CN114150046A - 一种低深度高通量单细胞基因变异检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种低深度高通量单细胞基因变异检测方法，将单细胞分离、裂解后，直接用转座酶进行片段化，同时连接测序接头，然后进行文库扩增和纯化。全部实验过程可以在一个试管中完成，极大的提高了单细胞建库的实验通量。
Description
技术领域
本发明涉及一种低深度高通量单细胞基因变异检测方法，属于基因测序领域。
背景技术
基因拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)是DNA的一种结构变异，它描述的是基因组上的片段拷贝数发生增加或者减少的现象。CNV的形成有NAHR、NHEJ、FoSTeS或逆转录转座四种机制。为了研究CNV，无论是在全基因组尺度上还是对于目标位点检测，有许多方法已经被开发出来。其中，单细胞全基因组扩增技术与二代测序技术的结合使得终于能观察到单细胞水平的CNV。不过单细胞全基因组扩增技术不是完美的，受限于扩增的均匀度问题，目前这个方法能看到的CNV分辨率还不高，同时整个过程的略微繁琐也限制了细胞通量的提高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明开发了单细胞直接建库方法，不仅提高了单细胞建库的均匀度，还大大增加了一次实验的细胞通量，与测序技术相结合实现了单细胞基因变异的低深度高通量检测。
具体的，本发明提供一种低深度高通量单细胞基因变异检测方法，其特征在于包括以下步骤：
制备单细胞悬液；
利用荧光激活细胞分选法将单细胞分选到细胞培养孔板的每一个孔中；
在孔中进行裂解反应，待裂解结束后加入转座酶(Tn5)反应混合液，将DNA片段化的同时在末端接上接头；
片段化产物经N5和N7引物进行扩增；
扩增产物纯化后作为测序文库；
测序获得基因变异信息。
根据优选的实施方式，所述细胞包括小鼠细胞系3T3、人血液淋巴细胞、GM12871、GM12891、HEK293、HeLa等。
根据优选的实施方式，所述扩增为RPA、RAA、桥式扩增、PCR中的一种。
根据优选的实施方式，所述细胞培养孔板为96孔板。
根据优选的实施方式，扩增产物纯化后的扩增文库使用Fragment Analyzer分析，根据文库中引物二聚体含量多少和DNA片段长度分布是否均匀来判断文库质量优劣。
根据优选的实施方式，所述细胞培养孔板的每一个孔中有预先加好的细胞裂解液。
根据优选的实施方式，所述裂解反应所使用的裂解酶选自蛋白酶和蛋白酶K中的至少一种。
根据优选的实施方式，制备单细胞悬液的时候，将多种细胞样品分别制备细胞悬浮液。
根据优选的实施方式，将单细胞悬液使用BD FACSAriaIII流式细胞仪根据FSC和SSC选择单细胞，并分选到细胞培养孔板的每一个孔中。
根据优选的实施方式，每一个孔中有一个细胞。
本发明公开了一种单细胞直接建库的方法，将单细胞分离、裂解后，直接用转座酶进行片段化，同时连接测序接头，然后进行文库扩增和纯化。全部实验过程可以在一个试管中完成，极大地提高了单细胞建库的实验通量。
本发明的优点在于：不需要进行单细胞基因组DNA的预扩增，减少了实验时间、成本，避免了单细胞预扩增产生的偏向性；利用转座酶反应高效的特点，省略文库定量过程，节约实验时间；同时利用序列标记区分单细胞，实现上百个文库混合后纯化，极大地提高了建库通量。
附图说明
图1.单细胞直接建库流程图；
图2.蛋白酶抑制剂在不同浓度下的实验效果；
图3.HeLa单细胞直接建库样品与eWGA、Bulk的1M bin CNV；
图4.淋巴单细胞直接建库样品与DOP-PCR、Bulk的1M bin CNV。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的核心内容，现将本发明用下面的例子作为说明。实施例是为了进一步解释发明内容部分，并不对于本发明造成限制。
举例的，使用人的GM12891细胞系，细胞培养液经过500g 5分钟的离心获得细胞沉淀，使用PBS溶液清洗2次后，用含有1％BSA的PBS溶液重悬得到单细胞悬液。
使用BD FACSAriaIII流式细胞仪根据FSC和SSC选择单细胞，并分选到96孔板中。96孔板中的每个孔预先加好2μL单细胞裂解液(30mM Tris-HCl(pH＝8.0),10mM NaCl,0.2μL蛋白酶K(Qiagen,19133)，5mM EDTA和0.5％Triton X-100)。分选完成后将96孔板以2000rpm离心1分钟，确保细胞进入裂解液。然后将96孔板放入PCR仪或恒温烘箱，50℃裂解3小时，释放基因组DNA。裂解结束后，直接加入10μL转座酶反应混合液(1×TD缓冲液，0.015μL Tn5转座酶TTE Mix V50(Vazyme,TD501)，0.625×蛋白酶抑制剂(Promega,G6521)，1mMMgCl2)，55℃反应1小时，此时基因组DNA被转座酶打断，并连接上测序接头。反应结束后，加入12μL含有N5和N7标记的引物的PCR反应液(11μL Q5 High-Fidelity2×Master Mix，10mMN5和N7标记引物各0.5μL)，进行文库扩增。扩增反应为72℃8min预反应，98℃30s变性DNA，24个循环的扩增(98℃15s，60℃30s，72℃90s)，最后72℃5min完整延伸DNA。PCR完成后，使用1×磁珠(VAHTS DNA clean beads(Vazyme,N411))进行DNA纯化。最后使用FragmentAnalyzer分析文库，根据文库中引物二聚体含量多少和DNA片段长度分布是否均匀来判断文库质量优劣。
整个建库过程在96孔板中进行，如图1所示。实验流程包括首先制备单细胞悬液；然后利用荧光激活细胞分选法(Fluorescence activated cell sorting,FACS)将单细胞分选到孔板的每一个孔中，每一个孔中含有预先加好的单细胞裂解液；接着进行裂解反应，待裂解结束后加入转座酶(Tn5)反应混合液，实现DNA片段化的同时末端接上接头(这一过程被称为Tagmentation)；下一步，片段化产物经N5(N5XX)和N7(N7XX)引物通过PCR扩增；最后，扩增产物纯化后即为可测序文库。文库的质检使用Fragment Analyzer通过分析片段长度分布，从而判断文库质量优劣。
由于转座酶只能对DNA双链进行打断和插入片段，所以裂解单细胞的方式选择酶裂，即利用活性剂破细胞膜，利用蛋白酶水解组蛋白，把双链DNA完全释放出来。裂解酶的选择有蛋白酶和蛋白酶K两种。蛋白酶K是从腐生菌Tritirachium album中提取的一种枯草杆菌蛋白酶，蛋白酶是从重组Bacillus菌株中提取的一种丝氨酸蛋白酶。两种酶最大的区别在于蛋白酶可以在70℃、30min的条件下被失活，而蛋白酶K不能被热失活，必须加蛋白酶抑制剂失活。在只改变裂解酶的情况下，同一类细胞，相同测序深度下做出来的在200k bin参数下的表现结果为：用蛋白酶K裂解的细胞CNV质量更高，说明蛋白酶K的裂解效果更好，释放DNA更充分，使得Tn5能更均匀地作用在基因组上，从而获得更均匀的PCR效果。
由于蛋白酶K的失活必须使用蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂的使用浓度理论上是根据产品说明书上要求的使用。但是在实验过程中发现，因为蛋白酶抑制剂是溶解在DMSO里面的，DMSO的存在也许会影响到Tn5的正常工作，所以如果蛋白酶抑制剂多加会对下游Tagmentaion造成影响，如果蛋白酶抑制剂加少了则不能充分失活蛋白酶K，未失活的蛋白酶K也会水解掉下游反应的酶。为了找到最适合的蛋白酶抑制剂浓度，设了3个梯度，分别为4.2×、2.5×和0.625×。结果如图2所示，0.625×的蛋白酶抑制剂就足以充分失活蛋白酶K，并且不会对下游反应造成影响，展现出稳定的表现。因此蛋白酶抑制剂的浓度控制在0.625×是比较好的选择。
通过实验发现，随着Tn5浓度的变化片段会略微变短，但都是适合用于做二代测序的片段长度。虽然从片段长度分布上看库的质量都不错，但是CNV质量还是有差别。在加入0.006μL或0.015μL的Tn5酶原液后，所取得的建库效果是相较于加0.003μL的酶原液更好的。
如前所述，哺乳单细胞中只含有约6pg的DNA原料，这样少的DNA对直接PCR带来了挑战。一方面原料很少的情况很容易过度扩增引物二聚体，对后续测序带来很大麻烦；另一方面，从单细胞起始需要扩增的倍数比较多，要求PCR酶既能保证一定的扩增均匀度并且要有高保真度。为了找到一种最适宜的酶，测试了三种PCR酶，分别是KAPA HiFi DNAPolymerase(以下简称KAPA)、Q5 High-Fidelity DNA Polymerases(以下简称Q5)和VazymeTruePrep Amplify Enzyme(以下简称TAE)，这三种酶都是目前被用于建库PCR的高保真PCR酶。比较三种酶扩增后的产物片段分布，能得到结论是Q5相较于其他两种酶几乎不会扩增出引物二聚体，最适宜用于单细胞直接建库的PCR。
本发明的单细胞直接建库方法因为摒弃了传统预扩增的步骤，所以理论上能减少单细胞库的扩增偏倚，获得更均匀的扩增效果。为了评估的扩增均匀性，使用人的细胞系HeLa，分别用单细胞直接建库的方法、eWGA预扩增再建库两种方法进行单细胞建库，同时与用大量HeLa细胞提取基因组DNA(bulk DNA)直接建库的结果来比较。如图3所示分别是eWGA扩增再建库、单细胞直接建库和大量细胞DNA直接建库的1M bin的CNV图。需要指出的是，eWGA样品和bulk DNA样品测序深度是3M测序读段，而单细胞直接建库样品的测序深度是300k测序读段。在测序深度相差10倍的情况下单细胞直接建库样品的扩增均匀度明显好于用eWGA预扩增再建库的样品。同时，在相同300k测序读段的测序深度下，单细胞直接建库样品的CNV质量与bulk样品相比几乎没有区别。
DOP-PCR因为扩增均匀的特点被广泛用于哺乳动物单细胞的CNV检测，特别是研究癌症细胞的CNV图谱，DOP-PCR在前些年几乎被认为是“最好”的方法。从人外周血单核细胞(PBMC)中分出淋巴单细胞，来比较DOP-PCR方法和单细胞直接建库方法的扩增均匀性。相较于HeLa细胞，淋巴细胞几乎没有CNV变异，是完全正常的二倍体细胞。如图4，同样在拥有500k的测序读段下，单细胞直接建库方法要略好于DOP-PCR再建库，和同样测序深度的Bulk样品相比略微逊色，但是差别非常小，这和用HeLa细胞做出来的结果是一致的。
两种细胞做出来的结果说明，本发明的方法在低测序深度下，有着非常好的扩增均一性，这也使得本发明的方法不需要在测序上测很深就能达到很好的CNV检测效果，这就大大降低了测序所带来的成本。所以本发明的方法用来做大量细胞的CNV检测有着得天独厚的优势。
本发明还提供一种高效的单细胞CNV分析流程，其特征在于，包含以下步骤：先利用GPU并行化的比对软件将数据进行基因组比对。得到比对结果后，再根据数据中的序列标记将比对结果拆分成单细胞的比对结果。这种先比对后拆分的流程可以极大的减少比对软件重复读取基因组的时间，同时利用GPU并行化，整体可以减少近10倍的比对时间。将基因组划分成不同分辨率的区间(50kb/100kb/200kb/500kb/1Mb/2Mb)，计算区间中的测序读段数量，根据区间中的GC含量和总测序深度标准化。利用隐马尔科夫模型(Hidden MarkovModel，HMM)或循环二元分割算法(circular binary segmentation，CBS)对标准化后的区间读段数进行分割，得到拷贝数。利用拷贝数的均值、中位数，分割拷贝数的个数、均值、标准差，成对的绝对离差中位数(Median Absolute Pairwise Difference，MAPD)等统计指标分析单细胞的拷贝数，确定数据质量和数据分辨率，并筛选出质量优秀的单细胞进入后续CNV分析。CNV的分析包括CNV发生的基因组位置分布、染色体分布、CNV长度分布等。
本领域技术人员可以知道的是，确定的数字，例如用量、加热时间、具体的型号等等都属于本领域的常规知识，是本领域技术人员在知道整体步骤的技术上可以尝试的。同样的，具体的步骤、物料也是本领域技术人员在整体技术的基础上可以选择的。以上为本发明较佳的实施方式，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种低深度高通量单细胞基因变异检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备单细胞悬液；
利用荧光激活细胞分选法将单细胞分选到细胞培养孔板的每一个孔中；
在孔中进行裂解反应，待裂解结束后加入转座酶(Tn5)反应混合液，将DNA片段化的同时在末端接上接头；
片段化产物经N5和N7引物进行扩增；
扩增产物纯化后作为测序文库；
测序获得基因变异信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞包括小鼠细胞系3T3、人血液淋巴细胞、GM12871、GM12891、HEK293、HeLa等。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增为RPA、RAA、桥式扩增、PCR中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养孔板为96孔板。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增产物纯化后的扩增文库使用FragmentAnalyzer分析，根据文库中引物二聚体含量多少和DNA片段长度分布是否均匀来判断文库质量优劣。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养孔板的每一个孔中有预先加好的细胞裂解液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解反应所使用的裂解酶选自蛋白酶和蛋白酶K中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备单细胞悬液的时候，将多种细胞样品分别制备细胞悬浮液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将单细胞悬液使用BD FACSAriaIII流式细胞仪根据FSC和SSC选择单细胞，并分选到细胞培养孔板的每一个孔中。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 陆士新等: "《干细胞与肿瘤》", 中国协和医科大学出版社, pages: 439 - 441 * |
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