CN114174484A

CN114174484A - 用于从基于三酰基甘油的油中去除叶绿素衍生物的二氧化硅吸附剂

Info

Publication number: CN114174484A
Application number: CN202080031739.2A
Authority: CN
Inventors: C·格兰姆斯; 德米特里厄斯·米克斯; C·利巴纳蒂; C·L·G·代顿
Original assignee: WR Grace and Co Conn
Current assignee: WR Grace and Co Conn
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2022-03-11
Also published as: US20230191360A1; EP3947614A1; JP2022528344A; KR20210145198A; EP3947614A4; WO2020197763A1

Abstract

本发明涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的吸附剂。具体地，本公开涉及一种用于从油、特别是基于三酰基甘油的油中去除包括叶绿素衍生物和/或痕量金属在内的杂质的改进的硅胶吸附剂。所述吸附剂包含用碱土金属氧化物诸如氧化镁处理过的硅胶，并且具有约7或更大的pH以及约3重量％或更大的水含量。

Description

用于从基于三酰基甘油的油中去除叶绿素衍生物的二氧化硅吸附剂

技术领域

本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法。具体地，本公开涉及一种用于从油中去除包括叶绿素衍生物和/或痕量金属在内的杂质的改进方法，并且涉及用于该方法的改进的基于二氧化硅的吸附剂。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已通过电子方式以ASCII格式提交并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2019年3月26日，命名为‘35893-513_SEQ_LIST.txt’，大小为36,864字节。

背景技术

通过压榨或溶剂提取方法获得的粗制三酰基甘油类油是三酰基甘油、磷脂、甾醇、生育酚、二酰基甘油、游离脂肪酸、痕量金属、叶绿素、β-胡萝卜素和其他微量化合物的复杂混合物。希望去除磷脂、游离脂肪酸、痕量金属、叶绿素和β-胡萝卜素，以产生味道淡、颜色浅和保质期长的优质全精炼油或色拉油。

去除磷脂会产生与三酰基甘油类油的精炼相关联的最大量的中性油损失。去除叶绿素会产生与基于三酰基甘油的油的精炼相关联的第二大量的中性油损失。

几种不同的技术可用于去除磷脂，包括水脱胶、酶辅助水脱胶、酸脱胶、苛性碱精炼和酶处理。

水脱胶通常应用于含有大量可水合磷脂的粗制油。所获得的磷脂由于具有温和的特性而可以用作卵磷脂(一种天然乳化剂)。通过该技术获得的油在行业中通常被称为“脱胶”，尽管仅部分脱胶。由于水脱胶油仍含有大量磷脂、尤其是不可水合磷脂，因此可能需要使用其他工艺技术(诸如苛性碱精炼或磷脂酶A(PLA)脱胶)来产生稳定性高和颜色低的成品高质量油。

在水脱胶过程中，在搅拌下将水添加到粗制油中，以有助于油中存在的磷脂的水合。磷脂或“胶”的水合使胶膨胀并凝聚成絮凝剂，随后将该絮凝剂从油的剩余部分分离。来自水脱胶过程的油损失可能是显著的，对精炼油工艺成本的整体经济平衡产生负面影响。

酶辅助水脱胶通常应用于含有大量可水合磷脂的粗制油，其中目标是使所有可水合磷脂反应并将它们转化成二酰基甘油，从而增加油收率，同时保持油中的不可水合磷脂。用于该过程的酶是磷脂酶C(PLC)和磷脂酰肌醇磷脂酶(PI-PLC)。

在酶辅助水脱胶过程中，在搅拌下将水和PLC添加到粗制油中。然后使酶在剪切混合下与油中的磷脂反应，以有助于磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和PI在油中转化成二酰基甘油。重相(水、变性蛋白质和磷化合物)具有高于油的比重，并且可通过沉降、过滤或离心的工业实践来分离。酶辅助水脱胶过程主要仅去除可水合磷脂。作为磷脂酸的盐测量的其余磷脂可以在后续加工操作中去除。

当目标是完全去除磷脂时，酸脱胶通常应用于粗制油。所获得的油在行业上通常被称为“超脱胶”或“完全脱胶”。将粗制油用磷酸或柠檬酸处理。该酸改善了不可水合磷脂(NHP)的亲水性质，从而有助于它们的去除。然后将水添加到酸处理的粗制油中，并且将油混合以有助于磷脂的水合。磷脂或“胶”的水合使胶膨胀并凝聚成絮凝剂，随后将该絮凝剂去除。酸脱胶过程去除了大多数磷脂，但脱胶油中仍有足够的磷脂需要额外处理。如在水脱胶过程中一样，一些油被乳化，并且被认为是工艺损失，对精炼油工艺成本的整体经济平衡产生负面经济影响。

当目标是去除所有磷脂和游离脂肪酸时，苛性碱精炼通常应用于粗制油或水脱胶油。将粗制油或水脱胶油用磷酸或柠檬酸处理。该酸改善了NHP的亲水性质，从而有助于它们的去除。将稀释的氢氧化钠溶液添加到酸处理的油中。苛性碱溶液中和游离脂肪酸(产生钠皂)，中和过量的酸，并在产生钠皂的情况下有助于水合和乳化所有剩余的磷脂。将氢氧化钠溶液/油混合，然后通过沉降、过滤或通过离心在工业上分离。然后将苛性碱处理的油“洗涤”并再次离心。来自离心机的油被称为“精炼后的”，并且水通常被称为“洗涤水”。对于食品应用，通常对“精炼后的”油进行漂白和除臭，以产生色拉油。水洗涤的替代方案是用吸附硅胶处理苛性碱处理的油，并过滤出在初始离心中未去除的残余皂和磷脂。

当目标是完全去除磷脂时，使用“酶精炼”或“酶脱胶”。一般来讲，现有技术的酶脱胶处理已对先前已通过其他方法中的一种(通常为水脱胶)进行脱胶的油实施。对于食品应用，依次对酶脱胶的油进行漂白和除臭(在行业中被称为“物理精炼”的工艺)。酶脱胶提供比水、酸或苛性碱脱胶更好的油收率，具有改善的经济结果。

酶反应会改变磷脂的性质，从而裂解一些磷脂部分。这降低了磷脂的乳化特性，使得当从油中分离胶时损失较少的油，从而节省了油。对磷脂表现出活性的酶通常称为“磷脂酶”。磷脂酶的类型基于酶在磷脂分子上反应的位置，并且被称为PLA1、PLA2、PLC和PLD。不同类型的磷脂酶在与磷脂反应时将产生不同的化合物。

具有磷脂酶活性的商业PLA1酶是

Ultra和QuaraLowP。具有磷脂酶活性的商业PLA2酶是Rohalase Xtra和LysoMax。已知这些产品在与脱胶油和1-1.5％柠檬酸-NaOH缓冲液在4.5＜pH＜7.0和40℃＜T＜55℃下混合时会产生极性溶血磷脂和极性脂肪酸。PLA1选择性地水解甘油主链上与磷酸根官能团相对的脂肪酸，并且PLA2选择性地水解磷脂的甘油主链中心的脂肪酸。PLA对与它们反应的磷脂没有选择性。

所得的反应会产生溶血磷脂和脂肪酸。溶血磷脂分子失去了一个亲水性官能团，反应位点处剩余的醇基团是亲水性的。现在具有两个亲水性位点，溶血磷脂分子是水溶性的，并且失去了其乳化特性。因此，PLA1或PLA2脱胶过程通过不再与胶一起去除任何中性油而减少了精炼损失，唯一的损失是原始磷脂分子。

在本领域中已知的是PLC酶通过选择性地水解磷酸根官能团来与磷脂反应。所得的反应产生二酰基甘油(“DAG”)和磷脂基团。二酰基甘油分子不再具有磷酸根官能团，不需要去除。PLC脱胶过程通过在仅去除磷酸根官能团的同时保留原始磷脂分子来减少精炼损失。然而，PLC不与油中存在的所有磷脂反应。一般来讲，PLC不与磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇(PI)反应。结合PLC使用的PI-PLC能够反应并去除PC、PE和PI。但在水脱胶后，不可水合磷脂仍保留在油中。因此，酶辅助水脱胶处理的油必须用苛性碱进一步处理以去除残留的胶，或者可用PLA1或PLA2进一步处理。

来自油料种子(诸如大豆和卡诺拉菜籽)和油料果实(诸如棕榈和藻类源油)的三酰基甘油类油包含叶绿素。在油生产过程的许多阶段去除叶绿素，包括种子破碎、油提取、脱胶、苛性碱处理和漂白步骤。在这些过程中的最后一个中，去除漂白过程中残留的叶绿素以达到可接受的水平。通常在漂白步骤中从油中去除该叶绿素，该漂白步骤涉及加热油并使其通过吸附剂以去除叶绿素和影响成品油的外观和/或稳定性的其他有色化合物。

高水平的叶绿素颜料会产生不期望的颜色，并在储存过程中引起油氧化，从而导致油变质。在食用油加工工业中，采用漂白步骤将叶绿素水平降低至低至0.02ppm，以在颜色和感官方面保证油品质。该漂白步骤增加了加工成本，并且由于夹带在漂白粘土中而降低了油收率。然后，必须对“废”粘土进行环境处理，并且“废”粘土由于具有酸处理的材料和吸附的油(约30重量％)的自燃性质而成为运输的危险材料。

在油加工期间，叶绿素通过从卟啉(氯)环失去镁离子而被改性成称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。通常，在加工期间，油中的脱镁叶绿素比叶绿素更丰富。脱镁叶绿素可以进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见Behavior of Chlorophyll Derivatives in CanolaOil Processing”，JAOCS，第9卷，1993年9月，第837-841页)。焦脱镁叶绿素主要是在植物油的加工过程中形成的(参见例如The lipid handbook，Frank D.Gunstone，JohnL.Harwood，Albert J.Dijkstra.2007年，第3版，第56页)。叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素以A型和B型两种形式存在。A组分在C7位置处具有甲基基团。B组分在C7位置处具有醛。

从WO2010/143149和WO2013/160372中已知使用酶来去除植物油中的焦脱镁叶绿素。WO2010/143149公开了使用能够水解来源于例如普通小麦(Triticum aestivum)和莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的焦脱镁叶绿素的酶来处理含焦脱镁叶绿素的组合物的方法。WO2013/160372公开了例如来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)和普通小麦的若干种叶绿素酶，这些酶能够转化油中的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。

二氧化硅也被用作从基于三酰基甘油的油中去除杂质的吸附剂。已用于纯化油的二氧化硅的示例包括在美国专利号9,295,810、4,781,864和9,493,748中所述的那些。然而，此类二氧化硅不能完全有效地从油中去除杂质，并且即使在二氧化硅处理之后，不期望水平的杂质(包括着色剂，诸如叶绿素衍生物)仍可能保留在油中。

因此，需要能够从基于三酰基甘油的油中去除杂质的替代二氧化硅。

发明内容

在一个方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，所述方法包括使所述油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅，其中所述吸附剂具有约7或更大(包括约7至约10)的pH，包含以干重计约0.1重量％或更大的碱土金属氧化物(诸如MgO)，并且具有约3重量％或更大、优选约10重量％或更大、或约25重量％至约75重量％的水含量。

在一个具体方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，所述方法包括使所述油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅，其中所述吸附剂具有约7至约10的pH，并且包含以干重计约2.5重量％至约15重量％、或约5重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％的MgO，并且具有约25重量％至约75重量％的水含量。

在另一方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，所述方法包括：使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含所述多肽的组合物接触以产生经脱色酶处理的油，以及使所述经脱色酶处理的油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅，其中所述吸附剂具有约7或更大(例如约7至约10)的pH，包含以干重计约0.1重量％或更大的碱土金属氧化物(诸如MgO)，并且具有约3重量％或更大、优选约10重量％或更大、或约25重量％至约75重量％的水含量。

在另一方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，所述方法包括：使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含所述多肽的组合物接触以产生经脱色酶处理的油，以及使所述经脱色酶处理的油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅；其中所述吸附剂具有约7至约10的pH，并且包含以干重计约2.5重量％至约15重量％、或约5重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％的MgO，并且具有约25重量％至约75重量％的水含量。

在另一方面，本公开涉及一种用于处理包含焦脱镁叶绿素的油的方法，所述方法包括：使所述油与具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽或包含所述多肽的组合物接触，其中焦脱镁叶绿素转化成焦脱镁叶绿酸，并且任选地，其中脱镁叶绿素转化成脱镁叶绿酸，以产生经焦脱镁叶绿素酶处理的油，以及使所述经焦脱镁叶绿素酶处理的油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅，其中所述吸附剂具有约7或更大(例如约7至约10)的pH，包含以干重计约0.1重量％或更大的碱土金属氧化物(诸如MgO)，并且具有约3重量％或更大、优选约10重量％或更大、或约25重量％至约75重量％的水含量。

在另一方面，本公开涉及一种用于处理包含焦脱镁叶绿素的油的方法，所述方法包括：使所述油与具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽或包含所述多肽的组合物接触，其中焦脱镁叶绿素转化成焦脱镁叶绿酸，并且任选地，其中脱镁叶绿素转化成脱镁叶绿酸，以产生经焦脱镁叶绿素酶处理的油，以及使所述经焦脱镁叶绿素酶处理的油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅；其中所述吸附剂具有约7至约10的pH，并且包含以干重计约2.5重量％至约15重量％、或约5重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％的MgO，并且具有约25重量％至约75重量％的水含量。

在另一方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，所述方法包括：使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含所述多肽的组合物接触以产生经脱色酶处理的油，以及使所述经脱色酶处理的油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅，其中所述吸附剂具有约7或更大(例如约7至约10)的pH，包含以干重计约0.1重量％或更大的碱土金属氧化物(诸如MgO)，并且具有约3重量％或更大、优选约10重量％或更大(诸如约25重量％至约75重量％)的水含量：并且其中与接触所述吸附剂之前所述组合物中叶绿素衍生物的总浓度相比，所述处理使所述组合物中叶绿素衍生物的总浓度降低至少5重量％。

在另一方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，所述方法包括：使所述油与具有脱色酶活性的多肽或包含所述多肽的组合物接触以产生经脱色酶处理的油，以及使所述经脱色酶处理的油与吸附剂接触，所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的二氧化硅；其中所述吸附剂具有约7至约10的pH，并且包含以干重计约2.5重量％至约15重量％、或约5重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％的MgO，并且具有约25重量％至约75重量％的水含量；并且其中与接触所述吸附剂之前所述组合物中叶绿素衍生物的总浓度相比，所述处理使所述组合物中叶绿素衍生物的总浓度降低至少5重量％。

在另一方面，用于本公开的方法中的所述多肽是具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，其中所述多肽选自由以下项组成的组：

a.与SEQ ID NO：1的氨基酸1至318具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％或者100％同一性的分离多肽；以及，

b.由与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％或者100％同一性的核酸序列编码的多肽。

在一个实施方案中，用于本公开的方法中的所述多肽将叶绿素底物转化成叶绿素产物。叶绿素底物可选自由以下项组成的组：叶绿素、脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素以及它们的组合，并且叶绿素产物可选自由以下项组成的组：脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸以及它们的组合。

在一个方面，所述油包含焦脱镁叶绿素，所述多肽具有如本文所公开的焦脱镁叶绿素酶活性，并且所述焦脱镁叶绿素转化成焦脱镁叶绿酸。

在另一方面，本公开涉及一种通过本文所公开的方法产生的油。

在另一方面，本公开涉及用于本公开的方法中的改善的基于二氧化硅的吸附剂。所述吸附剂包含用碱土金属氧化物、优选氧化镁处理过的无定形多孔二氧化硅，其量足以在最终吸附剂中提供约7或更大的pH和约3重量％或更大的水含量。

定义

术语“控制序列”可以与术语“表达调节核酸序列”互换使用。如本文所用，这些术语是指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物中或在体外表达所必需的和/或影响所述表达的核酸序列。当两个核酸序列可操作地连接时，它们通常将处于相同的取向并且也将在相同的阅读框中。它们通常将是基本上邻接的，但这可能不是必需的。表达调节核酸序列(诸如特别是适当的转录起始、终止、启动子、前导序列、信号肽、前肽、前肽原或增强子序列；Shine-Dalgamo序列、阻遏物或激活物序列；有效的RNA处理信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列)可以是在所选宿主生物中表现出活性的任何核酸序列，并且可以来源于编码对于宿主细胞是内源或异源的蛋白质的基因。每个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外源的(异源的)。当需要时，为了引入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特异性限制位点，可为控制序列提供接头。可针对特定目的对控制序列进行优化。

如本文所用，术语“叶绿素衍生物”包括叶绿素底物和叶绿素产物。叶绿素底物包括叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素。叶绿素产物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。叶绿素衍生物包括所谓的a和b化合物。

如本文所用，术语“脱色酶”(及其变型，包括短语“具有脱色酶活性的多肽”)意指该多肽能够将一种或多种叶绿素底物转化成叶绿素产物。例如，该多肽能够将叶绿素水解成脱植基叶绿素；将脱镁叶绿素水解成脱镁叶绿酸；和/或将焦脱镁叶绿素水解成焦脱镁叶绿酸。因此，术语“脱色酶活性”可包括叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性、焦脱镁叶绿素酶活性或它们的组合。

术语“水凝胶”在本文中用来指水含量为约25重量％或更大、优选约25重量％至约75重量％的基于二氧化硅的吸附剂。

术语“无定形”在本文中用来指其组成原子、分子或离子被排列成沿所有三个方向延伸的随机无序图案的固体材料，这可通过X射线衍射法或差示扫描量热法来测量。

如本文所用，术语“多孔”是指内部孔隙率为0.1cc/g或更大的材料，如通过如DIN66134中所述的Barrett-Joyner-Halenda(BJH)氮孔隙率测定法所测量。

如本文所用，关于用碱土金属氧化物处理的术语“处理过的”是指二氧化硅和碱土金属氧化物在高剪切条件下的亲密混合。

术语“颗粒表面积”被定义为意指如通过Brunauer Emmet Teller(BET)氮吸附方法测量的颗粒表面积。

短语“中值粒度”是指当颗粒在水或有机溶剂诸如丙酮或乙醇中浆化时通过动态光散射测量的中值粒度(D50，其为在尺寸上50体积％的颗粒小于该数并且50体积％的颗粒大于该数的体积分布)。

术语“基于三酰基甘油的油”是指包含三酰基甘油的油。

术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体包含编码多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至适当的控制序列(诸如启动子、RBS/Shine Delgado以及转录和翻译终止信号)以用于该多核苷酸在体外或在宿主细胞中转录和/或翻译。

表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序并且可以引起多核苷酸的表达。载体的选择通常将取决于载体与要引入载体的细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。另选地，载体可以是在引入宿主细胞中时整合进基因组中并与其所整合进的染色体一起复制的载体。整合克隆载体可随机地或在宿主细胞染色体中的预定靶基因座处整合。载体系统可以是单个载体或质粒或者两个或更多个载体或质粒，它们一起含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA或者转座子。

如本文所定义的宿主细胞是适用于遗传操纵并且可在可用于目标产物(诸如根据本发明的多肽)的工业生产的细胞密度下培养的生物体。宿主细胞可以是天然存在的宿主细胞或者来源于遗传操纵或经典诱变后的亲本宿主细胞的宿主细胞。有利的是，宿主细胞是重组宿主细胞。

宿主细胞可以是原核、古细菌或真核宿主细胞。原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、植物、动物或昆虫宿主细胞。

如本文所用，术语“异源”是指非天然存在于宿主细胞中的核酸或氨基酸序列。换句话讲，核酸或氨基酸序列与天然存在于宿主细胞中的核酸或氨基酸序列不同。

核酸或多核苷酸序列在本文中被定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸是指RNA和DNA。术语“核酸”和“多核苷酸序列”在本文中可互换使用。

“肽”是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸残基的短链。最短的肽即二肽由通过单肽键连接的2个氨基酸组成。

术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并且含有多于五个氨基酸残基的分子。如本文所用，术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，并且也可指两种或更多种多肽。因此，术语“蛋白质”和“多肽”可以互换使用。多肽可任选地被修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊二烯化、磺化等)以添加官能度。在特定底物的存在下在某些条件下表现出活性的多肽可被称为酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，可产生多个编码给定多肽的核苷酸序列。

“分离核酸片段”是作为片段不是天然存在的并且不会以天然状态存在的核酸片段。

如本文所用，术语“分离多肽”意指从与其天然相关联的至少一种组分(例如其他多肽材料)中移出的多肽。分离多肽可不含任何其他杂质。分离多肽可以是至少50％纯的，例如至少60％纯的、至少70％纯的、至少75％纯的、至少80％纯的、至少85％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的或至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％纯的，如通过SDS-PAGE或适用于此目的且本领域技术人员已知的任何其他分析方法所测定。分离多肽可由重组宿主细胞产生。

术语“启动子”在本文中被定义为结合RNA聚合酶并将聚合酶引导至核酸序列的正确下游转录起始位点以引发转录的DNA序列。启动子序列相对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或异源的。

当关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表示该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或表达原本异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。术语“重组”与“经基因修饰”和“转基因”同义。

术语“序列同一性”和“序列同源性”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此定义，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，将序列进行比对以用于最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可在被比较的两个序列中的任何一个中引入空位。这种比对可以在被比较的序列的全长上进行。另选地，比对可在较短的长度上进行，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。序列同一性是两个序列之间的相同匹配相对于所报告的比对区域的百分比。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用Needleman和Wunsch算法进行两个序列的比对来确定(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列均可以通过算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实施。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)第276-277页，http：//emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，将EBLOSUM62用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所用的任选参数是空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将理解，当使用不同算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。

在通过如上所述的程序NEEDLE比对后，如下计算查询序列与本发明的序列之间的序列同一性百分比：比对中显示两个序列中的相同氨基酸或相同核苷酸的对应位置的数量除以减去比对中的总空位数量后的比对总长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“最长同一性”。

还可以将本公开的核酸和蛋白质序列用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，从而例如识别其他家族成员或相关序列。此类搜索可以使用NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)来进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对，可以如Altschul，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/。

“合成分子”(诸如合成核酸或合成多肽)通过体外化学合成或酶合成产生。其包括但不限于针对所选宿主生物以最佳密码子使用制成的变体核酸。

合成核酸可优选地根据WO2006/077258和/或WO2008000632(以引用方式并入本文)中所述的方法针对密码子使用进行优化。WO2008/000632提出了密码子对优化。密码子对优化是这样的方法：其中对已针对其密码子使用(特别是所使用的密码子对)进行修饰的编码多肽的核苷酸序列进行优化，以获得编码该多肽的核苷酸序列的改进表达和/或所编码的多肽的改进产量。密码子对被定义为编码序列中的一组两个连续三联体(密码子)。本领域技术人员将会知道，密码子使用需要根据宿主物种进行调整，可能产生与SEQ ID NO：1具有显著同源性偏差但仍编码根据本发明的多肽的变体。

如本文所用，术语“变体”、“衍生物”、“突变体”或“同源物”可以互换使用。它们可以指多肽或核酸。变体包括在相对于参考序列的一个或多个位置处的置换、插入、缺失、截短、易位和/或倒位。变体可以例如通过位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及本领域技术人员已知的各种其他重组方法来制成。核酸的变体基因可通过本领域已知的技术人工合成。

具体实施方式

本公开涉及用于从油中、尤其是从基于三酰基甘油的油中去除杂质(包括含磷化合物，诸如磷胶、皂、痕量金属、叶绿素衍生物、游离脂肪酸等)的方法。更具体地，本公开涉及包含已用碱土金属氧化物处理过的无定形多孔二氧化硅的吸附剂，以及此类吸附剂从油中去除杂质的用途。

现已发现，与先前已知的二氧化硅相比，用碱土金属(诸如镁)、特别是用碱土金属氧化物(诸如氧化镁)处理具有特定水含量的多孔无定形二氧化硅产生具有改善的从油中去除杂质(诸如叶绿素衍生物和痕量金属)的能力的吸附剂。还已发现，与先前基于其他类型的二氧化硅(诸如干凝胶或酸性水凝胶)的吸附剂相比，pH为约7或更大、优选约7至约10的碱土金属氧化物处理过的二氧化硅吸附剂能够从基于三酰基甘油的油中去除更多的杂质(例如痕量金属、叶绿素衍生物等)。

因此，在一个方面，本公开涉及一种用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法，该方法包括使油与吸附剂接触，其中吸附剂包含二氧化硅、特别是已用碱土金属氧化物(诸如MgO)处理过的多孔无定形二氧化硅，其中吸附剂具有约7或更大的pH以及约3重量％或更大、或优选约10重量％或更大、或约25重量％至约75重量％的水含量。在一个具体实施方案中，吸附剂是水凝胶，并且具有约7至约10的pH以及约25重量％至约75重量％的水含量，并且包含以干重计约2.5重量％至约15重量％、或约5重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％的MgO。

在一个实施方案中，吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的多孔无定形二氧化硅，其量足以提供以干重计约0.1重量％或更大、更典型约1重量％至约40重量％、或约5重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％、或约2.5重量％至约15重量％的碱土金属氧化物。在一个具体实施方案中，将二氧化硅用氧化镁(MgO)处理，并且无定形二氧化硅是凝胶。在此类实施方案中，吸附剂包含以干重计约0.1重量％或更大的MgO，或约1重量％至约40重量％、或约2.5重量％至约15重量％、或约5重量％至约25重量％、或约5重量％至约15重量％、或约10重量％至约20重量％、或约10重量％至约15重量％的MgO。在一个具体实施方案中，吸附剂包含约10重量％至约20重量％的MgO。

在一些实施方案中，本公开的吸附剂具有约1∶3.8至约1∶26(包括约1∶12.77至约1∶3.3、或约1∶12.77至约1∶4.89、或约1∶8.09至约1∶4.90、或约1∶5.44至约1∶4.89)的MgO与SiO₂的摩尔比。在一个具体实施方案中，吸附剂具有约1∶5.44至约1∶4.89的MgO与SiO₂的摩尔比。

本公开的吸附剂可具有至少约3重量％、更典型约10重量％或更大、约20重量％或更大、或甚至约55重量％或更大的水含量。在某些实施方案中，本公开的吸附剂有利地由二氧化硅水凝胶制备，并且具有约25重量％至约75重量％的水含量。在其他实施方案中，吸附剂具有约30重量％至约65重量％、或约40重量％至约70重量％、或约50重量％至约65重量％、或约55重量％至约67重量％、或约58重量％至约65重量％的水含量。

本公开的吸附剂具有约7或更大(包括约7至约10、或约7.5至约9.7、或约8.0至约9.5、或约8.0至约9.0、或约8.2至约9.3)的pH。如本文所讨论，并且如实施例中所证实，已经发现，与先前基于酸性水凝胶的吸附剂相比，本公开的吸附剂在从油中去除杂质方面更为优越。

本公开的吸附剂可具有约0.1微米至约2000微米(包括约1微米至约1000微米或约2微米至约500微米或约5微米至约50微米)的中值粒度。在一个实施方案中，吸附剂具有约10微米至约30微米的中值粒度。

本公开的吸附剂可具有约50m²/g或更大(包括约300m²/g或更大、或约650m²/g或更大)的表面积。在一些实施方案中，本公开的吸附剂具有约50m²/g至约800m²/g、或约300m²/g至约700m²/g的表面积，如通过BET表面测量所测定。

本公开的吸附剂可具有约0.1cc/g或更大、优选约0.4cc/g或更大的孔体积。在一些实施方案中，吸附剂的孔体积可在约0.2cc/g至约2.0cc/g、或约0.7cc/g至约2.0cc/g的范围内，如通过氮孔隙法所测定。

在一个具体实施方案中，本公开的吸附剂包含已用氧化镁(MgO)处理并且具有约7至约10的pH的无定形硅胶，并且包含以干重计约2.5重量％至约15重量％的MgO，并且具有约25重量％至约75重量％的水含量。更具体地，在一个实施方案中，本公开的吸附剂包含已用MgO处理并且具有约8至约9的pH的无定形硅胶，包含以干重计约10重量％至约20重量％的MgO，并且具有约50重量％至约65重量％的水含量。

可以用于制备本公开的吸附剂的合适的二氧化硅包括无定形多孔硅胶和在二氧化硅的孔中具有约3重量％或更大的水分含量的沉淀物。在一个实施方案中，无定形二氧化硅是具有约25重量％或更大的水分含量(优选大于40重量％、最优选大于50重量％、甚至更优选约30重量％至约65重量％的水分)的“水凝胶”。在一些实施方案中，合适的二氧化硅水凝胶包括但不限于可商购获得的硅胶，诸如

二氧化硅和

300(W.R.Grace&Co.-Conn.，Columbia，Md.)。

在另一个实施方案中，基本上不含水分的二氧化硅可用作起始二氧化硅。所谓“基本上不含水”是指用于制备吸附剂的二氧化硅具有小于约15％的水分。随后通过使凝胶与足量的水接触来水合基本上不含水的二氧化硅，以优选地在与碱土金属氧化物混合之前在二氧化硅的孔中提供所需的水分含量，即约30重量％或更大。待添加的水量与所使用的具体二氧化硅的孔体积相关，并且可以由本领域技术人员容易地确定。适用于本公开的方法中的二氧化硅的制备的非限制性描述在实施例中示出。

可用于制备本公开的吸附剂的合适的碱土金属氧化物包括但不限于氧化镁、氧化钙、氧化锶、氧化钡、氧化铍或它们的组合。优选地，碱土金属氧化物是氧化镁。

本公开的吸附剂可通过优选地在高剪切条件下将所需量的碱金属氧化物粉末与具有所需水含量的无定形硅胶物理共混来制备。共混在足以提供自由流动粉末的温度下进行一段时间。优选地，共混在约室温至约100℃范围内的温度下进行足以获得均匀混合物的时间，例如约1秒或更长。本发明的最终吸附剂包含碱土金属氧化物处理的硅胶，其具有约3重量％或更大的水分含量和约7或更大的pH。在一个实施方案中，最终吸附剂是W.R.Grace&Co.-Conn以产品标注SP-2115提供的自由流动粉末，该产品含有以干重计约10重量％至约13重量％的氧化镁、约50％至约65％的水含量和约8.2至约9.3的pH。

一般来讲，本公开的方法包括使油与有效量的本公开的吸附剂接触以从油中去除杂质。在一个非限制性实施方案中，使油与以基于油的重量计量为约10重量％或更少的本公开的吸附剂接触。在其他实施方案中，使油与量为约0.01重量％至约10重量％、或量为约0.1重量％至约8重量％、或量为约0.1重量％至约5重量％、或量为约0.1重量％至约1重量％、或量为约0.1重量％至约0.5重量％、或量为约0.1重量％至约0.4重量％、或量为约0.1重量％至约0.3重量％、或量为约0.1重量％至约0.2重量％的吸附剂接触。

在某些实施方案中，可使油在小于约100℃的温度下、或更典型地在约60℃至小于约100℃的温度下(包括在约80℃的温度下)与本公开的吸附剂接触。在一些实施方案中，可使油可在低于约110℃的温度下(诸如在约70℃至约130℃的温度下或在约100℃的温度下)在真空下与本公开的吸附剂接触。在一个实施方案中，真空可为约50mbar至约700mbar，并且更典型地为约100mbar。在一个实施方案中，使油在约100℃的温度下在约100mbar的真空下与本公开的吸附剂接触。在另一个实施方案中，使油在约60℃至小于约100℃的温度下或在约80℃的温度下与本公开的吸附剂接触，之后施加约50mbar至约700mbar、更典型约100mbar的真空，并将温度升高至约70℃至约130℃。在一个具体实施方案中，使油在约80℃的温度下与本公开的吸附剂接触，之后施加约100mbar的真空，并将温度升高至约100℃。在一些实施方案中，使吸附剂与油接触约5分钟至约240分钟，包括约15分钟至约60分钟。处理后，可使用任何合适的技术(包括过滤)从油中去除二氧化硅。

可使用本公开的方法从油中去除的杂质包括但不限于含磷化合物，包括磷胶、皂、痕量金属(诸如但不限于钠、钾、镁、钙、铁、铝和铅)、叶绿素底物(包括叶绿素、脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素)、叶绿素衍生物(包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸)和游离脂肪酸(FFA)。

如上文所述用本公开的吸附剂处理油提供了满足可接受的食用油(包括烹调油)交易和运输标准的油。此类标准包括国家油料种子产品研究所(NIOP)、美国油脂化学家学会和ISO的标准。

可使用本公开的方法处理的油包括但不限于选自由以下项组成的组的基于三酰基甘油的油：卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芜荽油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果核油、白芒花籽油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、油菜籽油、米糠油、红花油、山茶花油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、椿花油、植物油和来自藻类的油。在一个实施方案中，油是来自藻类的油。

本公开的吸附剂可用于在油加工期间的多个阶段从油中去除杂质。例如，待处理的油可选自由以下项组成的组：粗制非脱胶油、脱胶油、苛性碱精炼油、苛性碱精炼和水洗油或水脱胶油。在一个实施方案中，油是粗制油，并且该方法包括使粗制油与本公开的二氧化硅接触。

在另一个实施方案中，油在与吸附剂接触之前首先经受脱色酶处理。例如，在一个实施方案中，该方法包括使包含叶绿素衍生物的油与具有脱色酶活性的多肽或与包含该多肽的组合物接触，以产生经脱色酶处理的油，以及使经脱色酶处理的油与本发明的吸附剂接触。可用于本公开的方法中的具有脱色酶活性的合适多肽的示例包括但不限于下文详细讨论的那些多肽。用于产生经脱色酶处理的油的合适方法以及各种油加工方法也在下文详细描述。

相对于与吸附剂接触之前油中的杂质水平，用本公开的吸附剂处理油有利地降低了杂质水平。例如，与接触二氧化硅之前油中存在的叶绿素衍生物的总浓度(按重量计)相比，使油(包括经脱色酶处理的油)与本公开的二氧化硅接触可使油中叶绿素衍生物(包括叶绿素底物和/或叶绿素产物)的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素衍生物包括焦脱镁叶绿素，并且与接触吸附剂之前油中存在的焦脱镁叶绿素的总浓度(按重量计)相比，使油(包括经脱色酶处理的油)与本公开的吸附剂接触可使油中焦脱镁叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素衍生物包括脱镁叶绿素，并且与接触二氧化硅之前油中存在的脱镁叶绿素的总浓度(按重量计)相比，使油(包括经脱色酶处理的油)与本公开的吸附剂接触可使油中脱镁叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素衍生物包括叶绿素，并且与接触二氧化硅之前油中存在的叶绿素的总浓度(按重量计)相比，使油(包括经脱色酶处理的油)与本公开的二氧化硅接触可使油中叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。

在另一个实施方案中，与接触吸附剂之前油中存在的痕量金属杂质的总浓度(按重量计)相比，使油(包括经脱色酶处理的油)与本公开的基于二氧化硅的吸附剂接触可使油中痕量金属杂质(诸如但不限于钠、钾、镁、钙、铁、铝和铅)的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。

在另一个实施方案中，使包含叶绿素衍生物、特别是叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽或与包含该多肽的组合物接触，以产生经脱色酶处理的油。在一个这样的实施方案中，叶绿素底物包括焦脱镁叶绿素，脱色酶处理将焦脱镁叶绿素的至少一部分转化为焦脱镁叶绿酸，并且与接触吸附剂之前经脱色酶处理的油中存在的焦脱镁叶绿酸的总浓度(按重量计)相比，使经脱色酶处理的油与本公开的吸附剂接触使经脱色酶处理的油中焦脱镁叶绿酸的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在另一个实施方案中，叶绿素底物包括脱镁叶绿素，脱色酶处理将脱镁叶绿素的至少一部分转化为脱镁叶绿酸，并且与接触吸附剂之前经脱色酶处理的油中存在的脱镁叶绿酸的总浓度(按重量计)相比，使经脱色酶处理的油与本公开的吸附剂接触使经脱色酶处理的油中脱镁叶绿酸的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在另一个实施方案中，叶绿素底物包括叶绿素，脱色酶处理将叶绿素的至少一部分转化为脱植基叶绿素，并且与接触吸附剂之前经脱色酶处理的油中存在的脱植基叶绿素的总浓度(按重量计)相比，使经脱色酶处理的油与本公开的吸附剂接触使经脱色酶处理的油中脱植基叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。

在一个实施方案中，本公开的方法还包括使油或经脱色酶处理的油与选自由以下项组成的组的另外的酶接触：磷脂酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶、脱镁叶绿酸酶、叶绿素酶以及它们的组合。

在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于处理包含焦脱镁叶绿素的油的方法，该方法包括使油与具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽或与包含该多肽的组合物接触，其中焦脱镁叶绿素转化成焦脱镁叶绿酸，并且任选地，其中脱镁叶绿素转化成脱镁叶绿酸，以产生经焦脱镁叶绿素酶处理的油，以及使经焦脱镁叶绿素酶处理的油与本公开的吸附剂接触。

多肽

具有脱色酶活性的任何合适的多肽可用于本公开的方法中。在一个具体实施方案中，多肽是具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽，并且选自由以下项组成的组：

a.与SEQ ID NO：1的氨基酸1至318具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％或者具有100％同一性的分离多肽；以及，

b.由与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或者具有100％同一性的核酸序列编码的多肽。

具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可以是与SEQ ID NO：1的氨基酸1至318具有至少80％同一性的多肽。如本文所公开的多肽可与SEQ ID NO：1的氨基酸1至318具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。如本文所公开的多肽可与SEQ ID NO：1的氨基酸1至318具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。如本文所公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可包含或含有SEQ ID NO：1的氨基酸1至318或者由这些氨基酸组成。具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可包含或含有SEQ ID NO：1的氨基酸2至318或者由这些氨基酸组成。令人惊讶的是，发现与SEQ ID NO：1的氨基酸1至318或氨基酸2至318具有至少80％同一性的多肽包含焦脱镁叶绿素酶活性。

具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽将焦脱镁叶绿素水解成焦脱镁叶绿酸(还可参见图1)。如本文所公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽优选地将焦脱镁叶绿素a和焦脱镁叶绿素b水解成它们的焦脱镁叶绿酸a和b化合物。因此，焦脱镁叶绿素酶活性可以通过焦脱镁叶绿酸的形成来确定。

如本文所公开的多肽还可包含脱镁叶绿素酶活性。具有脱镁叶绿素酶活性的多肽将脱镁叶绿素水解成脱镁叶绿酸。优选地，如本文所公开的多肽将脱镁叶绿素a和/或脱镁叶绿素b水解成它们相应的脱镁叶绿酸化合物。因此，脱镁叶绿素酶活性可以通过脱镁叶绿酸的形成来确定。

如本文所公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽还可包含叶绿素酶活性。具有叶绿素酶活性的多肽将叶绿素转化成脱植基叶绿素。优选地，如本文所公开的多肽将叶绿素a和/或叶绿素b水解成它们相应的脱植基叶绿素化合物。

在一个实施方案中，如本文所公开的多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性和叶绿素酶活性。

焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿素、叶绿素和反应产物焦脱镁叶绿酸、脱镁叶绿酸、脱植基叶绿素的测定可以如实施例中所公开通过HPLC进行。

多肽可来源于任何合适的来源，例如来源于植物、藻类或蓝细菌。如本文所公开的多肽可来源于植物，例如来源于大麦属(Hordeum sp.)或小麦属(Triticum s.)，例如大麦(Hordeum vulgare)或普通小麦。如本文所公开的多肽也可使用标准分子技术(例如从头合成)来生成。

如本文所公开的具有脱色酶活性(诸如焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽可以是分离多肽、纯多肽、重组多肽、合成多肽或变体多肽。可纯化如本文所公开的多肽。蛋白质的纯化可以通过本领域技术人员已知的若干方法进行。

如本文所公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的变体多肽可以是与SEQ IDNO：1的氨基酸1至318或与SEQ ID NO：1的氨基酸2至318具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的多肽。

如本文所公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽可以是在与根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列进行比对时与SEQ ID NO：1相比在一个或多个氨基酸位置处包含置换、缺失和/或插入的多肽，例如变体多肽。例如，如本文所公开的多肽可以是在与SEQ ID NO：1的多肽进行比对时与SEQ ID NO：1相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个或更多个氨基酸置换、缺失和/或插入的多肽，由此该多肽仍具有如本文所公开的多肽的活性或功能。技术人员将理解，如本文所公开的多肽中的这些微小氨基酸变化可在不损失蛋白质功能或活性的情况下存在(例如天然存在的突变)或产生(例如使用r-DNA技术)。在这些突变存在于多肽的结合结构域、活性位点或其他功能结构域中的情况下，多肽的特性可改变，但多肽可保持其活性。在存在不靠近活性位点、结合结构域或其他功能结构域的突变的情况下，可预期效果较小。

如本文所公开的多肽可由任何合适的多核苷酸序列编码，只要该多肽表现出如本文所公开的焦脱镁叶绿素酶活性即可。通常，编码如本文所公开的具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的多核苷酸序列是用于在特定宿主细胞中表达该多肽的经密码子优化的序列或经密码子对优化的序列。

组合物

本公开的方法还可包括使油与包含具有脱色酶活性的多肽(诸如本文所公开)的组合物接触。

这种组合物可包含载剂、赋形剂或其他化合物。通常，组合物或制剂包含可用于配制具有脱色酶活性(包括焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽的化合物。合适的制剂包括液体制剂，诸如乳液、悬浮液和溶液、糊剂、凝胶、颗粒以及冷冻干燥或喷雾干燥的粉末。

如本文所用的赋形剂是与如本文所公开的多肽一起配制的非活性物质，例如蔗糖或乳糖、甘油、山梨醇或氯化钠。包含如本文所公开的多肽的组合物可以是液体组合物或固体组合物。液体组合物通常包含水。当配制成液体组合物时，组合物通常包含降低水活性的组分，诸如甘油、山梨醇或氯化钠(NaCl)。包含如本文所公开的多肽的固体组合物可包含含有该多肽的颗粒，或者该组合物在液体基质(如脂质体或凝胶，如藻酸盐或角叉菜胶)中包含包封多肽。本领域有许多已知的技术来包封或颗粒化多肽或酶(参见例如G.M.H.Meesters，“Encapsulation of Enzymes and Peptides”，Chapter 9，inN.J.Zuidam and V.A.Nedovic(编辑)“Encapsulation Technologies for Active FoodIngredients and food processing”2010)。

如本文所公开的组合物还可包含载剂，该载剂包含如本文所公开的多肽。例如，如本文所公开的多肽可以固定在二氧化硅上。如本文所公开的多肽可通过本领域已知的技术结合或固定到载剂上。

包含如本文所公开的具有脱色酶活性(包括焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽的组合物可包含一种或多种另外的酶，例如脂肪酶(诸如磷脂酶，例如磷脂酶A、B和/或C)、叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶。另外的酶可以是磷脂酶C(PLC)、磷脂酰肌醇PLC和/或磷脂酶A，诸如磷脂酶A1或磷脂酶A2。

包含如本文所公开的具有脱色酶活性(包括焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽的组合物可包含细胞级分，例如来自宿主细胞的细胞级分，在该细胞级分中已产生具有脱色酶活性的多肽。细胞级分可通过各种方法生成，例如在通过超声处理和/或使用玻璃珠破碎宿主细胞之后。

本公开还涉及一种用于制备包含如本文所公开的多肽的组合物的方法，该方法可包括喷雾干燥包含该多肽的发酵培养基，或者颗粒化或包封如本文所公开的多肽，以及制备该组合物。

核酸、表达载体和重组宿主细胞

本公开还涉及一种与编码如本文所公开的多肽的核酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性或具有100％同一性的核酸。如本文所公开的核酸可以是与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核酸。如本文所公开的核酸可包含或含有SEQ ID：NO：2。如本文所公开的核酸还可包含启动子序列和/或其他控制序列。

编码如本文所公开的具有脱色酶活性(包括焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽的核酸可以是用于在特定宿主细胞中表达如本文所公开的多肽的经密码子优化的或经密码子对优化的序列。宿主细胞可以是例如假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。

在本发明的另一个实施方案中，公开了一种核酸，其为SEQ ID NO：2的核酸的分离核酸、纯核酸、重组核酸、合成核酸或变体核酸。变体核酸序列可例如与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。

本发明还涉及一种包含如本文所公开的核酸的表达载体，其中核酸可操作地连接至指导多肽在宿主细胞中表达的一个或多个控制序列。

将核酸插入核酸构建体或表达载体中的方法有多种，这些方法是本领域技术人员已知的，参见例如Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。可能期望的是用控制序列(诸如启动子和终止子序列)操纵编码本发明的多肽的核酸。

启动子可以是适用于显示出转录活性的真核或原核宿主细胞的任何合适的启动子序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可从编码对于细胞是内源的(天然的)或异源的(外来的)细胞外或细胞内多肽的多核苷酸获得。启动子可以是组成型或诱导型启动子。优选地，启动子是诱导型启动子，例如淀粉诱导型启动子。

适用于丝状真菌的启动子是可选自以下组的启动子，该组包括但不限于从编码以下酶的多核苷酸获得的启动子：米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、曲霉属(Aspergillus)gpdA启动子、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、黑曲霉或泡盛曲霉内切木聚糖酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、里氏木霉(T.reesei)纤维二糖水解酶I(CBHI)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶、镶片镰刀菌(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰刀菌Dania(WO 00/56900)、镶片镰刀菌Quinn(WO 00/56900)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合物)，以及它们的突变、截短和杂合启动子。

适用于细菌宿主的启动子是可选自大肠杆菌(E.coli)lac启动子、aroH启动子、araBAD启动子、77启动子、trc启动子、tac启动子和trp启动子的组的启动子。启动子的其他示例是天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)的启动子、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)碱性蛋白酶基因(枯草菌溶素基因)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)左旋蔗糖酶基因(sacB)的启动子、枯草芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyE)的启动子、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子。另一个示例是“共有”启动子，其“-35”区为TTGACA，“-10”区为TATAAT。

本发明还涉及一种包含如本文所公开的核酸或如所公开的表达载体的重组宿主细胞，其中该核酸对于宿主细胞是异源的。如本文所公开的重组宿主细胞可以是这样的宿主细胞：其中如本文所公开的具有脱色酶(包括焦脱镁叶绿素酶)活性的核酸和编码多肽对于宿主细胞是异源的。

如本文所公开的宿主细胞可以是任何合适的微生物、植物或昆虫细胞。合适的宿主细胞可以是真菌细胞，例如来自菌属枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、罗萨菌属(Rasamsonia)、木霉属(Trichoderma)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、米曲霉(A.oryzae)、大豆曲霉(A.sojae)、埃默森罗萨菌(Rasamsonia emersonii)、勒克瑙金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物两者。合适的细菌可来自菌属埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)或链霉菌属(Streptomyces)。细菌细胞可来自菌种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(B.puntis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、产玉米黄素假单胞菌(Pseudomonaszeaxanthinifaciens)、荧光假单胞菌或大肠杆菌(E.coli)。

合适的细菌宿主细胞可以是例如假单胞菌属，诸如荧光假单胞菌。

多肽的制备方法

适用于本公开的方法的多肽(例如具有脱色酶活性的多肽，包括具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽)可以通过在允许多肽表达的条件下在合适的发酵培养基中培养如本文所公开的宿主细胞并产生该多肽而产生。本领域技术人员理解如何根据所使用的宿主细胞(诸如发酵培养基的pH、温度和组成)来进行产生如本文所公开的多肽的方法。宿主细胞可以在摇瓶中或在体积为0.5升或1升或更大至10立方米至100立方米或更大立方米的发酵罐中培养。培养可根据宿主细胞的需要有氧地或厌氧地进行。如果宿主细胞是假单胞菌属(例如荧光假单胞菌)，则宿主细胞的培养在有氧条件下进行。

有利地，如本文所公开的多肽例如通过本领域技术人员已知的离心或过滤从发酵培养基中回收或分离。具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽的回收还可包括其中产生该多肽的细胞的破坏。细胞的破坏可以使用本领域技术人员已知的玻璃珠和/或超声处理来进行。用具有脱色酶活性的多肽处理包含叶绿素衍生物的油的方法

在一个实施方案中，本公开的方法还包括用如本文所公开的具有脱色酶活性的多肽或用包含上文所公开的多肽的组合物处理包含叶绿素衍生物(诸如焦脱镁叶绿素)的油。在一个实施方案中，如本文所公开的多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性。在另一个实施方案中，该多肽具有脱镁叶绿素酶活性。在另一个实施方案中，该多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性和脱镁叶绿素酶活性。在另一个实施方案中，该多肽具有焦脱镁叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性和叶绿素酶活性。

如本文所讨论，具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽能够将焦脱镁叶绿素水解成焦脱镁叶绿酸，具有脱镁叶绿素酶活性的多肽能够将脱镁叶绿素水解成脱镁叶绿酸，并且具有叶绿素酶活性的多肽能够将叶绿素水解成脱植基叶绿素。因此，在一个实施方案中，脱色酶处理可降低油中一种或多种叶绿素底物的水平。在各种实施方案中，叶绿素底物可以是叶绿素、脱镁叶绿素和/或焦脱镁叶绿素。例如，与处理之前油中存在的叶绿素底物的总浓度(按重量计)相比，用脱色酶处理可使油中叶绿素底物的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。叶绿素底物的总浓度的降低可能是焦脱镁叶绿素转化成焦脱镁叶绿酸、脱镁叶绿素转化成脱镁叶绿酸和/或叶绿素转化成脱植基叶绿素的结果。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素底物包含焦脱镁叶绿素，并且焦脱镁叶绿素的至少一部分因脱色酶处理而转化成焦脱镁叶绿酸。例如，与脱色酶处理之前油中存在的焦脱镁叶绿素的总浓度(按重量计)相比，脱色酶处理可使油中焦脱镁叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。焦脱镁叶绿素的总浓度的降低可能是焦脱镁叶绿素转化成焦脱镁叶绿酸的结果。在另一个实施方案中，油中的叶绿素底物包含脱镁叶绿素，并且脱镁叶绿素的至少一部分因处理而转化成脱镁叶绿酸。例如，与脱色酶处理之前油中存在的脱镁叶绿素的总浓度(按重量计)相比，脱色酶处理可使油中脱镁叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。脱镁叶绿素的总浓度的降低可能是脱镁叶绿素转化成脱镁叶绿酸的结果。在此类实施方案中，该多肽表现出脱镁叶绿素酶活性。

在另一个实施方案中，油中的叶绿素底物包含叶绿素，并且叶绿素的至少一部分因脱色酶处理而转化成脱植基叶绿素。例如，与脱色酶处理之前油中存在的叶绿素的总浓度(按重量计)相比，脱色酶处理可使油中叶绿素的总浓度降低按重量计至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。叶绿素的总浓度的降低可能是叶绿素转化成脱植基叶绿素的结果。在此类实施方案中，该多肽表现出叶绿素酶活性。

包含焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿素和/或叶绿素的油还可包含其他底物，例如磷脂。任选地，如本文所公开的用于处理油的方法还包括去除磷脂，如下文所述。

可根据本发明的方法处理包含叶绿素衍生物(包括叶绿素底物)的任何油，以从油中去除一种或多种不期望的叶绿素衍生物。油可以是基于三酰基甘油的油，包括各种基于植物或藻类的油。在一个实施方案中，可结合本发明的处理使用的合适的油包括但不限于以下项：卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芜荽油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果核油、白芒花籽油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、油菜籽油、米糠油、红花油、山茶花油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、椿花油、植物油和来自藻类的油。在一个实施方案中，可以根据本公开处理的油选自由以下项组成的组：卡诺拉油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、油菜籽油、米糠油、芝麻油、大豆油和葵花籽油。在一个实施方案中，油是来自藻类的油。

使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽接触可在任何合适的时间内以及在任何合适的pH和温度下进行。所述接触可在三酰基甘油类油的脱胶期间施加的pH和温度下进行。合适的pH可为pH 2至pH 10，例如pH 3至pH 9、pH 4至pH 8、pH 5至pH7、pH 5至8或pH 6.5至7.5。在一个实施方案中，使该多肽在4.0至7.5、或4.5至8.0、或4.5至7.0的pH下与油接触。在一个实施方案中，使该多肽在4.0至5.0的pH下、或更具体地在4.5的pH下与油接触。在另一个实施方案中，使该多肽在7.0的pH下接触。

用于使包含一种或多种叶绿素底物的油与如本文所公开的具有脱色酶活性的多肽接触的合适温度可为10℃至90℃，例如20℃至80℃、30℃至70℃、45℃至70℃、40℃至60℃或50℃至65℃。

例如，使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽接触可在5至8的pH和40℃至60℃的温度下、或在4.5至7.0的pH和40℃至60℃的温度下、或在7.0的pH和45℃至70℃的温度下、或在7.0的pH和50℃至65℃的温度下进行。

具有脱色酶活性的多肽可以任何合适的量投配到包含叶绿素底物的油中。例如，该多肽可在1U/g至50U/g经处理的油的范围内(诸如1.4U/g至50U/g经处理的油、或5U/g至50U/g经处理的油)投配。根据以下实施例中教导的酶活性定义一个单位。

令人惊讶的是，发现与参考多肽相比，如本文所公开的具有脱色酶(诸如焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽在酸性和苛性碱条件下会将较高量的叶绿素底物转化成叶绿素产物。参考多肽是包含根据SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：12包含具有焦脱镁叶绿素酶活性的莱茵衣藻叶绿素酶。

使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有脱色酶活性的多肽接触可在油脱胶期间进行。油脱胶包括若干加工步骤，诸如压榨和/或己烷提取、例如在脱胶酶(诸如如WO2005/086900或WO2011/046812中所公开的磷脂酶)的存在下脱胶、精炼、漂白和除臭。使包含一种或多种叶绿素底物的油与具有焦脱镁叶绿素酶活性、脱镁叶绿素酶活性和/或叶绿素酶活性的多肽接触可在油脱胶加工中的漂白步骤期间进行，如下文更详细地描述。

使具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽与油(诸如三酰基甘油类油或藻类油)接触可包括将包含如本文所公开的多肽的水性溶液分散在油中。用具有焦脱镁叶绿素酶活性的多肽处理的油通常包含0.5至10w/w％的水，例如1至10w/w％的水、1至5w/w％的水、2至8w/W％的水、2至4w/W％的水、3至6w/W％的水、0.5至5w/w％的水、1至3w/w％、1.5至2w/w％的水或5w/w％的水。

可使该多肽与油接触5分钟至24小时、10分钟至12小时、15分钟至10小时、0.5至24小时、1至12小时、1.5至6小时、或2至4小时的时间段。在一个实施方案中，可使该多肽与油接触2小时。在所述接触之后，通常分离水相和油相。

在如本文所公开的方法中处理的油可以是粗制非脱胶、脱胶(水脱胶、酶脱胶或酸脱胶)、苛性碱精炼或苛性碱精炼和水洗油或水脱胶油。在一个具体实施方案中，油包括非脱胶粗制油。粗制油通常是机械压榨或溶剂提取的油，并且其中油通常含有游离脂肪酸(FFA)和磷脂。脱胶油是其中大多数磷脂已从粗制油中去除的油。通常，脱胶油包含介于0.5ppm至200ppm之间的原子磷，诸如介于1ppm与100ppm之间的原子磷，诸如介于5ppm与50ppm之间的原子磷。精炼油是其中FFA已通过苛性碱处理中和并去除的油。油的苛性碱处理通常包括用氢氧化钠处理油。

使如本文所公开的具有脱色酶(例如焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽例如在油的脱胶期间与油接触可在任何合适的温度下进行，例如在45℃至70℃(包括50℃至65℃)的温度下进行。

使如本文所公开的具有脱色酶(例如焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽例如在油的脱胶期间与油接触可在任何合适的pH下进行，诸如在3.5至8.0的pH(例如4至7.5的pH，例如4.5至7.0的pH)下进行。

在一个实施方案中，本文所公开的处理方法还包括使油经受水脱胶。如本文所讨论，水脱胶通常应用于含有大量可水合磷脂的粗制油。所获得的磷脂由于具有温和的特性而可以用作卵磷脂(一种天然乳化剂)。通过该工艺获得的油在行业中通常被称为“脱胶”，尽管仅部分脱胶。

因此，在一个方面，本公开的处理方法包括使包含叶绿素衍生物(诸如叶绿素底物)的油(例如非脱胶粗制油)与水和本公开的多肽接触。通常，油的温度为45℃至70℃，包括50℃至65℃。水可以1至5w/w％(包括2至4w/w％)的量添加。多肽可以1U/g至50U/g经处理的油(诸如1.4U/g至50U/g经处理的油、或5U/g至50U/g经处理的油)的量投配。如本文所公开的多肽和水可作为单一组成添加，或者多肽可与水分开添加。通常，不向所得混合物中添加酸或碱，并且该方法在中性pH(例如约pH 7.0)下进行。在与多肽和水接触之后，可任选地使用剪切混合器来混合油。随后在搅拌(例如，使用连续搅拌的反应器)下将油温育0.5小时至24小时、或1小时至12小时、或1.5小时至6小时、或2小时至4小时，这有助于油中存在的磷脂的水合。温育并搅拌后，将油加热至70℃至85℃的温度。所得的油可通过沉降、过滤或离心的工业实践来分离。离心机产生两种料流，即水脱胶油和湿胶。

在另一个实施方案中，本文所公开的处理方法还包括使油经受酶辅助水脱胶。如本文所讨论，酶辅助水脱胶通常应用于含有大量可水合磷脂的粗制油，其中目标是使所有可水合磷脂反应并将它们转化成二酰基甘油，从而增加油收率，同时保持油中的不可水合磷脂。用于该方法的酶包括磷脂酶C(PLC)和磷脂酰肌醇磷脂酶(PI-PLC)。

因此，在一个方面，本公开的处理方法包括使包含叶绿素衍生物(诸如叶绿素底物)的油(例如非脱胶粗制油)与水、本公开的多肽和另外的酶接触。另外的酶可选自由PLC、PI-PLC以及它们的组合组成的组。在一个实施方案中，另外的酶包括PLC和PI-PLC两者。通常，油的温度为45℃至70℃，包括50℃至65℃。水可以1至5w/w％(包括2至4w/w％)的量添加。多肽可以1U/g至50U/g经处理的油(诸如1.4U/g至50U/g经处理的油、或5U/g至50U/g经处理的油)的量投配。PLC(例如，Purifine PLC)可以50ppm至500ppm(包括100ppm至400ppm、或150ppm至250ppm)的量添加。PI-PLC可以50ppm至500ppm(包括100ppm至400ppm、或150ppm至250ppm)的量添加。在一个实施方案中，另外的酶是Purifine 4G，其含有PLC和PI-PLC两者。在该实施方案中，Purifine 4G可以50ppm至500ppm(包括100ppm至400ppm、或150ppm至250ppm)的量添加。如本文所公开的多肽、另外的酶和水可作为单一组成添加，或者如本文所公开的多肽、另外的酶和水可单独添加。通常，不向所得混合物中添加酸或碱，并且该方法在中性pH(例如约pH 7.0)下进行。在与多肽、另外的酶和水接触之后，可任选地使用剪切混合器来混合该组合物。合适的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax反应器。随后在搅拌(例如，使用连续搅拌的反应器)下将组合物温育0.5小时至24小时、或1小时至12小时、或1.5小时至6小时、或2小时至4小时，这有助于PC、PE和PI在油中转化成二酰基甘油。温育并搅拌后，将组合物加热至70℃至85℃的温度，诸如85℃。所得的组合物可通过沉降、过滤或离心的工业实践来分离。离心机产生两种料流，即水脱胶油和重相(含有水、变性蛋白质和磷化合物)。

在另一个实施方案中，本文所公开的处理方法还包括使油经受酶脱胶。酶脱胶可应用于粗制油或应用于先前已通过不同方法(诸如水脱胶、酶辅助水脱胶或酸脱胶)脱胶的油。希望为食品或工业市场生产卵磷脂的加工商可在进一步加工之前对油进行水脱胶。磷脂的破坏在卵磷脂应用中是不可接受的。

因此，在一个方面，本公开的处理方法包括使包含叶绿素衍生物(诸如叶绿素底物)的组合物(诸如油，例如粗制油或先前脱胶的油)与本公开的多肽接触。可在与多肽接触之前调节油的pH，例如通过添加量为100ppm至1000ppm(包括500ppm)的酸(例如柠檬酸或磷酸)。通常，将pH调节至4.5至8.0(包括4.5至7.0)的pH。通常，在pH调节时，油的温度为70℃至85℃。在添加酸之后，可将所得的油混合5分钟至24小时，这取决于混合器的类型(例如，高剪切、搅动器等)。本领域技术人员将理解，当使用高剪切混合器时将需要较短的混合时间，而当施加较小的剪切时(例如，当使用简单的搅动器时)将需要较长的混合时间。在pH调节后，将组合物(例如油)冷却至45℃至70℃，包括50℃至65℃，并添加水、本公开的多肽和任选的另外的酶。另外的酶(但使用时)可选自由PLC、PI-PLC以及它们的组合组成的组。在一个实施方案中，另外的酶包括PLC和PI-PLC两者。水可以1至5w/w％(包括2至4w/w％)的量添加。多肽可以1U/g至50U/g经处理的油(诸如1.4U/g至50U/g经处理的油、或5U/g至50U/g经处理的油)的量投配。PLC(例如，Purifine PLC)可以50ppm至500ppm(包括100ppm至400ppm、或150ppm至250ppm)的量添加。PI-PLC可以50ppm至500ppm(包括100ppm至400ppm、或150ppm至250ppm)的量添加。在一个实施方案中，另外的酶是Purifine 4G，其含有PLC和PI-PLC两者。在该实施方案中，Purifine 4G可以50ppm至500ppm(包括100ppm至400ppm、或150ppm至250ppm)的量添加。多肽、另外的酶(当存在时)和水可作为单一组成添加，或者多肽、另外的酶和水可单独添加。

在与多肽、另外的酶(当存在时)和水接触之后，可使用剪切混合器来混合该组合物。合适的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax反应器。剪切混合是任选的，尤其是当被处理的组合物是或包含粗制非脱胶油时。随后将组合物搅拌(例如，使用连续搅拌的反应器)0.5小时至24小时、或1小时至12小时、或1.5小时至6小时、或2小时至4小时。

搅拌后，将磷脂酶A(PLA)酶添加到油中。PLA酶可以是PLA1酶和/或PLA2酶。在一个实施方案中，酶是PLA1酶。具有磷脂酶活性的氨基酸序列在本领域中广泛报道，包括在三酰基甘油类油中具有活性的磷脂。具有磷脂酶活性的商业PLA1酶包括

Ultra和QuaraLowP。具有磷脂酶活性的商业PLA2酶包括Rohalase Xtra和LysoMax。任何合适的PLA酶可以是添加的PLA，可根据制造商和所使用的连续搅拌槽反应器的类型而变化。在添加PLA酶之后，可使用剪切混合器来混合油。合适的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax反应器。随后在搅拌(例如，使用连续搅拌的反应器)下温育油。油可与PLA1酶一起温育，允许反应1小时至8小时、或2小时至7小时、或3小时至6小时。温育并搅拌后，将油加热至70℃至85℃的温度，诸如85℃。反应时间可根据PLA剂量和存在的不可水合磷脂(NHP)(例如磷酸的Ca和Mg盐)的水平而变化。所得的油可通过沉降、过滤或离心的工业实践来分离。

在另一个实施方案中，本公开的处理方法包括使包含叶绿素衍生物(诸如叶绿素底物)的油、特别是精炼后的油与本公开的多肽接触。通常，油的温度为45℃至70℃，包括50℃至65℃。多肽可以1U/g至50U/g经处理的油(诸如1.4U/g至50U/g经处理的油、或5U/g至50U/g经处理的油)的量投配。水可以1至10w/w％(包括2至8w/W％、或3至6w/w％、或5w/w％)的量添加到油中。多肽和水可作为单一组成添加，或者多肽可与水分开添加。通常，不向所得混合物中添加酸或碱，并且该方法在中性pH(例如pH 7.0)下进行。在与多肽和水接触之后，可使用剪切混合器来混合油。合适的剪切混合器是连续剪切混合器IKA Dispax反应器。在搅拌下将油温育1.5小时至3小时，包括2小时。温育并搅拌后，将油加热至70℃至85℃的温度。所得的油可通过沉降、过滤或离心的工业实践来分离。

在另一个实施方案中，如本文所公开的用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法还可包括去除焦脱镁叶绿酸和/或脱镁叶绿酸。在一个实施方案中，如本文所公开的用于处理包含叶绿素衍生物的油的方法还可包括去除脱植基叶绿素、焦脱镁叶绿酸和/或脱镁叶绿酸。焦脱镁叶绿酸、脱镁叶绿酸和/或脱植基叶绿素可以在油的水洗期间、在化学精炼步骤(添加水以去除过量的皂)期间或通过在除臭步骤中使用本公开的吸附剂来去除。

在一个实施方案中，用于处理包含叶绿素衍生物(诸如焦脱镁叶绿素)的油的方法还可包括用另外的酶处理油，该另外的酶选自由磷脂酶、叶绿素酶、脱镁叶绿素酶、焦脱镁叶绿素酶以及它们的组合组成的组。合适的磷脂酶可以是磷脂酶A、磷脂酶B和/或磷脂酶C或这些酶的任何合适的组合。用磷脂酶处理油(所谓的酶脱胶)降低了油中的磷脂含量，从而导致油中的原子磷含量降低。

本公开还涉及一种可通过如本文所公开的方法获得的油(例如，三酰基甘油类油、植物油、来自藻类的油等)。可以是可通过如本文所公开的方法获得的三酰基甘油类油的油可包含如本文所公开的具有脱色酶活性(诸如焦脱镁叶绿素酶活性)的多肽。

附图说明

图1：叶绿素转化成脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素以及转化成各自的反应产物脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的概述。示出了在C7位置处具有甲基基团的化合物A。B化合物在C7基团中具有醛，而不是甲基。结构取自PubChem，NCBI。

图2-2A：脱镁叶绿素a和b以及焦脱镁叶绿素a和b与不同的推定叶绿素酶在pH 7和50℃下温育24小时的HPLC结果。底物脱镁叶绿素a和b以及焦脱镁叶绿素a和b以及反应产物脱镁叶绿酸a和b以及焦脱镁叶绿酸a和b的量以峰表面积给出。前两列示出了反应产物的总和，并且底物“nd”意指：不可检测。

图3：脱镁叶绿素a和b以及焦脱镁叶绿素a和b与不同的推定叶绿素酶在pH 5和50℃下温育24小时的HPLC结果。底物脱镁叶绿素a和b以及焦脱镁叶绿素a和b以及反应产物脱镁叶绿酸a和b以及焦脱镁叶绿酸a和b的量以峰表面积给出。前两列示出了反应产物的总和，并且底物“nd”意指：不可检测。

图4：与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94温育24小时后卡诺拉油中的4A：叶绿素衍生物和4B：磷化合物。

图5：在不同反应条件下与来自大麦的CHL26酶和/或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94进行若干次温育后卡诺拉油和大豆油中的5A：叶绿素衍生物和5B：磷化合物，以及获得的胶中的5C：叶绿素衍生物。

图6-6A：苛性碱精炼后以及与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94温育后卡诺拉油和大豆油中的叶绿素衍生物。

图7：用于基于三酰基甘油的油的典型化学精炼方法的示意图。对油料种子(油菜籽或大豆)、油料果实植物(棕榈)或单细胞来源(藻类)进行溶剂提取和/或压榨以获得粗制油。然后用柠檬酸或磷酸处理粗制油以与不可水合磷脂反应，然后添加氢氧化钠以中和游离脂肪酸并形成钠皂。钠皂与存在的水形成乳液，从而允许在将油离心以产生精炼油时去除不可水合磷脂。然后可将精炼油用热水洗涤并离心以去除剩余的皂和磷脂。另选地，可用酸性二氧化硅处理精炼油以吸附皂、痕量金属和磷脂。工业酸性二氧化硅不具有任何去除叶绿素或叶绿素衍生物的能力。然后用漂白土处理油以去除油中存在的皂、磷脂以及叶绿素和叶绿素衍生物。在升高的温度和小于5mBar的真空下进行蒸汽蒸馏的除臭步骤的最后一步。蒸馏主要去除过氧化物、醛、酮和其他风味化合物。它还会破坏β-胡萝卜素并去除剩余的游离脂肪酸(0.1％)，以达到0.02％至0.05％最终游离脂肪酸(FFA)的水平。

图8：典型的酶脱胶/物理精炼方法的示意图。用磷酸或柠檬酸处理粗制油，以使不可水合磷脂能够在大约2的pH下失去与它们键合的钙或镁。然后添加氢氧化钠，使pH值高于4(对于柠檬酸)或高于6(对于磷酸)，以便磷脂酶可在与PLA发生酶促反应后起作用并获得非常低的残留磷(＜5ppm)。另选地，PLA可与PLC和/或PI-PLC反应，以使油收率最大化并且仍然获得非常低的残余磷，从而允许物理精炼。然后用酸性二氧化硅洗涤或处理油，接着用漂白土处理或与漂白土组合处理。在叶绿素水平小于50ppb的漂白过程之后，在除臭剂中对油进行物理精炼。高温蒸汽蒸馏去除上文图7中所述的所有化合物，但是其主要目的是去除FFA。FFA被蒸馏并收集在洗涤器中。与由在水脱胶或化学精炼中形成的乳液相关的损失相比，在除臭过程中损失的中性油非常有限。

图9：在水脱胶方法或酶辅助水脱胶方法中使用脱色酶的示意图。脱色酶可与60℃的水一起添加，或与PLC一起添加，或与PLC和PI-PLC的组合一起添加。温育两小时后，将油加热至70℃至85℃并离心以去除反应的胶和反应的叶绿素衍生物。

图10：经过改进以包括用脱色酶和本公开的二氧化硅吸附剂(诸如经MgO处理的吸附剂)处理的酶脱胶方法的示意图。首先用柠檬酸将粗制油处理成pH为大约2，以解离键合的钙离子和镁离子，将pH升高至4以上，以使PLC和脱色酶处于能够有效工作的pH值。添加1％至5％的水进行水解反应。在PLC和脱色酶温育完成后，可添加PLA1或PLA2以与油中存在的不可水合磷脂反应。在另外温育2小时至6小时后，将油加热至70℃至85℃并离心以去除反应的胶和叶绿素衍生物，从而产生在油中残余磷小于5ppm的油。然后可使酶脱胶的油任选地在真空下与本公开的二氧化硅吸附剂接触，以进一步去除叶绿素衍生物和痕量金属，如本文所述。

图11：用脱色酶接着用本公开的二氧化硅吸附剂处理的化学精炼方法的示意图。由于在该方法的早期步骤中pH非常低(大约2)和pH非常高(大约14)，脱色酶可能不在酸或苛性碱添加步骤中添加。脱色酶必须在初始离心步骤之后添加到精炼油中。在适于酶的温度(50℃至65℃)下在洗涤步骤中添加脱色酶是有利的。允许至少两个小时的温育时间，接着加热至70℃至85℃，然后离心。然后可通过任选地在真空下与本公开的二氧化硅吸附剂接触来进一步处理油，以进一步去除叶绿素衍生物和/或痕量金属，如本文所述。

图12：经过改进以包括用本公开的二氧化硅吸附剂处理但不进行脱色酶处理的酶脱胶/物理精炼方法的示意图。使酶脱胶的油或酶脱胶和洗涤的油任选地在真空下与本公开的二氧化硅吸附剂接触，并任选地与漂白土接触，以去除叶绿素衍生物和痕量金属，如本文所述。

图13：经过改进以包括用本公开的二氧化硅吸附剂处理但不进行脱色酶处理的用于基于三酰基甘油的油的化学精炼方法的示意图。使精炼油或精炼后的油任选地在真空下与本公开的基于二氧化硅的吸附剂接触，并任选地与漂白土接触，以去除叶绿素衍生物和痕量金属，如本文所述。

序列

SEQ ID NO：1＝来自大麦的具有脱色酶(包括焦脱镁叶绿素酶)活性的CHL26多肽。

SEQ ID NO：2：编码来自大麦的具有脱色酶(包括焦脱镁叶绿素酶)活性的多肽CHL26的经密码子优化的核酸序列，用于在荧光假单胞菌中表达。

SEQ ID NO：3：来自雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的CHL25推定叶绿素酶

SEQ ID NO：4：来自椰枣(Phoenix dactylifera)的CHL27推定叶绿素酶

SEQ ID NO：5：来自瓦勒迈杉(Wollemia nobilis)的CHL28推定叶绿素酶

SEQ ID NO：6：来自黄瓜(Cucumis sativus)的CHL29推定叶绿素酶

SEQ ID NO：7：来自醉蝶花(Tarenaya hassleriana)的CHL30推定叶绿素酶

SEQ ID NO：8：来自马铃薯(Solanum tuberosum)的CHL31推定叶绿素酶

SEQ ID NO：9：来自毛果杨(Populus trichocarpa)的CHL32推定叶绿素酶

SEQ ID NO：10：来自绿豆(Vigna radiata)的CHL33推定叶绿素酶

SEQ ID NO：11：N1阴性对照，绿色荧光蛋白(GFP)

SEQ ID NO：12：P2，具有焦脱镁叶绿素酶活性的莱茵衣藻叶绿素酶。SEQ ID NO：12在本文中也称为ELDC94。

SEQ ID NO：13：Spel位点和核糖体结合位点

SEQ ID NO：14：终止密码子和Xhol位点。

实施例

材料和方法

概述

标准基因技术(诸如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的基因修饰或杂交技术)是本领域已知的方法，诸如Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress或F.Ausubel等人编辑，“Current protocols in molecular biology”，GreenPublishing and Wiley Interscience，New York(1987)中所述。水是Milli-Q水，没有其他规定。

分析方法：

pH-化学计量添加酸和碱，达到添加到油中的水百分比。

2000克反应中2％的水将为40克，添加2.0克50％的柠檬酸溶液加上1.6mL 4M氢氧化钠将获得pH为4.5的水溶液。油的pH将始终保持为7。

皂-美国油脂化学家学会官方方法Cc 13a-43，2017年修订。游离脂肪酸-美国油脂化学家学会官方方法Ca 5a-40，2017年修订。

颜色-美国油脂化学家学会官方方法Ce 13e-92，2017重新批准。利用Tintometer的PFX-950的5¹/₄”单元。

磷和痕量金属-美国油脂化学家学会官方方法Ca 17-01-43，2017年修订。

磷脂组合物-对于³¹P NMR方法(也称为31-P NMR)，将10μL 10％DOL分散体分散于1mL水性溶液中，该水性溶液包含具有10％氧化氘(D₂O，Cambridge IsotopeLaboratories，DLM-4)的去矿物质水、25mg/mL脱氧胆酸(Sigma D2510)、5.84mg/mL EDTA二钠(Titriplex III，Merck 108418)和5.45mg/mL TRIS碱(三(羟甲基)氨基甲烷，Merck108387)，其中使用4N KOH将pH调节至pH 9，并且向其中添加2mg/mL TIP内标(磷酸三异丙酯，Aldrich 554669)(精确称量)。

所有样品均在具有Prodigy BBO探针的Bruker 400MHz Avancelll NMR光谱仪中测量。探针头的温度设定为300K。

用于定量的测量用半定量参数进行：128次扫描，90°脉冲，D1＝5秒。值以μmol/g的样品干重(DOL)记录。

通过UV/Vis分析绿色含量-AOCS UV/Vis方法用于测量油的绿色含量。AOCS UV/Vis方法在2017年重新批准的Cc 13d-55中描述。

通过HPLC-FLU分析叶绿素衍生物

脱镁叶绿素A和B、焦脱镁叶绿素A和B以及它们的脱镁叶绿环类以及叶绿素和脱植基叶绿素的分析通过HPLC使用荧光检测进行，荧光检测是基于Hwang等人(J.FoodHyg.Soc.Japan，第46卷，第2期，第45-48页)的工作开发的方法，对于A化合物扩展为λex410nm/λem 666nm的荧光检测，对于B化合物扩展为λex 436nm/λem 653nm的荧光检测。

吸附剂的水含量分析

通过将吸附剂加热至1750°F直至观察到恒重来测定水含量(以重量％计)。水含量等于以百分比表示的损失的质量除以材料的原始质量。

样品制备

将油样品在丙酮中稀释，将1g油在9mL丙酮中稀释，并以14000rpm离心5分钟。将澄清的上清液转移到进样瓶中，并将10μL样品进样到HPLC中。由于叶绿素水平在所有实际油样品中都非常低，因此在分析中没有考虑这些因素。

数据分析

色谱图的峰表面积(以任意单位计)指示油样品中存在的脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的量。图2和图3示出了与推定叶绿素酶在pH 5和pH 7下温育后油样品中脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的峰表面积。示出了植酸钙镁(phytin)的峰表面积之和、脱镁叶绿环类的峰表面积之和以及各种化合物的峰表面积之和。脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸的形成分别是脱镁叶绿素酶活性和焦脱镁叶绿素酶活性的存在的量度。

酶

磷脂酶C(PLC)和

PI-PLC以及真菌PLA1从DSM获得。

磷脂酶C包含SEQ ID NO：2的氨基酸38-282，其具有WO2005/086900中所公开的氨基酸取代63D、131S和134D。

PI-PLC包含根据WO2011/046812中公开的SEQ ID NO：8的成熟多肽。

真菌PLA1包含欧洲专利申请号EP18171015.3中公开的SEQ ID NO：1的成熟氨基酸序列。

设备

顶置式混合器是具有平叶桨片的IKA RW 20 Digital。

离心机是安装有“转鼓单元”以用于连续分离的De Laval Gyro测试仪。用安装的堵塞螺钉封闭离心机转鼓。

用具有G450转子定子的Ultra-Turrax匀化器SD-45以10,000rpm实现剪切混合。

二氧化硅吸附剂

测试吸附剂SP-2113、SP-2114、SP-2115、SP-2116、SP-2117和SP-2119从W.R.Grace&Co.-Conn.(Columbia，Md.)获得。

二氧化硅和

300(W.R.Grace&Co.-Conn.，Columbia，Md.)可商购获得。

实施例中使用的各种二氧化硅和吸附剂的特性在下面示出。

实施例1：推定叶绿素酶在假单胞菌中的表达

如图2和图3的表中所提供的推定叶绿素酶(CHL)在从Dow Global TechnologiesInc.(US20050130160、US20050186666和US20060110747)获得的假单胞菌系统中表达。根据DNA2.0的算法(

技术)，通过优化假单胞菌的基因密码子使用，设计了基于如图2-2A和图3中所示的推定叶绿素酶蛋白质序列的蛋白质序列的12个合成基因。出于克隆目的，DNA序列在5′-端含有Spel位点和核糖体结合位点(ACTAGTAGGAGGTAACTAATG)(SEQ IDNO：13)，在3′-端含有终止密码子和Xhol位点(T GAT GACT CG AG)(SEQ ID NO：14)。

SEQ ID NO：2示出了编码大麦的推定叶绿素酶SEQ ID NO：1的经密码子优化的核酸序列。

使用Spel和Xhol限制性酶克隆将DNA序列插入pDOW1169载体(Dow GlobalTechnologies Inc.，US20080058262)中。然后将包含在经修饰的tac启动子控制下编码CHL和PPH酶的基因的pDOW1169载体引入荧光假单胞菌尿嘧啶营养缺陷型菌株DPfl0中。在30℃下在不含尿嘧啶的M9基本培养基(Dow Global Technologies Inc.，US20050186666)上温育48小时后，选择转化细胞(Schneider等人，2005)。

在含有3ml M9培养基的24孔预灭菌深孔板(Axygen，CA，USA)中预培养正确的转化体。将板用Breathseal(Greiner bio-one，Frickenhausen，Germany)覆盖，并在Microton培养箱摇动器(Infers AG，Bottmingen，Switzerland)中在30℃、550rpm和80％湿度下温育16小时。从这些培养物中，将30mI用于接种含有3ml M9培养基的第二24孔预灭菌深孔板(Axygen，CA，USA)，在30℃、550rpm下培养24小时。8小时后，用IPTG(0.3mM最终浓度)诱导培养物。通过在2750rpm下离心10分钟收获培养物并移除上清液。将细胞沉淀物在-20℃下保存过夜。将来自3ml培养物的细胞沉淀物悬浮在1ml裂解缓冲液中，并在37℃下温育一小时。裂解缓冲液(1mM EDTA，50mM Tris，pH 8，0.25mg/ml溶菌酶，10mg/ml Dnasel，25mM MgSO₄和0.03％triton)。将裂解物以2750rpm离心10分钟，移出上清液并保存。

实施例2：粗制卡诺拉油中无细胞提取物中的焦脱镁叶绿素酶活性的测定

温育

使用来自北美来源的脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素含量高的粗制卡诺拉油以如下方式测定如实施例1中制备的上清液中的酶对焦脱镁叶绿素A和B的活性。使用Silverson混合器在高剪切混合下将缓冲液(5％(v/v))添加到油中。对于pH 5，使用20mM柠檬酸缓冲液。对于pH 7，使用20mM磷酸盐缓冲液。将24孔微量滴定板的每个孔填充1.425mL油包缓冲液分散体，并向每个孔添加75μL在实施例1中制备的5％(v/v)无细胞提取物(上清液)。测试样品的列表在图2-2A和图3的表中给出，并且包括含有莱茵衣藻焦脱镁叶绿素酶的阳性参照和阴性对照绿色荧光蛋白(GFP)。用塑料箔[Fasson S695]覆盖微量滴定板。用单独的磁性搅棒搅拌每个孔。使用KBMD微量滴定板搅拌器在50℃下进行温育。24小时后取样，并使用如上所述的HPLC-FLU分析脱镁叶绿素A和B以及焦脱镁叶绿素A和B以及它们的脱镁叶绿环类的存在。

图2和图3中的结果显示，只有CHL26(来自大麦的推定叶绿素酶)能够在pH 7和pH5下将所有脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素水解成它们相应的(焦)脱镁叶绿酸。

实施例3：粗制卡诺拉油与CHL26温育与时间的关系

以与实施例2中所述相同的方式，在pH 7下重复将粗制卡诺拉油与如实施例1中所述制备的大麦推定叶绿素酶CHL26的5％无细胞提取物一起温育。30分钟、2小时、5小时和24小时后取样。如上所述通过HPLC测量焦脱镁叶绿素a和b以及脱镁叶绿素a和b、焦脱镁叶绿酸a和b以及脱镁叶绿酸a和b。

表1中反应产物焦脱镁叶绿酸a和b以及脱镁叶绿酸a和b的形成表示为24小时后反应产物(相应的脱镁叶绿环类分子)的量的百分比。

表2示出了0.5小时、2小时和5小时后脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素的相对量随时间的变化，以相对于t＝0时的值的百分比表示(4次测量的平均值)。

表1：在pH 7和50℃下温育0.5小时、2小时、5小时和24小时后所有反应产物的相对 HPLC结果(相对于24小时后的值的百分比)。

表2：在pH 7和50℃下温育0.5小时、2小时和5小时后所有植酸钙镁化合物的相对 HPLC结果(相对于t＝0时的值的百分比)。

表1和表2中的结果显示，来自大麦的酶CHL26能够水解脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素以及a和b化合物。2小时后，所有脱镁叶绿素被转化(低于检测限)，而5小时后，几乎所有焦脱镁叶绿素被转化。

实施例4：通过10L生物反应器发酵生产CHL26和ELDC94

菌株和种菌

对于如实施例1中所述的包含CHL26(SEQ ID NO：1)和莱茵衣藻(ELDC94；SEQ IDNO：12)叶绿素酶的荧光假单胞菌，在单相摇瓶中制备预培养物，该摇瓶具有包含酵母提取物、盐和甘油作为C源的复合培养基，将该预培养物用作10L发酵的种菌，接种比例为10％，如下所述。

10L发酵

发酵过程基于工业荧光假单胞菌发酵(分批补料过程，限糖，IPTG诱导)。发酵过程包括在指数进料作为C源的葡萄糖下的生物质生产，然后在IPTG诱导体系下的生产阶段。在发酵23小时(生物质生产阶段结束)后，添加IPTG使其最终浓度为0.125mM，以诱导酶生产。将C源(葡萄糖)的进料速率降低至最大约70％，并将发酵延长至接种后48-55小时。

在发酵结束时，杀灭发酵液并经由苯甲酸盐处理释放酶，然后增加发酵液的pH。

回收

通过匀化释放细胞内酶。在750巴下进行两次，中间有12小时的冷却期。随后，用30％水稀释匀化的发酵液，添加15％DBF(Dicalite BF)、氯化钙(20g/kg初始发酵液)和絮凝剂C577(0.1％的初始发酵液)。将pH调节至8，并使材料澄清并进行超滤。用50％甘油稳定UF，并且为了确保完全杀灭剩余的细菌，添加MEP(对羟基苯甲酸甲酯/乙酯的丙二醇溶液)，用约15％v/v稀释产物。

活性

对p-NP底物的活性

使用生色底物4-硝基苯丁酸酯(Sigma N9874)测定酶活性。底物储备溶液：50mMpNP-丁酸酯的乙腈溶液。底物溶液：在使用前，将底物储备溶液以1∶4的比率与0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)混合，该缓冲液还含有0.2％BSA和2.0％Triton X-100。

在微量滴定板中，将120μL磷酸盐缓冲液(同上)与15μL底物溶液混合并在37℃下平衡。在通过添加15μL样品开始反应后，测量405nm处的OD持续5分钟。另外，通过添加15μL缓冲液而非样品进行空白测量。将曲线的线性部分的斜率用作活性的量度。稀释样品以确保5分钟后的吸光度增加小于1.0。

如下计算活性：

U/mL＝(ΔAbs/min样品-ΔAbs/min空白)/(ε_ρNP NP x 5)×1000×150/15×DfW

ε_ρNP＝对硝基苯酚的摩尔消光系数[L.mol-1.cm-1]

5＝温育时间[分钟]

1000＝从mmol到μmol的系数

150＝测定体积[μL]

15＝样品体积[μL]

Df＝稀释系数

W＝样品重量(g)

活性表示为在测试条件下每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚的酶量。使用在上述磷酸盐缓冲液中稀释的4-硝基苯酚标准溶液(Sigma N7660)进行校准。

CHL26的最终制剂的活性为1.4U/g(0.5w/w％)，ELDC94的最终制剂的活性为87U/g(0.04w/w％)。

实施例5：与粗制卡诺拉油与来自莱茵衣藻的参考酶(ELDC94)在不同条件下温育相比，粗制卡诺拉油与来源于大麦的具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶(CHL26)温育

将粗制卡诺拉油与0.5w/W％的大麦推定叶绿素酶CHL26的无细胞提取物温育，并与0.04w/w％的莱茵衣藻叶绿素酶(编码ELDC94＝Ref)的无细胞提取物进行比较，两种酶均如实施例4中所述制备。温育以10g规模进行(在具有温度控制的热板铝反应块上温育15ml玻璃反应容器中的10g油。

通过磁棒剧烈搅拌内容物)，并且现在在三个不同的温度(40℃、50℃和60℃)下以及在具有不同水相酸度的四种方案下进行：

酸性：400ppm柠檬酸预处理；

弱酸性：用500ppm柠檬酸和138ppm苛性碱(NaOH)预处理；

中性：只有水；

弱碱性：用150ppm NaOH预处理。

温育期间的总水含量为3％w/w，其包括酶制剂和预处理溶液。在实验之前，通过用水以1∶1稀释经预处理的油来评估含水环境的酸性，然后通过pH计测量pH。这样得到指示反应期间分散体中含水环境的酸性的以下pH值：酸性：pH3.4；弱酸性：pH 4.5；中性：pH 5.9；碱性：pH 7.9。

对于用柠檬酸预处理，将柠檬酸(作为50％w/w溶液)添加到70℃的油中，在70℃下保持搅拌30分钟，随后将温度降低至温育温度，并且对于弱酸性条件，添加NaOH(作为2.0％w/w溶液)。在仅添加NaOH的情况下，将油在温育温度下搅拌30分钟。

在温育期间，在0.5小时、2小时、4小时和24小时后取样，并如实施例2中所述通过HPLC-Flu现在相对于一组具有已知浓度的标准物进行分析。将所有底物(叶绿素、脱镁叶绿素、焦脱镁叶绿素-a和b)和所有反应产物(脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸-a和b)的浓度分别加和成总底物和总反应产物(以mg/kg油计)。所有结果在下表中以底物和反应产物的百分比给出。

表3、表4和表5中的结果显示，根据SEQ ID NO：1的大麦酶CHL26在酸和苛性碱的存在下具有更宽的应用范围，并且比来自莱茵衣藻的参考叶绿素酶在更高的温度下具有活性。

表3：与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94在40℃下在不同条件下温育后粗制卡诺拉油中的叶绿素衍生物(重量％)

表4与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94在50℃下在不同条件下温育后粗制卡诺拉油中的叶绿素衍生物(重量％)

表5与来自大麦的CHL26酶或来自莱茵衣藻的参考酶ELDC94在60℃下在不同条件下温育后粗制卡诺拉油中的叶绿素衍生物(重量％)

实施例6：粗制卡诺拉油与来自莱茵衣藻的酶(ELDC94)温育，然后用各种二氧化硅处理

将1,500克粗制卡诺拉油置于具有带正方形桨片的顶置式混合器的2升带夹套玻璃烧杯中，并以90转/分钟(rpm)混合。将夹套温度设定为65℃。一旦油温达到设定点，就将20mL ELDC94衣藻(藻类)(如实施例4中所述制备)和100克去离子水添加到油中。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并用塑料包裹物覆盖。在250rpm下将材料盖上混合24小时。

将1.5克50％(重量％)的柠檬酸添加到混合油中。将夹套的设定点降低至55℃。一旦材料达到55℃，就将油移到剪切混合器。将1.2mL 4N NaOH添加到油中并剪切混合30秒。添加0.3克

磷脂酶C(PLC)和30克去离子水。将油剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在55℃下以250rpm混合2小时。

将烧杯移回高剪切混合器，并将0.1克磷脂酶A1(PLA1)酶(Lecitase Ultra)添加到油中并剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在55℃下以250rpm混合2小时。将水浴的设定点升高至75℃。一旦油达到75℃，就利用具有带封闭孔的转鼓的Gyro离心机对油进行离心。收集油的样品。弃去胶。

将上述反应重复11次，并将油合并并标记为“对照”。

将六个500克上述经酶处理的卡诺拉油“对照”样品添加到六个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将0.25克、1.0克、2.0克、4.0克、6.0克和8.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加大约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。出乎意料的是，油在用测试二氧化硅进行吸附的过程中变成深绿色。在使用工业二氧化硅(

(Grace Davison，Columbia，Md.)或

二氧化硅(INEOS Silicas，Joliet，III.)的先前实验中，油的颜色未改变。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤纸盘为深绿色，但当使用工业二氧化硅时，滤盘和滤饼总是黄色的。滤盘和滤饼为深绿色。

将两个500克来自上文的上述经酶处理的卡诺拉油“对照”样品分开并添加到具有吸附程序构造的两个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将1.0克和2.0克二氧化硅SP-2116混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。试验期间油的颜色未从原始颜色改变。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为黄色。

将两个500克来自上文的上述经酶处理的卡诺拉油“对照”样品分开并添加到具有吸附程序构造的两个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将1.0克和2.0克二氧化硅SP-2117混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。试验期间油的颜色未从原始颜色改变。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为黄色。

油的含量在表6和表7中示出。

表6：用各种二氧化硅进一步处理后经ELDC94处理的油中的P、Ca、Mg和Fe含量

表7：用各种二氧化硅进一步处理后经ELDC94处理的油中叶绿素衍生物的含量

CHYL＝叶绿素；PYN＝脱镁叶绿素；PPYN＝焦脱镁叶绿素；POB＝脱镁叶绿酸；PPOB＝焦脱镁叶绿酸

b.d.＝低于检测限

n.d.＝未测定

24小时后，ELDC94衣藻(藻类)酶使叶绿素和叶绿素衍生物的量从19.86ppm降低至8.06ppm(经由AOCS UV/VIS方法，从53.6ppm降低至38.49ppm)。然而，这不足以显著地使该过程能够用于工业过程中。需要具有更强水解叶绿素和叶绿素衍生物的能力的酶，以及更好地去除那些生成的衍生物的方法。

上述数据表明，与其他两种二氧化硅相比，二氧化硅SP-2115具有最强的去除金属、叶绿素和叶绿素衍生物的能力。UV/Vis方法表明，与对照中叶绿素的量(即38.49ppm)相比，用低剂量(即0.25g和1g)的SP-2115处理使叶绿素分别减少2.20ppm和12.84ppm。相比之下，与对照相比，用最低剂量(即0.25g)的SP-2116和SP-2117处理后叶绿素的量分别增加0.54ppm和0.17ppm，而用最高剂量(即1g)的SP-2116和SP2117处理后叶绿素的量分别减少1.98ppm和1.83ppm。HPLC测试方法表明SP-2116和SP-2117在最高剂量下具有相同的有限减少模式。数据还表明，需要通过找到另外的标准和响应因子来改进叶绿素和叶绿素衍生物的HPLC方法，以使其更接近用于测量植物油中的绿色的AOCS方法。该方法的附加工作已完成并涵盖在以下实施例中。

实施例7：与来自莱茵衣藻的参考酶(ELDC94)相比，溶剂提取的粗制卡诺拉油与来源于大麦的具有焦脱镁叶绿素酶活性的酶(CHL26)温育

将35磅容器的溶剂提取的粗制卡诺拉油倒入不锈钢大容器中，并用IKA混合器混合均匀。

在混合之后，将大约1.5kg粗制卡诺拉置于具有带正方形桨片的顶置式混合器的2升带夹套玻璃烧杯中，并以90转/分钟(rpm)混合。将夹套温度设定为65℃。一旦油温达到设定点，就将如实施例4中所述制备的0.7克酶ELDC94(反应1)或7.5克CHL26(反应2)与100克去离子水一起添加到油中。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并用塑料包裹物覆盖。将材料与酶在250rpm下温育24小时。

将烧杯移回高剪切混合器，并将0.1克真菌磷脂酶Ai(PLA₁)酶添加到油中并剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在55℃下以250rpm混合2小时。将水浴的设定点升高至75℃。一旦油达到75℃，就利用具有带封闭孔的转鼓的Gyro离心机对油进行离心。收集油和胶的样品，并如上所述分析P、Ca、Mg和Fe以及叶绿素衍生物的存在(使用HPLC)。

将油和离心机转鼓中剩余的重相的混合物倒入400mL烧杯中，其中滗析出油。将剩余的油和重相置于50mL离心管中并旋转。弃去来自滗析转鼓和管中的油，并将液体重相合并。

表8和图4a)中的结果显示，根据SEQ ID NO：1的具有焦脱镁叶绿素酶活性的CHL26酶能够减少溶剂提取的粗制卡诺拉油中的叶绿素衍生物。叶绿素底物是叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素，并且叶绿素产物是脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸和焦脱镁叶绿酸。

表8：用酶CHL26和参考酶ELDC94处理后粗制卡诺拉油中的化合物(以ppm计)

*起始材料(粗制卡诺拉油)

图4b)中的结果显示，在收集的重相中仍存在未反应的磷脂，这表明磷脂酶反应太短而无法完成。

实施例8：压榨的粗制卡诺拉油与CHL26酶在不同条件下温育，并用二氧化硅SP- 2115处理

将35磅容器的压制的粗制卡诺拉油倒入不锈钢大容器中，并用IKA混合器混合均匀。

反应3-CHL26与PLC和PI-PLC在pH 4.5下温育2小时，然后与PLA1温育2小时

将约1.5kg粗制卡诺拉置于具有带正方形桨片的顶置式混合器的2升夹套玻璃烧杯中。将油以90rpm混合。将夹套温度设定为70℃。将1.5克50％(重量％)的柠檬酸添加到混合油中并剪切混合1分钟。将夹套的设定点降低至60℃。一旦材料达到60℃，就将油移到剪切混合器。将1.2mL 4N NaOH添加到油中并剪切混合30秒。添加0.3克Purifine PLC(LR79.14，2018年2月)、0.02克Purifine PI-PLC、7.5克如实施例4中所述制备的CHL26酶[大麦二棱变种(大麦，植物)]和100克去离子水。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在60℃下以250rpm混合2小时。

将带夹套玻璃烧杯再次移到剪切搅拌器，其中添加0.075克PLA₁(notebook，0743B2)，并将油剪切混合1分钟。将带夹套玻璃烧杯移回顶置式混合器并用塑料包裹物覆盖。将油混合，并使反应在250rpm下持续2小时。将水浴的设定点升高至75℃。一旦油达到75℃，就利用具有带封闭孔的转鼓的Gyro离心机对油进行离心。收集油和胶的样品。

反应4-ELDC94与PLC和PI-PLC在pH 4.5下温育2小时，然后与PLA₁温育2小时

使用0.61克配制的酶溶液(如实施例4中所述制备)，将来自上文反应1的相同程序用于酶ELDC94。

将两个450克反应4经酶处理的卡诺拉油样品分开并添加到具有吸附程序构造的两个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将1.0克和2.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。油在用测试二氧化硅进行吸附的过程中变成深绿色。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应5-CHL26与PLC和PI-PLC在pH 4.5下温育2小时，然后与PLA₁温育4小时

遵循与反应1相同的程序，但使PLA1反应反应4小时而不是仅2小时。

将两个450克反应5经酶处理的卡诺拉油样品分开并添加到具有吸附程序构造的两个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0克和3.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应6-CHL26与PLC和PI-PLC在pH 4.5下温育2小时，然后与PLA1温育4小时

遵循与反应3相同的程序，不同的是将两倍量的CHL26(共15克)添加到反应中。

将两个450克反应6经酶处理的卡诺拉油样品分开并添加到具有吸附程序构造的两个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将1.0g和2.0g二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应7-CHL26与PLC和PI-PLC在中性pH下温育2小时，然后与PLA₁温育4小时

遵循与反应1相同的程序，不同的是不进行pH调节。

反应8-SBO CHL26与PLC和PI-PLC在pH 4.5下温育2小时，然后与PLA₁温育2小时

遵循与反应1相同的程序，但油是溶剂提取的粗制大豆油(SBO)。

将三个450g反应8经酶处理的大豆油样品分开并添加到具有吸附程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将0.25克、0.5克和1.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

在表9和图5b)中，示出了在根据反应1至6进行酶处理之前和之后油和相应胶的磷(P)、钙(Ca)、镁(Mg)和铁(Fe)含量。在中性pH下，与pH 4.5下的反应相比，油中剩余较高量的P。表9还示出了用二氧化硅SP-2115处理后油的P、Ca、Mg和Fe含量。该数据表明，二氧化硅处理可在不使用漂白土的情况下将痕量磷和金属去除至足以满足漂白油工业标准的水平。当添加MgO时，它们未失去其吸附这些杂质的能力。

表10和图5a)中的结果显示，当CHL26和ELDC94酶在相同条件下温育(反应1和2)时，与后者相比，前者在粗制卡诺拉油中转化更高量的叶绿素衍生物。表10还显示，与未进一步与二氧化硅接触的经酶处理的油中叶绿素底物和产物的量相比，使经酶处理的油与二氧化硅SP-2115接触降低了油中叶绿素底物和叶绿素产物两者的量。

在本实施例中，与酸性条件(pH 4.5)相比，CHL26酶在中性条件下在粗制卡诺拉油中将更高量的叶绿素底物转化成相应的叶绿素产物(将反应7与反应3、5和6进行比较)。

CHL26酶还将大豆油中的叶绿素底物转化成相应的叶绿素产物(反应8)。

表10中的结果还显示，与利用ELDC94酶的反应相比，当使油与CHL26酶反应时，在胶(重相)中发现更高量的叶绿素产物。

表9：与参考酶ELDC94和/或无酶处理和/或二氧化硅处理后相比，用CHL26酶处理后卡诺拉油(Can)或大豆油(SBO)中的化合物

b.d.-低于检测限

Tr-痕量

表10：与参考酶ELDC94和/或无酶处理和/或二氧化硅处理后相比，用CHL26酶处理后卡诺拉油或大豆油和分离的胶中的叶绿素衍生物

b.d.-低于检测限

实施例9：CHL26酶和二氧化硅处理在卡诺拉油和大豆油的苛性碱精炼应用中的用途

以下实验是对CHL26在苛性碱精炼应用中的评估，其中油已用磷酸和氢氧化钠处理，如在卡诺拉油和大豆油的工业过程中发生的那样。“精炼后的”产物是用磷酸处理然后用氢氧化钠处理以将游离脂肪酸(FFA)转化成钠皂的油，所述钠皂是水溶性的并且在“精炼”离心的水或“重”相中去除。然后将油用水(2％w/w至10％w/w)洗涤，以去除油中存在的剩余皂和残余磷脂。任选地，在水洗步骤中在精炼离心之后对酶进行评估，但是在低得多的温度下进行。

将五加仑塑料桶的精炼后的卡诺拉油(ORCAN)用高剪切混合器混合，以使其均匀。取出2-3kg样品用于以下实验。

反应9-ELDC94-比较性

将2kg精炼后的卡诺拉置于热板上的4升玻璃烧杯中，以90rpm顶置混合。在搅动下将油加热至60℃。一旦材料达到60℃，就将烧杯移到剪切混合器。将0.8克酶ELDC94(如实施例4中所述制备)和100克去离子水添加到油中。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖以最小化水分损失。将玻璃烧杯移回顶置式混合器并用塑料包裹物覆盖。将油在60℃下以250rpm混合4小时。将温度升高至75℃。利用Gyro离心机对油进行离心。收集分离的油。

将油和离心机转鼓中剩余的重相的混合物倒入400mL烧杯中，其中滗析出油。将剩余的油和重相置于50mL离心管中并旋转。弃去来自滗析转鼓和管中的油，并将液体重相合并。重相为深绿色。

反应10-ELDC94-比较性

反应10是反应9的重复，不同的是使用3kg油和2.0g ELDC94(如实施例4中所述制备)。

在分析来自反应9和10的油后，将油合并并再次分析。

反应11-CHL26

反应11是反应9的重复，不同的是使用10.1克CHL26(如实施例4中所述制备)代替ELDC94。重相为比反应9和10更浅的绿色。

反应12-CHL26

反应12是反应10的重复，不同的是使用20克CHL26。

在分析之后，将反应11和12的油合并并混合，并在混合之后再次分析。

反应13-ELDC94-比较性

在水洗离心后，从苛性碱精炼生产线编号1中取出3kg精炼后的大豆油(ORSBO)。将油置于4升玻璃烧杯中，并置于热板上，用正方形混合桨片(90rpm)顶置混合。一旦材料冷却至60℃，就将烧杯移到剪切混合器。将1.0克ELDC94酶(如实施例4中所述制备)和150克去离子水添加到油中。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖以最小化水分损失。将玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在60℃下以250rpm混合4小时。将温度升高至75℃，然后利用Gyro离心机对油进行离心。

收集油和重样品用于进一步分析。

将剩余的油和离心机转鼓中剩余的重相倒入400mL烧杯中，其中滗析出油。将剩余的油和重相置于50mL离心管中并旋转。弃去管中的剩余油，并将液体重相合并。重相为无色的，没有可辨别的颜色颜料。

反应14-CHL26

反应14是反应13的重复，不同的是利用15克CHL26(如实施例4中所述制备)代替ELDC94。

反应15-EDLC94-比较性

在水洗离心后，从苛性碱精炼生产线编号1中取出3kg精炼后的大豆油(ORSBO)。将油置于4升玻璃烧杯中，并置于热板上，用正方形混合桨片(90rpm)顶置混合。一旦材料冷却至60℃，就将烧杯移到剪切混合器。将1.2克ELDC94酶(如实施例4中所述制备)和150克去离子水添加到油中。将材料剪切混合1分钟，同时用塑料包裹物覆盖以最小化水分损失。将玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在60℃下以250rpm混合4小时。将温度升高至75℃，然后利用Gyro离心机对油进行离心。

收集油和重相(胶)样品用于进一步分析。

反应16-CHL26

反应16是反应15的重复，不同的是使用15克CHL26。

反应9至16的结果以及来自反应9和10以及来自反应11和12的合并和混合油的结果在表11和图6-6A中示出。

表9和图6-6A中的结果显示，具有焦脱镁叶绿素酶的酶CHL26比参考叶绿素酶ELDC94将更高量的叶绿素底物(叶绿素、脱镁叶绿素和焦脱镁叶绿素)转化成其叶绿素产物(脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸)。

表11：苛性碱精炼之后以及用CHL26酶和ELDC94(参考)酶处理之后，精炼后的卡诺拉油(ORCAN)和精炼后的大豆油(ORSBO)中的叶绿素衍生物(底物和产物)

b.d＝低于检测限

n.m.＝未测量

表12的结果示出了在上述酶处理后精炼后的卡诺拉油和精炼后的大豆油中游离脂肪酸(FFA)、皂以及磷光剂和Ca、Mg、Fe和/或叶绿素的含量。

表12：苛性碱精炼之后以及用CHL26酶和ELDC94(参考)酶处理之后，精炼后的卡诺拉油(ORCAN)、精炼后的大豆油(ORSBO)的组成

tr＝痕量

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

t.d.＝太暗而无法测量

*＝HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

反应9和10-二氧化硅处理

将来自反应9和10的油合并，然后分成三个500克经酶处理的ORCAN油样品，并添加到具有吸附剂程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将1.0克、2.0克和3.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。油在用测试二氧化硅进行吸附的过程中变成深绿色。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤纸盘为深绿色。将油分别标记为9101、9102和9103。标记为9100的油是合并的反应9和反应10的样品。

将经处理的卡诺拉油9102(436克)和9103(448克)合并，并置于3L Claisen烧瓶中。将油用氮气鼓泡约2分钟。开始施加真空，停止氮气鼓泡，并使来自蒸汽发生器的水蒸汽开始除臭过程。在除臭过程中实现的真空介于0.82-0.98mBar之间。在真空和水鼓泡(3重量％)下将油加热至230℃。保持鼓泡和温度两小时。停止加热，并使油在真空和水鼓泡下冷却。在约100℃下用氮气破坏真空，并使其进一步冷却至70℃，然后向空气开放。油为深绿色/灰色。将油标记为91023-DEO。

表13中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后合并的反应9和10油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和叶绿素的含量。

表13：酶处理之后或在酶和二氧化硅处理之后精炼后的卡诺拉油(ORCAN)的组成

tr＝痕量

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

t.d.＝太暗而无法测量

*＝HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表14中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后合并的反应9和10油中的叶绿素底物和产物。

如HPLC方法所报告，来自使用ELDC94的反应的合并样品的进料为18.71ppm，显示在用SP-2115处理后底物显著减少至14.04ppm，并且在用SP-2115处理后将组合样品中的产物从0.39ppm完全去除至低于检测限。

反应11和12-二氧化硅处理

将来自反应11和12的油合并，然后分成三个500克经酶处理的ORCAN油样品，并添加到具有吸附剂程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将1.0克、2.0克和3.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。将油分别标记为11121、11122和11123。标记为11120的油是反应11和反应12油的合并样品。

将经处理的卡诺拉油11122(449克)和11123(451克)合并，并置于3L Claisen烧瓶中，并且根据除臭程序组装。将油用氮气鼓泡约2分钟。开始施加真空，停止氮气鼓泡，并使来自蒸汽发生器的水蒸汽开始除臭过程。在除臭过程中实现的真空介于0.28-0.56mBar之间。在真空和水鼓泡(3重量％)下将油加热至230℃。保持鼓泡和温度两小时。停止加热，并使油在真空和水鼓泡下冷却。在约100℃下用氮气破坏真空，并使其进一步冷却至70℃，然后向空气开放。油为浅绿色/灰色。将油标记为111223-DEO。

表15中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后合并的反应11和12油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和叶绿素的含量。

表15：酶处理之后或在酶和二氧化硅处理之后精炼后的卡诺拉油(ORCAN)的组成

tr＝痕量

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

t.d.＝太暗而无法测量

*＝HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表16中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后合并的反应11和12油中的叶绿素底物和产物。

如HPLC方法所报告，来自使用CHL26的反应的合并样品的进料为18.19ppm，显示用SP-2115处理后底物从12.00ppm显著减少至3.95ppm，并且产物从6.19ppm减少至0.17ppm。显然，SP-2115对于CHL26的酶促反应的底物和产物两者具有在吸附过程中去除它们的能力。

反应5和13-二氧化硅处理SP-2114与SP-2115的比较

将三个500克来自反应13的经酶处理的精炼大豆油样品分开并添加到具有吸附程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将0.5克、1.0克和2.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。将油分别标记为135、1310和1320。标记为130的油是来自反应13的样品。

将500克来自反应5的经酶处理的精炼大豆油样品添加到具有吸附程序构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0克二氧化硅SP-2114混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。在吸附过程中观察到油的颜色变化为绿色/棕色。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为浅绿色。将样品标记为132-2114。

表17中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后反应5和反应13油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和叶绿素的含量。

表17：酶处理后或酶和二氧化硅处理后油的组成

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表18中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后反应5和13油中的叶绿素底物和产物。

在SP-2114与SP-2115的直接比较中，SP-2114不如SP-2115好，但与使用SP-2115实现的41ppb相比，能够将反应13油中的叶绿素从298ppb降低至104ppb，如由UV/Vis方法所报告。

反应14-二氧化硅处理SP-2113、SP-2115与SP-2119的比较

将三个500克来自反应14的经酶处理的精炼大豆油样品分开并添加到具有吸附程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将0.5克、1.0克和2.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。将油分别标记为145、1410和1420。标记为140的油是反应14的样品。

将500克来自反应14的经酶处理的精炼大豆油样品添加到具有吸附程序构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0克二氧化硅SP-2113混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。在吸附过程中未观察到油的颜色变化。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为黄色。将样品标记为142-2113。

将500克来自反应14的经酶处理的精炼大豆油样品添加到具有吸附程序构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0克二氧化硅SP-2119混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。在吸附过程中未观察到油的颜色变化。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为黄色。将样品标记为142-2119。

将经酶处理和经二氧化硅处理的精炼后的大豆油样品1420(471克)和1410(461克)合并，并置于3L Claisen烧瓶中，并且根据除臭程序组装。将油用氮气鼓泡约2分钟。开始施加真空，停止氮气鼓泡，并使来自蒸汽发生器的水蒸汽开始除臭过程。在除臭过程中实现的真空介于0.28-0.56mBar之间。在真空和水鼓泡(3重量％)下将油加热至230℃。保持鼓泡和温度两小时。停止加热，并使油在真空和水鼓泡下冷却。在约100℃下用氮气破坏真空，并使其进一步冷却至70℃，然后向空气开放。油为无色的，没有绿色。将油标记为14101420-DEO。

表19中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后反应14油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和叶绿素的含量。

表19：酶处理后或酶和二氧化硅处理后ORSBO的组成

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

*＝HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表20中的结果示出了在如上所述进行二氧化硅处理后反应14油中的叶绿素底物和产物。

与用SP-2115处理的样品不同，用SP-2113或SP-2119处理的样品不表现出如通过UV/Vis方法所测量的任何叶绿素去除活性。该方法是行业所接受的。

反应15-二氧化硅处理和/或除臭

将三个500g来自反应15的经酶处理的精炼大豆油样品分开并添加到具有吸附程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将0.5克、1.0克和2.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。将油分别标记为155、1510和1520。标记为150的油是反应15的样品。

将经酶处理和经二氧化硅处理的精炼后的大豆油样品1520(457克)和1510(461克)合并，并置于3L Claisen烧瓶中，并且根据除臭程序组装。将油用氮气鼓泡约2分钟。开始施加真空，停止氮气鼓泡，并使来自蒸汽发生器的水蒸汽开始除臭过程。在除臭过程中实现的真空介于0.57-0.97mBar之间。在真空和水鼓泡(3重量％)下将油加热至230℃。保持鼓泡和温度两小时。停止加热，并使油在真空和水鼓泡下冷却。在约100℃下用氮气破坏真空，并使其进一步冷却至70℃，然后向空气开放。油为无色的，没有绿色。将油标记为15101520-DEO。

将618克来自反应15的经酶处理的油(无任何吸附剂处理)置于3L Claisen烧瓶中，并且根据除臭程序组装。将油用氮气鼓泡约2分钟。开始施加真空，停止氮气鼓泡，并使来自蒸汽发生器的水蒸汽开始除臭过程。在除臭过程中实现的真空介于1.15-1.40mBar之间。在真空和水鼓泡(3重量％)下将油加热至230℃。

保持鼓泡和温度两小时。停止加热，并使油在真空和水鼓泡下冷却。在100℃下用氮气破坏真空，并使其冷却至70℃，然后向空气开放。油为无色的，没有任何绿色。将油标记为150-DEO。

表21中的结果示出了在如上所述进行除臭和/或二氧化硅处理后反应15油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和叶绿素的含量。

表21：酶处理后或酶和二氧化硅处理后油的组成

tr＝痕量

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

*＝HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表22中的结果示出了在如上所述进行除臭和/或二氧化硅处理后反应15油中的叶绿素底物和产物。结果表明需要吸附剂来去除最终较浅的颜色。

反应16-二氧化硅处理或除臭

将三个500克来自反应16的经酶处理的精炼大豆油样品分开并添加到具有吸附程序构造的三个1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将0.5克、1.0克和2.0克二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。将油标记为165、1610和1620。标记为160的油是来自反应16的样品。

将825.3克经酶处理的油(无任何吸附剂处理)置于3L Claisen烧瓶中，并且根据除臭程序组装。将油用氮气鼓泡约2分钟。开始施加真空，停止氮气鼓泡，并使来自蒸汽发生器的水蒸汽开始除臭过程。在除臭过程中实现的真空介于1.15-1.40mBar之间。在真空和水鼓泡(3重量％)下将油加热至230℃。保持鼓泡和温度两小时。停止加热，并使油在真空和水鼓泡下冷却。在100℃下用氮气破坏真空，并使其冷却至70℃，然后向空气开放。预计颜色会变绿，但呈非常轻微的红色，没有绿色。将样品标记为160-Deo。

表23中的结果示出了在如上所述进行除臭或二氧化硅处理后反应16油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和叶绿素的含量。

表23：酶处理后或酶和二氧化硅处理后油的组成

tr＝痕量

b.d.＝低于检测限

n.m.＝未测量

HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表24中的结果示出了在如上所述进行除臭或二氧化硅处理后反应16油中的叶绿素底物和产物。结果表明需要用吸附剂处理来去除最终的绿色。

实施例10：精炼后的卡诺拉(ORCAN)油与CHL26酶温育，并用二氧化硅SP-2115或商业二氧化硅或漂白粘土处理

将五加仑塑料桶的精炼后的卡诺拉油(ORCAN)用高剪切混合器混合，以使其均匀。取出样品用于以下实验。

反应17-CHL26

将3,000克精炼后的卡诺拉油置于热板上的4升玻璃烧杯中，顶置混合。在搅动下将油加热至60℃。一旦材料达到60℃，就将油移到剪切混合器。添加15g脱色酶CHL26(如实施例4中所述制备)和150g去离子水。将材料剪切混合1分钟。将玻璃烧杯移回顶置式混合器并用塑料包裹物覆盖。将油在60℃下混合4小时。将油温升高至75℃，并利用具有带封闭孔的转鼓的Gyro离心机对油进行离心。收集油和重样品。

将油和转鼓中剩余的重相倒入400mL烧杯中，其中滗析出油。将剩余的油和重相置于50mL离心管中并旋转。弃去管中剩余的油，并将液体重相合并。重相为深绿色。

反应18-20--CHL26

将3000克精炼后的卡诺拉油置于4升夹套玻璃烧杯中。将温度设定为60℃。一旦材料达到60℃，就将油移到剪切混合器。将15g脱色酶CHL26(如实施例4中所述制备)和150g去离子水添加到热油中。将材料剪切混合1分钟。将玻璃烧杯移回顶置式混合器并再次用塑料包裹物覆盖。将油在60℃下混合4小时。将油温升高至75℃，并利用具有带封闭孔的转鼓的Gyro离心机对油进行离心。重复该程序三次，并且收集油并将其合并以用于反应18-20。

反应17-用SP-2115进行二氧化硅处理

将500克来自反应17的精炼后的卡诺拉油添加到具有上述设备构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0g二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。在相同的条件下重复该实验，不同的是使用4克、6克和8克二氧化硅SP-2115。

反应18-20-二氧化硅处理SP-2115与商业二氧化硅和漂白粘土的比较

将来自合并的反应18-20的精炼后的卡诺拉油用可商购获得的二氧化硅(

300)、漂白粘土(Clariant 126FF)或两批单独的SP-2115处理，如下所述。

将500克来自合并的反应18-20的精炼后的卡诺拉油添加到具有上述设备构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0g

300混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃，并将油混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。

将500克来自合并的反应18-20的精炼后的卡诺拉油添加到具有上述设备构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0g漂白粘土

supreme 126FF(Clariant)混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃，并将油混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。

将500克来自合并的反应18-20的精炼后的卡诺拉油添加到具有上述设备构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0g第一批二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃，并将油混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。

将500克来自合并的反应18-20的精炼后的卡诺拉油添加到具有上述设备构造的1000mL圆底烧瓶中。将油加热至80℃，并将2.0g第二批二氧化硅SP-2115混合到油中，并添加约100mbar的真空。将温度升高至100℃，并将油混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。

表25中的结果示出了如上所述用二氧化硅SP-2115、

二氧化硅或漂白粘土处理后反应17油或合并的反应18-20油中游离脂肪酸(FFA)、皂、P、Ca、Mg、Fe和钠(Na)的含量。

表25：用CHL26处理后或用CHL26和SP-2115、

300二氧化硅或漂白粘土处理后油的组成

b.d.-低于检测限

t-痕量

n.m.-未测量

精炼后意指洗涤和干燥后

Can-卡诺拉

将油样品(约1克)用CHCl₃(氯仿)在100ml容量瓶中稀释，并使用UV-Vis方法观察670nm处的峰值吸光度来测量叶绿素含量。还使用HPLC方法进行测量。结果在表26中示出。

表26：用CHL26处理后或用CHL26和SP-2115、

二氧化硅或漂白粘土处理后油的叶绿素含量

*＝HPLC是总叶绿素衍生物的测量结果

表27-28中的结果示出了如上所述进行处理后反应17或合并的反应18-20油中的叶绿素底物和产物。剩余的水平接近工业过程中所需的叶绿素底物和产物的水平。优化脱色酶的反应条件将能够消除将漂白土用于极绿的卡诺拉油。

表28：用CHL26处理后或用CHL26和SP-2115、

300或漂白粘土处理后油中的叶绿素底物和产物组成。

商业二氧化硅

300在去除脱色酶反应中生成的产物方面的能力有限，实际上似乎一些叶绿素产物会转化回底物。漂白土在去除存在于未反应的脱色酶油中的叶绿素底物方面的能力更强，但不会去除经脱色酶处理的油的产物以及本公开的二氧化硅。

实施例11：二氧化硅吸附剂的制备

该实施例描述了以下反应21-30中吸附剂的制备：

反应21-SP-2113的制备

将600克

二氧化硅在60℃下干燥以去除173克水。然后用含有18.6克NaOH和81.9克水的氢氧化钠溶液浸渍二氧化硅。将材料在瓦林混碎机中共混5分钟。

反应22-SP-2114的制备

将600克

二氧化硅与12.2g MgO粉末在瓦林混碎机中共混5分钟。

反应23-SP-2115的制备

将600克

二氧化硅与31.6g MgO粉末在瓦林混碎机中共混5分钟。

反应24-SP-2116的制备

将600克

300二氧化硅在60℃下干燥以去除173克水。然后用含有11.4克NaOH和92克水的氢氧化钠溶液浸渍二氧化硅。将材料在瓦林混碎机中共混5分钟。

反应25-SP-2117的制备

将600克

300二氧化硅在60℃下干燥以去除173克水。然后用含有17.8克NaOH和92克水的氢氧化钠溶液浸渍二氧化硅。将材料在瓦林混碎机中共混5分钟。

反应26-SP-2119的制备

将600克含有小于10重量％的水、表面积为707m²/g且中值粒度为19微米的二氧化硅干凝胶与30克MgO在瓦林混碎机中共混5分钟。

反应27-吸附剂A的制备

将4.8克SP-2115在110℃的烘箱中干燥3小时。

反应28-吸附剂B的制备

将5克MgO粉末和20克

二氧化硅共混到容器中，密封，然后摇动混合1小时。

反应29-吸附剂C的制备

将24.5克含有小于10重量％的水、表面积为707m²/g且中值粒度为19微米的二氧化硅干凝胶用23.6克D1水浸渍，然后添加到包含2.5克MgO粉末的容器中。将内容物密封并摇动混合1小时。

反应30-吸附剂D的制备

将264克具有4重量％的水、表面积为330m²/g且粒度介于88微米与210微米之间的二氧化硅干凝胶用303克D1水浸渍。将材料分成六个不同的容器，每个容器包含6克MgO粉末。将每个容器摇动混合1小时，然后将内容物全部合并到较大的容器中并摇动混合1小时。

实施例12：油的酶处理和吸附处理。

将实施例11中制备的吸附剂用于进一步处理先前经受脱色酶处理的两批油(即，如实施例9中所述制备的油11120)。

反应31-用吸附剂A处理经脱色酶处理的油

将100克经酶处理的油11120加热至80℃，然后将0.21克吸附剂A混合到油中。施加100mbar真空，然后将温度设定为100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应32-用吸附剂B处理经脱色酶处理的油

将100克经酶处理的油11120加热至80℃，然后将0.4克吸附剂B混合到油中。施加100mbar真空，然后将温度设定为100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应33-用吸附剂C处理经脱色酶处理的油

将100克经酶处理的油11120加热至80℃，然后将0.4克吸附剂C混合到油中。施加100mbar真空，然后将温度设定为100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应34-用吸附剂D处理经脱色酶处理的油

将100克经酶处理的油11120加热至80℃，然后将0.4克吸附剂D混合到油中。施加100mbar真空，然后将温度设定为100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为深绿色。

反应35-用

二氧化硅处理经脱色酶处理的油

将100克经酶处理的油11120加热至80℃，然后将0.4克

二氧化硅混合到油中。施加100mbar真空，然后将温度设定为100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为绿色。

反应36-用

300二氧化硅处理经脱色酶处理的油

将100克经酶处理的油11120加热至80℃，然后将0.4克

300二氧化硅混合到油中。施加100mbar真空，然后将温度设定为100℃并混合30分钟。破坏真空，并用布氏漏斗过滤材料。滤盘和滤饼为黄色。

使用AOCS UV/Vis方法测定反应31-36中产生的油的绿色浓度。结果在表29中示出。

表29：在用各种吸附剂进一步处理之后经脱色酶处理的油的绿色。

序列表

<110> 邦吉全球创新有限责任公司

C·L·G·代顿

德米特里厄斯·米克斯

C·利巴纳蒂

C·格兰姆斯

<120> 用于从基于三酰基甘油的油中去除叶绿素衍生物的二氧化硅吸附剂处理

<130> 35893-513

<160> 14

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 318

<212> PRT

<213> 大麦（Hordeum vulgare）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL26推定叶绿素酶

<400> 1

Met Ala Ser Ala Gly Asp Val Phe Asp His Gly Arg His Gly Thr Ser

1 5 10 15

Leu Ala Arg Val Glu Gln Ala Lys Asn Thr Arg Cys Ser Ala Ala Ser

20 25 30

Arg Val Asp Ala Asp Ala Gln Ala Gln Gln Ser Pro Pro Lys Pro Leu

35 40 45

Leu Val Ala Ala Pro Cys Asp Ala Gly Glu Tyr Pro Val Val Val Phe

50 55 60

Leu His Gly Tyr Leu Cys Asn Asn Tyr Phe Tyr Ser Gln Leu Ile Gln

65 70 75 80

His Val Ala Ser His Gly Phe Ile Val Val Cys Pro Gln Leu Tyr Thr

85 90 95

Val Ser Gly Pro Asp Thr Thr Ser Glu Ile Asn Ser Ala Ala Ala Val

100 105 110

Ile Asp Trp Leu Ala Ala Gly Leu Ser Ser Lys Leu Ala Pro Gly Ile

115 120 125

Arg Pro Asn Leu Ala Ala Val Ser Ile Ser Gly His Ser Arg Gly Gly

130 135 140

Lys Val Ala Phe Ala Leu Gly Leu Gly His Ala Lys Thr Ser Leu Pro

145 150 155 160

Leu Ala Ala Leu Ile Ala Val Asp Pro Val Asp Gly Thr Gly Met Gly

165 170 175

Asn Gln Thr Pro Pro Pro Ile Leu Ala Tyr Lys Pro Asn Ala Ile Arg

180 185 190

Val Pro Ala Pro Val Met Val Ile Gly Thr Gly Leu Gly Glu Leu Pro

195 200 205

Arg Asn Ala Leu Phe Pro Pro Cys Ala Pro Leu Gly Val Ser His Ala

210 215 220

Ala Phe Tyr Asp Glu Cys Ala Ala Pro Ala Cys His Leu Val Ala Arg

225 230 235 240

Asp Tyr Gly His Thr Asp Met Met Asp Asp Val Thr Thr Gly Ala Lys

245 250 255

Gly Leu Ala Thr Arg Ala Leu Cys Lys Ser Gly Gly Ala Arg Ala Pro

260 265 270

Met Arg Arg Phe Val Ala Gly Ala Met Val Ala Phe Leu Asn Lys Trp

275 280 285

Val Glu Gly Lys Pro Glu Trp Leu Asp Ala Val Arg Glu Gln Thr Val

290 295 300

Ala Ala Pro Val Val Leu Ser Ala Val Glu Phe Arg Asp Glu

305 310 315

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码来自大麦的推定叶绿素酶CHL26的经密码子优化的核酸序列

<220>

<221> misc_feature

<400> 2

atggcatcag caggggacgt atttgatcat ggacggcacg gaaccagttt ggcgagggta 60

gaacaagcga agaacacccg ctgtagcgca gcgtcccgcg tggatgcgga cgcccaggct 120

cagcagtcgc cgcccaaacc cctcctggtt gcagccccat gcgacgcagg cgaatacccg 180

gtggtcgtat tccttcacgg ctacttgtgc aacaattact tctactcgca gctgatccag 240

catgtcgcga gccacggctt cattgtagtg tgcccgcagc tgtataccgt gtctggtccg 300

gatacaacca gtgaaattaa tagcgccgct gccgtcatcg actggctcgc ggcaggactg 360

tcgtccaagc tggccccagg catccgtccg aacctggccg ccgtgagcat cagcggccac 420

tcacgcggtg gcaaggtggc ctttgccctg ggtctggggc atgccaagac cagcttgccg 480

ctggctgccc tgattgccgt ggatccagtc gacggcaccg ggatgggcaa ccaaactccc 540

cctccgatcc tggcctataa gccgaacgcc attcgggtcc ctgctcccgt gatggtgatc 600

ggcacaggac tgggcgaact gcctcgcaac gcgctgtttc caccttgcgc ccccttgggt 660

gtgtcgcacg ccgcgttcta cgatgagtgt gccgcacccg catgccacct ggttgcccgc 720

gactatggcc acaccgacat gatggatgac gtaacaaccg gcgccaaagg cctggcaacc 780

cgtgcgctgt gcaagagcgg tggggcaaga gccccgatgc gccgttttgt cgccggcgct 840

atggtggcgt tcctgaataa gtgggtggag ggcaagccgg aatggttgga cgccgtgcgc 900

gaacagaccg tggctgcacc ggtggtcctg tccgccgtag agtttcgcga tgagtaa 957

<210> 3

<211> 309

<212> PRT

<213> 雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL25推定叶绿素酶

<400> 3

Met Ser Ala Pro Thr Ser Leu Ala Thr Asn Val Phe Gly Phe Gly Ser

1 5 10 15

Tyr Thr Thr Met Leu Gln Lys Val Glu Ser Val Thr Thr Ser Ser Met

20 25 30

Pro Val Pro Pro Pro Lys Ser Leu Leu Ile Ala Thr Pro Ser Glu Ala

35 40 45

Gly Glu Phe Pro Leu Leu Ile Phe Leu His Gly Tyr Leu Leu Tyr Asn

50 55 60

Ser Phe Tyr Ser Gln Leu Leu Gln His Val Ala Ser His Gly Phe Ile

65 70 75 80

Val Ile Ala Pro Gln Leu Tyr Ile Val Ala Gly Pro Asp Thr Thr Asp

85 90 95

Glu Ile Lys Ser Thr Ala Ala Ile Thr Asn Trp Leu Ser Lys Gly Val

100 105 110

Leu Gln Gly Leu Leu Pro Pro Tyr Val Arg Pro Asn Leu Ser Lys Leu

115 120 125

Ala Leu Ala Gly His Ser Arg Gly Gly Lys Val Ala Phe Ala Leu Ala

130 135 140

Leu Gln Lys Thr Met Thr Lys Leu Lys Phe Ser Thr Leu Ile Gly Ile

145 150 155 160

Asp Pro Val Asp Gly Met Asp Lys Gly Lys Gln Thr Pro Pro Pro Val

165 170 175

Leu Thr Tyr Ile Pro His Ser Phe Asp Leu Asp Met Ala Val Met Val

180 185 190

Ile Gly Ser Gly Leu Gly Glu Val Lys Arg Asn Pro Leu Phe Pro Pro

195 200 205

Cys Ala Pro Lys Gly Val Asn His Glu Asp Phe Phe Lys Glu Cys Arg

210 215 220

Lys Pro Ala Cys His Ile Val Ala Lys Asp Tyr Gly His Leu Asp Met

225 230 235 240

Leu Asp Asp Glu Thr Asn Gly Phe Arg Gly Arg Ser Ser Tyr Cys Leu

245 250 255

Cys Lys Asn Gly Glu Ala Arg Glu Pro Met Arg Arg Phe Val Gly Gly

260 265 270

Val Val Val Ala Ser Met Lys Ala Tyr Leu Asn Gly Asp Asn Thr Asp

275 280 285

Leu Ile Ala Ile Lys Gly His Glu Ala Ala Pro Val Glu Leu Lys Thr

290 295 300

Ile Glu Phe Leu Val

305

<210> 4

<211> 306

<212> PRT

<213> 椰枣（Phoenix dactylifera）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL27推定叶绿素酶

<400> 4

Met Ala Ser Val Ile Ile Asn Lys Pro Ser Ala Thr Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Phe Asp Tyr Gly Lys Leu His Val Asp Thr Ile Pro Ala Lys Gln Ser

20 25 30

Asp Glu Ser Ser Pro Pro Lys Asp Ile Leu Val Val Cys Pro Lys Val

35 40 45

Ala Gly Ser Tyr Thr Val Val Leu Phe Ile Gln Gly Tyr Leu Leu Ser

50 55 60

Asn Ala Tyr Tyr Thr Gln Leu Leu Gln His Val Ala Ser His Gly Phe

65 70 75 80

Ile Leu Ile Ala Pro Gln Cys Ile Val Val Ser Pro Tyr Ser Glu Glu

85 90 95

Asp Ile Thr Ser Ala Ala Ala Val Thr Asn Trp Leu Ser Asp Gly Leu

100 105 110

Gln Ser Val Leu Pro Thr Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp Lys Leu Ala

115 120 125

Leu Ala Gly His Ser Arg Gly Gly His Ala Ala Phe Ala Leu Ala Leu

130 135 140

Gly His Ala Glu Thr Thr Leu Lys Phe Ser Leu Leu Met Gly Ile Asp

145 150 155 160

Pro Val Ala Gly Pro Ser Lys Cys Cys Gln Ile Pro Pro Lys Ile Leu

165 170 175

Thr Tyr Glu Pro Ser Ser Phe Glu Leu Glu Ile Pro Val Leu Val Leu

180 185 190

Gly Thr Gly Leu Gly Ser Glu Gln Lys Asn Ile Leu Phe Pro Ala Cys

195 200 205

Ala Pro Asp Gly Val Asn His Lys Glu Phe Tyr Ser Glu Cys Lys Pro

210 215 220

Pro Cys Tyr His Phe Val Val Thr Asp Tyr Gly His Leu Asp Met Leu

225 230 235 240

Asp Asp Thr Ala Pro Lys Ile Thr Lys Cys Val Cys Lys Asn Gly Thr

245 250 255

Asn Cys Arg Glu Ile Met Arg Arg Thr Thr Gly Gly Ile Met Thr Ala

260 265 270

Phe Leu Lys Ala Tyr Leu Leu Asp Leu Glu Glu Asp Leu Lys Ala Ile

275 280 285

Ala Asp Pro Gln Ile Ala Pro Thr Lys Leu Asp Pro Val Ser Tyr Arg

290 295 300

Leu Glu

305

<210> 5

<211> 326

<212> PRT

<213> 瓦勒迈杉（Wollemia nobilis）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL28推定叶绿素酶

<400> 5

Met Gly Leu Glu Asp Ile Phe Lys Glu Gly Pro Leu Pro Ile Gln Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Pro Ala Gln Gln Arg Ala Thr Ala Thr Gly Pro Cys Cys

20 25 30

His Gly Arg Ala Ser Pro Met Glu Pro Thr Ala Leu Pro Pro Lys Pro

35 40 45

Leu Met Val Ile Leu Pro Ser Gln Glu Gly Asp Tyr Pro Val Leu Leu

50 55 60

Tyr Leu His Gly Tyr Leu Leu Leu Asn Ser Tyr Tyr Ser Gln Leu Leu

65 70 75 80

Cys His Ile Ala Ser His Gly Tyr Ile Ala Ile Ala Pro Gln Met Tyr

85 90 95

Thr Ala Ala Gly Pro Asp Ala Thr Pro Glu Ile Arg Asp Ala Val Ala

100 105 110

Ile Thr Glu Trp Leu Pro Thr Gly Phe Ala Gly Arg Leu Pro Thr His

115 120 125

Val Arg Pro Asp Leu Gln Lys Val Ala Val Ala Gly His Ser Arg Gly

130 135 140

Gly Lys Val Ala Phe Gly Ala Ala Leu Gly Arg Ala Thr Pro Pro Pro

145 150 155 160

Ser Leu Pro Tyr Ala Ala Ile Val Gly Val Asp Pro Val Asp Gly Met

165 170 175

Ala Ala Gly Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ile Leu Gly Tyr Gly Asp His

180 185 190

Asp Phe Glu Asn Ser Ile Pro Ala Leu Val Ile Gly Ser Gly Leu Gly

195 200 205

Pro Val Arg Arg Asn Pro Leu Phe Pro Pro Cys Ala Pro Ala Gly Val

210 215 220

Asn His Val Asp Phe Phe Arg Glu Cys Arg Ala Pro Ala Tyr His Phe

225 230 235 240

Val Ala Thr Glu Tyr Gly His Gln Asp Phe Leu Asp Asp Glu Thr Gly

245 250 255

Gly Val Arg Gly Arg Ala Thr Tyr Cys Leu Cys Lys Asn Gly Thr Ala

260 265 270

Arg Glu Pro Met Arg Arg Phe Ala Ala Gly Ile Ile Val Ala Phe Leu

275 280 285

Asn Ala Trp Leu Arg Asn Asp Ser Ala Asp Leu Glu Asp Val Leu Asp

290 295 300

Pro Ser Arg Ala Pro Val Lys Met Glu Pro Pro Glu Trp Asn Leu Phe

305 310 315 320

Gln Lys Val Pro Thr Leu

325

<210> 6

<211> 328

<212> PRT

<213> 黄瓜（Cucumis sativus）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL29推定叶绿素酶

<400> 6

Met Ala Ala Val Val Val Asp Val Lys Gly Lys Ser Lys Ser Ala Ala

1 5 10 15

Val Ser Ser Val Val Asp Leu Asp Pro His Pro Tyr Asp Gly Val Phe

20 25 30

Glu Lys Gly Lys Phe Glu Val Gly Val Ile Thr Lys Thr Thr Asp Ile

35 40 45

Phe Ser Thr Ser Lys Pro Leu Leu Val Phe Thr Pro Lys Thr Pro Gly

50 55 60

Leu Tyr Pro Ala Ile Leu Phe Phe His Gly Phe Ser Cys Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Phe Tyr Thr Asp Phe Leu Thr Leu Ile Ala Ser His Gly Tyr Val Ile

85 90 95

Ala Ala Pro Gln Leu Tyr Val Met Pro Thr Thr Ser Glu Met Asp Glu

100 105 110

Ile Lys Ser Ala Val Asp Val Ile Lys Trp Leu Ser Ser Gly Leu Asp

115 120 125

Pro Leu Leu Pro Thr Asn Val Lys Gly Asp Leu Ser Lys Leu Ser Leu

130 135 140

Leu Gly His Ser Arg Gly Gly Lys Thr Ala Phe Ser Leu Ala Leu Gly

145 150 155 160

Trp Gly Ser Pro Ser Leu Pro Phe Ser Ala Ile Ile Gly Ile Asp Pro

165 170 175

Val Ala Gly Ser Lys Phe Phe Arg Pro Glu Pro Gln Ile Leu Asp Pro

180 185 190

Pro Ser Gln Pro Phe Lys Ile Ser Leu Pro Ile Thr Val Val Gly Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Pro Gln Lys Ala Thr Pro Val Thr Cys Ala Cys Ala Pro

210 215 220

Asp Gly Leu Asn His Ile Ala Phe Phe Lys Lys Cys Lys Pro Thr Cys

225 230 235 240

Ala His Phe Val Ala Val Asn Tyr Gly His Met Asp Ile Leu Asp Asp

245 250 255

Asn Pro Pro Gly Met Thr Gly Tyr Phe Thr Asn Ile Ala Cys Lys Asn

260 265 270

Gly Lys Gly Pro Arg Asp Leu Met Arg Lys Cys Cys Ser Gly Leu Val

275 280 285

Val Ala Ser Leu Lys Ala Tyr Leu Asp Asn Asp Val Ser Ile Leu Asn

290 295 300

Ala Ile Tyr Asp Pro Ser Ile Ala Pro Thr Glu Leu Asn Pro Val Glu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Lys Thr Pro Ser Ala

325

<210> 7

<211> 317

<212> PRT

<213> 醉蝶花（Tarenaya hassleriana）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL30推定叶绿素酶

<400> 7

Met Gly Glu Glu Ser Glu Arg Leu Gly Ser Ser Ala Phe Glu Pro Gly

1 5 10 15

Ser Leu Pro Thr Thr Val Ile Lys Ala Asp Pro Ser Arg Glu Asp Pro

20 25 30

Val Ser Pro Pro Lys Pro Val Met Ile Val Ala Pro Thr Val Ala Gly

35 40 45

Thr Tyr Pro Val Val Phe Phe Phe His Gly Phe Tyr Leu Arg Asn Tyr

50 55 60

Phe Tyr Ser Asp Val Leu Ser His Val Ala Ser His Gly Phe Ile Leu

65 70 75 80

Val Ala Pro Gln Leu Cys Lys Leu Leu Pro Pro Gly Gly Gln Val Glu

85 90 95

Val Asp Asp Ala Gly Lys Val Ile Asn Trp Ala Pro Lys Tyr Leu Lys

100 105 110

Ser Leu Leu Pro Gly Ser Val Lys Pro Ser Gly Glu Asp Thr Ser Leu

115 120 125

Val Gly His Ser Arg Gly Gly Lys Thr Ala Phe Ala Val Ala Leu Gly

130 135 140

His Ala Ser Thr Leu Asp Pro Ser Thr Lys Phe Ser Ala Leu Val Gly

145 150 155 160

Ile Asp Pro Val Ala Gly Ser Asn Val Cys Met Arg Thr Gln Pro His

165 170 175

Ile Leu Thr Tyr Glu Pro Glu Ser Phe Glu Leu Asp Met Pro Val Ala

180 185 190

Val Val Gly Thr Gly Leu Gly Pro Lys Trp Asn Asn Val Met Pro Pro

195 200 205

Cys Ala Pro Asp Gly Val Asn His Lys Glu Phe Phe Asn Glu Cys Arg

210 215 220

Pro Thr Arg Ala His Phe Val Ala Ala Asp Tyr Gly His Met Asp Met

225 230 235 240

Leu Asp Asp Asp Leu Glu Gly Ala Val Gly Tyr Leu Ala Gly Cys Leu

245 250 255

Cys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Lys Ser Gly Met Arg Arg Phe Val Gly

260 265 270

Gly Ile Val Val Ala Phe Leu Lys Tyr Ser Val Phe Gly Asp Lys Ser

275 280 285

Glu Ile Asn Ser Ile Val Lys Asp Pro Ser Leu Ser Pro Ala Arg Ile

290 295 300

Asp Pro Pro Pro Gln Phe His Glu Ala Ser Ser Phe Val

305 310 315

<210> 8

<211> 306

<212> PRT

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL31推定叶绿素酶

<400> 8

Met Val His Gly Lys Ala Ser Ile Glu Arg Asn Ile Lys Met Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ile Phe Glu Ile Gly Asn Glu Thr Ile Asn Thr Ile Asn Val

20 25 30

Lys Ser Ser Ser Ser Leu Pro Cys Ser Leu Leu Val Phe Ser Pro Thr

35 40 45

Thr Lys Gly Ser Tyr Pro Val Leu Leu Phe Phe His Gly Phe Met Leu

50 55 60

Gln Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Leu Leu Gln His Ile Ser Ser His Arg

65 70 75 80

Tyr Ile Ile Val Ala Pro Gln Phe Pro Leu Ile Asn Leu Gln Glu Met

85 90 95

Lys Asn Val Arg Lys Ile Ala Glu Trp Leu Ile Asn Asn Leu Lys Ser

100 105 110

Val Val Pro Glu Lys Val Gln Pro Asp Leu Glu Lys Val Ala Ile Ser

115 120 125

Gly His Ser Lys Gly Gly Asn Thr Ala Phe Ala Val Ala Phe Asp Ser

130 135 140

Ser Met Pro Leu Lys Phe Ser Ala Leu Leu Gly Ile Glu Pro Val Ala

145 150 155 160

Gly Thr Ser Thr Ser Cys Leu Cys Pro Pro Tyr Val Leu Glu Tyr Ile

165 170 175

Pro Arg Ile Phe Asn Gln Ser Ile Pro Val Ala Val Leu Gly Ala Gly

180 185 190

Leu Ser Asn Gln Ser Thr Cys Cys Leu Leu Gln Ser Val Ala Pro Asn

195 200 205

Gly Val Asn His Ala Glu Phe Phe Asn Glu Ser Lys Pro Pro Cys Tyr

210 215 220

Tyr Phe Met Ala Lys Asp Tyr Gly His Ala Asp Met Leu Glu Ala Glu

225 230 235 240

Gly Ile Met Ala Ile Leu Ile Arg Ile Leu Met Lys Ser Gly Lys Gly

245 250 255

Ser Lys Asp Ser Met Ile Arg Ala Val Gly Gly Ile Val Val Ala Phe

260 265 270

Leu Lys Ala Tyr Leu Glu Gly Gln Ile Asp Asp Leu Asn Asp Ile Val

275 280 285

Lys Ser Pro Asn Leu Ala Pro Ile Thr Leu Asp Pro Val Ile Ser Ile

290 295 300

Lys Asp

305

<210> 9

<211> 343

<212> PRT

<213> 毛果杨（Populus trichocarpa）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL32推定叶绿素酶

<400> 9

Met Ala Ala Ile Glu Asp Ser Pro Thr Phe Ser Ser Val Val Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Glu Ile Gly Ser Leu Pro Thr Thr Glu Ile Pro Val Asp

20 25 30

Pro Val Glu Asn Asp Ser Thr Ala Pro Pro Gly Ser Leu Leu Ile Phe

35 40 45

Arg Pro Glu Glu Lys Gly Thr Tyr Pro Val Ile Leu Phe His His Gly

50 55 60

Thr Gly Cys Gln Asn Ser Trp Tyr Thr Asp Val Phe Lys Phe Ile Ser

65 70 75 80

Ser His Gly Tyr Ile Val Val Ala Pro Gln Leu Tyr Gly Leu Met Pro

85 90 95

Pro Ser Gly Gln Asp Glu Leu Asp Leu Ala Ala Glu Val Ala Asn Trp

100 105 110

Leu Pro Ser Gly Leu Arg Cys Val Leu Pro Glu Asp Ile Glu Gly Asp

115 120 125

Ile His Asn Leu Ala Leu Ala Gly His Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Ala

130 135 140

Phe Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asp Val Ser Leu Asp Val Asp Phe

145 150 155 160

Ser Ala Leu Ile Gly Val Asp Pro Val Ala Gly Thr Ser Lys Thr Asn

165 170 175

Gln Met Glu Pro Lys Ile Leu Asn Tyr Glu Ser Cys Ser Phe Asn Phe

180 185 190

Ser Ile Pro Val Ala Ile Ile Gly Thr Gly Leu Gly Asn Lys Pro Ala

195 200 205

Cys Pro Ile Ile Arg Gln Thr Cys Ala Pro Asp Gly Val Ser His Thr

210 215 220

Glu Ile Phe Asn Glu Cys Lys Pro Pro Cys Ser His Phe Val Thr Thr

225 230 235 240

Asp Tyr Gly His Met Asp Val Leu Asp Asp Asp Ile Gly Leu Ile Gly

245 250 255

Glu Gly Ala Arg Ala Met Cys Lys Gly Ser Arg Arg Gly Val Ser Arg

260 265 270

Asp Pro Met Arg Arg Thr Val Gly Gly Val Ser Val Ala Phe Leu Glu

275 280 285

Ala Phe Phe Lys Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Asn Lys Ile Leu Lys Ser

290 295 300

Asn Tyr Phe Ala Pro Thr Thr Leu Asp Pro Val Gln Asn Lys Ser Glu

305 310 315 320

Gly Thr Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Met Ser Met Pro Ala Thr Leu

325 330 335

Asp Trp His Ile Asp Glu Leu

340

<210> 10

<211> 318

<212> PRT

<213> 绿豆（Vigna radiata）

<220>

<221> misc_feature

<223> CHL33推定叶绿素酶

<400> 10

Met Ala Ala Ile Glu Asp Ser Pro Thr Phe Ser Ser Val Val Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Glu Ile Gly Ser Leu Pro Thr Thr Glu Ile Pro Val Asp

20 25 30

Pro Val Glu Asn Asp Ser Thr Ala Pro Pro Lys Pro Leu Leu Ile Phe

35 40 45

Thr Pro Thr Val Pro Gly Ala Tyr Pro Val Ile Leu Phe Cys His Gly

50 55 60

Phe Phe Val Pro Asn Thr Phe Tyr Ser His Leu Leu Thr His Ile Val

65 70 75 80

Ser His Gly Phe Ile Leu Val Ala Pro Gln Leu Phe Cys Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Met Leu Glu Pro Ser Glu Val Lys Phe Ala Gly Lys Val Ala Asp

100 105 110

Trp Leu Ala Glu Gly Leu Gln Pro Leu Leu Pro Glu Asn Val Glu Ala

115 120 125

Asn Leu Glu Lys Leu Val Val Ser Gly His Ser Lys Gly Gly Lys Thr

130 135 140

Ala Phe Cys Val Ala Leu Gly Tyr Ala Lys Thr Lys Leu Lys Phe Ser

145 150 155 160

Ala Leu Val Gly Ile Asp Pro Val Ala Gly Thr Ser Lys Tyr Cys Glu

165 170 175

Thr Asn Pro His Ile Leu Lys Gly Val Pro Gly Ser Phe Asn Leu Asn

180 185 190

Met Pro Val Ala Val Ile Gly Ser Glu Leu Gly Pro Lys Lys Gly Asn

195 200 205

Cys Cys Ser Pro Pro Cys Ala Pro Asp Gly Met Asn His Lys Glu Phe

210 215 220

Phe Lys Glu Cys Lys Pro Pro Ser Ala His Phe Val Val Ala Arg Tyr

225 230 235 240

Gly His Met Asp Met Leu Asp Asp Glu Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr

245 250 255

Leu Leu Ser Lys Cys Ala Cys Lys Asn Gly Ser Gly Pro Arg Asp Leu

260 265 270

Met Arg Arg Thr Ile Gly Gly Leu Val Val Ala Phe Leu Arg Ala Gln

275 280 285

Leu Asn Asp His Trp Lys Asp Phe Asp Ala Ile Leu Asn Pro Asn Ile

290 295 300

Ala Pro Thr Gln Leu Asp Asn Met Val Tyr Ile Pro Ala Ser

305 310 315

<210> 11

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 绿色荧光蛋白

<400> 11

Met Thr Ala Leu Thr Glu Gly Ala Lys Leu Phe Glu Lys Glu Ile Pro

1 5 10 15

Tyr Ile Thr Glu Leu Glu Gly Asp Val Glu Gly Met Lys Phe Ile Ile

20 25 30

Lys Gly Glu Gly Thr Gly Asp Ala Thr Thr Gly Thr Ile Lys Ala Lys

35 40 45

Tyr Ile Cys Thr Thr Gly Asp Leu Pro Val Pro Trp Ala Thr Leu Val

50 55 60

Ser Thr Leu Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ala Lys Tyr Pro Ser His

65 70 75 80

Ile Lys Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Thr Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Ser Phe Glu Gly Asp Gly Val Tyr Lys Thr Arg Ala Met

100 105 110

Val Thr Tyr Glu Arg Gly Ser Ile Tyr Asn Arg Val Thr Leu Thr Gly

115 120 125

Glu Asn Phe Lys Lys Asp Gly His Ile Leu Arg Lys Asn Val Ala Phe

130 135 140

Gln Cys Pro Pro Ser Ile Leu Tyr Ile Leu Pro Asp Thr Val Asn Asn

145 150 155 160

Gly Ile Arg Val Glu Phe Asn Gln Ala Tyr Asp Ile Glu Gly Val Thr

165 170 175

Glu Lys Leu Val Thr Lys Cys Ser Gln Met Asn Arg Pro Leu Ala Gly

180 185 190

Ser Ala Ala Val His Ile Pro Arg Tyr His His Ile Thr Tyr His Thr

195 200 205

Lys Leu Ser Lys Asp Arg Asp Glu Arg Arg Asp His Met Cys Leu Val

210 215 220

Glu Val Val Lys Ala Val Asp Leu Asp Thr Tyr Gln

225 230 235

<210> 12

<211> 301

<212> PRT

<213> 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）

<220>

<221> misc_feature

<223> P2焦脱镁叶绿素酶

<400> 12

Met Ser Asp Asp Tyr Ile Lys Arg Gly Asp Leu Pro Thr Ser Lys Trp

1 5 10 15

Ser Gly Arg Val Thr Leu Arg Val Asp Ser Ala Met Ala Val Pro Leu

20 25 30

Asp Val Val Ile Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ala Ala Ala Tyr Pro Val

35 40 45

Leu Val Met Tyr Asn Gly Phe Gln Ala Lys Ala Pro Trp Tyr Arg Gly

50 55 60

Ile Val Asp His Val Ser Ser Trp Gly Tyr Thr Val Val Gln Tyr Thr

65 70 75 80

Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ile Val Val Asp Arg Val Glu Leu Thr Tyr

85 90 95

Leu Glu Pro Leu Leu Thr Trp Leu Glu Thr Gln Ser Ala Asp Ala Lys

100 105 110

Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Ala Asp Val Ser Arg Leu Gly Thr Met Gly

115 120 125

His Ser Arg Gly Gly Lys Leu Ala Ala Leu Gln Phe Ala Gly Arg Thr

130 135 140

Asp Val Ser Gly Cys Val Leu Phe Asp Pro Val Asp Gly Ser Pro Met

145 150 155 160

Thr Pro Glu Ser Ala Asp Tyr Pro Ser Ala Thr Lys Ala Leu Ala Ala

165 170 175

Ala Gly Arg Ser Ala Gly Leu Val Gly Ala Ala Ile Thr Gly Ser Cys

180 185 190

Asn Pro Val Gly Gln Asn Tyr Pro Lys Phe Trp Gly Ala Leu Ala Pro

195 200 205

Gly Ser Trp Gln Met Val Leu Ser Gln Ala Gly His Met Gln Phe Ala

210 215 220

Arg Thr Gly Asn Pro Phe Leu Asp Trp Ser Leu Asp Arg Leu Cys Gly

225 230 235 240

Arg Gly Thr Met Met Ser Ser Asp Val Ile Thr Tyr Ser Ala Ala Phe

245 250 255

Thr Val Ala Trp Phe Glu Gly Ile Phe Arg Pro Ala Gln Ser Gln Met

260 265 270

Gly Ile Ser Asn Phe Lys Thr Trp Ala Asn Thr Gln Val Ala Ala Arg

275 280 285

Ser Ile Thr Phe Asp Ile Lys Pro Met Gln Ser Pro Gln

290 295 300

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SpeI位点和核糖体结合位点

<400> 13

actagtagga ggtaactaat g 21

<210> 14

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 终止密码子和XhoI位点

<400> 14

tgatgactcg ag 12

Claims

1.一种用于从油中去除叶绿素和叶绿素衍生物的吸附剂，

所述吸附剂包含用碱土金属氧化物处理过的无定形多孔硅胶，所述吸附剂具有约7或更大的pH、以干重计至少0.1重量％的碱土金属氧化物含量以及约3重量％或更大的水含量。

2.根据权利要求1所述的吸附剂，其中所述吸附剂包含以干重计1重量％至约40重量％的碱土金属氧化物。

3.根据权利要求1所述的吸附剂，其中所述碱土金属氧化物选自由氧化镁、氧化钙、氧化钡、氧化铍或它们的组合组成的组。

4.根据权利要求1所述的吸附剂，其中所述碱土金属氧化物是氧化镁。

5.根据权利要求4所述的吸附剂，其中氧化镁的量在约5重量％至约25重量％的MgO的范围内。

6.根据权利要求5所述的吸附剂，其中所述氧化镁包括约10重量％至约20重量％的MgO。

7.根据权利要求1所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有7.0至10.0的pH。

8.根据权利要求7所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有7.5至9.7的pH。

9.根据权利要求8所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有8.0至9.5的pH。

10.根据权利要求1或4所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有10重量％或更大的水含量。

11.根据权利要求10所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约25重量％至约75重量％的水含量。

12.根据权利要求11所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约40重量％至约70重量％的水含量。

13.根据权利要求12所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约55重量％至约65重量％的水含量。

14.根据权利要求1或4所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约0.1微米至约2,000微米的中值粒度。

15.根据权利要求14所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约2微米至约500微米的中值粒度。

16.根据权利要求15所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约5微米至约50微米的中值粒度。

17.根据权利要求1或4所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有至少50m²/g的表面积。

18.根据权利要求17所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约50m²/g至约800m²/g的表面积。

19.根据权利要求1或4所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有至少约0.1cc/g的孔体积。

20.根据权利要求19所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有至少约0.4cc/g的孔体积。

21.根据权利要求20所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约0.7cc/g至约2.0cc/g的孔体积。

22.根据权利要求1所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约7至约10的pH、以干重计约5重量％至25重量％的MgO的氧化镁量以及约25重量％至约65重量％的水含量。

23.根据权利要求22所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有约8至约9.5的pH、以干重计约10重量％至20重量％的MgO的氧化镁量以及约55重量％至约65重量％的水含量。

24.根据权利要求1、4、22或23中任一项所述的吸附剂，其中所述吸附剂具有从油中去除叶绿素和叶绿素衍生物的能力。

25.根据权利要求24所述的吸附剂，其中所述油包括基于三酰基甘油的油。

26.根据权利要求24或25所述的吸附剂，其中所述基于三酰基甘油的油选自由以下项组成的组：卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果核油、白芒花籽油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、油菜籽油、米糠油、红花油、山茶花油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、椿花油、植物油和来自藻类的油。

27.根据权利要求24或25所述的吸附剂，其中所述油是经脱色酶处理的油。

28.根据权利要求1或27所述的吸附剂，其中所述硅胶是水凝胶或水合干凝胶。

29.根据权利要求1、24或28所述的吸附剂，其中与接触所述吸附剂之前所述经脱色酶处理的油中叶绿素和叶绿素衍生物的总浓度相比，所述吸附剂使所述经脱色酶处理的油中叶绿素和叶绿素衍生物的总浓度降低至少5重量％。

30.根据权利要求29所述的吸附剂，其中与接触所述吸附剂之前所述经脱色酶处理的油中叶绿素和叶绿素衍生物的总浓度相比，所述吸附剂使所述经脱色酶处理的油中叶绿素和叶绿素衍生物的总浓度降低至少50重量％。