CN114155918A - 基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在fasn抑制剂试验方法 - Google Patents

基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在fasn抑制剂试验方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药学分析技术领域，且公开了基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在脂肪酸合酶(FASN)抑制剂试验方法，该分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法具体操作步骤如下：S1、分子对接；S2、分子动力学模拟；S3、细胞活力检测‑MTT法；S4、蛋白质免疫印迹；S5、细胞周期检测。本发明通过采用分子对接与分子动力学模拟搭配工作，整个分析实验主要是就是分析了FDA化合物库中的化合物对FASN的TE活性中心的结合能力，通过打分排序，确定了分数最低(结合能力最强)的化合物Adapalene，随后通过多种细胞实验验证，证明Adapalene确实具有抑制FASN活性的能力，且对癌细胞具有多种活性，从而来达到实验的目的。

Description

基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在 FASN抑制剂试验方法
技术领域
本发明属于药学分析技术领域，具体是基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法。
背景技术
hFASN是具有七个催化结构域的同型二聚体。TE结构域是这个大分子酶复合体的第七个功能域，FASN的其余结构域主要协助从头合成棕榈酸酯。其中，MAT、KS、KR、DH、ER结构域直接参与脂肪酸链的延长，ACP结构域通过运载延长中的脂肪酸链在各结构域之间的移动参与传递，TE结构域则是通过催化水解棕榈酸酯和ACP上的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基团之间的硫酯键，使得延伸完毕的棕榈酸最终从ACP上释放出来，抑制TE结构域的水解反应，ACP上连接的脂肪酸链延长至16碳之后无法顺利脱离，从而阻止ACP继续参与脂肪酸生物合成中间产物在各个催化结构域之间的传递，进而阻止新的脂肪酸链的合成进程，奥利司他是美国食品药监督管理局(FDA)批准的含β-内酯的药物，可共价结合TE结构域的活性氨基酸Ser2308从而抑制其活性，进而阻止棕榈酸合成，诱导内质网应激和肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤生长并防止血管生成，因此，TE结构域是参与终止棕榈酸合成和调节脂肪酸链长度的非常有前景的靶点。
由于近20年已报道的真正高活性、低毒性，可以用于药品开发的FASN抑制剂仍然非常缺乏，沿着老药新用的思路可大大缩短漫长的新药研发周期，降低研发成本并提高研发成功率，加速抗乳腺癌药物的研发进程，为了解决上述问题，本申请提出来基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题，本发明提供了基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，本研究中以经FDA在内的监管机构所批准的药物作为配体化合物分子，通过分子对接和分子动力学模拟等手段将结合TE结构域的活性化合物从非活性化合物数据库中富集出来，试图虚拟筛选安全性已得到充分验证的以FASN-TE为靶点的抑制剂，在确定受体蛋白为FASN的TE结构域，配体为FDA在内的监管机构所批准的药物之后，我们依次通过基于结构域的结构预测潜在的结合口袋，查阅其活性氨基酸位点；并将潜在结合口袋和活性氨基酸作为对接区域进行分子对接，得到结合能最低的化合物；通过分子动力模拟对分子对接的结果进行验证；最后使用选取的化合物进行后续的体外细胞实验。希望通过分子对接和分子动力学模拟筛选出能够显著抑制TE结构域活性位点的化合物，进而抑制依赖FASN的脂肪酸合成，进而抑制肿瘤，以解决背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，该分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法具体操作步骤如下：
S1、分子对接；
S2、分子动力学模拟；
S3、细胞活力检测-MTT法；
S4、蛋白质免疫印迹；
S5、细胞周期检测；
S6、细胞增殖检测；
S7、细胞凋亡检测；
S8、细胞划线实验；
S9、细胞内FASN酶活检测；
S1步骤中分子对接具体操作步骤如下：
1)使用Openbabel软件将自ZINC网站打包下载的文件拆分成多个含单个小分子化合物的配体mol2文件；
2)批量创建文件夹，并按数字序号依次命名；
3)批量将配体放入文件夹中，并将配体统一命名；
S2步骤中分子动力学模拟具体操作步骤如下：
拓扑文件准备
1)在Linux环境下安装Gromacs软件，下载CHARMM36力场并置于工作目录下；
2)使用PyMOL软件检查受体pdb文件，去除可能包含的结晶水和小分子配体等结构并置于工作目录；
3)通过pdb2gmx指令生成将受体gro、top、itp拓扑文件；
4)配体拓扑文件的准备；
5)使用Avogadro程序将配体pdb文件添加氢原子并生成mol2文件；
6)借助sort_mol2_bonds.pl脚本修正配体mol2文件；
7)通过CGenFF将配体mol2文件转换为str文件；
8)借助cgenff_charmm2gmx.py脚本将str文件转化为itp、prm、top、pdb等文件；
蛋白质受体复合体的构建
1)通过editconf指令将配体pdb文件转换成gro文件；
2)将配体的坐标信息添加到受体gro文件；
3)将配体的拓扑信息写入受体topol.top文件，并在molecules部分添加配体信息；
定义盒子并添加溶剂
1)通过editconf指令将复合体放入盒子中，并将复合物与盒子边界的最小距离设定为1.0nm；
2)通过solvate指令在盒子中添加水分子；
3)将ions.mdp置于工作目录，通过grompp和genion指令往盒子中添加离子平衡体系中的电荷；
能量最小化
1)将em.mdp置于工作目录，通过grompp和mdrun指令使体系的能量最小化；
2)平衡
3)通过make_ndx指令给配体创建一个包含氢原子之外所有原子的索引组；
4)通过genrestr指令输出配体施加位置限制的itp文件；
5)将itp文件写入受体topol.top文件；
热浴
1)将nvt.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令执行NVT平衡；
2)将npt.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令执行NPT平衡；
正式模拟
1)将md.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令运行50ns MD模拟。
本申请的实验试图选取FASN催化棕榈酸合成代谢中其关键作用的TE结构域作为对接目标，此外，待筛选的小分子化合物需要具有较大的选择范围和余地，且需要易于购买到纯度可得到保证的商品化化合物用于后续的体外细胞验证实验，因此，我们选取了药物安全性已得到充分验证的FDA库和World库作为筛选对象。
将分子对接所得结合能最低的化合物Adapalene作为本次潜在FASN抑制剂筛选的首要研究对象，并对其结合结果进行了分子动力学模拟；接下来，我们购买了包含Adapalene在内结合能最低的四种化合物进行了体外细胞实验验证，使用四种化合物处理乳腺癌细胞株，检测其细胞活力和FASN蛋白表达量，四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor的抑制效果，Adapalene效果最强，与前期的分子对接结果一致，进而我们选取了效果最优的Adapalene进行下一步的实验，体外细胞实验结果表明，Adapalene对乳腺癌细胞株具有降低FASN酶活力，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期，抑制细胞侵袭转移，引起细胞内质网应激的作用，综合以上实验结果，Adapalene确实是潜在的可用于乳腺癌临床治疗的FASN抑制剂。
作为本发明的一种优选技术方案，S3中的细胞活力检测-MTT法具体操作步骤如下：
1)待96孔板中细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清DMEM处理细胞24h，每个药物浓度重复6孔；
2)提前将MTT和DMSO配制5mg/mL的MTT溶液；
3)按照9:1的比例将无血清培养液和MTT溶液(5mg/mL)配制成0.5mg/mL混合液；
4)弃培养液，每孔加入PBS清洗，每孔加入100μL混合液；
5)37℃恒温培养1h；
6)弃混合液，每孔加入并吹打100μL DMSO；
7)使用酶标仪测492nm处吸光值。
作为本发明的一种优选技术方案，S4中蛋白质免疫印迹具体操作步骤如下：
蛋白样品制备
1)将细胞接至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h，每个药物浓度重复3孔；
2)PBS洗涤细胞，加入120μL裂解液，刮取至离心管；
3)冰上超声4min；
4)4℃离心，上清液移至新离心管中。
5)BCA法测定蛋白浓度并调平；
6)按比例加入4×Loading Buffer，95℃煮样10min，样品可放置于-20℃保存；
电泳
1)配制SDS-PAGE分离胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1.5M Tris-HCL(pH 8.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，每个制胶板加入7mL分离胶，加水补齐，等待凝固；
2)配制SDS-PAGE浓缩胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1M Tris-HCL(pH6.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，倒掉制胶板中的水，加浓缩胶补齐，并插梳子，等待凝固；
3)配制1×Running Buffer：将5×Running Buffer和超纯水按1:4比例稀释并颠倒混匀；
4)将制胶板置于电泳槽，加1×Running Buffer，拔梳子，每孔加适量Marker或样品；
5)电泳：恒压80V电泳30min，再调至120V电泳使条带跑至凝胶底部；
转膜
1)配制1×Transfer Buffer：5×Transfer Buffer、无水甲醇和超纯水按1:1:3比例稀释并颠倒混匀；
2)剪膜：PVDF在甲醇中浸泡激活；
3)转膜：海绵和三层滤纸放置在转膜夹上，经Transfer Buffer浸泡，将凝胶放置在转膜夹的黑色部分并将膜覆于其上，夹上转膜夹，插入槽中，恒流250mA转膜2.5h左右使样品从凝胶充分转移至膜上；
孵育抗体
1)洗膜：提前稀释10×TBS溶液至1×TBST溶液，待转膜完毕后，用1×TBST溶液摇床清洗3次，每次10min；
2)封闭：按每20mL TBST加入1g脱脂奶粉的比例提前配制封闭液，并将膜放入封闭液，37℃摇床1h；
3)孵育一抗：用一抗稀释液稀释一抗，将膜置于一抗孵育液；4℃孵育过夜；
4)洗膜：TBST洗膜3次；
5)孵育二抗：膜放入含二抗的封闭液中，37℃摇床1h；
6)洗膜：TBST洗膜3次；
显影
1)配制ECL发光液：两种溶液按1:1比例混合；
使用曝光机显影，选择ImageLab软件的印迹Chemi选项，曝光前均匀滴加160μL发光液，得到条带后使用ImageJ软件定量分析条带的灰度值并使用GraphPad Prism软件作图，每个实验重复三次。
作为本发明的一种优选技术方案，S5中的细胞周期检测具体操作步骤如下：
1)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
2)吸取六孔板中的DMEM至2mL离心管，300μL胰酶消化贴壁细胞5min，并用1mL刚才吸取的DMEM吹打收集细胞；
3)4℃离心，留沉淀；
4)PBS重悬细胞，4℃离心，弃上清；
5)细胞固定：70％乙醇，-20℃固定12h；
6)4℃离心，弃上清；
7)PBS重悬，4℃离心，弃上清；
8)按试剂盒说明配制碘化丙啶染色液；
9)染色液重悬细胞，37℃避光孵育30min；
10)流式检测：488nm检测红色荧光；
11)使用ModFit拟合分析。
作为本发明的一种优选技术方案，S6中的细胞增殖检测具体操作步骤如下：
1)提前自备固定液(4％甲醛)、洗涤液、通透液；
2)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
3)配制2×EdU工作液(即20μM)：EdU(10mM)和无血清培养液按1:500比例稀释；
4)每孔吸除1mL培养液并加入1mL 37℃预热好的2×EdU工作液(20μM)，37℃孵育2h；
5)去除培养液，固定液室温固定15min；
6)去除固定液，使用洗涤液、通透液洗涤细胞多次；
7)配制Click Additive Solution：用去离子水溶解Click Additive，混匀至溶解；
8)配制Click反应液：需按顺序依次加入Click Reaction Buffer、CuSO4、Azide594、Click Additive Solution；
9)去除洗涤液，加入反应液，避光孵育30min；
10)洗涤液洗涤细胞3次；
11)配制1×Hoechst 33342溶液：Hoechst 33342(1000×)和PBS按1:1000比例稀释；
12)加入Hoechst 33342溶液，避光孵育；
13)洗涤液洗涤细胞3次；
14)荧光显微镜检测：Azide594激发光590nm，发射光615nm；Hoechst 33342激发光346nm，发射光460nm。
作为本发明的一种优选技术方案，S7中的细胞凋亡检测具体操作步骤如下：
1)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
2)收集培养液至离心管，胰酶消化贴壁细胞5min，并用1mL刚才吸取的培养液吹打消化后的细胞至单细胞状态并汇入离心管，1100g，4min，4℃离心；
3)用0.5mL PBS，1100g，4min，4℃离心洗涤细胞2次；
4)Annexin V-FITC结合液重悬细胞；
5)依次加入Annexin V-FITC、PI；
6)流式检测：分别选用FITC/PE或FL1/FL2通道；
7)荧光显微镜检测：细胞悬液滴至载玻片，盖盖玻片进行观察。
作为本发明的一种优选技术方案，S8中的细胞划线实验具体操作步骤如下：
1)待六孔板细胞密度长至70％～80％；
2)并每孔使用1mL枪头在六孔板底部的细胞中划三条直线，并用PBS清洗掉漂浮细胞；
3)每孔加入含不同药物浓度DMEM处理细胞，荧光显微镜拍照记录；
4)放置在培养箱中37℃恒温培养24h，再次使用荧光显微镜拍照记录。
作为本发明的一种优选技术方案，S9中的细胞内FASN酶活检测具体操作步骤如下：
1)待培养皿中细胞密度长至70％～80％，不同药物浓度处理细胞24h；
2)分光光度计预热，用蒸馏水调零；
3)PBS清洗细胞后，使用细胞刮刀刮取细胞；
4)冰浴超声3min；
5)4℃离心，取上清；
6)将上清液、乙酰CoA、丙二酰CoA、NADPH等底物加入比色皿，混匀后测定340nm吸光值；
7)剩余的蛋白样品使用BCA法测定总蛋白浓度；
8)利用单位时间内340nm光吸收下降速率和样品的蛋白浓度计算FASN的酶活力。
作为本发明的一种优选技术方案，该牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法涉及的实验试剂包括有脂肪酸合成酶(FAS)活性检测试剂盒、BeyoClickTMEdU-594细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、免疫染色封闭液、免疫染色洗涤液、RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白分子量标准Marker、4％免疫组化固定液、丙烯酰胺(Acrylamide)、二硫叔糖醇(DTT)、噻唑蓝(MTT)、一抗稀释液、溴酚蓝、棕榈酸、Tween-20、无水甲醇、Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor、Tris-HCL、氯化钾、盐酸、乙醇、氯化钠、脱脂奶粉、胎牛血清、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、显影液、甘油、Trizma base、甘氨酸、二甲基亚矾(DMSO)、过硫酸铵(AP)、胰酶(无EDTA)、胰酶(含EDTA)、高糖培养液、PBS；
实验抗体包括有FASN Rabbit mAb、PARP Rabbit mAb、PERK Rabbit mAb、CHOPRabbit mAb、BiP Rabbit mAb、β-Actin Rabbit mAb、Anti-Bcl-2antibody、Anti-Baxantibody、Anti-IRE1 antibody、Anti-ATF6 antibody、Anti-DDIT3 antibody、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP；
实验仪器包括有：电热恒温鼓风干燥箱、超声波细胞粉碎仪、电热恒温水浴锅、制冰机、金属恒温浴、恒温振荡器、低速离心机、涡旋混合器、超低温冰箱、电子分析天平、倒置生物显微镜、移液器、真空泵、圆周摇床、超净工作台、化学发光成像分析系统、台式冷冻离心机、多功能酶标仪、流式细胞仪、移液器、台式pH计、磁力搅拌器、智能正置荧光显微镜、二氧化碳培养箱、紫外可见分光光度计、倒置荧光显微镜、超纯水一体化系统。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过采用分子对接与分子动力学模拟搭配工作，能够快速有效地完成大量数据的筛选，并且借助计算机的编程控制精准的获得实验数据，这样的话既能够保证工作效率的大幅提升，同时也能够保证整体实验分析的稳定进行，并且因为操作人员亲自操作，因此在实验过程中能够进一步完善初步方案，并且也能够发现新的问题，使得该操作分析方法与结论逐渐完善和逐渐逼近正确方向，整个分析实验主要是就是分析了FDA化合物库中的化合物对FASN的TE活性中心的结合能力，通过打分排序，确定了分数最低(结合能力最强)的化合物Adapalene，随后通过多种细胞实验验证，证明Adapalene确实具有抑制FASN活性的能力，且对癌细胞具有多种活性，从而来达到实验的目的；传统的研发新产品与原料进行实验整体周期长、成本大，很容易受到各种因素的影响而中断，本操作方法的实验分析材料来自于现有的且被专业机构承认的安全药物，通过分析其额外的功能效果，结合分子对接和分子动力模拟等虚拟筛选手段大幅减少实验需要测试的化合物数量，大大缩短漫长的新药研发周期，降低研发成本并提高研发成功率，加速抗乳腺癌药物的研发进程，跨过安全性验证这道坎，也能更快地投入临床治疗，是抗癌FASN抑制剂的研发新思路和新方向。
附图说明
图1为本发明整体工作流程示意图；
图2为本发明由DoGSiteScorer预测的TE结构域打分前三的活性口袋示意图；
图3为本发明经分子对接筛选出的四种化合物示意图；
图4为本发明筛选得到的四种化合物与人脂肪酸合酶TE结构域的相互作用示意图；
图5为本发明Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域复合物体系的RMSF分析示意图；
图6为本发明Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域复合物体系的接触对信息示意图；
图7为本发明Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域的结合自由能示意图；
图8为本发明Adapalene、Celecoxib、Lumacaftor、Alectinib对人属乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7)细胞活力的影响示意图；
图9为本发明Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor对人属乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7)细胞内FASN表达水平的影响；
图10为本发明Adapalene对人属乳腺癌细胞(MDA-MB-231、MCF-7)细胞内脂肪酸合酶活性的影响示意图；
图11为本发明不同浓度Adapalene对乳腺癌细胞增殖的影响示意图；
图12为本发明Adapalene对乳腺癌细胞凋亡的影响示意图；
图13为本发明不同浓度Adapalene对乳腺癌细胞株细胞周期的影响示意图；
图14为本发明浓度梯度的Adapalene处理两株乳腺癌细胞后，其侵袭转移的改变示意图；
图15为本发明Adapalene对两株乳腺癌细胞的内质网应激的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1至图15所示，本发明提供基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，该分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法具体操作步骤如下：
S1、分子对接；
S2、分子动力学模拟；
S3、细胞活力检测-MTT法；
S4、蛋白质免疫印迹；
S5、细胞周期检测；
S6、细胞增殖检测；
S7、细胞凋亡检测；
S8、细胞划线实验；
S9、细胞内FASN酶活检测；
S1步骤中分子对接具体操作步骤如下：
1)使用Openbabel软件将自ZINC网站打包下载的文件拆分成多个含单个小分子化合物的配体mol2文件；
2)批量创建文件夹，并按数字序号依次命名；
3)批量将配体放入文件夹中，并将配体统一命名；
S2步骤中分子动力学模拟具体操作步骤如下：
拓扑文件准备
1)在Linux环境下安装Gromacs软件，下载CHARMM36力场并置于工作目录下；
2)使用PyMOL软件检查受体pdb文件，去除可能包含的结晶水和小分子配体等结构并置于工作目录；
3)通过pdb2gmx指令生成将受体gro、top、itp拓扑文件；
4)配体拓扑文件的准备
5)使用Avogadro程序将配体pdb文件添加氢原子并生成mol2文件；
6)借助sort_mol2_bonds.pl脚本修正配体mol2文件；
7)通过CGenFF将配体mol2文件转换为str文件；
8)借助cgenff_charmm2gmx.py脚本将str文件转化为itp、prm、top、pdb等文件；
蛋白质受体复合体的构建
1)通过editconf指令将配体pdb文件转换成gro文件；
2)将配体的坐标信息添加到受体gro文件；
3)将配体的拓扑信息写入受体topol.top文件，并在molecules部分添加配体信息；
定义盒子并添加溶剂
1)通过editconf指令将复合体放入盒子中，并将复合物与盒子边界的最小距离设定为1.0nm；
2)通过solvate指令在盒子中添加水分子；
3)将ions.mdp置于工作目录，通过grompp和genion指令往盒子中添加离子平衡体系中的电荷；
能量最小化
1)将em.mdp置于工作目录，通过grompp和mdrun指令使体系的能量最小化；
2)平衡
3)通过make_ndx指令给配体创建一个包含氢原子之外所有原子的索引组；
4)通过genrestr指令输出配体施加位置限制的itp文件；
5)将itp文件写入受体topol.top文件；
热浴
1)将nvt.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令执行NVT平衡；
2)将npt.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令执行NPT平衡；
正式模拟
1)将md.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令运行50ns MD模拟。
本申请的实验试图选取FASN催化棕榈酸合成代谢中其关键作用的TE结构域作为对接目标，此外，待筛选的小分子化合物需要具有较大的选择范围和余地，且需要易于购买到纯度可得到保证的商品化化合物用于后续的体外细胞验证实验，因此，我们选取了药物安全性已得到充分验证的FDA库和World库作为筛选对象。
将分子对接所得结合能最低的化合物Adapalene作为本次潜在FASN抑制剂筛选的首要研究对象，并对其结合结果进行了分子动力学模拟；接下来，我们购买了包含Adapalene在内结合能最低的四种化合物进行了体外细胞实验验证，使用四种化合物处理乳腺癌细胞株，检测其细胞活力和FASN蛋白表达量，四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor的抑制效果，Adapalene效果最强，与前期的分子对接结果一致，进而我们选取了效果最优的Adapalene进行下一步的实验，体外细胞实验结果表明，Adapalene对乳腺癌细胞株具有降低FASN酶活力，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期，抑制细胞侵袭转移，引起细胞内质网应激的作用，综合以上实验结果，Adapalene确实是潜在的可用于乳腺癌临床治疗的FASN抑制剂。
其中，S3中的细胞活力检测-MTT法具体操作步骤如下：
1)待96孔板中细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清DMEM处理细胞24h，每个药物浓度重复6孔；
2)提前将MTT和DMSO配制5mg/mL的MTT溶液；
3)按照9:1的比例将无血清培养液和MTT溶液(5mg/mL)配制成0.5mg/mL混合液；
4)弃培养液，每孔加入PBS清洗，每孔加入100μL混合液；
5)37℃恒温培养1h；
6)弃混合液，每孔加入并吹打100μL DMSO；
7)使用酶标仪测492nm处吸光值。
其中，S4中蛋白质免疫印迹具体操作步骤如下：
蛋白样品制备
1)将细胞接至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h，每个药物浓度重复3孔；
2)PBS洗涤细胞，加入120μL裂解液，刮取至离心管；
3)冰上超声4min；
4)4℃离心，上清液移至新离心管中。
5)BCA法测定蛋白浓度并调平；
6)按比例加入4×Loading Buffer，95℃煮样10min，样品可放置于-20℃保存；
电泳
1)配制SDS-PAGE分离胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1.5M Tris-HCL(pH 8.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，每个制胶板加入7mL分离胶，加水补齐，等待凝固；
2)配制SDS-PAGE浓缩胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1M Tris-HCL(pH6.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，倒掉制胶板中的水，加浓缩胶补齐，并插梳子，等待凝固；
3)配制1×Running Buffer：将5×Running Buffer和超纯水按1:4比例稀释并颠倒混匀；
4)将制胶板置于电泳槽，加1×Running Buffer，拔梳子，每孔加适量Marker或样品；
5)电泳：恒压80V电泳30min，再调至120V电泳使条带跑至凝胶底部；
转膜
1)配制1×Transfer Buffer：5×Transfer Buffer、无水甲醇和超纯水按1:1:3比例稀释并颠倒混匀；
2)剪膜：PVDF在甲醇中浸泡激活；
3)转膜：海绵和三层滤纸放置在转膜夹上，经Transfer Buffer浸泡，将凝胶放置在转膜夹的黑色部分并将膜覆于其上，夹上转膜夹，插入槽中，恒流250mA转膜2.5h左右使样品从凝胶充分转移至膜上；
孵育抗体
1)洗膜：提前稀释10×TBS溶液至1×TBST溶液，待转膜完毕后，用1×TBST溶液摇床清洗3次，每次10min；
2)封闭：按每20mL TBST加入1g脱脂奶粉的比例提前配制封闭液，并将膜放入封闭液，37℃摇床1h；
3)孵育一抗：用一抗稀释液稀释一抗，将膜置于一抗孵育液；4℃孵育过夜；
4)洗膜：TBST洗膜3次；
5)孵育二抗：膜放入含二抗的封闭液中，37℃摇床1h；
6)洗膜：TBST洗膜3次；
显影
1)配制ECL发光液：两种溶液按1:1比例混合；
使用曝光机显影，选择ImageLab软件的印迹Chemi选项，曝光前均匀滴加160μL发光液，得到条带后使用ImageJ软件定量分析条带的灰度值并使用GraphPad Prism软件作图，每个实验重复三次。
其中，S5中的细胞周期检测具体操作步骤如下：
1)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
2)吸取六孔板中的DMEM至2mL离心管，300μL胰酶消化贴壁细胞5min，并用1mL刚才吸取的DMEM吹打收集细胞；
3)4℃离心，留沉淀；
4)PBS重悬细胞，4℃离心，弃上清；
5)细胞固定：70％乙醇，-20℃固定12h；
6)4℃离心，弃上清；
7)PBS重悬，4℃离心，弃上清；
8)按试剂盒说明配制碘化丙啶染色液；
9)染色液重悬细胞，37℃避光孵育30min；
10)流式检测：488nm检测红色荧光；
11)使用ModFit拟合分析。
其中，S6中的细胞增殖检测具体操作步骤如下：
1)提前自备固定液(4％甲醛)、洗涤液、通透液；
2)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
3)配制2×EdU工作液(即20μM)：EdU(10mM)和无血清培养液按1:500比例稀释；
4)每孔吸除1mL培养液并加入1mL 37℃预热好的2×EdU工作液(20μM)，37℃孵育2h；
5)去除培养液，固定液室温固定15min；
6)去除固定液，使用洗涤液、通透液洗涤细胞多次；
7)配制Click Additive Solution：用去离子水溶解Click Additive，混匀至溶解；
8)配制Click反应液：需按顺序依次加入Click Reaction Buffer、CuSO4、Azide594、Click Additive Solution；
9)去除洗涤液，加入反应液，避光孵育30min；
10)洗涤液洗涤细胞3次；
11)配制1×Hoechst 33342溶液：Hoechst 33342(1000×)和PBS按1:1000比例稀释；
12)加入Hoechst 33342溶液，避光孵育；
13)洗涤液洗涤细胞3次；
14)荧光显微镜检测：Azide594激发光590nm，发射光615nm；Hoechst 33342激发光346nm，发射光460nm。
其中，S7中的细胞凋亡检测具体操作步骤如下：
1)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
2)收集培养液至离心管，胰酶消化贴壁细胞5min，并用1mL刚才吸取的培养液吹打消化后的细胞至单细胞状态并汇入离心管，1100g，4min，4℃离心；
3)用0.5mL PBS，1100g，4min，4℃离心洗涤细胞2次；
4)Annexin V-FITC结合液重悬细胞；
5)依次加入Annexin V-FITC、PI；
6)流式检测：分别选用FITC/PE或FL1/FL2通道；
7)荧光显微镜检测：细胞悬液滴至载玻片，盖盖玻片进行观察。
其中，S8中的细胞划线实验具体操作步骤如下：
1)待六孔板细胞密度长至70％～80％；
2)并每孔使用1mL枪头在六孔板底部的细胞中划三条直线，并用PBS清洗掉漂浮细胞；
3)每孔加入含不同药物浓度DMEM处理细胞，荧光显微镜拍照记录；
4)放置在培养箱中37℃恒温培养24h，再次使用荧光显微镜拍照记录。
其中，S9中的细胞内FASN酶活检测具体操作步骤如下：
1)待培养皿中细胞密度长至70％～80％，不同药物浓度处理细胞24h；
2)分光光度计预热，用蒸馏水调零；
3)PBS清洗细胞后，使用细胞刮刀刮取细胞；
4)冰浴超声3min；
5)4℃离心，取上清；
6)将上清液、乙酰CoA、丙二酰CoA、NADPH等底物加入比色皿，混匀后测定340nm吸光值；
7)剩余的蛋白样品使用BCA法测定总蛋白浓度；
8)利用单位时间内340nm光吸收下降速率和样品的蛋白浓度计算FASN的酶活力。
潜在结合口袋预测
用于对接的受体TE结构域(3TJM)来源于PDB数据库，在得到脂肪酸合酶的结构域后，对其进行除水、去除小分子等预处理后，通过使用DoGSiteScorer在线工具来预测FASN各个结构域晶体结构的潜在结合口袋，然后根据它们的大小，表面积和可药用性评分等指标对其进行排名，并且结合查阅文献得知的TE结构域催化三联体Ser 2308-His 2481-Asp2338；将可药性打分最高的活性口袋和附近的活性氨基酸确定为分子对接的受体蛋白与配体结合的三维搜索空间。表1和图2列出预测活性口袋的信息。
表1 由DoGSiteScorer预测的TE结构域的潜在活性口袋
Figure BDA0003368012650000211
分子对接
我们首先选取了仅由FDA批准的小分子化合物库(下文简称为FDA库)作为筛选对象，进行了2113次分子对接；此后，我们又选取了经FDA在内的多个监管机构所批准的药物组成的化合物库(下文简写为World库)作为筛选对象，进行了6289次分子对接，化合物结构文件均来源于用于虚拟筛选的数据库ZINC 15(Irwin et al.,2012,Sterling and Irwin,2015)。
本实验是通过AutoDock 4.2软件中的拉马克遗传算法(Lamarckian GeneticAlgorithm，LGA)进行半柔性分子对接；使用PyMOL软件对受体进行除水以及其他小分子，设置TE对接中心为(-2.626、62.794、52.717)，设置大小为
Figure BDA0003368012650000212
的覆盖了活性位点氨基酸及周围表面部分的网格。选择刚性受体和柔性配体，运行AutoDock程序得出结果。
表2和表3分别为FDA库和World库中结合能打分前十的配体化合物。其中Adapalene(阿达帕林)在FDA库中结合能最低，在World库结合能打分第二，由于化合物Cgp74588未能找到购买途径，且用于后期体外细胞实验验证的商品化Adapalene易购买到，因此我们将此作为最有希望开发为FASN抑制剂的药物，并且我们还购买了FDA库中打分次之的三个化合物Celecoxib(塞来昔布)、Alectinib(阿来替尼)、Lumacaftor(卢马卡托)作为对比，图3为筛选得到的四种化合物的结构示意图。
Adapalene为第三代含芳烃的维甲酸类药物(Krautheim and Gollnick,2003)，其副作用小于维甲酸(Spilovska et al.,2016,Waugh et al.,2004)；用于治疗痤疮，经文献调研显示，Adapalene的抗增殖作用还可用于某些癌症的治疗(Ocker et al.,2003,Li etal.,2019,Wang et al.,2020)，如直肠癌(DiSilvestro et al.,2001)、宫颈内皮癌等(Ocker et al.,2003)，此外，还报告了口服Adapalene和其他活性药物成分的新型治疗组合，也具有良好的疗效(Unal,2018,Janani et al.,2019,Bakr et al.,2020,Hayashi andKawashima,2012)；Adapalene的化学结构可能作为研究和开发用于不同治疗领域的新化合物的基础，如抗癌治疗、神经保护、抗菌治疗、免疫调节等；Celecoxib是一种非甾体抗炎药物，用于缓解风湿关节炎和急性疼痛；另有研究表明，Celecoxib的使用与许多类型癌症，特别是乳腺癌的发生和发展的降低有着密切的联系，有望成为抗肿瘤治疗的候选药物；Alectinib是一种第二代ALK特异性抑制剂，用作治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌；Lumacaftor是用于治疗罕见性囊性纤维化的药物，具有改善肺功能、减轻肺恶化以及其他益处。
使用PyMOL软件进行可视化，选择构象最佳的对接结果经Discovery StudioVisualizer软件分析其与氨基酸残基的结合模式，图4表明Adapalene可与TE结构域的活性氨基酸Ser 2308以及Leu 2222、Ile 2250、Glu 2251、Tyr 2347、Tyr 2351、Phe 2370、Glu2374、Phe 2423、Leu 2427形成疏水相互作用，并与氨基酸Tyr 2347、Tyr 2351、Phe 2370形成π-π堆积。
表2 FDA库中结合能最低的十个化合物
Figure BDA0003368012650000231
表3 World库中结合能最低的十个化合物
Figure BDA0003368012650000232
Figure BDA0003368012650000241
需要注意的是图4中的(A)、(B)、(C)、(D)分别为由Discovery Studio Visualizer显示的人脂肪酸合酶的TE结构域的氨基酸残基与配体小分子Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor之间的相互作用，(E)为Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域活性口袋的相对位置示意图。
分子动力学模拟
为了进一步了解蛋白质和配体之间的相互作用，我们选择分子对接中最可靠的结合姿势作为起始结构，并通过Gromacs 2018.8软件进行分子动力学模拟；该系统利用CHARMM36力场，通过Avogadro软件加氢后由CGenFF(Vanommeslaeghe et al.,2010,Yu etal.,2012)生成配体拓扑；将配体和蛋白质置于立方体水盒子中并添加相应数目的抗衡离子以使系统保持电中性，使用最速下降算法进行10000步以最小化系统的能量，消除蛋白质-配体复合物的任何有害接触和空间碰撞，然后我们依次进行5ns NVT，5ns NPT模拟及50ns无限制分子动力学模拟。
Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域复合物体系的RMSF分析
Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域复合物体系的RMSF分析可反应结构域的氨基酸残基的稳定和柔性区域，曲线上波动较大的区域通常为无规则卷曲结构，而配体小分子与之结合的催化区域的氨基酸残基通常波动相对较小，包括活性氨基酸Ser 2308在内的与Adapalene相互作用的TE结构域氨基酸RMSF波动较小，因此其相互作用或者其所在区域可能相对稳定，具体参照图5所示。
Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域复合物体系的接触对信息
如图6所示，在50ns的分子动力学模拟过程中，Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域接触频率最高的十个氨基酸残基及其接触频率分别为Leu 2427(0.93413)、Ile 2250(0.92814)、Phe 2370(0.92615)、Leu 2222(0.89222)、Phe 2423(0.89222)、Glu 2251(0.88024)、Gln 2374(0.87824)、Tyr 2347(0.85828)、Phe 2375(0.8503)、The 2348(0.83433)；此外，Adapalene还和TE结构域催化三联体中的两个氨基酸His 2481和Ser2308发生相互作用，其接触频率分别为0.06986和0.06587。
MM/PBSA结合自由能计算及能量分析
通过计算结合自由能可得知，在Adapalene与TE结构域复合物体系中范德华力△Evdw的贡献较大，有助于受体蛋白与配体小分子Adapalene的结合，非极性溶剂化能△ESASA次之，静电相互作用的贡献较弱，而极性溶剂化能△EPB为正值，溶剂化作用对复合物结合具有一定的阻碍作用(表4)；图7(A)显示在50ns的分子动力学模拟过程中，MM/PBSA结合自由能波动范围不大，较为稳定，在计算结合自由能后，将结合自由能分解至每个氨基酸残基中以探究Adapalene与TE结构域中各个残基之间的能量差异，如图7(B)其中能量贡献前十的氨基酸残基及其结合自由能分别为Phe 2423(-8.5797kJ/mol)、Ile 2250(-8.1315kJ/mol)、Phe 2370(-8.0283kJ/mol)、Tyr 2347(-5.3743kJ/mol)、Leu 2427(-4.6133kJ/mol)、Phe 2371(-2.6634kJ/mol)、Leu 2222(-2.3518kJ/mol)、Phe 2375(-2.1127kJ/mol)、Ala2367(-2.047kJ/mol)、Tyr 2351(-1.9946kJ/mol)。
表4 Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域的MM/PBSA结合自由能
Figure BDA0003368012650000251
Figure BDA0003368012650000261
需要注意的是图7中(A)Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域的结合自由能随时间的变化；(B)Adapalene与人脂肪酸合酶TE结构域的结合自由能的分解。
细胞实验
四种化合物对两株乳腺癌细胞的细胞活力的影响
通过对受体蛋白的潜在口袋进行预测和查阅其活性氨基酸位点，并以此作为对接区域进行分子对接，选取结合能最低的四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor，通过设置11个从0μM到100μM的药物浓度，测定针对MDA-MB-231和MCF-7两株乳腺癌细胞株细胞活力的抑制情况；如图8所示，对于MDA-MB-231细胞株，Adapalene、Celecoxib、Lumacaftor三种药物对于两株细胞的细胞活力的抑制依次减弱，其IC50值分别为14.7μM、75.4μM、79.2μM；对于MCF-7细胞株，三种药物处理后细胞活力减弱，其半抑制浓度依次增加，Adapalene的IC50为13.3μM、Lumacaftor的IC50为56.4μM、Celecoxib的IC50为71.0μM；此外，Alectinib对细胞活力的影响最弱，处理后，两种乳腺癌细胞株的IC50均100μM以上。
需要注意的是图8中的(A)不同浓度的四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor处理MDA-MB-231细胞株24h后，利用MTT检测细胞活力；将对照组数据归一化，实验数据源自3次独立重复试验结果，数据为平均值±标准差；(B)不同浓度的四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor处理MCF-7细胞株24h后，利用MTT检测细胞活力。将对照组数据归一化，实验数据源自3次独立重复试验结果，数据为平均值±标准差。四种化合物对两株乳腺癌细胞FASN表达量的影响。
通过蛋白质免疫印迹检测同一药物浓度下的Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor四种药物是否针对FASN的表达量具有抑制作用，结果如图9(A,B)所示，15μM药物浓度的Adapalene对MDA-MB-231和MCF-7细胞内FASN表达水平的抑制最为显著，之后依次为Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor，结果与分子对接结果一致；并且如图9(C,D)所示，Adapalene对于两株细胞株FASN表达水平的抑制作用呈浓度梯度依赖性。
需要注意的是图9中(A)15μM浓度的四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor处理MDA-MB-231和MCF-7细胞株24h后，利用免疫印迹实验检测细胞内FASN的表达水平；(B)B为A蛋白结果定量图。将对照组数据归一化，实验数据源自3次独立重复试验结果，数据为平均值±标准差；(C)不同浓度的Adapalene处理MDA-MB-231和MCF-7细胞株24h后，利用免疫印迹实验检测细胞内FASN的表达水平；(D)为C中蛋白表达水平做定量处理，对照组数据归一化，数据为平均值±标准差。
Adapalene抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞内FASN酶活力
前述的分子对接实验中得到了结合能最低的化合物Adapalene，为验证Adapalene是否为潜在的FASN抑制剂，进行FASN酶活性检测实验；如图10所示，经不同浓度Adapalene(0,5,10,15,20μM)处理MDA-MB-231和MCF-7两种细胞株24h后，NADPH的氧化速率呈浓度依赖降低，FASN酶活性呈浓度依赖降低，说明Adapalene对于两种细胞株的FASN活力均有抑制作用，但是相对于MDA-MB-231细胞株，Adapalene对于MCF-7细胞株的胞内FASN活力的抑制效果更为显著，其IC50值约为15～20μM；由于前述实验显示经Adapalene处理后的细胞与对照组的细胞活力产生显著性差异，因此也间接证明了FASN活力对于维持癌细胞存活的重要性。
需要注意的是图10中配制Adapalene药物梯度，用以处理MDA-MB-231和MCF-7细胞株，细胞经药物处理24h后，使用NADPH氧化法检测细胞内FASN酶活；(A)单位时间内处理组相对于对照组氧化NADPH的百分率；(B)处理组的细胞内FASN酶活性的抑制水平以相对于对照组酶活性下降的百分比表示。
Adapalene抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞株的增殖
当细胞倾向于存活和增殖而不是细胞死亡时，就会导致稳态的失衡，而这种失衡是癌症产生的开端，因此当我们在筛选潜在抗癌药物时，Adapalene对肿瘤细胞的增殖是否具有抑制作用是我们探究的首要问题，通过检测与掺入细胞DNA中的EdU形成共价反应的荧光探针标记的叠氮化合物Azide，如图11所示，单位时间内细胞新合成的DNA随给药浓度的增加而明显减少，表明细胞的增殖受到显著抑制；其中，5μM药物浓度处理的细胞的荧光强度Azide 594相对于对照组显著减弱，但被荧光标记的细胞数量却有所增加，初步推测低浓度给药时，依然有部分细胞进入DNA合成期。
需要注意的是图11中(A)不同浓度的Adapalene处理MDA-MB-231细胞株24h后，使用EdU检测法检测药物对细胞增殖的影响；(B)不同浓度的Adapalene处理MCF-7细胞株24h后，使用EdU检测法检测药物对细胞增殖的影响。
Adapalene诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞的凋亡
前述实验已证明Adapalene可抑制细胞的增殖，而细胞凋亡作为一种细胞死亡形式，在整个进化过程中高度保守，是维持细胞生存与死亡平衡、预防癌症和相关疾病的重要机制，凋亡途径的缺陷最终可能导致肿瘤细胞的繁殖，也是积极治疗癌症的一大障碍，因此诱导癌细胞凋亡，限制正常细胞并发死亡是癌症治疗的首要目标。
在本研究中，使用不同方法检测两种乳腺癌细胞的凋亡水平，分别经过不同浓度(0,10,20,30μM)的Adapalene处理24h；如图12(A)所示，随着Adapalene药物处理浓度增加，乳腺癌细胞中的凋亡蛋白PARP的剪切水平逐步提高，与此同时抗凋亡蛋白Bcl-2也显著降低，其中两种乳腺癌细胞株在Adapalene给药浓度达到20μM时，PARP的剪切情况和Bcl-2的减少均已极为明显；正常生理状态下，细胞膜的磷脂酰丝氨酸位于膜内侧，细胞进入早凋时期时，其开始出现外翻现象，Annexin V是一种可与PS发生结合的磷脂结合蛋白，进而被FITC标记可显示为绿色荧光；首先，通过荧光显微镜观察可反映凋亡状况的荧光染色情况，如图12(B)所示，激发细胞中的绿色荧光，随着Adapalene药物处理浓度增加，观察到其强度有显著地增强，表明越来越多的癌细胞发生了早凋；细胞晚期凋亡时，细胞膜的选择透过性降低，碘化丙啶可以透过处于凋亡晚期或者已经发生坏死的细胞的细胞膜，碘化丙啶可嵌入DNA中，在激发光的激发下呈现出红色荧光，随给药浓度增加，图B中所示的红色荧光逐渐显著，因此红光和绿光的增加表明越来越多的细胞发生了凋亡；此外，图12(C)通过流式细胞仪的定量分析得知早凋和晚凋细胞呈药物浓度依赖性增加，其中，在25μM给药浓度时，MDA-MB-231中处于早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例分别为17.5％和34.6％，在30μM的给药浓度处理后，而MCF-7中处于早期凋亡和晚期凋亡状态的细胞更是分别达到了19.4％和56.0％。
综合以上凋亡蛋白表达水平、荧光观察和流式检测结果，Adapalene的处理，可引起乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白表达量的变化，凋亡蛋白表达量显示出明显的增加，与此同时，抗凋亡蛋白表达水平出现大幅度的降低，并且细胞凋亡状况的增加具有药物浓度依赖性的特点，证明，已上市的Adapalene药物确实对乳腺癌细胞具有非常显著地促进细胞凋亡的效果。
需要注意的是图12中(A)不同浓度的Adapalene处理MDA-MB-231和MCF-7细胞株24h后，使用蛋白质免疫印记检测细胞内凋亡蛋白PARP以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平；(B)利用荧光染料AnnexinⅤ-FITC-PI进行染色处理，利用显微镜荧光激发模式，呈现细胞中PS和DNA的标记情况；(C)利用流式细胞术对两种乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中不同凋亡情况的细胞进行聚类。
Adapalene抑制两株乳腺癌细胞株的细胞周期
在机体中出现肿瘤时，一个显著的特征是癌细胞的细胞周期出现异常，所以，对于肿瘤细胞的细胞周期的进程具有干扰作用的药物，也是防治癌症药物开发的思路之一；如图13所示，两个主峰分别为G0/G1期和G2/M期细胞，处于两主峰之间的为正在进行DNA复制的S期细胞；如图所示，从S期到G2/M期的转换的抑制随药物浓度增加而增加，呈药物浓度依赖性。但在低药物浓度时，从G0/G1期到G2/M期转换的抑制并不显著，而当药物浓度增加至一定程度时，其转换开始逐渐受到抑制；前述细胞增殖实验现象与细胞周期实验结果相符，即低浓度时被荧光标记的细胞数量相对于对照组有所增加可能是由于G0/G1期到G2/M期的转换尚未受到显著抑制；此外，随Adapalene给药浓度的增加，MCF-7乳腺癌细胞株的细胞周期的抑制程度相较于MDA-MB-231更为显著，药物浓度达到15μM时，MCF-7细胞基本均阻滞在G0/G1期。
需要注意的是图13中MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞株使用浓度梯度的Adapalene处理，基于流式分析原理，检测乳腺癌细胞经过药物处理24h后其中的细胞周期进程的改变。
Adapalene抑制肿瘤细胞的侵袭转移
肿瘤细胞的侵袭转移是乳腺癌患者疾病复发和死亡的主要原因。根据之前的报道，敲除FASN可抑制细胞的转移和侵袭，所以，可抑制乳腺癌细胞FASN酶活和下调FASN表达量的化合物Adaplene也可能对乳腺癌细胞的侵袭和转移能力具有干扰抑制效果；我们是通过细胞划痕实验来检测乳腺癌细胞株侵袭转移能力的；如图14所示，划痕实验中，两种乳腺癌细胞种随给药浓度增加其转移能力而逐渐减弱，药物在MDA-MB-231和MCF-7两株细胞之间的效果无明显差异，其中，对照组和5μM给药浓度时，细胞具有向划痕中心愈合的趋势；达到10μM时，划痕界限几乎不变，细胞转移能力明显受到抑制；更高浓度时，由于部分乳腺癌细胞发生凋亡，划痕界限出现向两侧移动的趋势。
需要注意的是图14中浓度梯度的Adapalene处理两株乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7后，显微镜下观察向划痕中心愈合的情况。
Adapalene引起细胞的内质网应激
如图15所述，不同浓度的Adapalene加药处理MDA-MB-231和MCF-7两种乳腺癌细胞株24h后，内质网应激相关的免疫球蛋白结合蛋白BiP、转录因子CHOP以及UPR的三条通路上的关键蛋白PERK、IRE1、ATF6表达水平随药物浓度梯度均呈现不同程度地增加；这些结果证明Adapalene在人乳腺癌细胞中引起内质网应激，内质网应激是细胞对于外界刺激的一种保护性反应，内质网稳定状态的破坏会干扰分泌蛋白和膜蛋白修饰、折叠和组装的进程，与此同时内质网作为一个严格的质量控制系统会阻滞未折叠蛋白和错误折叠蛋白继续向高尔基体的囊泡转运，其进而使其聚集积累，此过程称之为未折叠蛋白反应UPR，除了促进折叠和不正确折叠蛋白降解，另一方面减少mRNA的持续翻译，可以在一定程度减轻内质网的压力，其稳定得到一定程度的恢复，但内质网应激的持续存在或加重会破坏其稳态，从而导致肿瘤细胞由从促生存状态转变为促凋亡状态。
需要注意的是图15中(A)不同浓度的Adapalene处理MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞株，利用基于蛋白质免疫印迹原理的Western Blotting实验，检测24h后其中与内质网应激相关蛋白(IRE1、BIP、PERK、ATF6、CHOP)的表达量的改变。(B)B为A蛋白结果定量图；将对照组数据归一化，实验数据源自3次独立重复试验结果，数据为平均值±标准差,*p＜0.05，**＜0.01，***＜0.001，****＜0.0001，ns表示无显著性差异。
总体结论：
本申请的实验试图选取FASN催化棕榈酸合成代谢中其关键作用的TE结构域作为对接目标，此外，待筛选的小分子化合物需要具有较大的选择范围和余地，且需要易于购买到纯度可得到保证的商品化化合物用于后续的体外细胞验证实验，因此，我们选取了药物安全性已得到充分验证的FDA库和World库作为筛选对象。
将分子对接所得结合能最低的化合物Adapalene作为本次潜在FASN抑制剂筛选的首要研究对象，并对其结合结果进行了分子动力学模拟；接下来，我们购买了包含Adapalene在内结合能最低的四种化合物进行了体外细胞实验验证，使用四种化合物处理乳腺癌细胞株，检测其细胞活力和FASN蛋白表达量，四种化合物Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor的抑制效果，Adapalene效果最强，与前期的分子对接结果一致，进而我们选取了效果最优的Adapalene进行下一步的实验，体外细胞实验结果表明，Adapalene对乳腺癌细胞株具有降低FASN酶活力，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期，抑制细胞侵袭转移，引起细胞内质网应激的作用，综合以上实验结果，Adapalene确实是潜在的可用于乳腺癌临床治疗的FASN抑制剂。
由于近20年已报道的低毒性且高活性的可用于药品开发的FASN抑制剂仍然非常缺乏，乳腺癌治疗和愈后效果不理想，抗癌药物的研发始终是癌症研究的重点领域；因此，科学家越来越聚焦于研发出对肿瘤有清除和抑制生长作用的FASN抑制剂。通过挖掘已上市药物的新适应症可大幅减少大量时间和资金成本，并通过分子对接和分子动力模拟等虚拟筛选手段大幅减少实验需要测试的化合物数量，大大缩短漫长的新药研发周期，降低研发成本并提高研发成功率，加速抗乳腺癌药物的研发进程，跨过安全性验证这道坎，也能更快地投入临床治疗，是抗癌FASN抑制剂的研发新思路和新方向。
其中，该牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法涉及的实验试剂包括有脂肪酸合成酶(FAS)活性检测试剂盒、BeyoClickTMEdU-594细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、免疫染色封闭液、免疫染色洗涤液、RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白分子量标准Marker、4％免疫组化固定液、丙烯酰胺(Acrylamide)、二硫叔糖醇(DTT)、噻唑蓝(MTT)、一抗稀释液、溴酚蓝、棕榈酸、Tween-20、无水甲醇、Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor、Tris-HCL、氯化钾、盐酸、乙醇、氯化钠、脱脂奶粉、胎牛血清、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、显影液、甘油、Trizma base、甘氨酸、二甲基亚矾(DMSO)、过硫酸铵(AP)、胰酶(无EDTA)、胰酶(含EDTA)、高糖培养液、PBS；
实验抗体包括有FASN Rabbit mAb、PARP Rabbit mAb、PERK Rabbit mAb、CHOPRabbit mAb、BiP Rabbit mAb、β-Actin Rabbit mAb、Anti-Bcl-2 antibody、Anti-Baxantibody、Anti-IRE1 antibody、Anti-ATF6 antibody、Anti-DDIT3 antibody、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP；
实验仪器包括有：电热恒温鼓风干燥箱、超声波细胞粉碎仪、电热恒温水浴锅、制冰机、金属恒温浴、恒温振荡器、低速离心机、涡旋混合器、超低温冰箱、电子分析天平、倒置生物显微镜、移液器、真空泵、圆周摇床、超净工作台、化学发光成像分析系统、台式冷冻离心机、多功能酶标仪、流式细胞仪、移液器、台式pH计、磁力搅拌器、智能正置荧光显微镜、二氧化碳培养箱、紫外可见分光光度计、倒置荧光显微镜、超纯水一体化系统。
其中里面关于实验试剂的具体制作手段为：
1)完全培养基
Figure BDA0003368012650000331
Figure BDA0003368012650000341
试剂配制在需无菌环境中操作，颠倒混匀后置于冰箱中4℃保存。
2)PBS
Figure BDA0003368012650000342
加入3.2L ddH20，pH调至7.4，定容至4L并灭菌。
免疫印迹相关试剂
1)SDS-PAGE分离胶(10％)
Figure BDA0003368012650000343
2)SDS-PAGE浓缩胶(5％)
Figure BDA0003368012650000344
Figure BDA0003368012650000351
3)1.5M Tris-HCl,pH 8.8
Figure BDA0003368012650000352
使用盐酸调节pH至8.8，定容至500mL，置于4℃保存备用。
4)1.0M Tris-HCl,pH 6.8
Figure BDA0003368012650000353
使用盐酸调节pH至6.8，定容至500mL，置于4℃保存备用。
5)10％SDS
Figure BDA0003368012650000354
50℃水浴溶解，室温保存。
6)10％过硫酸铵
Figure BDA0003368012650000355
涡旋混匀后可分装至2mL离心管中，置于-20℃保存备用。
7)5×电泳缓冲液
Figure BDA0003368012650000361
使用时需用超纯水稀释5倍。
8)5×转膜缓冲液
Figure BDA0003368012650000362
9)1×转膜缓冲液
Figure BDA0003368012650000363
10)10×TBS
Figure BDA0003368012650000364
加入适量超纯水，待其完全溶解后，使用浓盐酸调节pH至7.5，定容至2L。
11)TBST
Figure BDA0003368012650000371
12)4×上样缓冲液
Figure BDA0003368012650000372
充分混匀后置于-20℃保存备用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：该分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法具体操作步骤如下：
S1、分子对接；
S2、分子动力学模拟；
S3、细胞活力检测-MTT法；
S4、蛋白质免疫印迹；
S5、细胞周期检测；
S6、细胞增殖检测；
S7、细胞凋亡检测；
S8、细胞划线实验；
S9、细胞内FASN酶活检测；
S1步骤中分子对接具体操作步骤如下：
1)使用Openbabel软件将自ZINC网站打包下载的文件拆分成多个含单个小分子化合物的配体mol2文件；
2)批量创建文件夹，并按数字序号依次命名；
3)批量将配体放入文件夹中，并将配体统一命名；
S2步骤中分子动力学模拟具体操作步骤如下：
拓扑文件准备
1)在Linux环境下安装Gromacs软件，下载CHARMM36力场并置于工作目录下；
2)使用PyMOL软件检查受体pdb文件，去除可能包含的结晶水和小分子配体等结构并置于工作目录；
3)通过pdb2gmx指令生成将受体gro、top、itp拓扑文件；
4)配体拓扑文件的准备
5)使用Avogadro程序将配体pdb文件添加氢原子并生成mol2文件；
6)借助sort_mol2_bonds.pl脚本修正配体mol2文件；
7)通过CGenFF将配体mol2文件转换为str文件；
8)借助cgenff_charmm2gmx.py脚本将str文件转化为itp、prm、top、pdb等文件；
蛋白质受体复合体的构建
1)通过editconf指令将配体pdb文件转换成gro文件；
2)将配体的坐标信息添加到受体gro文件；
3)将配体的拓扑信息写入受体topol.top文件，并在molecules部分添加配体信息；
定义盒子并添加溶剂
1)通过editconf指令将复合体放入盒子中，并将复合物与盒子边界的最小距离设定为1.0nm；
2)通过solvate指令在盒子中添加水分子；
3)将ions.mdp置于工作目录，通过grompp和genion指令往盒子中添加离子平衡体系中的电荷；
能量最小化
1)将em.mdp置于工作目录，通过grompp和mdrun指令使体系的能量最小化；
2)平衡
3)通过make_ndx指令给配体创建一个包含氢原子之外所有原子的索引组；
4)通过genrestr指令输出配体施加位置限制的itp文件；
5)将itp文件写入受体topol.top文件；
热浴
1)将nvt.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令执行NVT平衡；
2)将npt.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令执行NPT平衡；
正式模拟
1)将md.mdp置于工作目录中，通过grompp和mdrun指令运行50ns MD模拟。
2.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S3中的细胞活力检测-MTT法具体操作步骤如下：
1)待96孔板中细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清DMEM处理细胞24h，每个药物浓度重复6孔；
2)提前将MTT和DMSO配制5mg/mL的MTT溶液；
3)按照9:1的比例将无血清培养液和MTT溶液(5mg/mL)配制成0.5mg/mL混合液；
4)弃培养液，每孔加入PBS清洗，每孔加入100μL混合液；
5)37℃恒温培养1h；
6)弃混合液，每孔加入并吹打100μL DMSO；
7)使用酶标仪测492nm处吸光值。
3.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S4中蛋白质免疫印迹具体操作步骤如下：
蛋白样品制备
1)将细胞接至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h，每个药物浓度重复3孔；
2)PBS洗涤细胞，加入120μL裂解液，刮取至离心管；
3)冰上超声4min；
4)4℃离心，上清液移至新离心管中。
5)BCA法测定蛋白浓度并调平；
6)按比例加入4×Loading Buffer，95℃煮样10min，样品可放置于-20℃保存；
电泳
1)配制SDS-PAGE分离胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1.5M Tris-HCL(pH8.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，每个制胶板加入7mL分离胶，加水补齐，等待凝固；
2)配制SDS-PAGE浓缩胶：随后按照凝胶配方配制ddH2O、30％AB、1M Tris-HCL(pH6.8)、10％AP、TEMED并涡旋混匀，倒掉制胶板中的水，加浓缩胶补齐，并插梳子，等待凝固；
3)配制1×Running Buffer：将5×Running Buffer和超纯水按1:4比例稀释并颠倒混匀；
4)将制胶板置于电泳槽，加1×Running Buffer，拔梳子，每孔加适量Marker或样品；
5)电泳：恒压80V电泳30min，再调至120V电泳使条带跑至凝胶底部；
转膜
1)配制1×Transfer Buffer：5×Transfer Buffer、无水甲醇和超纯水按1:1:3比例稀释并颠倒混匀；
2)剪膜：PVDF在甲醇中浸泡激活；
3)转膜：海绵和三层滤纸放置在转膜夹上，经Transfer Buffer浸泡，将凝胶放置在转膜夹的黑色部分并将膜覆于其上，夹上转膜夹，插入槽中，恒流250mA转膜2.5h左右使样品从凝胶充分转移至膜上；
孵育抗体
1)洗膜：提前稀释10×TBS溶液至1×TBST溶液，待转膜完毕后，用1×TBST溶液摇床清洗3次，每次10min；
2)封闭：按每20mL TBST加入1g脱脂奶粉的比例提前配制封闭液，并将膜放入封闭液，37℃摇床1h；
3)孵育一抗：用一抗稀释液稀释一抗，将膜置于一抗孵育液；4℃孵育过夜；
4)洗膜：TBST洗膜3次；
5)孵育二抗：膜放入含二抗的封闭液中，37℃摇床1h；
6)洗膜：TBST洗膜3次；
显影
1)配制ECL发光液：两种溶液按1:1比例混合；
使用曝光机显影，选择ImageLab软件的印迹Chemi选项，曝光前均匀滴加160μL发光液，得到条带后使用ImageJ软件定量分析条带的灰度值并使用GraphPad Prism软件作图，每个实验重复三次。
4.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S5中的细胞周期检测具体操作步骤如下：
1)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
2)吸取六孔板中的DMEM至2mL离心管，300μL胰酶消化贴壁细胞5min，并用1mL刚才吸取的DMEM吹打收集细胞；
3)4℃离心，留沉淀；
4)PBS重悬细胞，4℃离心，弃上清；
5)细胞固定：70％乙醇，-20℃固定12h；
6)4℃离心，弃上清；
7)PBS重悬，4℃离心，弃上清；
8)按试剂盒说明配制碘化丙啶染色液；
9)染色液重悬细胞，37℃避光孵育30min；
10)流式检测：488nm检测红色荧光；
11)使用ModFit拟合分析。
5.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S6中的细胞增殖检测具体操作步骤如下：
1)提前自备固定液(4％甲醛)、洗涤液、通透液；
2)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
3)配制2×EdU工作液(即20μM)：EdU(10mM)和无血清培养液按1:500比例稀释；
4)每孔吸除1mL培养液并加入1mL 37℃预热好的2×EdU工作液(20μM)，37℃孵育2h；
5)去除培养液，固定液室温固定15min；
6)去除固定液，使用洗涤液、通透液洗涤细胞多次；
7)配制Click Additive Solution：用去离子水溶解Click Additive，混匀至溶解；
8)配制Click反应液：需按顺序依次加入Click Reaction Buffer、CuSO4、Azide 594、Click Additive Solution；
9)去除洗涤液，加入反应液，避光孵育30min；
10)洗涤液洗涤细胞3次；
11)配制1×Hoechst 33342溶液：Hoechst 33342(1000×)和PBS按1:1000比例稀释；
12)加入Hoechst 33342溶液，避光孵育；
13)洗涤液洗涤细胞3次；
14)荧光显微镜检测：Azide594激发光590nm，发射光615nm；Hoechst33342激发光346nm，发射光460nm。
6.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S7中的细胞凋亡检测具体操作步骤如下：
1)将细胞接种至六孔板，待细胞密度长至70％～80％，加入含不同药物浓度的无血清培养液处理细胞24h；
2)收集培养液至离心管，胰酶消化贴壁细胞5min，并用1mL刚才吸取的培养液吹打消化后的细胞至单细胞状态并汇入离心管，1100g，4min，4℃离心；
3)用0.5mL PBS，1100g，4min，4℃离心洗涤细胞2次；
4)Annexin V-FITC结合液重悬细胞；
5)依次加入Annexin V-FITC、PI；
6)流式检测：分别选用FITC/PE或FL1/FL2通道；
7)荧光显微镜检测：细胞悬液滴至载玻片，盖盖玻片进行观察。
7.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S8中的细胞划线实验具体操作步骤如下：
1)待六孔板细胞密度长至70％～80％；
2)并每孔使用1mL枪头在六孔板底部的细胞中划三条直线，并用PBS清洗掉漂浮细胞；
3)每孔加入含不同药物浓度DMEM处理细胞，荧光显微镜拍照记录；
4)放置在培养箱中37℃恒温培养24h，再次使用荧光显微镜拍照记录。
8.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：S9中的细胞内FASN酶活检测具体操作步骤如下：
1)待培养皿中细胞密度长至70％～80％，不同药物浓度处理细胞24h；
2)分光光度计预热，用蒸馏水调零；
3)PBS清洗细胞后，使用细胞刮刀刮取细胞；
4)冰浴超声3min；
5)4℃离心，取上清；
6)将上清液、乙酰CoA、丙二酰CoA、NADPH等底物加入比色皿，混匀后测定340nm吸光值；
7)剩余的蛋白样品使用BCA法测定总蛋白浓度；
8)利用单位时间内340nm光吸收下降速率和样品的蛋白浓度计算FASN的酶活力。
9.根据权利要求1的基于分子对接和分子动力模拟筛选的药物化合物库中的潜在FASN抑制剂试验方法，其特征在于：该牡丹籽粕单体化合物中的FASN抑制剂实验方法涉及的实验试剂包括有脂肪酸合成酶(FAS)活性检测试剂盒、BeyoClickTMEdU-594细胞增殖检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、免疫染色封闭液、免疫染色洗涤液、RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白分子量标准Marker、4％免疫组化固定液、丙烯酰胺(Acrylamide)、二硫叔糖醇(DTT)、噻唑蓝(MTT)、一抗稀释液、溴酚蓝、棕榈酸、Tween-20、无水甲醇、Adapalene、Celecoxib、Alectinib、Lumacaftor、Tris-HCL、氯化钾、盐酸、乙醇、氯化钠、脱脂奶粉、胎牛血清、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、显影液、甘油、Trizma base、甘氨酸、二甲基亚矾(DMSO)、过硫酸铵(AP)、胰酶(无EDTA)、胰酶(含EDTA)、高糖培养液、PBS；
实验抗体包括有FASN Rabbit mAb、PARP Rabbit mAb、PERK Rabbit mAb、CHOP RabbitmAb、BiP Rabbit mAb、β-Actin Rabbit mAb、Anti-Bcl-2antibody、Anti-Bax antibody、Anti-IRE1 antibody、Anti-ATF6 antibody、Anti-DDIT3 antibody、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP；
实验仪器包括有：电热恒温鼓风干燥箱、超声波细胞粉碎仪、电热恒温水浴锅、制冰机、金属恒温浴、恒温振荡器、低速离心机、涡旋混合器、超低温冰箱、电子分析天平、倒置生物显微镜、移液器、真空泵、圆周摇床、超净工作台、化学发光成像分析系统、台式冷冻离心机、多功能酶标仪、流式细胞仪、移液器、台式pH计、磁力搅拌器、智能正置荧光显微镜、二氧化碳培养箱、紫外可见分光光度计、倒置荧光显微镜、超纯水一体化系统。
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