CN114158559A - 一种诱导植物防御的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于控制植物病害的方法。本发明描述了一种通过激活植物防御相关基因，诱导长效启动植物防御的方法。本发明中的2‑氯异烟酸(2‑chloroisonicotinic acid)能够有效预防和治疗病原体引起的植物病害。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，通过施用2-氯异烟酸诱导植物防御真菌、细菌和卵菌产生的不同植物病害。在植物上应用2-氯异烟酸时，可获得较高的植物病害防护水平。
背景技术
在自然界中，植物不断受到不同生物和非生物胁迫的影响(Tolosa and Zhang(2020)，Current and future perspectives Plants 9:56)。植物病原菌引起的病害是影响作物产量的主要限制因素之一，每年造成各种重要作物损失10-30％(Savary et al(2019)Nat Ecol Evol 3:430-439)。植物病害的控制应包括综合可持续管理，可以将不同的遗传、生物、化学和农业做法结合起来(Van Esse et al New Phytol 225:70-86)。
可持续的管理系统可以通过对环境友好的方法保护植物免受疾病侵袭，同时实现可观的产量(De Almeida Lopes et al(2018)J Appl Microbiol 125:1466-1481)。
目前出现的控制植物病害的一些替代策略是以使用抗性诱导剂为基础的。总的来说，除了提供符合环境法规的新型疾病控制策略外，天然的诱发剂是帮助解开诱导抗性现象背后复杂机制的有效工具。植物的生长和发育受到各种外部因素的不利影响，通常分为生物(昆虫、草食动物和微生物病原体)和非生物(极端温度、不适当的供水等)胁迫。对这些环境胁迫的适应是生存和繁殖的必要条件(Rasmann et al(2012)Plant Signal Behav 7:447-449)。在植物进化出的众多防御策略中，有些是组成型防御机制，但大多数是诱导型的，因此它们更特殊(Frost et al(2008)Plant Physiol 146:818-824)。
识别不同的激发子会激活不同的防御反应。主要的调节激素是水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)，尽管乙烯和脱落酸(ABA)等也发挥着关键作用(Denance et al.2013)Front PlantSci 4:155)。对于植物来说，成功地应对某种环境胁迫或同时发生的几种环境胁迫是一项复杂的任务。这些反应在很大程度上是重叠的，可以是积极的和消极的(Ahmad et al(2010)Mol Plant Pathol 11:817-827)。
诱导抗性导致整个植株产生各种类型的系统抗性。诱导抗性基于两种一般机制:在局部刺激和启动后直接激活系统组织中的防御反应，这意味着系统反应的激活，但只有当病原体到达这些部位时才发生。最典型的诱导抗性类型是系统获得性抗性(SAR)，它主要依赖于SA，而不是JA依赖防御(Conrath(2009)Adv Bot Res 51:361-395)。
启动机制是一种生理状态，使植物在受到生物或非生物胁迫后能够做出更快速和/或更有力的反应。“启动”状态与防御反应的增加、更有效的激活和增强抵抗力有关(Conrath(2009)Adv Bot Res 51:361-395)。这种敏感性的增加与零或最小值的基因诱导相关(Slaughter et al(2012)Plant Physiol 158:835-843)。启动状态产生于感知和/或防御反应诱导信号的放大，而不是直接激活这些防御反应。
诱导抗性使植物能够在各种情况下激活适当的防御系统，以避免自身资源的滥用，并最大限度地权衡各种防御。然而，实施响应需要时间，这段时间可能意味着植物在防御响应行动之前就遭受了相当大的损害。启动因子的进化可能是为了弥补这种脆弱性，同时也允许植物感知环境因素，并加速准备状态，以便在病原体攻击时做出快速、强烈的反应(Frost et al(2008)Plant Physiol 146:818-824)。
现阶段已经开发出不同的生物活性的化合物，并已经在野外条件下使用(Liu etal Front Microbiol 8:2552)。这些化合物可以诱导重要反应，触发植物内源性防御反应，抑制病原体定植和增殖，促进可持续发展的健康农业(Jamiolkowska Agronomy 10:173)。新的生理活性化合物的鉴定及其应用越来越成为植物生物学研究的热点(Norambuena etal(2009)Plant Systems Biology 9:345-354)。小分子在植物科学中的应用提供了令人惊喜的前景。到目前为止，生物活性小分子已被应用为为植物激素、除草剂和生长调节剂。植物科学家已经开始进一步探索新的植物激素信号调节器的化学空间，这说明了小分子的应用潜力巨大，如芸苔素唑和瑟汀诺(Kaschani and van der Hoorn(2007)Current Opinionin Chemical Biology 11:88-98)。
分子对接是理解化合物与生物分子相互作用的桥梁，用于合理的化合物设计和发现。另外，在机理研究中，通过将一个分子(配体)以非共价的方式置入DNA/蛋白质(受体)的靶特异性区域的优先结合位点，可以形成潜在疗效和更多特异性的稳定复合物。从对接技术得到的信息可以用来提示配合物的结合能、自由能和稳定性。目前，对接技术被用于预测配体-受体复合物的初步结合参数(Guedes et al(2014)Biophysical Reviews 6:75-87)。
限制农业发展的一个重要问题是植物防治病害的途径不足，限制了全世界每年的农业生产。因此，尽管现在取得了一些进展，但仍有必要找出可能有助于植物防御的新化合物，以实现更有效的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导植物防御的方法，以解决现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明通过应用2-氯异烟酸，触发与植物防御相关的基因表达，提供了一种诱导植物防御的有效方法。诱导对病害的自然防御是目前一种非常重要和有前景的方法，它可以利用植物中已经存在的生化和分子机制来控制病害。植物防御反应包括一系列与植物固有免疫相关的识别、信号传递和应答事件。这种先天免疫可以被许多因素激活，这对疾病的控制起着决定性的作用。植物激活的防御机制包括抗菌素、防御素和致病相关蛋白的合成。在本发明中，2-氯异烟酸首次被证明能通过激活防御基因来预防和治疗由细菌、卵菌和真菌引起的疾病。
本发明还首次公开了用于有效防治植物病害的2-氯异烟酸的用量和使用方法。在本发明的一个实施例中，2-氯异烟酸的应用，在0.01-0.5μM的浓度范围内，可以使由细菌、卵菌和真菌造成的疾病迅速好转。本发明提出的方法可以通过定期施用2-氯异烟酸来预防病菌对健康植物的侵染。在本发明的特定实施例中，2-氯异烟酸应用于患病植物每周至少一次。2-氯异烟酸的施用浓度范围按照被保护或处理的作物以及施用技术的不同而有所差异。当使用低剂量或超低剂量时，该化合物的有效浓度可能会显著降低。在本发明的一个实施例中，刺激植物的自然防御和诱导对病害的抗性的方法涉及到2-氯异烟酸与农药的联合应用。本发明专利技术中的化合物应用方式是，可将2-氯异烟酸通过溶液、悬浮液、乳液、粉末、颗粒、浓缩乳化物、气溶胶、浸渍颗粒、佐剂、糊状或通过封装配制而成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.用于设计化合物的方法图示。
图2.化合物2-氯异烟酸的化学结构。
图3.化合物2-氯异烟酸与植物受体激酶的相互作用。
图4.0.01μM浓度的2-氯异烟酸处理24h后，拟南芥抗病相关基因的相对表达量。每个处理10株。参与植物免疫的基因有:水杨酸(PR1:发病机制相关蛋白)；茉莉酸/乙烯2(PDF1.2:防御素)。
图5.0.01μM浓度的2-氯异烟酸处理拟南芥后，不同时间点抗病相关基因的相对表达。每个处理10株。参与植物免疫的基因有:水杨酸(PR1:发病机制相关蛋白)；茉莉酸/乙烯2(PDF 1.2:防御素)。
图6.不同浓度2-氯异烟酸处理拟南芥抗病相关基因的相对表达。每个处理10株。参与植物免疫的基因有:水杨酸(PR1:发病机制相关蛋白)；茉莉酸/乙烯2(PDF 1.2:防御素)。
图7.2-氯异烟酸对拟南芥病害的防治作用。
A)拟南芥(At)-番茄灰霉病(Bc)互作。
B)拟南芥(At)-丁香假单胞菌(Ps)相互作用，每个处理10株。
C)拟南芥(At)-拟南芥透明壳孢菌(Ha)相互作用，每个处理10株。化合物浓度为0.01μM，处理48h后评价。
实施例
实施例1：使用对接方法设计用于植物防御的化合物。对来自不同植物物种的受体类激酶(RLK)、受体类蛋白(RLP)和壁受体类激酶(WRLK)进行了鉴定和分析。此外，BLASTp套件被用来确认WRLK。此外，PrankWeb被用于绑定地点预测和保护探索。P2Rank是从蛋白质结构预测配体结合位点的一种新型机器学习方法。另一方面，将Mcule用于分子发现平台。它提供质量最高的化合物数据库和分子建模工具，为制药和生物技术公司提供了独特的解决方案。Mcule的数据库有超过1亿个可综合访问的化合物。在此基础上，进行了基于结构的虚拟筛选、毒性分析和合成。最后测定了生物活性(图1)。采用上述方法，2-氯异烟酸(图2)在与不同植物受体蛋白相互作用过程中得到了很高的分数(图3)。
实施例2：拟南芥植株经2-氯异烟酸处理后植物防御基因的激活。用0.01μM浓度的2-氯异烟酸处理植物。在喷药后24h采集10种植物叶片。按照生产厂家的说明书，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，Calif.)从叶片中提取总RNA，其中包括DNase处理。采用Oligo-dT引物和SuperScriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad公司，Calif公司)按照说明书合成cDNA。采用RotorGene 3000型PCR仪和QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)进行实时定量PCR，所有与植物防御相关基因引物序列见表1。实时定量PCR反应条件为：95℃变性15min，95℃变性15s，60℃延伸30s，72℃延伸30s，40个循环。数据采用GraphPad Prism Software Inc(La Jolla，CA，USA)进行单因素方差分析。均数间差异显著性采用Tukey多重比较检验，P<0.001。每个样品设5个重复，实验重复两次。从图4可以看出，所有分析的基因在2-氯异烟酸处理拟南芥植株后均被激活。PDF1.2、PR1基因与对照组的植株相比均有显著表达。这些表达与水杨酸和茉莉酸途径有关。
表1.实验中使用的引物列表。
实施例3：2-氯异烟酸处理拟南芥植株后不同时间点植物防御基因的激活。用0.01μM浓度的2-氯异烟酸处理植物。分别于喷药后24、48和72h采集10种植物叶片。按照生产厂家的说明书，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，Calif.)从叶片中提取总RNA，其中包括DNase处理。采用Oligo-dT引物和SuperScriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad公司，Calif公司)按照说明书合成cDNA。采用RotorGene 3000型PCR仪和QuantiTect SYBRGreen PCR试剂盒(Qiagen)进行实时定量PCR，所有与植物防御相关基因引物序列见表1。实时定量PCR反应条件为：95℃变性15min。然后95℃变性15s，60℃延伸30s，72℃延伸30s，40个循环。数据采用GraphPad Prism软件Inc.进行单因素方差分析。(La Jolla，CA，USA)。均数间差异显著性采用Tukey’s多重比较检验，P<0.001。每个样品设5个重复。实验重复两次。图5显示了2-氯异烟酸在溶液中作用48小时后如何获得较高的表达量。所有被评估的基因在48小时后都有高表达。
实施例4：不同浓度的2-氯异烟酸处理拟南芥后植物防御基因的激活。用0.001、0.01、0.1、0.5和1μM浓度的2-氯异烟酸处理植物。喷雾后48小时采集10株植物叶片。按照生产厂家的说明书，使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，Calif.)从叶片中提取总RNA，其中包括DNase处理。采用Oligo-dT引物和SuperScriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen公司，Carlsbad公司，Calif公司)按照说明书合成cDNA。采用RotorGene 3000型PCR仪和QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)进行实时定量PCR，所有与植物防御相关基因引物序列见表1。实时定量PCR反应条件为：95℃变性15min。然后95℃变性15s，60℃延伸30s，72℃延伸30s，40个循环。数据采用GraphPad Prism软件Inc.进行单因素方差分析。(LaJolla，CA，USA)。均数间差异显著性采用Tukey多重比较检验，P<0.001。每个样品设5个重复。实验重复两次。从图6可以看出，在0.01-0.5μM浓度范围内，2-氯异烟酸处理拟南芥植株后，所有分析基因均被激活。
实施例5：应用2-氯异烟酸防治拟南芥病害效果评价。
为了比较2-氯异烟酸对不同植物病害的防治效果，在拟南芥中分别感染灰霉病菌(Botrytis cinerea)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和卵菌(Hyaloperonosporaarabidopsidis)进行了试验。以0.01M的浓度，每48h喷施1周。作为对照，研究了水处理植物。在受灰葡萄孢感染的植物中，测量了病变直径。每次处理包括10株植物。每个处理的植株先按照不同的接种方案接种指示的病原菌，24小时后用2-氯异烟酸处理植株。
拟南芥-灰霉菌:将拟南芥(Arabidopsis thaliana-Botrytis cinerea)分离株在合成培养基上培养，对4至5周龄的拟南芥叶片进行侵染试验。每片叶片接种灰霉病菌5μl，孢子数为5×105个/mL。在测定病害前，将植株置于高湿度条件下保存。
拟南芥-丁香假单胞菌:丁香假单胞菌培养于含50μg/mL利福平的金氏B培养基中，在28℃条件下过夜。收集细菌，清洗，用水稀释到所需的浓度。对4周龄植株用无针注射器浸润紫丁香叶，浓度为5×105cfu/mL。用70％乙醇对6个叶片进行表面灭菌，重复3次，进行细菌计数。
拟南芥-卵菌:侵染的方法是，用每毫升含有5×104分生孢子的孢子悬吊液接种拟南芥植株至饱和状态，用透明盖子覆盖植株，在16℃、10小时的光周期下保持高湿度(90-100％)的生长条件。为了评估分生孢子的产生，在1ml水中处理植物。涡旋后，用计数器测定分生孢子的释放量。
在拟南芥植物中观察到对真菌、细菌和卵菌产生的不同疾病的高水平控制(图7)。本发明有助于防治各类植物疾病，揭示了能够激活植物对疾病的自然防御和诱导抗性的有效化合物。本发明提供了一种植物病害的治疗方法。
Claims (7)
1.一种诱导植物防御的方法，其特征在于：在植物上施用有效量的2-氯异烟酸。
2.权利要求1的方法，其中植物病害是由细菌、卵菌和真菌各种植物病原体中的一种或多种引起。
3.权利要求1的方法，其中2-氯异烟酸应用浓度范围为0.01μM-0.5μM。
4.权利要求1的方法，其中2-氯异烟酸每周应用于植物一次或两次。
5.权利要求1的组成，包括2-氯异烟酸的农用组合物，例如：适当的赋形剂或载体。
6.权利要求1的方法，2-氯异烟酸用于植物疾病的预防或治疗。
7.权利要求1的组成，其中2-氯异烟酸应用浓度范围为0.01μM至0.5μM，或者说是低剂量和超低剂量的应用。
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