CN114149940B - 无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境污染物生物处理技术，公开了一种无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用。所述无色杆菌(Achromobacter sp.)的保藏编号为CCTCC NO：M20211051。本发明还提供含有该无色杆菌的菌剂，以及该无色杆菌和菌剂在去除Mn²⁺中的应用。本发明提供的无色杆菌在酸性条件下能够发挥对Mn²⁺进行氧化和去除的作用，可作为优良的锰氧化菌，应用于矿山酸性废水中锰的生物处理方面，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广等优点。

Description

无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用

技术领域

本发明涉及环境污染物生物处理技术，具体涉及一种无色杆菌、含有 该菌的菌剂及它们的应用。

背景技术

锰是矿山酸性废水中最主要的污染物之一，锰过量会引起中枢神经系 统、呼吸系统方面的疾病，处理矿山酸性废水中的锰是环境领域中的重要课 题。

去除矿山酸性废水中锰的常用处理方法有直接沉淀法、氧化法、吸附法 等物理化学处理技术，因其成本高、操作难度大、易产生二次污染等缺点， 难以适用于偏远废弃矿区的矿山酸性废水治理。生物法因其成本低廉、操作 简单、不会产生二次污染等优点而备受关注。目前对于微生物处理含锰废水， 国内外已开展大量的研究，由于筛选的微生物通常只适用于中性环境中生长 并发挥作用，因此多用于处理含铁锰的地下水；而对于锰浓度较高、pH值 较低的矿山酸性废水，使用受到严重的限制。

如何获得适应性强、耐受浓度高、去除效率高的耐酸菌，对于含锰矿 山酸性废水的处理具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中微生物无法处理锰浓度较高、pH 值较低的废水的问题，提供一种无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用， 该菌株能够在酸性条件下，对Mn²⁺进行氧化去除，且去除效率高。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种无色杆菌，该无色杆菌(Achromobacter sp.)的保藏编号为CCTCC NO：M20211051。

本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的无色杆菌。

优选地，所述菌剂含有所述无色杆菌的的活菌体、死菌体和发酵产物 中的至少一种；优选为活菌体。

优选地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为液态菌剂。

本发明第三方面提供上述的无色杆菌、上述的菌剂在去除Mn²⁺中的应 用。

优选地，所述Mn²⁺为酸性废液中的Mn²⁺。

本发明第四方面提供一种去除Mn²⁺的方法，包括以下步骤：将上述的 无色杆菌和/或上述的菌剂与含有Mn²⁺的样品接触。

优选地，所述含有Mn²⁺的样品为含有Mn²⁺的酸性废液，优选为含有 Mn²⁺的矿山酸性废水。

优选地，所述含有Mn²⁺的酸性废液的pH为2-6。

优选地，所述接触的过程包括：将所述无色杆菌和/或所述菌剂与所述 含有Mn²⁺的样品混合得到混合液，将所述混合液进行震荡培养；

优选地，所述混合液中所述无色杆菌的浓度为10⁷-10⁹CFU/mL；

所述震荡培养的条件至少满足：温度为30-40℃、转速为100-150rpm。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供的无色杆菌对Mn²⁺具有显著的去除效率，尤其是在酸性条 件下也能够发挥对Mn²⁺进行氧化及去除的作用，对含锰矿山酸性废水中 Mn²⁺的去除率高达95％；该无色杆菌可作为优良的锰氧化菌，应用于矿山酸 性废水中锰的生物处理方面，具有无二次污染、处理效率高、适应范围广等 优点。

生物保藏

本发明提供的菌株为无色杆菌(Achromobacter sp.QBM-4)，并于2021 年8月18日被保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为 CCTCC，地址位于湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为 CCTCC No：M20211051。

附图说明

图1是实施例1获得的菌株QBM-4的系统发育树图；

图2是在不同pH条件下实施例1获得的菌株QBM-4的处理时间与Mn²⁺的浓度关系图；

图3是实施例1获得的菌株QBM-4的处理时间与MnO₂的浓度关系图；

图4是实施例1获得的菌株QBM-4对矿山酸性废水(分别为UE、LT、 LM)中Mn²⁺的去除率。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值， 这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来 说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及 单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值 范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明第一方面提供一种无色杆菌(Achromobacter sp.)， 于2021年8月18日被保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为 CCTCC，地址位于湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为 CCTCC No：M20211051。

本发明提供的无色杆菌从湖南省长沙市浏阳市硫铁矿尾矿的渗滤液中 分离得到。所述无色杆菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的 方法。

示例性地，所述无色杆菌的分离过程包括以下步骤：将渗滤液样品加入 液体培养基中培养后，每次按照0.5-2％的接种量连续富集，转接3-5次，将 最后一次的培养液稀释10⁶-10⁸倍，涂布于固体培养平板上，倒置培养；待 平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线进行纯化分离。

本发明提供的无色杆菌经过发酵培养能够产生大量的无色杆菌的活菌 体和/或发酵产物。本发明对发酵培养方法没有特别的限制，只要通过该发酵 培养方法可以使所述无色杆菌大量增殖即可。例如，可以将无色杆菌以接种 量为0.5-6体积％接种至液体培养基中，在温度为30-40℃、转速为100-150 rpm的条件下，进行震荡培养48-90h后得到发酵液。

根据本发明，无色杆菌的分离过程中及发酵培养时，采用的液体培养基 可以为本领域常规使用的培养基，固体培养平板由液体培养基内加入适量 的琼脂制成。优选情况下，液体培养基含有K₂HPO₄ 0.05-0.2g/L、葡萄糖 0.2-0.4g/L、蛋白胨0.3-0.8g/L、酵母提取物0.1-0.3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3 g/L、NaNO₃ 0.1-0.3g/L、CaCl₂ 0.05-0.2g/L、(NH₄)₂CO₃ 0.05-0.2g/L、柠檬酸 铁铵0.5-1g/L；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶于水后，用1M 的H₂SO₄调节pH至4.0，121℃灭菌20min，再用0.22μm滤膜过滤添加MnSO₄·H₂O，使得MnSO₄·H₂O浓度为0.1-0.3g/L。

第二方面，本发明提供一种菌剂，该菌剂含有上述的无色杆菌。

在本发明中，对所述菌剂中无色杆菌的浓度没有特别的限制，可以根 据具体的情况进行具体的选择。

根据本发明，所述菌剂含有所述无色杆菌的的活菌体、死菌体和发酵 产物中的至少一种；优选为活菌体。菌剂含有无色杆菌的的活菌体时，利用 无色杆菌的生长过程，对Mn²⁺进行氧化，以有效去除Mn²⁺。

根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途 的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的辅料(赋形剂)等成分，例 如所述菌剂可以为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为液态菌剂，例如可以为 无色杆菌的发酵液。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技 术人员所熟知，在此不再详细说明。

第三方面，本发明提供上述的无色杆菌、上述的菌剂在去除Mn²⁺中的 应用。

根据本发明，上述的无色杆菌、上述的菌剂可以用于去除废液、废水或 者固废中的Mn²⁺，以减小对环境的污染。优选情况下，所述Mn²⁺为酸性废 液中的Mn²⁺，即本发明提供的无色杆菌能够在酸性条件下存活并有效发挥 氧化去除Mn²⁺的作用。

第四方面，本发明提供一种去除Mn²⁺的方法，包括以下步骤：将上述 的无色杆菌和/或上述的菌剂与含有Mn²⁺的样品接触。

根据本发明，所述含有Mn²⁺的样品为含有Mn²⁺的酸性废液，优选为含 有Mn²⁺的矿山酸性废水。

根据本发明，所述含有Mn²⁺的酸性废液的pH为2-6。

根据本发明，与含有Mn²⁺的样品接触的无色杆菌的形式并没有特别的 限定，只要保证加入后所述无色杆菌能够对Mn²⁺进行有效地氧化去除即 可，例如，可以为培养至对数期的活化菌体(发酵液或菌体沉淀)。

本发明对加入的无色杆菌数量也没有特别的限制，这可以根据所述含 有Mn²⁺的样品中Mn²⁺的含量来决定。

根据本发明，所述接触的过程包括：将所述无色杆菌和/或所述菌剂与 所述含有Mn²⁺的样品混合得到混合液，将所述混合液进行震荡培养。含有 Mn²⁺的样品为废液或者废水时，可直接与无色杆菌和/或菌剂混合；含有Mn²⁺的样品为固废时，可将固废先配制为相应的溶液后，再与无色杆菌和/或菌剂 混合。

根据本发明，所述混合液中所述无色杆菌的浓度为10⁷-10⁹CFU/mL，具 体可以为10⁷CFU/mL、5×10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、 10⁹CFU/mL，或者上述两个值之间的任意值。

根据本发明，所述震荡培养的条件至少满足：温度为30-40℃，具体可 以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃，或者上述两个值之间的任意值； 转速为100-150rpm，具体可以为100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、 150rpm，或者上述两个值之间的任意值。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，矿山酸性废水为湖南省长沙市浏阳市硫铁矿尾矿的渗 滤液，节杆菌MN1405分离自锰矿样品，其他原材料、试剂、仪器和设备等 均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到；

活化培养基：K₂HPO₄ 0.1g/L、葡萄糖0.3g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母提取 物0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、NaNO₃ 0.2g/L、CaCl₂ 0.1g/L、(NH₄)₂CO₃ 0.1g/L、柠檬酸铁铵0.8g/L；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶 于水后，用1M的H₂SO₄调节pH至4.0，121℃灭菌20min；

液体培养基：K₂HPO₄ 0.1g/L、葡萄糖0.3g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母提取 物0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、NaNO₃ 0.2g/L、CaCl₂ 0.1g/L、(NH₄)₂CO₃ 0.1g/L、柠檬酸铁铵0.8g/L；具体制备过程为：将上述液体培养基的组分溶 于水后，用1M的H₂SO₄调节pH至4.0，121℃灭菌20min，再用0.22μm滤 膜过滤添加MnSO₄·H₂O，使得MnSO₄·H₂O浓度为0.2g/L；

固体培养平板：K₂HPO₄ 0.1g/L、葡萄糖0.3g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母提 取物0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、NaNO₃ 0.2g/L、CaCl₂ 0.1g/L、(NH₄)₂CO₃ 0.1g/L、柠檬酸铁铵0.8g/L、琼脂2g/L；具体制备过程为：将上述液体培养 基的组分溶于水后，用1M的H₂SO₄调节pH至7.0，121℃灭菌20min，再 用0.22μm滤膜过滤添加MnSO₄·H₂O，使得MnSO₄·H₂O浓度为0.2g/L。

实施例1

(1)将矿山酸性废水于4℃保存运输到实验室，作为目标菌的筛选材料； 将5mL矿山酸性废水加入到100mL液体培养基中，在温度为35℃、转速为 120rpm的条件下培养7天后，每次按照1体积％的接种量接种至液体培养基 中进行连续富集，转接4次；

(2)将第4次富集的培养液稀释10⁶-10⁸倍涂布于固体培养平板上，35℃ 倒置培养1-3天；

(3)待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得 QBM-4纯菌落。

将QBM-4纯菌落接种于液体培养基中，放入恒温震荡培养箱中在温度 为35℃、转速为120rpm的条件下培养，进行分子生物学鉴定。

菌株QBM-4的分子生物学鉴定：采用SDS方法或STE方法提取菌株 QBM-4的总DNA，将总DNA稀释到约50ng/uL为模板，进行16S rDNA基 因扩增，以通用引物27F(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)和1492R(核 苷酸序列如SEQ ID No.2所示)为引物，进行PCR扩增，测定其全序列， 获得的菌株QBM-4的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.1(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

SEQ ID No.2(1492R)：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

将菌株QBM-4的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库，与 GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，初步鉴定出菌株QBM-4属 于Achromobacter sp.，相似度为99％，菌株QBM-4的系统发育树图如图1 所示。

实施例2

将实施例1得到的菌株QBM-4接入到活化培养基中，经过夜活化得到 活化液，将活化液按1体积％的接种量接种至pH分别为4.0、5.0和6.0、 Mn²⁺浓度为60mg/L的液体培养基中得到混合液(混合液中无色杆菌的浓度 为10⁷-10⁹CFU/mL)，并设置空白对照，将混合液在温度为35℃、转速为 120rpm的恒温培养箱中震荡培养，每隔24h取样；用火焰原子吸收分光光 度法测定溶液中Mn²⁺浓度的变化，结果如图2所示。

图2的结果显示：菌株QBM-4可在pH为4.0、5.0和6.0的酸性条件下 存活并具有除锰效率；菌株QBM-4在pH为4.0、5.0和6.0条件下的除锰效 率分别为93.6±0.7％、94.5±0.7％和95.2±0.2％。因此，菌株QBM-4对处理矿 山酸性废水中的Mn²⁺具有应用价值。

实施例3

将实施例1得到的菌株QBM-4接入到活化培养基中，经过夜活化得到 活化液，将活化液按1体积％的接种量接种至pH为4.0、Mn²⁺浓度为60mg/L 的液体培养基中得到混合液(混合液中无色杆菌的浓度为10⁷-10⁹CFU/mL)， 并设置空白对照，将混合液在温度为35℃、转速为120rpm的恒温培养箱震 荡培养，每隔24h取样，用LBB法测定溶液中生成的MnO₂浓度的变化， 结果如图3所示。

LBB法的具体过程为：取50μL样品悬浮液，立即加入250μL的0.04％ (m/V)白贝林蓝I溶液，避光静置反应3-4h，在全波长酶标仪上，测定624nm 处的吸光值；通过OD₆₂₄/KMnO₄浓度对应的标准曲线图得到当量KMnO₄浓 度，然后乘以2.5后即可换算得到当量的MnO₂浓度。

图3的结果显示：菌株QBM-4具有氧化Mn²⁺的特性，锰氧化速率约为 0.05mM/d，这表明菌株QBM-4可通过将Mn²⁺氧化为MnO₂的方式将溶液中 的Mn²⁺去除，与传统的添加氧化剂将Mn²⁺氧化去除的方法相比，成本低、 操作简单。

实施例4

将实施例1得到的菌株QBM-4接入到活化培养基中，经过夜活化得到 活化液，将活化液按以5体积％的接种量接入三个不同的含锰矿山酸性废水 样品(分别为UE：浏阳七宝山硫铁矿矿涌水，LT：浏阳七宝山尾矿库渗滤 液，LM：湘西花垣电解锰渣渗滤液)中得到混合液(混合液中无色杆菌的 浓度为10⁷-10⁹CFU/mL)，将混合液在温度为35℃、转速为120rpm的恒温培 养箱中震荡培养，监测震荡培养前后矿山酸性废水中的Mn²⁺浓度，结果见 表1和图4(ud表示未检出)。

由图4可知，菌株QBM-4对实际废水样品UE、LT、LM中Mn²⁺的去 除效率分别为91.9％、88.81％和85.2％。表1和图4的数据表明，菌株QBM-4 可成功应用于含锰矿山酸性废水的生物处理工艺，实现矿山酸性废水中锰的 去除。

表1三个不同的含锰矿山酸性废水样品震荡培养前的水质情况

对比例1

将Mycetocola sp.KCTC 19753进行活化后，以5体积％的接种量接入三 个不同的含锰矿山酸性废水样品(分别为UE、LT、LM)中得到混合液(混 合液中Mycetocola sp.KCTC19753的浓度为10⁷-10⁹CFU/mL)，将混合液在 温度为35℃、转速为120rpm的恒温培养箱中震荡培养，监测震荡培养前后 矿山酸性废水中的Mn²⁺浓度，结果见表2。

表2

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。 在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变 型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和 组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南农业大学

<120> 无色杆菌、含有该菌的菌剂及它们的应用

<130> 2021.10.08

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1409

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

cttaccatgc agtcgaacgg cagcacggac ttcggtctgg tggcgagtgg cgaacgggtg 60

agtaatgtat cggaacgtgc ccagtagcgg gggataacta cgcgaaagcg tagctaatac 120

cgcatacgcc ctacggggga aagcagggga tcgcaagacc ttgcactatt ggagcggccg 180

atatcggatt agctagttgg tggggtaacg gctcaccaag gcgacgatcc gtagctggtt 240

tgagaggacg accagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300

agtggggaat tttggacaat gggggaaacc ctgatccagc catcccgcgt gtgcgatgaa 360

ggccttcggg ttgtaaagca cttttggcag gaaagaaacg tcgtgggtta ataccccgcg 420

aaactgacgg tacctgcaga ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480

cgtagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttcggaa 540

agaaagatgt gaaatcccag agcttaactt tggaactgca tttttaacta ccgagctaga 600

gtgtgtcaga gggaggtgga attccgcgtg tagcagtgaa atgcgtagat atgcggagga 660

acaccgatgg cgaaggcagc ctcctgggat aacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg 720

gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ctagctgttg 780

gggccttcgg gccttggtag cgcagctaac gcgtgaagtt gaccgcctgg ggagtacggt 840

cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat 900

taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct acccttgaca tgtctggaat cctgaagaga 960

tttaggagtg ctcgcaagag aaccggaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcattag ttgctacgaa 1080

agggcactct aatgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140

ctcatggccc ttatgggtag ggcttcacac gtcatacaat ggtcgggaca gagggtcgcc 1200

aacccgcgag ggggagccaa tcccagaaac ccgatcgtag tccggatcgc agtctgcaac 1260

tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgtcgcg gtgaatacgt 1320

tcccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttttacc agaagtagtt 1380

agcctaaccg caaggggggc gataccacg 1409

Claims (13)

1.一种无色杆菌，其特征在于，该无色杆菌（Achromobacter sp.）的保藏编号为CCTCCNO：M20211051。

2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有根据权利要求1所述的无色杆菌。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有所述无色杆菌的活菌体。

4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂或者固态菌剂。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂。

6.权利要求1所述的无色杆菌或者权利要求2至5中任意一项所述的菌剂在去除Mn²⁺中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Mn²⁺为酸性废液中的Mn²⁺。

8.一种去除Mn²⁺的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的无色杆菌和/或权利要求2至5中任意一项所述的菌剂与含有Mn²⁺的样品接触。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有Mn²⁺的样品为含有Mn²⁺的酸性废液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有Mn²⁺的样品为含有Mn²⁺的矿山酸性废水。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述含有Mn²⁺的酸性废液的pH为2-6。

12.根据权利要求9至11中任意一项所述的方法，其特征在于，所述接触的过程包括：将所述无色杆菌和/或所述菌剂与所述含有Mn²⁺的样品混合得到混合液，将所述混合液进行震荡培养。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述混合液中所述无色杆菌的浓度为10⁷-10⁹CFU/mL；

所述震荡培养的条件至少满足：温度为30-40℃、转速为100-150 rpm。

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