CN114164132A

CN114164132A - 一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法

Info

Publication number: CN114164132A
Application number: CN202110733899.8A
Authority: CN
Inventors: 余子全; 何小荣; 刘思蓓; 时素亚; 程雪菁
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN114164132B

Abstract

本发明公开了一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪‑1‑羧酸和吩嗪‑1‑甲酰胺的方法，所述无色杆菌的分类命名为无色杆菌H6，已于2021年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2021262。所述无色杆菌H6的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。该无色杆菌H6可代谢产生具有抗植物病原真菌活性的化合物吩嗪‑1‑羧酸（PCA）和吩嗪‑1‑甲酰胺（PCN），可在短期内进行大规模发酵培养，其发酵培养成本低、且不受时域、季节的限制，扩大了PCA和PCN的生产途径，降低了PCA和PCN的生产成本，且通过无色杆菌H6的发酵培养物中分离的PCA和PCN具有良好的制备农用抗生素的应用前景，可有效防治农作物真菌病害。

Description

一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法。

背景技术

无色杆菌(Achromobacter sp.)是一种革兰氏阴性菌，兼性厌氧型杆状细菌，广泛存在于土壤、水体等环境中，可以产生广谱抗生素、磷酯酶和蛋白酶等，另外还可产生对昆虫具有杀伤力的杀虫蛋白。

天然吩嗪化合物是一类含氮杂环的芳香化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等广谱生物活性[McDonald M, Mavrodi DV, Thomashow LS, et al. Phenazine biosynthesisin Psedudomonas fluorescens: branchpoint from the primary shikimatebiosynthetic pathway and role of phenazine-1,6-dicarboxylic acid. J Am Chem Soc, 2001, 123 : 9459-9460]，有巨大的药物开发潜力。吩嗪-1-羧酸（PCA）和吩嗪-1-甲酰胺（PCN）具有广谱抗真菌作用，可以抑制许多植物病原真菌的生长，且PCN的抗真菌活性显著高于PCA[Chin-A-Woeng TFC, Bloemberg GV, Lugtenberg BJJ. Phenazine andtheir role in biocontrol by Pseudomonas bacteria. New Phytol, 2003 157: 503-523]，在农作物病害防治中具有巨大应用价值。由此可见，在大力发展高效、低毒的化学农药的同时，筛选和应用能产生吩嗪类化合物的无色杆菌用于植物病虫害防治是一条经济的、有利于农业生产可持续发展的有效途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，利用该菌株可制备吩嗪-1-羧酸（PCA）和吩嗪-1-甲酰胺（PCN），扩大了吩嗪-1-羧酸（PCA）和吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的生产途径，可有效防治植物病虫害。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种无色杆菌，所述无色杆菌的分类命名为无色杆菌 H6，已于2021年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2021262，拉丁文命名为Achromobacter sp. H6。

进一步，所述无色杆菌 H6的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种如上所述无色杆菌的应用，用于发酵制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺。

本发明还提供了一种如上所述无色杆菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，包括如下步骤：

1）制备无色杆菌 H6的发酵培养物，通过离心将发酵液和菌体分离开，取上清液按1:1(v/v)的比例加入丁酮萃取，静置后待其自然分层，丁酮萃取层经蒸馏浓缩后得到发酵粗提物，重复萃取3-4次，合并粗提物用离心浓缩仪冷冻抽提干燥后即得粗提浸膏；

2）将粗提浸膏用甲醇溶解后，上硅胶柱经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0~0:100进行梯度洗脱，收集其中含有吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的馏分，洗脱馏分再经HPLC制备分离，分离得到的组分经离心浓缩仪冷冻抽干，得到吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺。

进一步，所述步骤1）中无色杆菌 H6的发酵培养物的制备方法为：将过夜活化的无色杆菌 H6接入种子培养基，置于28 °C、120 rpm摇床过夜培养得种子液，将种子液以5%(v/v)的接种量接入到发酵培养基中，于28 °C、120 rpm摇床培养到第三天时，收集发酵液制得发酵培养物。

进一步，所述种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：NaCl 10g，葡萄糖 10 g，细菌学蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 0.7 g，KH₂PO₄0.3 g，CaCl₂ 0.53 g，pH7.0。

进一步，所述步骤2）中所述HPLC的条件为：色谱柱为Agilent Ultimate XB-C18柱，流动相包括A相和B相，流动相A相：10%（v/v）的乙腈+0.08%（v/v）的甲酸，溶剂为水，流动B相：90%（v/v）的乙腈，溶剂为水；梯度洗脱程序：0~23min，流动相比例为A相/B相（v/v）：95:5~0:100；23~26min，流动相比例为A相/B相（v/v）：0:100；26~27min，流动相比例为A相/B相（v/v）：0:100~95:5；27~30min；流动相比例为A相/B相（v/v）：95:5，检测波长254 nm，流速1mL/min。

本发明一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法的有益效果：本发明的无色杆菌 H6可代谢产生具有抗真菌活性的吩嗪类化合物PCA和PCN，该菌株可在短期内进行大规模发酵培养，其发酵培养成本低、且不受时域、季节的限制，扩大了PCA和PCN的生产途径，降低了生产成本，因此为PCA和PCN的生产制备提供了新方法，可有效防治农作物病真菌病害的发生。

附图说明

图1是无色杆菌H6在光学显微镜和扫描电镜下的细胞显微形态；

图2是无色杆菌H6基于16S rDNA序列的邻接法构建的系统发育树；

图3为无色杆菌 H6发酵粗提物的高效液相色谱图；

图4为化合物1(PCA)的质谱分析图；

图5为化合物1的C谱图；

图6为化合物1的H谱图；

图7为化合物2(PCN)的质谱分析图；

图8为化合物2的C谱图；

图9为化合物2的H谱图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1

一种无色杆菌，所述无色杆菌的分类命名为无色杆菌 H6，已于2021年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2021262，拉丁文命名为Achromobacter sp. H6。所述无色杆菌 H6的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的无色杆菌H6 是从土壤中分离获得的，其细胞形态特征图如图1所示，图1中A图为无色杆菌H6的相差显微镜观察图，B图为无色杆菌的扫描电镜观察图，该细胞为长杆状，在固体培养基上培养其菌落潮湿、表面光滑、边缘整齐﹑无色透明。利用通用引物(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT)进行常规PCR扩增菌株H6的16S rDNA并测序，提交到GenBank中，对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析。

其PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，25个循环；72 ℃补平10 min，16℃保温；PCR反应的体系为14 μL ddH₂O，1.6 μLdNTP Mixture（2.5 mmol/L），2.0 μL 10× PCR Ex Taq Buffer，0.6 μL上游引物（10pmol/L），1.0 μL模板，0.6 μL下游引物（10 pmol/L），0.2 μL TaKaRa Ex Taq（5 U/μL）。

BLAST分析结果显示，该菌株与Achromobacter sp. GD1A与Achromobacter sp.NP631a的相似度为99.79%，通过邻接法构建系统发育树清晰地揭示了该菌株H6与无色杆菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于无色杆菌属的一种，其系统发育树如图2所示。

实施例2

一种无色杆菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，包括以下步骤：

1、配制种子培养基和发酵培养基：

发酵培养基与种子培养基相同，每升培养基中含有：NaCl 10 g，葡萄糖 10 g，细菌学蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 0.7 g，KH₂PO₄ 0.3 g，CaCl₂0.53 g，pH7.0，其配制方法是将上述组分按其含量混合均匀后调pH，然后115℃灭菌30min，备用；

2、发酵：

种子培养：将在平板上活化的无色杆菌 H6 接入种子培养基，置于28 °C，120 rpm摇床过夜培养得种子液；

大规模发酵培养：将种子液以5%的接种量接入到发酵培养基中，28 °C，120 rpm摇床培养到第三天时，收集发酵液制得无色杆菌 H6 发酵培养物。

3、发酵液的萃取：

无色杆菌 H6 发酵液于高速离心机上8000 rpm，15 min离心，取上清液倒入分液漏斗。按1∶1(v/v)比例加入丁酮后混匀，静置后待其自然分层，丁酮萃取层经蒸馏浓缩后得到发酵粗提物，重复萃取3-4次，合并粗提物用离心浓缩仪冷冻抽提干燥后即得粗提浸膏。

4、化合物的分离

粗提浸膏用甲醇溶解后，上硅胶柱，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0~0:100进行梯度洗脱，收集其中含有化合物PCA、PCN的馏分，馏分再经半制备型HPLC制备分离，分别收集PCA和PCN样品，离心浓缩仪冷冻抽干，得到PCA(5mg)和PCN(11 mg），其高效液相色谱图如图3所示。

高效液相色谱（HPLC）条件：色谱柱为Agilent Ultimate XB-C18柱，流动相包括A相和B相，流动相A相：10%(v/v)的乙腈+0.08%(v/v)的甲酸，溶剂为水，流动B相：90%(v/v)的乙腈，溶剂为水；进样程序：0~23 min，流动相比例为A相/B相（v/v）：95:5~0:100；23~26min，流动相比例为A相/B相（v/v）：0:100；26~27 min，流动相比例为A相/B相（v/v）：0:100~95:5；27-30min，流动相比例为A相/B相（v/v）：95:5；检测波长254 nm，流速1 mL/min

5、化合物的鉴定

通过结构分析，对本发明从无色杆菌 H6的发酵培养物中分离制备得到的2个化合物（即化合物1、2）进行质谱和核磁共振分析鉴定，其分析鉴定结果如下：

化合物1: 浅黄色粉末，易溶于甲醇溶液，正源低分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z 225.00, [M - H]⁺（图4），推测其分子式为C₁₃H₈N₂O₂（计算值为225.06）。结合¹H-NMR和¹³C-NMR数据（表1，图5，图6）分析，其波谱数据与文献[Lee JY, Moon SS, HwangBK. Isolation and in vitro and in vivo activity against Phytophthora capsiciand Colletotrichum orbiculare of phenazine-1-carboxylic acid from Pseudomonas aeruginosa strain GC-B26. Pest Manag Sci, 2003, 59: 872-882]一致，故将化合物1鉴定为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA)。

化合物2: 浅黄色粉末，易溶于甲醇溶液，正源低分辨电喷雾质谱图显示其准分子离子峰为m/z 224.04, [M - H]⁺（图7），推测其分子式为C₁₃H₉N₃O（计算值为224.08）。结合¹H-NMR和¹³C-NMR数据（表1，图8，图9）分析，其波谱数据与文献[Kumar RS, Ayyadurai N,Pandiaraja P, et al. Characterization of antifungal metabolite produced by anew strain Pseudomonas aeruginosa PUPa3 that exhibits broad-spectrumantifungal activity and biofertilizing traints. J Appl Microbiol, 2005, 98:145-154]一致，故将化合物2鉴定为吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide, PCN)

确定化合物1、2的结构如式（I）所示：

表1. 化合物1 (PCA)、化合物2 (PCN)的NMR (500 MHz)核磁数据归属

Table1. ¹H NMR (500 MHz) and ¹³C NMR (125 MHz) assignments ofcompounds 1 and 2 (J in Hz within parentheses).

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一种无色杆菌及其应用与制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctggcagcgg gagcttacac atgcagtcga acggcagcac ggacttcggt ctggtggcga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat gtatcggaac gtgcccagta gcgggggata actacgcgaa 120

agcgtagcta ataccgcata cgccctacgg gggaaagcag gggatcgcaa gaccttgcac 180

tattggagcg gccgatatcg gattagctag ttggtggggt aacggctcac caaggcgacg 240

atccgtagct ggtttgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatggggga aaccctgatc cagccatccc 360

gcgtgtgcga tgaaggcctt cgggttgtaa agcacttttg gcaggaaaga aacgtcgcgg 420

gttaataccc cgcgaaactg acggtacctg cagaataagc accggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540

caggcggttc ggaaagaaag atgtgaaatc ccagagctta actttggaac tgcattttta 600

actaccgagc tagagtgtgt cagagggagg tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt 660

agatatgcgg aggaacaccg atggcgaagg cagcctcctg ggataacact gacgctcatg 720

cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg 780

tcaactagct gttggggcct tcgggccttg gtagcgcagc taacgcgtga agttgaccgc 840

ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900

tggatgatgt ggattaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acctaccctt gacatgtctg 960

gaatcctgaa gagatttagg agtgctcgca agagaaccgg aacacaggtg ctgcatggct 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtca 1080

ttagttgcta cgaaagggca ctctaatgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggtcgg 1200

gacagagggt cgccaacccg cgagggggag ccaatcccag aaacccgatc gtagtccgga 1260

tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgt 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttt 1380

taccagaagt agttagccta accgcaaggg gggcgatacc acgtagatcc tgcccc 1436

Claims

1.一种无色杆菌，其特征在于：所述无色杆菌的分类命名为无色杆菌H6，已于2021年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2021262。

2.如权利要求1所述一种无色杆菌，其特征在于：所述无色杆菌 H6的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求1所述无色杆菌的应用，其特征在于：用于发酵制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺。

4.一种如权利要求1所述无色杆菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）制备无色杆菌 H6的发酵培养物，通过离心将发酵液和菌体分离开，取上清液按1:1(v/v)的比例加入丁酮萃取，萃取3-4次，静置后待其自然分层，丁酮萃取层经蒸馏浓缩后得到发酵粗提物，重复萃取3-4次，合并粗提物用离心浓缩仪冷冻抽提干燥后即得粗提浸膏；

2）将粗提浸膏用甲醇溶解后，上硅胶柱经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0~0:100进行梯度洗脱，收集其中含有吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的馏分，洗脱馏分再经半制备型HPLC制备分离，分离得到的组分经离心浓缩仪冷冻抽干，得到吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺。

5.如权利要求4所一种无色杆菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于：所述步骤1）中无色杆菌 H6的发酵培养物的制备方法为：将过夜活化的无色杆菌 H6接入种子培养基，置于28 °C、120 rpm摇床过夜培养得种子液，将种子液以5%(v/v)的接种量接入到发酵培养基中，于28 °C、120 rpm摇床培养到第三天时，收集发酵液制得发酵培养物。

6.如权利要求4所一种无色杆菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于：所述种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：NaCl 10 g，葡萄糖 10g，细菌学蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，K₂HPO₄ 0.7 g，KH₂PO₄ 0.3 g，CaCl₂0.53 g，pH7.0。

7.如权利要求4所一种无色杆菌制备吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于：所述步骤2）中所述HPLC的条件为：色谱柱为Agilent Ultimate XB-C18柱，流动相包括A相和B相，流动相A相：10%（v/v）的乙腈+0.08%（v/v）的甲酸，溶剂为水，流动B相：90%（v/v）的乙腈，溶剂为水；梯度洗脱程序：0~23min，流动相比例为A相/B相（v/v）：95:5~0:100；23~26min，流动相比例为A相/B相（v/v）：0:100；26~27min，流动相比例为A相/B相（v/v）：0:100~95:5；27~30min；流动相比例为A相/B相（v/v）：95:5，检测波长254 nm，流速1 mL/min。