEQ ID NO.26RQEAYK
SEQ ID NO.27RSPLNTGTASKLT
SEQ ID NO.28QDMDHENMF
SEQ ID NO.29SYDVKMK
SEQ ID NO.30SPWVSSYEQY
SEQ ID NO.31YDTSENNYY
SEQ ID NO.32RQEAYK
SEQ ID NO.33FANNARLM
SEQ ID NO.34QDMDHENMF
SEQ ID NO.35SYDVKMK
SEQ ID NO.36TDTGNTEAF
SEQ ID NO.37HSTISGTDY
SEQ ID NO.38GLTSNV
SEQ ID NO.39RLRGGSNYKLT
SEQ ID NO.40QHMGHRAMY
SEQ ID NO.41FVYSYEK
SEQ ID NO.42SPIMGLAATHNEQF
SEQ ID NO.43HSTISGTDYI
SEQ ID NO.44GLTSNV
SEQ ID NO.45RDVNTGTASKLT
SEQ ID NO.46QHMGHRAMY
SEQ ID NO.47FVYSYEK
SEQ ID NO.48SRLGLSTDTQY
SEQ ID NO.49YSDSASNYF
SEQ ID NO.50DIRSNV
SEQ ID NO.51PRGLGVTNSL
SEQ ID NO.52QNMNHEYMS
SEQ ID NO.53SMNVEV
SEQ ID NO.54SLVWGTYNEQF
实施例1
用编码mLPA特异性TCR基因的慢病毒转导T细胞
为了评估是否有可能产生具有CD1c自反应性的初级T细胞系，本发明人用表达CDlc自反应mLPA特异性T细胞克隆的TCRα和β链的慢病毒转导来自健康供体的PBMC。本发明人生成了由2A肽连接的编码来自mLPA特异性T细胞克隆DN4.99的TCRα和β基因的慢病毒载体pHR-SIN-EGFP(由V.Cerundolo提供，英国牛津)。为了改善CD1c限制性TCR的同源配对和最小化与内源性TCR链的错配，发明人用人V和小鼠C区产生了嵌合基因，如(Canderan等，2010Canderan G,Gruarin P,Montagna D,Fontana R,Melloni G,Traversari C,Dellabona P,Casorati G.“一种有效的诱导和维持自体非小细胞肺癌特异性人T细胞的策略”,PLoS One.2010，8月9日；5(8):e12014)所述(图1A)。为了产生嵌合TCR链，通过PCR将TRAV38-TRAJ44(SEQ ID NO：15)和TRBV28-TRBJ2-7(SEQ ID NO：16)区段分别与小鼠TRAC和TRBC cDNA融合。
将T细胞从健康供体中纯化并在补充有100U/ml hrIL-2和10ng/ml IL-7(R&D系统公司)的RPMI-FCS完全培养基中用抗CD3/CD28免疫磁珠(Dynal)活化。活化后两天，以5的MOI用500μl完全培养基中的慢病毒感染4×105T细胞。15天后，就小鼠TCRβ表达分选转导的T细胞。用抗CD3/CD28免疫磁珠和细胞因子刺激阳性和阴性细胞，并在10天后检测抗原识别。仅那些显示出表面表达转导的TCR链的T细胞(即仅小鼠Cβ表达细胞)(而不是从相同细胞系分选的未转导的T细胞)(图1B)识别表达CD1c的肿瘤细胞系(图1C)。抗CDlc-mAb抑制识别，强调了免疫反应的特异性。
这些结果表明，能够以CD1c依赖性方式识别白血病母细胞的mLPA特异性T细胞可以在转导mLPA特异性TCR基因后体外产生。这种策略可能是急性白血病免疫治疗相对安全的一种方法。事实上，来自干细胞供体的同种异体T细胞可能被转导，并且它们最终的同种异体反应性可以通过编辑内源TCR基因来预防(Canderan等，2010Canderan G,Gruarin P,Montagna D,Fontana R,Melloni G,Traversari C,Dellabona P,Casorati G.“一种有效的诱导和维持自体非小细胞肺癌特异性人T细胞的策略”(An efficient strategy toinduce and maintain in vitro human T cells specific for autologous non-smallcell lung carcinoma)，PLoS One.2010年8月9日；5(8):e12014.；Provasi等,2012ProvasiE,Genovese P,Lombardo A,Magnani Z,Liu PQ,Reik A,Chu V,Paschon DE,Zhang L,Kuball J,Camisa B,Bondanza A,Casorati G,Ponzoni M,Ciceri F,Bordignon C,Greenberg PD,Holmes MC,Gregory PD,Naldini L,Bonini C.“编辑T细胞对锌指核酸酶和慢病毒基因转移对白血病的特异性”(Editing T cell specificity towards leukemiaby zinc finger nucleases and lentiviral gene transfer).Nat Med.2012May；18(5):807-15)。值得仔细评估的问题是mLPA特异性T细胞在体外也杀伤正常单核细胞。在HSCT过程中使用mLPA特异性过继T细胞治疗的情况下，这种副作用可能在移植时期期间患者可以耐受，此时最小残留白血病的控制是至关重要的。
为了确定转导的T细胞中存在的两种主要T细胞亚群识别白血病细胞的能力，从用表达DN4.99 TCR(图2A)的慢病毒载体转导的PBMC中分选CD4+和CD8+T细胞并测试它们识别CD1c+白血病细胞的能力。CD4+(图2B)和CD8+(图2C)亚群都能够识别THP1-CD1c+靶细胞系。还就杀伤白血病靶细胞评估了TCR转导的CD8+T细胞。只有TCR转导的T细胞特异性杀伤表达CD1c的白血病细胞系THP1，而不是THP1 WT细胞(图2D)。箭头表示与用DN4.99 TCR转导的CD8+T细胞共培养72小时后消失的CD33+THP1白血病细胞系。
这些结果显示，通过转导CD1c自反应TCR，可以成功地重定向CD4+和CD8+T细胞针对CD1c+白血病细胞系，并确认转导的CD8+T细胞对恶性细胞具有强烈的细胞毒性。
产生CDlc自反应TCR文库以靶向白血病细胞
为了研究其他mLPA特异性TCR的抗白血病功效，本发明人从分离自健康供体或白血病患者的五种不同CD1c自反应T细胞克隆中克隆了编码TCR的cDNA。表1报道了TCR的序列。
表1：CD1c自反应性T细胞克隆的TCR Va和Vb部分的CDR3区的序列。
Figure BDA0003360078780000481
对于每个TCR报道了克隆的名称、Va(TRAV)和Vb(TRBV)基因区段的名称、从保守半胱氨酸开始的V区的最后一个氨基酸序列(Va和Vb序列)、N区(N区)、和J区段(Ja序列和Jb序列)的序列。
如表1所示，CD1c自反应T细胞克隆优先表达与TRBV28配对的TRAV38或与TRBV4配对的TRAV26，即使它们是从不同的供体分离的。TCR Vα链的特征在于非常短的N区序列，而Vβ链利用非常相似的Jβ区段。TCR Vα和Vβ链均含有不同的N区，每个区都表征特定的T细胞克隆(在序列中加下划线)。
对于每个TCR，本发明人产生了慢病毒载体，其中编码TCR Vα和Vβ链的cDNA分别与小鼠Cα和Cβ连接，并使用2A肽连接在一起。在慢病毒载体中，嵌合TCR基因之后是IRES序列以允许eGFP报道分子标志物的转录。可以通过简单消化切除GFP基因以获得没有荧光标志物的相同构建体。
为了验证克隆的TCR是否可以在T细胞表面表达，将每种构建体转导入Jurkat 76细胞中，Jurkat 76细胞是不表达内源性TCR的T细胞急性白血病细胞系，但允许任何外源性TCR的膜表达。此外，TCR信号传导机制是完整的，因此Jurkat 76细胞可用于研究外源TCR对抗原的识别。图3A显示了由小鼠Cβ特异性mAb检测到的转导的TCR的表达。五个TCR中有四个在细胞表面表达良好。只有从自反应T细胞克隆DN 7.6.16克隆的TCR是弱表达的。在初始实验中，表达DN4.99和CD4P8E3 TCR的Jurkat 76细胞也在不存在或存在合成脂质抗原mLPA的情况下用THP1-CD1c细胞攻击。如图3B所示，在识别CDlc+THP1细胞后，转导的Jurkat 76细胞上调作为TCR信号传导指示器的活化标志物CD69。TCR转导的Jurkat 76细胞对CD69的上调通过向测定中加入mLPA进一步增强，证实了两种克隆TCR的抗原特异性。
实施例2
鉴定前导CDlc限制性TCR以工程化T细胞用于过继免疫疗法
本发明人将具有看似不同的亲和力的来自5种独立的CD1c自反应T细胞克隆的5种不同的mLPA特异性TCR克隆入慢病毒载体。为了评估这些TCR的表达和相对Ag亲和力，发明人将它们转导入Jurkat 76细胞中，并通过分析细胞表面上的CD69上调来测试它们识别白血病靶细胞的能力。如图3A所示，5种TCR以不同水平表达：5种中有4种(TCR DN4.99，DN4.2，PZ-P8A6和P8E3)被良好表达；一种(TCR DN7.6.16)保留在Jurkat 76细胞内(数据未显示)
此外，4种表达的TCR中的3种(TCR DN4.99，DN4.2，PZ-P8A6)识别表达CD1c的K562急性骨髓性白血病细胞系，并且所述识别进一步通过向靶细胞添加合成的mLPA抗原而增加(图3B)。这些数据证实了本发明TCR的脂质Ag特异性。
发明人注意到Jurkat 76细胞表达CD1c并推断这可能导致用mLPA特异性TCR转导的Jurkat 76细胞的“强直”刺激，增加其对随后的Ag刺激的响应阈值并最终影响它们的功能性响应。为了避免这种混杂因素，发明人因此通过用CRISP/Cas9技术删除β2m基因而产生缺乏所有CD1表面表达的Jurkat 76细胞。用编码Cas9重组酶的质粒与靶向β2m基因的导向RNA一起电穿孔Jurkat 76细胞。45天后，通过细胞分选分离丢失MHC I类表达的电穿孔细胞，并进一步培养至第85天，此时CD1c也从细胞表面下调。Jurkat 76β2m-细胞用5种CD1c自反应性TCR转导，获得了表面表达类似于由Jurkat 76细胞显示的表达(图4A)，并用含或不含mLPA的白血病细胞系K562-CDlc攻击Jurkat 76β2m-细胞。如图4B所示，TCR转导的Jurkat76β2m-细胞显示出与Jurkat 76细胞观察到的相当的识别模式，虽然同时显著增加的CD69RFI表明与Jurkat 76细胞相比Ag响应性大大增加(尽管表面TCR表达总体相似)。
用mLPA脂质滴定法攻击表达TCR DN4.99，TCR DN4.2和TCR PZP8A6的Jurkat 76β2m-细胞以评估转导的TCR的亲和力。
图5A显示了在用于抗原识别的非常相同的Jurkat细胞上，转导的TCR的表达水平。
该测定提供了不依赖于测试TCR的表面表达的Ag亲和力。如图5B所示，TCR DN4.99显示出最高的TCR亲和力(EC50＝100ng/ul)，表明这可以代表装备T细胞用于过继免疫疗法方案的前导TCR。
为了证实可以产生大量表达转导的mLPA特异性TCR的T细胞，将编码TCR DN4.99，TCR DN4.2和TCR PZP8A6的病毒转导至从健康供体的外周血分离的多克隆T细胞中。如图6A所示，超过60％的T细胞表达转导的嵌合TCR。此外，用三种mLPA特异性TCR中的每一种工程化的T细胞特异性识别表达CD1c的两种不同AML细胞系(THP1，K562)(图6B)。
这支持了通过转导mLPA特异性TCR将大量T细胞重新靶向针对表达CD1C的白血病细胞的方法的可行性。
本发明人还评估了表达转导的mLPA特异性TCR的主要CD4+和CD8+T细胞亚群是否都识别表达CD1C的AML细胞系。实际上，如在与转导的T细胞过夜培养后CD33+细胞消失所显示(图7C-D)，TCR转导的CD4+或CD8+T细胞特异性识别(图7A-B)并杀伤THP1-CD1c+白血病细胞。
将mLPA特异性TCR转移到初级多克隆CD4+和CD8+T细胞会产生效应细胞，其可以杀伤表达CD1c的白血病细胞系，这是其临床使用的先决条件。
实施例3
评估用前导mLPA特异性TCR DN4.99工程改造的T细胞的抗白血病功效
发明人首先测试了用前导TCR DN4.99工程改造的总初级T细胞是否也杀伤从AML患者新鲜分离的初级母细胞。如图8所示，TCR DN 4.99转导的T细胞而非空白转导的T细胞，特异性杀伤初级AML母细胞支持了该策略的潜在功效。
图8A证实初级AML母细胞表达CDlc，使其可被mLPA特异性T细胞靶向。图8B显示将mLPA特异性TCR转移到初级多克隆细胞中产生可杀伤表达CD1c的初级白血病母细胞的效应T细胞，这是这些TCR的治疗应用的最终目标。
目前，预计在干细胞移植或诱导化疗后疾病复发时应用采用白血病特异性T细胞的过继细胞疗法。这可以挽救复发的患者。在这种治疗方案中，针对由CD1c自反应性T细胞靶向的提出的白血病进行验证的一个关键点是CD1c在复发的白血病母细胞上的表达以及它们被mLPA特异性T细胞的识别。为了解决这个关键问题，评估了新鲜分离的白血病母细胞的CD1c表达及其在诊断和移植后复发时激活DN4.99 mLPA特异性T细胞的能力。图9显示了代表性的结果。
诊断时初级母细胞上CD1c的表达在移植前复发时维持，并且mLPA特异性T细胞以相似程度识别原发性和复发性白血病细胞。
总体而言，图9A和B中显示的结果支持在干细胞移植或诱导化疗后疾病复发时用重定向的mLPA特异性T细胞的过继细胞疗法的应用。
实施例4
评估用前导mLPA特异性TCR DN4.99工程改造的T细胞的安全性
发明人还评估了用前导mLPA特异性TCR DN4.99工程改造的T细胞的过继细胞疗法的安全性。主要问题是排除转导的T细胞可能的有害的靶向肿瘤外识别。通过与GM-CSF和IL-4培养，mLPA在白血病细胞中和源自循环单核细胞的原发性活化的树突细胞中高度富集，而在稳定状态下的循环单核细胞和B细胞中非常低。原理上，这种Ag表达模式应该选择性地将用前导mLPA特异性TCR DN4.99工程改造的T细胞的反应性靶向白血病细胞和正常成熟DC的选定子集。此外，CD1c表达在造血前体中不存在(Lepore,de Lalla等J Exp Med2014Lepore M,de Lalla C,Gundimeda SR,Gsellinger H,Consonni M,Garavaglia C,Sansano S,Piccolo F,Scelfo A,
Figure BDA0003360078780000501
D,Montagna D,Locatelli F,Bonini C,Bondanza A,Forcina A,Li Z,Ni G,Ciceri F,
Figure BDA0003360078780000502
P,Xia C,Mori L,Dellabona P,Casorati G,De Libero G.“将人T细胞靶向CD1c+白血病的新型自身脂质抗原”(A novelself-lipid antigen targets human T cells against CD1c+leukemias).J ExpMed.2014Jun 30；211(7):1363-77)，排除了维持正常血细胞形成所必需的细胞的识别。然而，作为评估体外安全性的进一步措施，发明人已经研究了前导mLPA特异性TCR DN4.99与常见且丰富的磷脂的可能的交叉反应性，所述磷脂与mLPA共享结构特征并且可能引发肿瘤外T细胞的识别。磷脂酰丝氨酸(PS)是所有细胞和血小板膜的组分，而溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)是在循环中以及在生物膜中以高浓度存在的磷脂(图10)。
如图11所示，表达mLPA特异性TCR DN4.99(A)或TCR DN4.2(B)的Jurkat 76细胞不识别PS和三种不同的LPE物质。相反，细胞被mLPA活化，正如在与载脂质K562-CD1c细胞共培养后，TCR转导的Jurkat 76细胞上CD69表达的上调所示。
这支持了使用mLPA特异性TCR工程改造的T细胞的过继性细胞疗法的安全性，因为它们将选择性识别白血病富集的mLPA抗原，而不是具有类似结构的其他广泛分布且丰富的磷脂。
还评估了TCR转导的T细胞控制NSG小鼠中白血病细胞的能力。将表达CD1c的急性白血病细胞系或初级母细胞移植入免疫缺陷NSG小鼠中，随后转移用mLPA特异性TCR转导或未转导的患者自体T细胞和多克隆同种异体。为了追踪体内白血病进展，发明人已经产生了表达萤光素酶和CDlc或萤光素酶而没有CDlc的THP-1细胞(数据未显示)。原发性白血病的进展通过流式细胞术在血液样品上监测。
序列表
<110> 圣拉斐尔医院有限公司
圣拉斐尔基金会中心
<120> TCR及其用途
<130> 182546F1 1PWCN
<150> EP15187993.9
<151> 2015-10-01
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<220>
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<400> 1
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Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
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50 55 60
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Leu Lys Ile Ser Asp Ser Gln Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys
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<212> PRT
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<223> 合成的
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Asp Arg Cys Asp Arg Leu Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys
65 70 75 80
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85 90 95
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<223> 合成的
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Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
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<212> DNA
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atcgctgaag acagaaagtc cagtaccttg atcctgcacc gtgctacctt gagagatgct 300
gctgtgtact actgcatcct gagagacgta aataccggca ctgccagtaa actcaccttt 360
gggactggaa caagacttca ggtcacgctc gat 393
<210> 22
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcagg tcccatagac 60
actgaagtta cccagacacc aaaacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120
aaatgtgaac aacatatggg gcacagggct atgtattggt acaagcagaa agctaagaag 180
ccaccggagc tcatgtttgt ctacagctat gagaaactct ctataaatga aagtgtgcca 240
agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctctcttaa accttcacct acacgccctg 300
cagccagaag actcagccct gtatctctgc gccagcagcc ggctaggact atccacggat 360
acgcagtatt ttggcccagg cacccggctg acagtgctc 399
<210> 23
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
atgacatcca ttcgagctgt atttatattc ctgtggctgc agctggactt ggtgaatgga 60
gagaatgtgg agcagcatcc ttcaaccctg agtgtccagg agggagacag cgctgttatc 120
aagtgtactt attcagacag tgcctcaaac tacttccctt ggtataagca agaacttgga 180
aaaggacctc agcttattat agacattcgt tcaaatgtgg gcgaaaagaa agaccaacga 240
attgctgtta cattgaacaa gacagccaaa catttctccc tgcacatcac agagacccaa 300
cctgaagact cggctgtcta cttctgtgca gccccccgcg ggctgggagt taccaactca 360
ctttcgggaa ggggaccaaa ctctcggtca taccaaaat 399
<210> 24
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
atgccccagc tccttggcta tgtggtcctt tgccttctag gagcaggccc cctggaagcc 60
caagtgaccc agaacccaag atacctcatc acagtgactg gaaagaagtt aacagtgact 120
tgttctcaga atatgaacca tgagtatatg tcctggtatc gacaagaccc agggctgggc 180
ttaaggcaga tatactattc aatgaatgtt gaggtgactg ataagggaga tgttcctgaa 240
gggtacaaag tctctcgaaa agagaagagg aatttccccc tgatcctgga gtcgcccagc 300
cccaaccaga cctctctgta cttctgtgcc agcagtttgg tctggggaac ctacaatgag 360
cagttcttcg ggccagggac acggctcacc gtgcta 396
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Tyr Asp Thr Ser Glu Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Arg Gln Glu Ala Tyr Lys
1 5
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Arg Ser Pro Leu Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr
1 5 10
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gln Asp Met Asp His Glu Asn Met Phe
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys
1 5
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Ser Pro Trp Val Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Tyr Asp Thr Ser Glu Asn Asn Tyr Tyr
1 5
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Arg Gln Glu Ala Tyr Lys
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Phe Ala Asn Asn Ala Arg Leu Met
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gln Asp Met Asp His Glu Asn Met Phe
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Thr Asp Thr Gly Asn Thr Glu Ala Phe
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Gly Leu Thr Ser Asn Val
1 5
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Arg Leu Arg Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Gln His Met Gly His Arg Ala Met Tyr
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys
1 5
<210> 42
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Ser Pro Ile Met Gly Leu Ala Ala Thr His Asn Glu Gln Phe
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
His Ser Thr Ile Ser Gly Thr Asp Tyr Ile
1 5 10
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gly Leu Thr Ser Asn Val
1 5
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Arg Asp Val Asn Thr Gly Thr Ala Ser Lys Leu Thr
1 5 10
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Gln His Met Gly His Arg Ala Met Tyr
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Ser Arg Leu Gly Leu Ser Thr Asp Thr Gln Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Tyr Ser Asp Ser Ala Ser Asn Tyr Phe
1 5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Asp Ile Arg Ser Asn Val
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Pro Arg Gly Leu Gly Val Thr Asn Ser Leu
1 5 10
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gln Asn Met Asn His Glu Tyr Met Ser
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Ser Met Asn Val Glu Val
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Ser Leu Val Trp Gly Thr Tyr Asn Glu Gln Phe
1 5 10
<210> 55
<211> 881
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
gaattcgccc ttctgcagca gggacctgtg agcatggcat gccctggctt cctgtgggca 60
cttgtgatct ccacctgtct tgaatttagc atggctcaga cagtcactca gtctcaacca 120
gagatgtctg tgcaggaggc agagaccgtg accctgagct gcacatatga caccagtgag 180
agtgattatt atttattctg gtacaagcag cctcccagca ggcagatgat tctcgttatt 240
cgccaagaag cttataagca acagaatgca acagagaatc gtttctctgt gaacttccag 300
aaagcagcca aatccttcag tctcaagatc tcagactcac agctggggga tgccgcgatg 360
tatttctgtg cttataggag ccccttaaat accggcactg ccagtaaact cacctttggg 420
actggaacaa gacttcaggt cacgctcgat atccagaacc cagaacctgc tgtgtaccag 480
ttaaaagatc ctcggtctca ggacagcacc ctctgcctgt tcaccgactt tgactcccaa 540
atcaatgtgc cgaaaaccat ggaatctgga acgttcatca ctgacaaaac tgtgctggac 600
atgaaagcta tggattccaa gagcaatggg gccattgcct ggagcaacca gacaagcttc 660
acctgccaag atatcttcaa agagaccaac gccacctacc ccagttcaga cgttccctgt 720
gatgccacgt tgaccgagaa aagctttgaa acagatatga acctaaactt tcaaaacctg 780
tcagttatgg gactccgaat cctcctgctg aaagtagcgg gatttaacct gctcatgacg 840
ctgaggctgt ggtccagttg aggatcccga agggcgaatt c 881
<210> 56
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
cccaccatgg gaatcaggct cctctgtcgt gtggcctttt gtttcctggc tgtaggcctc 60
gtagatgtga aagtaaccca gagctcgaga tatctagtca aaaggacggg agagaaagtt 120
tttctggaat gtgtccagga tatggaccat gaaaatatgt tctggtatcg acaagaccca 180
ggtctggggc tacggctgat ctatttctca tatgatgtta aaatgaaaga aaaaggagat 240
attcctgagg ggtacagtgt ctctagagag aagaaggagc gcttctccct gattctggag 300
tccgccagca ccaaccagac atctatgtac ctctgtgcca gcagtccatg ggtaagctcc 360
tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggatct gagaaatgtg 420
actccaccca aggtctcctt gtttgagcca tcaaaagcag agattgcaaa caaacaaaag 480
gctaccctcg tgtgcttggc caggggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaatggca aggaggtcca cagtggggtc agcacggacc ctcaggccta caaggagagc 600
aattatagct actgcctgag cagccgcctg agggtctctg ctaccttctg gcacaatcct 660
cgaaaccact tccgctgcca agtgcagttc catgggcttt cagaggagga caagtggcca 720
gagggctcac ccaaacctgt cacacagaac atcagtgcag aggcctgggg ccgagcagac 780
tgtggaatca cttcagcatc ctatcatcag ggggttctgt ctgcaaccat cctctatgag 840
atcctactgg ggaaggccac cctatatgct gtgctggtca gtggcctggt gctgatggcc 900
atggtcaaga aaaaaaattc ctgagac 927
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 58
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
atccagaacc cagaacctgc tgtgtaccag ttaaaagatc ctcggtctca ggacagcacc 60
ctctgcctgt tcaccgactt tgactcccaa atcaatgtgc cgaaaaccat ggaatctgga 120
acgttcatca ctgacaaaac tgtgctggac atgaaagcta tggattccaa gagcaatggg 180
gccattgcct ggagcaacca gacaagcttc acctgccaag atatcttcaa agagaccaac 240
gccacctacc ccagttcaga cgttccctgt gatgccacgt tgaccgagaa aagctttgaa 300
acagatatga acctaaactt tcaaaacctg tcagttatgg gactccgaat cctcctgctg 360
aaagtagcgg gatttaacct gctcatgacg ctgaggctgt ggtccagt 408
<210> 59
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
gaggatctga gaaatgtgac tccacccaag gtctccttgt ttgagccatc aaaagcagag 60
attgcaaaca aacaaaaggc taccctcgtg tgcttggcca ggggcttctt ccctgaccac 120
gtggagctga gctggtgggt gaatggcaag gaggtccaca gtggggtcag cacggaccct 180
caggcctaca aggagagcaa ttatagctac tgcctgagca gccgcctgag ggtctctgct 240
accttctggc acaatcctcg aaaccacttc cgctgccaag tgcagttcca tgggctttca 300
gaggaggaca agtggccaga gggctcaccc aaacctgtca cacagaacat cagtgcagag 360
gcctggggcc gagcagactg tggaatcact tcagcatcct atcatcaggg ggttctgtct 420
gcaaccatcc tctatgagat cctactgggg aaggccaccc tatatgctgt gctggtcagt 480
ggcctggtgc tgatggccat ggtcaagaaa aaaaattcct ga 522
<210> 60
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
atccagaacc ccgaccccgc cgtgtaccag ctgcgggaca gcaagagcag cgacaagagc 60
gtgtgcctgt tcaccgactt cgacagccag accaacgtga gccagagcaa ggactccgac 120
gtgtacatca ccgacaagtg cgtgctggac atgcggagca tggacttcaa gagcaactcc 180
gccgtggcct ggtccaacaa gagcgacttc gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatc 240
atccccgagg acaccttttt ccccagcccc gagagcagct gcgacgtgaa actggtggag 300
aagagcttcg agaccgacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat cggcttcaga 360
atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaac ctgctgatga ccctgcggct gtggagcagc 420
<210> 61
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
gaggacctga agaacgtgtt cccccccgag gtggccgtgt tcgagcccag cgaggccgag 60
atcagccaca cccagaaagc caccctggtc tgcctggcca ccggcttcta ccccgaccac 120
gtggagctgt cttggtgggt gaacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg caccgacccc 180
cagcccctga aagagcagcc cgccctgaac gacagccggt actgcctgag cagccggctg 240
agagtgagcg ccaccttctg gcagaacccc cggaaccact tccggtgcca ggtgcagttc 300
tacggcctga gcgagaacga cgagtggacc caggacagag ccaagcccgt gacccagatc 360
gtgagcgccg aggcctgggg cagagccgac tgcggcttca ccagcgagag ctaccagcag 420
ggcgtgctgt ccgccaccat cctgtacgag atcctgctgg gcaaggccac actgtacgcc 480
gtgctggtgt ccgccctggt gctgatggct atggtgaagc ggaaggacag ccggggctga 540

Claims (31)

1.一种分离或纯化的T细胞受体(TCR)，包含：
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRa1)氨基酸序列：SEQ.ID NO:25,31,37,43和49，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRa2)氨基酸序列：SEQ.ID NO:26,32,38,44和50，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRa3)氨基酸序列：SEQ.ID NO:27,33,39,45和51，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRb1)氨基酸序列：SEQ.ID NO:28,34,40,46和52，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRb2)氨基酸序列：SEQ.ID NO:29,35,41,47和53，和；
-与选自下组的氨基酸序列具有至少80％相同性的互补决定区(CDRb3)氨基酸序列：SEQ.ID NO:30,36,42,48和54。
2.如权利要求1所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其包含：
-与SEQ ID NO：25具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：26具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：27具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：28具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：30具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：31具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：32具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：33具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：34具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：35具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：36具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：37具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：38具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：39具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：40具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：41具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：42具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：43具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：44具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：45具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：46具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：47具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：48具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：49具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：50具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：51具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：52具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：53具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：54具有至少80％相同性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其包含：
-与SEQ ID NO：25具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：26具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：27具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：28具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：29具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：30具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：31具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：32具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：33具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：34具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：35具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：36具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：37具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：38具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：39具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：40具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：41具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：42具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：43具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：44具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：45具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：46具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：47具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：48具有至少80％相同性的氨基酸序列，或
-与SEQ ID NO：49具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：50具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：51具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQID NO：52具有至少80％相同性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO：53具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID NO：54具有至少80％相同性的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其包含：
-SEQ ID NO:25,和SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28,和SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，或
-SEQ ID NO:31,和SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34,和SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，或
-SEQ ID NO:37,和SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40,和SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，或
-SEQ ID NO:43,和SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46,和SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，或
-SEQ ID NO:49,和SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52,和SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54。
5.分离或纯化的TCR，包含(a)与选自SEQ ID NO：1、3、5、7或9的序列具有至少80％相同性的氨基酸序列，和(b)与选自SEQ ID NO：2、4、6、8或10的序列具有至少80％相同性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的分离或纯化的TCR或功能性变体，其包含与SEQ ID No.1具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.2具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.3具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.4具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.5具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.6具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.7具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.8具有至少80％相同性的氨基酸序列，或者
-与SEQ ID No.9具有至少80％相同性的氨基酸序列和与SEQ ID No.10具有至少80％相同性的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其包含：
-SEQ ID NO:1,和SEQ ID NO:2或
-SEQ ID NO:3,和SEQ ID NO:4或
-SEQ ID NO:5,和SEQ ID NO:6或
-SEQ ID NO:7,和SEQ ID NO:8或
-SEQ ID NO:9,和SEQ ID NO:10。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分离或纯化的TCR，其包含恒定区的鼠、人或人源化氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的分离或纯化的TCR，其包含与SEQ ID No.11具有至少80％相同性的氨基酸序列或与SEQ ID No.12具有至少80％相同性的氨基酸序列。
10.如权利要求8所述的分离或纯化的TCR，其包含与SEQ ID No.13具有至少80％相同性的氨基酸序列或与SEQ ID No.14具有至少80％相同性的氨基酸序列。
11.如前述权利要求中任一项所述的分离或纯化的TCR，其为多聚体形式。
12.如前述权利要求中任一项所述的分离或纯化的TCR，其对与自身脂质相关的CD1c分子具有特异性。
13.如权利要求12所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其中所述自身脂质是甲基溶血磷脂酸或其衍生物。
14.如权利要求13所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其中所述甲基溶血磷脂酸选自甲基溶血磷脂酸(mLPA)，C16-甲基溶血磷脂酸(C16-mLPA)或C18-甲基溶血磷脂酸(C18-mLPA)或其衍生物。
15.一种分离或纯化的核酸，其包含编码如权利要求1-14中任一项所述的TCR的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的分离或纯化的核酸，其中所述核苷酸序列是密码子优化的。
17.如权利要求15或16所述的分离或纯化的核酸，其中所述核苷酸序列包含a)与选自SEQ ID NO：15、17、19、21或23的序列具有至少80％相同性的核苷酸序列，和b)与选自SEQID NO：16、18、20、22或24的序列具有至少80％相同性的核苷酸序列。
18.一种重组表达载体，其包含权利要求15-17所述的核酸。
19.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求18所述的重组表达载体，优选所述宿主细胞是T细胞。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的TCR，权利要求15-17所述的核酸，权利要求18所述的重组表达载体，权利要求19所述的宿主细胞和药学上可接受的运载体。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其还包含甲基溶血磷脂酸(mLPA)。
22.如权利要求1-14中任一项所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，如权利要求15-17所述的核酸，如权利要求18所述的重组表达载体，如权利要求19所述的宿主细胞或如权利要求20或21所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防血液病症。
23.如权利要求1-14中任一项所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，如权利要求15-17所述的核酸，如权利要求18所述的重组表达载体，如权利要求19所述的宿主细胞或如权利要求20或21所述的药物组合物，其用于权利要求22中所述的用途，其中所述血液病症的特征在于来源于造血前体的未成熟和异常细胞的血液和骨髓积聚。
24.如权利要求1-14中任一项所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，如权利要求15-17所述的核酸，如权利要求18所述的重组表达载体，如权利要求19所述的宿主细胞或如权利要求20或21所述的药物组合物，其用于权利要求22或23中所述的用途，其中所述血液病症为急性白血病，优选原发性急性髓性白血病或B细胞急性白血病。
25.用于权利要求21-23中所述用途的分离或纯化的T细胞受体(TCR)、核酸、重组表达载体、宿主细胞或药物组合物，其还包含给予试剂或治疗处理，所述试剂优选是甲基溶血磷脂酸(mLPA)或优选治疗处理是造血干细胞移植(HSCT)或化疗处理，所述化疗处理优选自：天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱，氮杂胞苷。
26.如权利要求1-14中任一项所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，如权利要求15-17所述的核酸，如权利要求18所述的重组表达载体，如权利要求19所述的宿主细胞或如权利要求20或21所述的药物组合物，其用于在造血干细胞移植(HSCT)后防止血液病症复发的方法中。
27.如权利要求1-14中任一项所述的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其用于诊断血液病症的方法，优选所述血液病症的特征在于来自造血前体的未成熟和异常细胞的血液和骨髓积聚，优选所述血液病症为急性白血病，优选原发性急性髓性白血病或B细胞急性白血病。
28.如权利要求27所述用途的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其中所述方法包括加入甲基溶血磷脂酸(mLPA)。
29.如权利要求27或28所述用途的分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR为可溶性和/或多聚体形式。
30.一种生产如权利要求19所述的宿主细胞的方法，包括用如权利要求1-14中任一项所述的TCR或如权利要求15-17所述的核酸或如权利要求18所述的载体转导所述宿主细胞的步骤。
31.如权利要求30所述的方法，还包括扩增所述宿主细胞，优选在甲基溶血磷脂酸(mLPA)存在下扩增所述宿主细胞。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1551886A (zh) * 2000-12-29 2004-12-01 �Ϳ���ҽҩ��˾ 用于选择性癌症治疗的特异性人抗体
WO2008028601A2 (de) * 2006-09-04 2008-03-13 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur verbesserung der spezifischen effektorfunktion von einzelketten- antigen-erkennenden genetischen konstrukten (scarc) durch deren murinisierung
WO2013039889A1 (en) * 2011-09-15 2013-03-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-a1- or hla-cw7-restricted mage
WO2015077615A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Engineered high-affinity human t cell receptors

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10654907B2 (en) * 2014-01-29 2020-05-19 University Health Network Methods and compositions for producing a cell expressing a T cell receptor
WO2016070119A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Baylor College Of Medicine Survivin specific t-cell receptor targeting tumor but not t cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1551886A (zh) * 2000-12-29 2004-12-01 �Ϳ���ҽҩ��˾ 用于选择性癌症治疗的特异性人抗体
WO2008028601A2 (de) * 2006-09-04 2008-03-13 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur verbesserung der spezifischen effektorfunktion von einzelketten- antigen-erkennenden genetischen konstrukten (scarc) durch deren murinisierung
WO2013039889A1 (en) * 2011-09-15 2013-03-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-a1- or hla-cw7-restricted mage
WO2015077615A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Engineered high-affinity human t cell receptors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARCO LEPORE等: "A novel self-lipid antigen targets human T cells against CD1c+ leukemias", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 211, no. 7, 30 June 2014 (2014-06-30), pages 1373, XP008171017, DOI: 10.1084/jem.20140410 *
郝佩佩等: "TCR基因修饰T细胞研究进展", 中华微生物学和免疫学杂志, vol. 32, no. 5, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 473 - 476 *

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