CN114160221B - 一种基于电润湿现象的液滴生成方法及应用 - Google Patents

一种基于电润湿现象的液滴生成方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于电润湿现象的液滴生成方法及应用，涉及数字微流控技术领域。基于电润湿现象的液滴生成方法，包括：将母液滴置于数字微流控芯片的底板上的电极区域内，在一定的电驱动下，母液滴向外喷射生成大量微小子液滴。在喷射过程中，底板上电极的通电面积为母液滴截面积的2倍以上，优选为100倍以上，更优选为140倍以上。通过采用通电面积较大的大电极，将母液滴置于底板上的电极区域内，由于液滴完全置于电极内，可以产生全方位喷射，是一种快速、低耗电、高通量的液滴生成方法。

Description

一种基于电润湿现象的液滴生成方法及应用
技术领域
本发明涉及数字微流控技术领域，具体而言，涉及一种基于电润湿现象的液滴生成方法及应用。
背景技术
大规模液滴生成方法可用于许多领域，例如微胶囊、微粒和微纤维的合成，或作为微反应器进行化学或生化反应。在管道微流体中形成液滴通常是将一种流体引入另一种不混溶的流体，广泛用于大量生产液滴的通道几何结构包括：交叉流、共流、流量聚焦、阶梯乳化、微通道乳化、膜乳化等。目前，通道微流体依赖于泵、管道、微阀的复杂网络和精确控制。此外，由于管道微流体系统的固有特性，初始样品体积损耗巨大，样品使用率很难达到100％。但是数字微流体(DMF)可以很好地解决这些问题。
广义上的DMF，是一种微尺度的单个液滴处理技术。目前科研人员已经开发了基于热毛细管力、表面声波、介电泳、光电润湿、机械驱动和介电润湿(EWOD)力等不同DMF方法。DMF系统无需复杂的外部附件，在众多方法中，基于EWOD的DMF是最广泛被研究和开发的方法，因为它具有高度的灵活性和可重构性。基于EWOD的DMF设备允许全电子控制，从而可以实现小尺寸和即时检测。
数字微流体的液滴生成方法包括：
(1)从大电极上的大液滴中分出小液滴。相邻电极连续通电以在液滴上形成颈部；然后通过关闭前方通电电极和储存电极之间的电极来夹断颈部。随着母液滴缩回，在前方电极处形成子液滴。通过该原理可以产生低至1.2nL的液滴。
(2)在多样的DMF结构上通过针头、毛细管或芯片外压力分出小液滴。这些方法的缺点是需要外部设备来实现液滴生成控制，包括阀门、注射器、泵；优点是外部设备可以确保精确地控制液滴体积。
(3)片上液滴分裂。母液滴被加载到芯片中并连续分裂产生微小的子液滴。3D叶片结构和磁珠用于辅助芯片上液滴分裂过程。这种方法可以生成低至5pL的液滴。
(4)通过特殊形状的电极产生液滴，例如L型电极、Y型电极。这种方法可以实现快速简单的液滴分裂。
(5)通过液滴卫星喷射技术产生液滴。该技术使用DMF芯片上的EWOD力分出极微小剂量的液滴。然而，这种极微小的液滴尺寸高度不均匀，所以通常会被看作一个整体而不是单个离散液滴。
因为全电子的液滴产生过程受到许多不确定因素的影响，例如：芯片表面粗糙度、疏水涂层、介电特性、环境湿度，所以一些液滴生产系统带有电容测量和PID反馈控制功能，以生成大小均匀的液滴。DMF上的液滴生成允许单独操纵液滴。然而，由于几何结构限制，这种DMF芯片上液滴生成是低通量的。
微粒和细胞浓度对于生化反应、基于微珠的免疫测定和细胞生物学的片上样品制备至关重要。数字微流体中有很多方法可以富集微粒或者细胞，包括：(1)介电泳力，微粒或细胞被DEP力吸引或排斥到液滴的一侧，然后液滴分裂以产生包含粒子的液滴；(2)光电镊子，可以使用光电镊子根据光学或介电特性的差异从种群中挑选特定细胞，并使用EWOD将其分离成单独的液滴；(3)磁力辅助，用磁体固定磁珠，用EWOD力将未结合的物质与上清液中的子滴移走。这些方法需要外部能源(激光、磁铁)和控制系统或高频交流电(DEP)辅助。目前，可以实现微粒和细胞富集的全电子和仅基于EWOD的方法还有没被开发出来。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法及应用，旨在实现母液滴的全方位喷射，提供一种快速、高通量的液滴喷射方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法，包括：将母液滴置于数字微流控芯片的底板上的电极区域内，施以高压电信号，当电信号撤去时，母液滴喷射形成大量微小子液滴；在喷射过程中，所述底板上电极的通电面积为所述母液滴截面积的2倍以上。
在可选的实施方式中，在喷射过程中，底板上电极的通电面积为母液滴截面积的100倍以上。
在可选的实施方式中，在喷射过程中，底板上电极的通电面积为母液滴截面积的140-160倍。
在可选的实施方式中，母液滴包括主体溶液和表面活性剂；母液滴的体积为1nL-10μL。
在可选的实施方式中，DMF芯片还包括与底板相对的顶板，在顶板和底板之间设置有垫片，以形成空腔，母液滴是在空腔内进行喷射。
在可选的实施方式中，底板上的电极的喷射电压有效值为100伏以上，喷射频率为1-3000Hz；
优选地，底板上的电极的喷射电压有效值为175-1000伏，喷射频率为50-1000Hz。
在可选的实施方式中，顶板和底板之间的间距为10-500μm；优选为50-200μm。
在可选的实施方式中，在对底板上的电极进行通电之前，在空腔内填充油类物质。
在可选的实施方式中，底板包括第一基板和位于第一基板上的图案化电极，图案化电极是由导电材料对电极进行图案化形成，在底板靠近顶板的表面上涂覆有电介质层和位于电介质层上的疏水层；顶板包括第二基板，第二基板靠近底板的表面上涂覆有疏水层；
所述电介质层的厚度为500nm-100μm，所述第一基板和所述第二基板上的所述疏水层的厚度为10nm-100μm；
优选地，电介质层的厚度为8-15μm，第一基板和第二基板上的疏水层的厚度为100nm-1μm；
优选地，在喷射时，向底板上的电极施加交流信号，以使接触顶板和底板的液滴进行喷射。
第二方面，本发明还提供上述任一实施方式中的液滴喷射方法在数字PCR、生化反应样品制备、微粒富集或微粒分散中的应用。
本发明具有以下有益效果：通过采用通电面积较大的大电极，将母液滴置于底板上的电极区域内，当电极对液滴施加电信号时，液滴在电润湿作用下产生形变增加与电极表面接触面积(呈现趴下的状态)，当电信号撤去时，液滴恢复原始形状；当电信号为交变信号，则母液滴不断重复趴下、恢复，每次恢复都会有子液滴产生，可以产生全方位喷射，是一种快速、低耗电、高通量的液滴喷射方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为全方位喷射微液滴的DMF芯片示意图；
图2为电极与液滴大小面积(Area)对比；
图3为DNA溶液的全方位喷射过程；
图4为DNA溶液全方位喷射结果分析；
图5为荧光微粒在DMF芯片上的全方位喷射过程中被富集的过程图；
图6为A549细胞在DMF芯片上的全方位喷射过程中被富集的过程图。
主要元件符号说明：001-底板；002-顶板；003-垫片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
针对现有技术中存在的液滴喷射通量低、速度慢等问题，发明人提供一种全新的喷射方法，利用大电极对母液滴进行喷射，使电极可以将液滴完全包裹，可以产生全方位喷射，是一种快速、低耗电、高通量的液滴喷射方法。
本发明实施例提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法，包括：
S1、DMF芯片制造
请参照图1，DMF芯片包括底板001与底板001相对的顶板002，在顶板002和底板001之间设置有垫片003，以形成封闭空腔，母液滴是在闭腔室内进行喷射。也就是说，整个封闭空腔处于底板001上电极区域内。
需要说明的是，在底板001上设置有电极，为保证通电面积远大于母液滴的截面积，可以采用一个大电极或者很多个小电极组成。
在实际操作过程中，先制备符合要求的底板001和顶板002，然后安装垫片003进行搭接，将夹子将顶板002和底板001紧紧地组装在一起，控制垫片003的厚度即可以控制顶板002和底板001之间的间距。DMF芯片的搭建方法可以参照现有技术，在此不做过多赘述。
在一些实施例中，可以不形成封闭空腔，仅保证上下底板分开即可，上下底板之间可以是开放的，仅靠几根柱子支撑也是可行的。
在一些实施例中，底板001包括第一基板和位于第一基板上的图案化电极，图案化电极是由导电材料对电极进行图案化形成，在底板001靠近顶板002的表面上涂覆有电介质层和位于电介质层上的疏水层。顶板002包括第二基板，第二基板靠近底板001的表面上涂覆有疏水层。
具体地，第一基板和第二基板可以均为玻璃基板或PCB板，可以利用金属或导电聚合物对底板上的大电极进行图案化形成图案化电极，并在导电层上旋涂电介质层和疏水层，电介质层和疏水层的材质不限，可以采用现有技术中的常用材质，如可以采用光刻胶(SU-8 3010)作为电介质层，采用聚四氟乙烯(Teflon)作为疏水层，旋涂的速度不限，可以大致为300-3000rpm。
进一步地，顶板和底板之间的间距为10-500μm；优选为50-200μm；电介质层的厚度为500nm-100μm，第一基板和第二基板上的所述疏水层的厚度为10nm-100μm；优选地，电介质层的厚度为8-15μm，第一基板和第二基板上的疏水层的厚度为100nm-1μm，垫片003的材质可以为聚酰亚胺，垫片003的厚度依据顶板002和底板001之间的间距进行选择。
S2、喷射试剂选择
母液滴不限制具体的成分，可以根据需要进行选择，常规的用于DMF芯片上喷射液滴的溶液均可以适用于本发明实施例中的方法。
在优选的实施例中，母液滴包括主体溶液和表面活性剂；表面活性剂可以降低界面张力并防止液滴聚集。为提高生成小液滴的均匀性，需要加入表面活性剂。如果不添加表面活性剂，喷出的微小液滴可能会聚集并且融合在一起。此外，不添加表面活性剂时，喷出的微小液滴不会远离母液滴，它们会与母液滴融合。
具体地，表面活性剂的种类不限，一般的表面活性剂均可以满足要求，如一般的高分子非离子表面活性剂，可以采用嵌段式聚醚F-127。还可以为Triton X-100、Triton X-15、乙醇酸乙氧基化物、4-壬基苯基醚等。此外，还可以使用不同种类和浓度的表面活性剂来获得单个离散的微小液滴。
在一些实施例中，母液滴的主体溶液可以但不限于DNA荧光基团溶液、荧光微珠溶液、细胞悬浮液。主体溶液可以为混合溶液也可以为悬浮液，以上几种原料均适合于本发明实施例所提供的液滴喷射方法。
S3、全方位喷射
将母液滴置于DMF芯片的底板001上的电极区域内，由于底板001采用的大电极或很多小电极，在喷射过程中，底板001上电极的通电面积为母液滴截面积的2倍以上，以使电极能把液滴完全包裹，产生全方位喷射。
需要说明的是，当电极对液滴施加电信号时，液滴在电润湿作用下产生形变，增加与电极表面接触面积；当电信号撤去时，液滴恢复原始形状。如果撤去迅速，液滴恢复的过程中，最前方伸展出去的液体来不及恢复到母液滴中，则会留下而形成子液滴。当有变化电场产生时，母液滴边缘交替发生润湿和恢复，每次恢复都会有子液滴产生。
具体地，当液滴是纯溶液时，喷射生成大量子液滴；当液滴中有颗粒物时，每次喷射只有液体喷出，而颗粒物无法喷出，随着母液滴不断减小体积，颗粒物在母液滴中富集；当母液滴富集到一定程度，继续通电时母液滴不稳定，最后颗粒物也被喷出，生成含有单个颗粒物的子液滴。
如图2所示，为获得均一的小液滴，在喷射过程中，底板001上电极的通电面积为母液滴截面积的100倍以上；优选地，在喷射过程中，底板001上电极的通电面积为母液滴截面积的140-160倍。采用远大于母液滴的大电极，对电极通电使母液滴沿着边缘的各个方向喷射微小液滴，产生的微小液滴不会接触到电极的边缘反弹回来。另一种情况是母液滴与电极部分接触，并从母液滴与底部电极接触的部分喷射出微小液滴。
液滴的变形和破裂与喷射频率和电压有关，喷射出的微小液滴尺寸可以巧妙地通过不同频率和电压的组合来控制。在一些实施例中，底板001上的电极的喷射电压有效值为100伏以上，喷射频率为1-3000Hz；优选地，底板001上的电极的喷射电压为175-1000伏，喷射频率为50-1000Hz。母液滴的体积为1nL-10μL，将喷射电压和喷射频率控制在上述范围内，可以获得小液滴，适合于应用在很多领域。
在一些实施例中，顶板002和底板001之间的间距为10-500μm；优选为50-200μm。顶板002和底板001之间的间距大小也会影响电场，间距太大时电场会变弱，可能会导致少量且不完整的喷射，甚至不喷射。当母液滴不接触顶板时，无全方位喷射现象，尺寸大于喷射液滴尺寸的颗粒或细胞将保留在母液滴中，不被喷出。
需要说明的是，喷射频率(F)、喷射电压(V)、底板001和顶板002之间的间隙(H)三者的参数相互限制，H越大，需要V越大，或F越大。H最大值由能产生的最大电压决定，如F为1kHz，V为350V，则H最大值为200μm。
在实际操作时，在对底板001上的电极进行通电之前，在封闭空腔内填充油类物质。在喷射时，向底板001上的电极施加交流信号，以使接触顶板002和底板001的液滴进行喷射。在方波交流信号下，液滴边缘会发生振动、变形，从各个方向向外破碎成数以万计的微小液滴。具体地，交变信号的形式不限，可以为方波、脉冲波或正弦波等。
在实际操作时，顶板002可以接地，也可以不接地，只要保证液滴边缘有变化电场产生即可。
需要说明的是，在通电之前填充油类物质的作用是防止喷射出来的超小液滴挥发，并且提供稳定的喷射环境。油类物质的具体成分不限，可以为十六烷油、硅油。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例是采用图1中的DMF芯片结构，在底板001和顶板002形成的封闭空腔内进行喷射。
实施例1
本实施例提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法，包括：
(1)喷射试剂制备
DNA寡核苷酸的3'端被修改为荧光基团，制备形成DNA荧光基团溶液，在该溶液中DNA最终浓度为10μM，表面活性剂F127的体积分数为9-10％。
(2)全方位喷射
将0.2μL的DNA荧光基团溶液加载到电极的中心，然后填充十六烷油到腔室中。电极由1100Hz、10Vpp电信号驱动，Vrms>349V。驱动时间可能是1秒到1000秒，使用Image J分析微小液滴的尺寸分布。
结果与分析：在连接到高压交流电的底部电极(即底板001)和连接到地的顶部单片ITO电极之间，母液滴开始沿着边缘喷射微小的液滴。由于液滴中含有表面活性剂，微小液滴通常不会相互融合，而是会在母液滴周围扩散铺成一个微小液滴圈，如图3所示。
微小液滴的尺寸分析过程如图4所示。图4中的A是荧光显微镜拍摄的实物图像，经过二进制转换和阈值设置，可以计算出微小液滴的数量和面积，如图4中的B和C所示。图4中的D中的微小液滴尺寸分布显示出高度的均匀性，变异系数为18％。
通过图4可以看出，全方位喷射技术产生的液滴尺寸高度均一，使得该方法可以用于数字PCR的试剂分发，它具有快速、全电子化、试剂消耗低、PCR试剂100％分发等优点。
实施例2
本实施例提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法，包括：
(1)喷射试剂制备
将直径为20μm的荧光微球悬液(荧光微球材质为聚苯乙烯)稀释至适当浓度，添加F127至最终浓度为9-10％。
(2)全方位喷射
将0.5μL的直径为20μm荧光微珠溶液加载到电极的中心，然后填充十六烷油到腔室中。电极由1100Hz、10Vpp电信号驱动，Vrms>349V，驱动时间为几秒到几十秒。
实施例3
本实施例提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法，包括：
(1)喷射试剂制备
A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)在含有10％(体积分数)胎牛血清和1％(质量分数)青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，每天更换培养液。所有细胞均在37℃的加湿CO2培养箱中培养。当细胞长满培养皿底部约80％时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化成单细胞，并将细胞悬液以800rpm离心3分钟。弃去上清液，将剩下的细胞用于制备细胞悬液。用4μM的Calcein AM染活细胞，4μM的EthD-1染死细胞。最终制备成含有10％的F127和7x105个细胞/mL的PBS悬液，取0.2μL该悬液滴入硅油中。
图像由荧光显微镜拍摄。
(2)全方位喷射
填充硅油到腔室中，之后将含有7x105个细胞/mL的0.2μL细胞悬浮液滴加载到芯片腔室的油中。电极由800Hz、6Vpp信号(173Vrms)驱动3分钟，然后将输入电压升10Vpp(301Vrms)并持续45秒。
实施例2和实施例3的结果与分析：图5和图6显示了中全方位喷射液滴过程中微粒和A549肿瘤细胞被富集的过程。刚开始时直径为20μm荧光微珠和10-15μm的细胞无法与微小液滴一起喷射出去，液滴中的微珠和细胞会被富集。一旦液滴中的液体被排干，微珠和细胞就会分散成离散的单个珠子或成簇的细胞，这种富集方法是一种低频的全电子的微粒富集方法，无需外部附件和控制系统。
需要指出的是，液滴喷射可以分化出三种技术，一种是液滴生成，二是颗粒富集，三是颗粒单液滴分散。其中，图5的仅显示了单液滴分散。
综上所述，本发明提供一种基于电润湿现象的液滴生成方法，是在DMF平台上开发的一种全方位喷射液滴技术，数以万计的微小液滴可以从母液滴的外缘被喷出，并在EWOD力的作用下扩散成一个较大的微小液滴圈；当母液滴中存在微粒子时，粒子不会被喷射出去而是在剩余的母液滴中被富集。该液滴喷射方法是一种快速、低耗电、高通量的液滴喷射方法。
本发明所提供的液滴喷射方法可以实现全电子化，无需外部辅助系统；可应用于DMF平台上的数字PCR、生化反应样品制备、微粒富集等，具有广泛的应用场景。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于电润湿现象的液滴生成方法，其特征在于，包括：将母液滴置于数字微流控芯片的底板上的电极区域内，施以高压电信号，当电信号撤去时，母液滴喷射形成大量微小子液滴；其中，所述电极区域是由一个大电极形成，在喷射过程中，所述底板上电极的通电面积为所述母液滴截面积的100倍以上；
DMF芯片还包括与所述底板相对的顶板，在所述顶板和所述底板之间设置有垫片，以形成空腔，所述母液滴是在所述空腔内进行喷射；
在喷射时，向所述底板上的电极施加交流信号，以使接触所述顶板和所述底板的液滴进行喷射；
所述底板上的电极的喷射电压有效值为100伏以上，喷射频率为1-3000Hz。
2.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，在喷射过程中，所述底板上电极的通电面积为所述母液滴截面积的140-160倍。
3.根据权利要求1或2所述的液滴生成方法，其特征在于，所述母液滴包括主体溶液和表面活性剂；所述母液滴的体积为1nL-10µL。
4.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，所述底板上的电极的喷射电压为175-1000伏，喷射频率为50-1000Hz。
5.根据权利要求4所述的液滴生成方法，其特征在于，所述顶板和所述底板之间的间距为10-500μm。
6.根据权利要求5所述的液滴生成方法，其特征在于，所述顶板和所述底板之间的间距为50-200μm。
7.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，在对所述底板上的电极进行通电之前，在所述空腔内填充油类物质。
8.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于，所述底板包括第一基板和位于所述第一基板上的图案化电极，所述图案化电极是由导电材料对电极进行图案化形成，在所述底板靠近所述顶板的表面上涂覆有电介质层和位于所述电介质层上的疏水层；
所述顶板包括第二基板，所述第二基板靠近所述底板的表面上涂覆有疏水层；
所述电介质层的厚度为500nm-100μm，所述第一基板和所述第二基板上的所述疏水层的厚度为10nm-100μm。
9.根据权利要求8所述的液滴生成方法，其特征在于，所述电介质层的厚度为8-15μm，所述第一基板和所述第二基板上的所述疏水层的厚度为100nm-1μm。
10.权利要求1-9中任一项所述的液滴生成方法在数字PCR、生化反应样品制备、微粒富集或微粒分散中的应用。
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