CN114158502B - 一种基于拉力指标的快速评估双壳贝类抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于拉力指标的快速评估双壳贝类抗性的方法，在不影响测试个体活性的基础上，实现无损伤地检测拉力指标，并基于拉力指标快速评估扇贝抗性的方法。本发明对扇贝进行高效、无损的拉力检测，将获得的扇贝总力、闭壳时间、平均力、最大力四项拉力指标作为快速评估扇贝抗性的依据。本发明方法与传统方法相比，可实现无损活体检测，同心率检测方法相比，本发明方法具有更加稳定、准确、简便且检测成功率高等特点。此外，本发明首次将扇贝闭壳肌拉力作为快速评估扇贝抗性的指标。采用本发明方法能够为扇贝抗性指标测定的提供参考，为后续扇贝抗逆品种的选育提供技术支持。

Description

一种基于拉力指标的快速评估双壳贝类抗性的方法
技术领域
本发明属于海洋生物育种技术领域，具体涉及到一种基于拉力指标的快速评估双壳贝类抗性的方法。
背景技术
双壳贝类闭壳肌其主要由横纹肌、平滑肌及韧带组成，其同机体的强壮程度、逃逸行为、辅助进食等因素都密切相关。其中韧带负责在肌肉放松的情况下，将双壳打开；而横纹肌通过快速收缩使双壳快速闭合；平滑肌的收缩使双壳缓慢闭合并可保持长时间的闭合状态。闭壳肌拉力是指双壳贝类在双壳闭合的过程中，闭壳肌收缩能力的一种量化指标。有研究发现，双壳贝类拉力指标的变化与季节的影响显著相关，是一种具有发展潜力的双壳贝类生理检测指标，闭壳肌拉力同样也是表征双壳贝类的抗性及反映机体健康状况的重要指标。
扇贝是我国海水养殖的主要经济双壳贝类之一，由于其营养丰富，风味鲜美，深受国内外消费者的喜爱。近30年来，中国扇贝年产量从不足0.2万吨增长到230多万吨(中国渔业统计年鉴2020)。目前扇贝养殖品种主要包括栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、海湾扇贝(Argopecten irradias)、华贵栉孔扇贝(C.nobilis)。
然而，我国扇贝养殖业在经历了80年代的快速发展期后，出现了种质衰退、生长缓慢、抗逆性差等问题，制约扇贝养殖业的可持续发展。选育高产抗逆的扇贝新品种/系成为扇贝遗传育种工作的重点，但现阶段仍缺乏可以高效、精准的评估扇贝抗性的方法。目前，评估贝类抗性性状一般以半致死率或存活率来评价，但该指标极易受到其他因素影响，难以准确反映贝类的耐受性。已有的研究中有使用心率指标作为无损的评估扇贝抗性的活体检测指标的方法(公开号为CN 105165675A的中国发明专利)，但心率指标的检测操作较为繁琐，对测量条件要求较高。因此，提供一种检测过程更加方便快捷，且对机体不会造成损伤的评估贝类抗性性状指标的方法，对于扇贝育种就具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于拉力指标的快速评估双壳贝类抗性的方法，在不影响测试个体活性的基础上，实现无损伤地检测拉力指标，并基于拉力指标快速评估扇贝抗性的方法；从而解决现阶段海产经济贝类养殖过程中缺少高效无损的快速评估扇贝抗性方法的问题。
本发明首先提供一种基于双壳贝类闭壳肌拉力指标来评估双壳贝类综合抗性指数的综合抗性评估模型，所述的模型的公式如下：
yCRIS＝-5.334-0.002χTF+0.067χSCT+0.608χAF-0.021χMF，
其中yCRIS为中综合抗性指数，
χTF：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的总力指标(The total force，TF)：
χSCT：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的闭壳时间指标(Shell Closing time，SCT)；
χAF：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的平均力指标(The average force，AF)；
χMF：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的最大力指标(Maximum force，MF)。
所述的总力指标、闭壳时间指标、平均力指标和最大力指标经过了标准化的筛选；
所述的标准化筛选，是将每一次测定的扇贝个体的总力、闭壳时间、平均力、最大力指标数据通过SPSS 23软件计算数据的标准值，将|标准值︱>3的数据视为离群值进行剔除，四项拉力指标中只要有一项出现离群值，则同一次测定的四项拉力指标便全部被剔除，最后得到四项扇贝拉力指标全部有效的数据；所述的标准值计算公式如下：
Figure BDA0003401269950000031
其中χ标为所检测扇贝个体同一项拉力指标的标准值；χ为所检测扇贝个体同一项拉力指标数据；
Figure BDA0003401269950000032
为所检测扇贝个体同一项拉力指标数据的平均值；σ为所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的标准差。
本发明所提供的模型用于评估双壳贝类个体的抗性；
本发明另一个方面还提供一种快速评估双壳贝类抗性的方法，是使用上述的模型来进行评估；
其中一种具体的方法，包括如下的步骤：
1)将待测的双壳贝类放置于充气的循环海水体系中进行检测前的养殖；
2)将拉力测定装置的上下夹片调整至0.75cm的间距，数显拉力计读数调零，单位调至N(1N＝0.98kg)，将取样率调至1000Hz(5个数据/秒)，连接好串口，通过数据分析软件进行联机测试，确定设备与软件连接成功。
3)将双壳贝类从海水中取出，保持其开壳状态，迅速放置于调试好的拉力测定装置上，待扇贝双壳稳定夹住上下夹片后，开始测量，测量时间为3分钟；
4)测量结束后，将每个双壳贝类个体的总力、闭壳时间、平均力、最大力数据通过SPSS 23软件的分析-描述统计-描述功能计算数据的标准值，将|标准值︱>3的数据视为离群值进行剔除，四项拉力指标中只要有一项出现离群值，四项拉力指标便全部被剔除，最后得到双壳贝类拉力指标的有效数据；所述的标准值计算公式如下：
Figure BDA0003401269950000033
χ标：所有检测扇贝个体同一项拉力指标的标准值；χ：所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据；
Figure BDA0003401269950000034
所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的平均值；σ：所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的标准差。
5)将标准化后的四项拉力指标的有效数据带入到综合抗性评估模型中，计算各扇贝个体的综合抗性指数(Comprehensive resistance index of scallop，CRIS)的大小，进而评估出各双壳贝类个体的抗性能力，综合抗性指数越大，双壳贝类抗性能力越强。
所述的双壳贝类，作为实施例的具体记载为扇贝。
本发明对扇贝进行高效、无损的拉力检测，将获得的扇贝总力、闭壳时间、平均力、最大力四项拉力指标作为快速评估扇贝抗性的依据。本发明方法与传统方法相比，可实现无损活体检测，同心率检测方法相比，本发明方法具有更加稳定、准确、简便且检测成功率高等特点。此外，本发明首次将扇贝闭壳肌拉力作为快速评估扇贝抗性的指标。采用本发明方法能够为扇贝抗性指标测定的提供参考，为后续扇贝抗逆品种的选育提供技术支持。
附图说明：
图1：本发明中涉及到的48只18月龄栉孔扇贝个体的综合抗性指数yCRIS和温度胁迫下的耐受时间DT相关散点图。
具体实施方式
申请人在长期的研究中发现扇贝的四项拉力指标可作为快速评估扇贝抗性的指标。
扇贝作为双壳贝类的主要代表之一，其闭壳肌拉力同样可以作为评估扇贝抗性的指标，其中包含有如下四个指标：
总力(The total force，TF)：3min内所测拉力数据的总和；
闭壳时间(Shell Closing time，SCT)：拉力数据>0.1N的时间总和；
平均力(The average force，AF)：总力/闭壳时间，即平均每秒的拉力值；
最大力(Maximum force，MF)：3min内所测拉力数据的最大值。
其中闭壳肌总力是指扇贝在静息状态下，3分钟测试时间内的所有力值的总和，反映了扇贝3分钟内总体的力值表达水平；闭壳时间是指扇贝在静息状态下，稳定闭壳的有效时间，反映了扇贝闭壳肌持续闭壳的能力；平均力是指总力/闭壳时间，反映了扇贝每秒钟的闭壳力的表达水平；最大力则是在闭壳时间内所出现的最大力值，其反映了扇贝单个个体闭壳力所能达到的最大程度。
下面以栉孔扇贝为例，详细描述本发明的方法，但本发明并不局限于以下描述内容：
实施例1：
2020年9月从青岛崂山海区取50只24月龄的栉孔扇贝进行拉力指标标准化测定，具体步骤如下：
1、扇贝拉力标准化测定：
1)将50只24月龄栉孔扇贝放置在实验室充气的循环海水体系中保持10min以上。
2)将拉力测定装置的上下夹片调整至0.75cm的间距，数显拉力计读数调零，单位调至N(1N＝0.98kg)，将取样率调至1000Hz(5个数据/秒)，连接好串口，通过数据分析软件进行联机测试，确定设备与软件连接成功。
3)将待测栉孔扇贝从海水中取出，保持其开壳状态，迅速放置于调试好的拉力测定装置上，待栉孔扇贝双壳稳定夹住上下夹片后，开始测量，测量时间为3分钟。
2、扇贝拉力指标标准化数据收集：
1)测量结束后，通过数据分析软件(智能测量系统3.0)将50只栉孔扇贝的拉力测量数据导出并保存至excel表格中，进行四项扇贝拉力指标的计算，包括：
总力(The total force，TF)：3min内所测拉力数据的总和；
闭壳时间(Shell Closing time，SCT)：拉力数据>0.1N的时间总和；
平均力(The average force，AF)：总力/闭壳时间，即平均每秒的拉力值；
最大力(Maximum force，MF)：3min内所测拉力数据的最大值。
2)将50只栉孔扇贝的总力、闭壳时间、平均力、最大力拉力数据依此通过SPSS 23软件的分析-描述统计-描述功能计算数据的标准值，将|标准值︱>3的数据视为离群值进行剔除，四项拉力指标中只要有一项出现离群值，四项拉力指标便全部被剔除，最后得到扇贝拉力指标的有效数据。所述的标准值计算公式如下：
Figure BDA0003401269950000061
χ标：所有检测扇贝个体同一项拉力指标的标准值；χ：所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据；
Figure BDA0003401269950000062
所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的平均值；σ：所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的标准差。
将50只扇贝个体的四项拉力指标分别带入标准值计算方程中，计算结果如表1所示。
表1：50只24月龄栉孔扇贝拉力指标标准值统计表
Figure BDA0003401269950000063
Figure BDA0003401269950000071
结果显示，50只24月龄栉孔扇贝的四项拉力指标的|标准值︱均小于3，无异常值出现。因此，50只24月龄栉孔扇贝的四项拉力指标数据均为有效数据。四项拉力指标计算结果显示，50只24月龄栉孔扇贝的总力范围在225.67N-3120.59N之间；闭壳时间在24.20S-180.00S之间变化；平均力范围为4.65N-31.30N；最大力范围为1.63N-11.27N；(如表2所示)。
3、扇贝综合抗性指数计算：
将标准化后的四项拉力指标的有效数据带入到综合抗性评估公式中，计算各扇贝个体的综合抗性指数(Comprehensive resistance index of scallop，CRIS)的大小，进而评估出各扇贝个体的抗性能力，综合抗性指数越大，扇贝抗性能力越强。其综合抗性指数计算公式如下：
yCRIS＝-5.334-0.002χTF+0.067χSCT+0.608χAF-0.021χMF
χTF：总力；χSCT：闭壳时间；χAF：平均力；χMF：最大力；yCRIS：综合抗性指数。
将50只24月龄栉孔扇贝的四项拉力指标的有效数据带入评估扇贝抗性指数的公式中，分别求得每个检测扇贝个体的抗性指数(表2)。
表2：50只24月龄栉孔扇贝拉力指标及抗性指数统计表
Figure BDA0003401269950000081
Figure BDA0003401269950000091
实施例2：
运用本发明方法，另取50只青岛海域养殖的18月龄栉孔扇贝进行检测，以验证本发明方法的准确性和可靠性。具体步骤如下：
1、扇贝拉力标准化测定：
1)将50只18月龄栉孔扇贝放置在实验室充气的循环海水体系中保持10min以上。
2)将拉力测定装置的上下夹片调整至0.75cm的间距，数显拉力计读数调零，单位调至N(1N＝0.98kg)，将取样率调至1000Hz(5个数据/秒)，连接好串口，通过数据分析软件进行联机测试，确定设备与软件连接成功。
3)将待测栉孔扇贝从海水中取出，保持其开壳状态，迅速放置于调试好的拉力测定装置上，待栉孔扇贝双壳稳定夹住上下夹片后，开始测量，测量时间为3分钟。
2、扇贝拉力指标标准化数据收集：
1)测量结束后，通过数据分析软件(智能测量系统3.0)将50只18月龄栉孔扇贝的拉力测量数据导出并保存至excel表格中，进行四项扇贝拉力指标的计算，包括：
总力(The total force，TF)：3min内所测拉力数据的总和；
闭壳时间(Shell Closing time，SCT)：拉力数据>0.1N的时间总和；
平均力(The average force，AF)：总力/闭壳时间，即平均每秒的拉力值；
最大力(Maximum force，MF)：3min内所测拉力数据的最大值。
2)将50只18月龄栉孔扇贝的总力、闭壳时间、平均力、最大力拉力数据依此通过SPSS 23软件的分析-描述统计-描述功能计算数据的标准值，将|标准值︱>3的数据视为离群值进行剔除，四项拉力指标中只要有一项出现离群值，四项拉力指标便全部被剔除，最后得到扇贝拉力指标的有效数据。所述的标准值计算公式如下：
Figure BDA0003401269950000101
χ标：所有检测扇贝个体同一项拉力指标的标准值；χ：所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据；
Figure BDA0003401269950000102
所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的平均值；σ：所有检测扇贝个体同一项拉力指标数据的标准差。
将50只18月龄扇贝个体的四项拉力指标分别带入标准值计算方程中，如表3所示。
表3：50只18月龄栉孔扇贝拉力指标标准值统计表
Figure BDA0003401269950000111
Figure BDA0003401269950000121
结果显示，50只18月龄栉孔扇贝中有48只栉孔扇贝的四项拉力指标的|标准值︱均小于3，因此剔除有异常值出现的扇贝，剩余48只18月龄栉孔扇贝的四项拉力指标数据为有效数据。四项拉力指标计算结果显示，48只18月龄栉孔扇贝的总力范围在205.69N-6724.38N之间；闭壳时间在112.40S-180.00S之间变化；平均力范围为3.05N-37.36N；最大力范围为1.21N-8.22N；(如表4所示)。
3、扇贝综合抗性指数计算：
将标准化后的四项拉力指标的有效数据带入到综合抗性评估公式中，计算各扇贝个体的综合抗性指数(Comprehensive resistance index of scallop，CRIS)的大小，进而评估出各扇贝个体的抗性能力，综合抗性指数越大，扇贝抗性能力越强。其综合抗性指数计算公式如下：
yCRIS＝-5.334-0.002χTF+0.067χSCT+0.608χAF-0.021χMF
χTF：总力；χSCT：闭壳时间；χAF：平均力；χMF：最大力；yCRIS：综合抗性指数。
将48只18月龄栉孔扇贝的四项拉力指标的有效数据带入评估扇贝抗性指数的公式中，分别求得每个检测扇贝个体的抗性指数。此外，为了验证本发明方法的准确性将这48只18月龄栉孔扇贝进行温度胁迫。将初始水温设置为19℃，升温速度设置为1℃/d，至34℃为止。实时记录各栉孔扇贝个体的死亡时间(即耐受时间DT)如表4所示。
表4.48只18月龄栉孔扇贝拉力指标、抗性指数及扇贝耐受时间统计表
Figure BDA0003401269950000131
Figure BDA0003401269950000141
结果显示，48只栉孔扇贝的综合抗性指数yCRIS同温度胁迫下的耐受时间DT呈极显著正相关(R2＝0.8324，Pearson相关系数r＝0.912，P<0.01)，即综合抗性指数yCRIS越大，温度胁迫下的耐受时间越长，扇贝综合抗性越强，验证了本发明方法的准确性。
结果表明本发明的基于拉力指标快速评估扇贝抗性方法准确性高且可靠性强，通过拉力指标可以有效的确定扇贝抗性的强弱，从而能够为扇贝抗性指标体系的建立提供快速有效的检测方法，同时为扇贝抗逆品种选育提供技术支撑。

Claims (5)

1.一种基于双壳贝类闭壳肌拉力指标来评估双壳贝类综合抗性指数的模型，其特征在于，所述的模型的公式如下：
Figure FDA0003732634130000011
其中yCRIS为综合抗性指数，
χTF：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的总力指标，即3min内所测拉力数据的总和；
χSCT：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的闭壳时间指标，即拉力数据>0.1N的时间总和；
χAF：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的平均力指标；即总力/闭壳时间，代表平均每秒的拉力值；
χMF：为待检测双壳贝类个体闭壳肌拉力的最大力指标，即3min内所测拉力数据的最大值；
所述的总力指标、闭壳时间指标、平均力指标和最大力指标经过了标准化的筛选，是将每一次测定的双壳贝类个体的总力、闭壳时间、平均力、最大力指标数据通过SPSS 23软件计算数据的标准值，将|标准值︱>3的数据视为离群值进行剔除，四项拉力指标中只要有一项出现离群值，则同一次测定的四项拉力指标便全部被剔除，最后得到四项双壳贝类拉力指标全部有效的数据；
所述的标准值计算公式如下：
Figure FDA0003732634130000012
其中χ标为所检测双壳贝类个体同一项拉力指标的标准值；χ为所检测双壳贝类个体同一项拉力指标数据；
Figure FDA0003732634130000013
为所检测双壳贝类个体同一项拉力指标数据的平均值；σ为所有检测双壳贝类个体同一项拉力指标数据的标准差。
2.权利要求1所述的模型在评估双壳贝类个体抗性中的应用。
3.一种快速评估双壳贝类抗性的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的模型来进行评估。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)将待测的双壳贝类放置于充气的循环海水体系中进行检测前的养殖；
2)将拉力测定装置的上下夹片调整至0.75cm的间距，数显拉力计读数调零，单位调至N，将取样率调至1000Hz，连接好串口，通过数据分析软件进行联机测试，确定设备与软件连接成功；
3)将双壳贝类从海水中取出，保持其开壳状态，迅速放置于调试好的拉力测定装置上，待双壳贝类的双壳稳定夹住上下夹片后，开始测量，测量时间为3分钟；
4)测量结束后，将每个双壳贝类个体的总力、闭壳时间、平均力、最大力数据通过SPSS23软件计算数据的标准值，将|标准值︱>3的数据视为离群值进行剔除，四项拉力指标中只要有一项出现离群值，四项拉力指标便全部被剔除，最后得到双壳贝类拉力指标的有效数据；所述的标准值计算公式如下：
Figure FDA0003732634130000021
χ标：所有检测双壳贝类个体同一项拉力指标的标准值；χ：所有检测双壳贝类个体同一项拉力指标数据；
Figure FDA0003732634130000022
所有检测双壳贝类个体同一项拉力指标数据的平均值；σ：所有检测双壳贝类个体同一项拉力指标数据的标准差；
5)将标准化后的四项拉力指标的有效数据带入到权利要求1所述的模型中，计算各双壳贝类个体的综合抗性指数的大小，进而评估出各双壳贝类个体的抗性能力，综合抗性指数越大，双壳贝类抗性能力越强。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的双壳贝类为扇贝。
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