CN1141386C - 用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物细胞培养技术，特别是涉及一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法。磁敏性微载体的矫顽力低于200安培/米，粒径为50μm～2mm，湿比重为1.1～2.5g/cm3，磁稳定流化床的表观液速为5～25厘米/分钟，磁场强度为3～100mT；将培养系统和经预处理的微载体清洗、蒸汽灭菌后，注入细胞培养基浸泡微载体适当时间；接种，让培养基循环、充氧，废弃部分培养基同时补充新鲜培养基，进行细胞培养过程。使用磁敏性微载体，颗粒相对静止，减少了细胞的损伤，细胞密度达到108个细胞/ml以上。

Description

用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法
本发明属于动物细胞培养技术，特别是涉及一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法。
动物细胞大规模培养在现代生物技术及医药产业中具有越来越重要的意义，已用于生产乙肝、乙脑、狂犬等疫苗。培养贴壁依赖性细胞最初是采用滚瓶系统，劳动强度大，单位体积提供的细胞生长面积小，培养效率低。1967年Van Wezel开发了微载体培养系统，培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径几十至几百微米的微珠。用微载体培养贴壁依赖性细胞时，细胞贴壁在微载体上，微载体悬浮于培养基中。因为微载体有很大的比表面积，因而大大提高了培养效率。用于微载体培养的生物反应器有气升式生物反应器、通气搅拌笼式生物反应器、机械搅拌式反应器、帆式搅拌反应器、流化床生物反应器等类型。在这些反应器中，由于微载体悬浮于液体中，相互碰撞，对细胞的生长不利，故微载体的量一般为1-5克/升，最高达到12-15克/升，同时搅拌造成的剪切以及气泡的破碎都对细胞有损伤，所获细胞密度一般为106-107个细胞/ml。
磁稳定流化床(Magnetically stabilized fluidized bed)是给普通流化床加上磁场，流化床中的颗粒也有磁性。颗粒在磁场中形成链，液体通过流化床时颗粒层均匀膨胀，液体呈活塞流动。磁稳定流化床既有普通流化床的压降和流化特性，又有填充床的液体流动和固液接触特性。此外，通过调节磁场强度，可以调节磁稳定流化床的液体流速上限，因而磁稳定流化床操作范围宽、适应面广。磁稳定流化床中固体颗粒相对静止，消除了颗粒间的碰撞和摩擦，同时磁稳定流化床中的颗粒密度可达40％(体积分率)以上，仅略低于填充床，比用于动物细胞培养的气升式反应器高1-2个数量级。因此，如果将微载体做成磁性颗粒，用磁稳定流化床培养动物细胞，有望将细胞密度提高1-2个数量级。
磁稳定流化床由于具有独特的优点，已在生化工程中得到了多方面的应用。在固定化生物反应器方面，正如文献《生物技术与生物工程》(Biotech.Bioeng.1981，23，2561-2567)一文所述的将脲酶与四氧化三铁颗粒共包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，在外加磁场作用下，液体流速达24厘米/分钟而颗粒层仍保持稳定，同期转化率可与填充床相比。文献《化工学报》1988(1)，120-126所述的以含磁粉的聚甲基丙烯酸甲酯为载体，包埋热带假丝酵母，在恒定磁场中用于含酚废水的处理，提高了反应速度，使单位体积反应器的降解量明显增加。文献《生物技术进展》(Biotech.Prog.，1990，6，452-457)所述的将磁稳定流化床应用于固定化植物细胞的培养，将细胞与磁粉共包埋制成磁性颗粒，生产次生代谢物，以培养基为流化基质，培养基循环充氧，消除了因颗粒碰撞造成的损失。而对用磁稳定流化床培养动物细胞至今未见报道。
本发明的目的在于克服运用微载体培养动物细胞时，微载体颗粒在反应器中的互相碰撞，提高微载体的装填密度，减少细胞的损伤，提高动物细胞培养的密度和反应器的效率，提供一种用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法。
本发明的目的是这样实现的：在普通的液固流化床中加上纵向磁场，流化床内装有磁敏性微载体。细胞培养基从下端进入流化床，从上端离开。离开的培养基可以经过充氧后全部返回入口，实现批式培养；也可以部分返回或不返回，以实现灌注培养。磁场用Helmholtz线圈实现，线圈内通直流电。磁场方向包括向上和向下，磁场可以是均匀磁场，也可以是有梯度的磁场。床体下端有滤网，以防止颗粒泄露；滤网下有支撑板；支撑板下有液体分布板，使液体均匀分布；床体下端为锥形底，以消除流化床的死角，该锥角为40°-120°；滤网、分布板和支撑板的材质以能蒸汽灭菌且不污染培养液为准，如陶瓷或不锈钢。床体上端面有接种口。床体上端有颗粒入口，用以加入磁敏性微载体颗粒。床体上端面或侧壁有开孔，用来安装传感器(如测定温度、溶液酸碱度的pH值范围、溶解氧范围)。床体上下端有灭菌蒸汽的出入口。
本发明所用磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法如下：
(1)在磁场关闭的状态下，清洗磁稳定流化床动物细胞培养系统内的所有容器、管路；在启动磁稳定流化床动物细胞培养系统的控制装置之前设定细胞培养所需的溶液pH值范围、溶解氧范围及反应温度。
(2)将磁敏性微载体预处理后由微载体加入口加入到磁稳定流化床中，然后由灭菌蒸汽入口向系统内通入蒸汽灭菌；或在通入蒸汽前加入缓冲液至浸没磁敏性微载体再通入蒸汽灭菌，所述的缓冲液为磷酸缓冲液；或将磁敏性微载体单独灭菌后在无菌环境下加入到已经灭菌的磁稳定流化床中；其中磁敏性微载体的加入量按视体积计为磁稳定流化床工作体积的10％～95％，磁敏性微载体的矫顽力低于200安培/米，粒径为50μm～2mm，湿比重为1.1～2.5g/cm3，磁稳定流化床的液体表观流速为5厘米/分钟～25厘米/分钟，磁场强度为3～100mT；灭菌时遵循一定的次序，保证所有容器、管路、元件及微载体都充分灭菌。
(3)冷却后将磁稳定流化床内的液体由排水口排出；经过微孔滤膜由磁稳定流化床培养基入口向磁稳定流化床内注入细胞培养基至浸没磁敏性微载体但不超过磁稳定流化床的工作体积的95％，浸泡磁敏性微载体适当时间。
(4)由磁稳定流化床的接种口加入已制备好的细胞种子液。
(5)经过气体过滤装置由磁稳定流化床的灭菌蒸汽入口通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气，持续5秒钟以上，使磁敏性微载体颗粒悬浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气，20-30分钟后关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气；以后每隔20-30分钟重复关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气的过程，直至细胞在磁敏性微载体上贴壁完全；其中的通气是指前述的经过气体过滤装置通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气并持续5秒钟以上；经过微孔滤膜补足细胞培养基使之充满充氧装置和管路。
(6)启动磁稳定流化床动物细胞培养系统的控制装置和充氧装置，让细胞培养基循环，进行细胞培养过程；根据实际操作的需要，经过微孔滤膜连续或分批补充新鲜细胞培养基，定时取样分析，直至达到所需的细胞密度或预定的培养时间；关闭磁稳定流化床动物细胞培养系统的控制装置和充氧装置，停止细胞培养基的循环；在细胞培养过程中，每隔2-12小时将磁场关闭一下，再重新开启。
(7)关闭磁场，将贴有细胞的磁敏性微载体由磁稳定流化床的培养基出口或微载体加入口水洗排出进行后处理，或将贴有细胞的磁敏性微载体留在磁稳定流化床中，进行其它操作。
本发明为了提高动物细胞培养的密度和反应器的效率，所使用的用于动物细胞培养的磁敏性微载体既要对磁场有响应，又要适于细胞的贴壁、生长，还不能有磁粉的泄露，以免污染培养液和伤害细胞。
用于动物细胞培养的磁敏性微载体是核壳式结构，内核为磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成，壳层为适于细胞贴壁、生长的基质。
所用磁粉的平均粒径为0.1-5微米，所说的磁粉为γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。所说的高分子聚合物可由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂制备，其中单体包括可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体，如苯乙烯系列，如苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯或α-甲基苯乙烯，和甲基丙烯酸甲酯。引发剂包括悬浮聚合常用的引发剂，如过氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二异丁腈(AIBN)。交联剂包括悬浮聚合常用的交联剂，如二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯。壳层基质包括适合不同种类的细胞贴壁和生长的基质，如明胶、葡聚糖等。
上述微载体的制备是将聚合单体、交联剂、引发剂和磁粉按一定比例混合均匀进行聚合，以明胶溶液为分散剂，经悬浮聚合得到含磁粉的颗粒，经洗涤、烘干后得所需磁核；将磁核与壳层基质混合，悬浮于甲苯液中，使裹有明胶的磁核充分分散，之后降温、交联、还原、洗涤，得磁敏性微载体。所制得的微载体可以进一步进行包括DEAE修饰或衍生化的表面修饰，以改变其电荷分布、亲水性等。
制备出的磁敏性微载体的平均粒径为50微米～2毫米，湿比重1.1-2.5g/cm3，磁粉含量为30％-50％(wt)。微载体具有刚性致密结构。壳核式结构的微载体，其壳层为有利于细胞贴壁、生长的基质，这种结构既使微载体对磁场有响应，又隔绝了磁粉与细胞的直接接触，还防止了在培养基中磁粉的泄露、污染培养液和对细胞的伤害，培养结果表明适于Vero细胞贴壁生长。
本发明所用的其它附属装置包括：培养基储罐、灭菌装置、充氧装置、温度控制装置、溶液pH值控制装置、溶解氧控制装置及必要的连接管路。培养基储罐和灭菌装置为常规设计。充氧装置是为了向培养基供氧，它连接在培养基的循环途中，可以直接向充氧装置内的液体通入富氧空气或无菌空气，或在充氧装置内采用气体交换膜向培养基供氧，由溶解氧传感器和溶解氧控制装置控制供氧的通气量。温度控制装置和溶液pH值控制装置(包括传感器)可选购商品设备。温度控制方式有多种，对小型磁稳定流化床可以在下端安装冷却棒和加热棒，冷却棒为套管结构，内通冷水；加热棒可以是套管结构，内通热水或蒸汽，或采用电热丝加热。温度控制也可以采用水夹套控制温度的方式。对大型磁稳定流化床，可以在磁稳定流化床内壁安装纵向排管，也可以用水夹套，或安装多根冷却棒和加热棒，也可以在培养基循环途中安装换热器。控制溶液pH值范围的关键是避免溶液中的酸或碱过浓，对大型磁稳定流化床可以采用喷淋的方式。最方便的控制方式是将控制元件全部安装在充氧装置上，这样既可以简化流化床主体的结构，又可以避免局部的温度过高以及酸或碱浓度的过高对细胞的伤害，其控制方式可以采用上述的各种方法，取决于充氧装置的规模、制造工艺、成本和控制策略。
磁稳定流化床所用的材质，以能灭菌、不污染培养基、不损伤细胞、易加工为宜。对小型磁稳定流化床，罐体可以用玻璃，顶盖、接口、附属管路、滤网、分布板等可用不锈钢。对大型磁稳定流化床可以都采用不锈钢材质。
对小型磁稳定流化床，罐体上端不需要扩大段。对大型磁稳定流化床，上端最好接有扩大段，以减少颗粒的夹带。扩大段的内径为主体内径的1.0-2.0倍，高度为主体内径的0.5-3.0倍，扩大段下部锥段的锥角为40°-120°。
磁稳定流化床截面的形状为圆形、方形等。以圆形最佳，因为可以充分利用磁场的均匀部分，而且床内的壁效应最小。
磁稳定流化床的高径比为1∶1-20∶1，内径为1厘米-100厘米。
本发明使用磁敏性微载体，颗粒相对静止，消除了颗粒间的碰撞和摩擦，提高了微载体的装填密度，减少了细胞的损伤，磁敏性微载体的体积分率可以达到40％以上，从而提高了细胞培养的密度和单位磁稳定流化床体积的生产能力。用本发明的培养技术培养Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，使用自制的磁敏性微载体，细胞密度达到108个细胞/ml以上，远高于用搅拌式或气升式反应器所达到的细胞密度。
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
图1.本发明的磁稳定流化床动物细胞培养系统示意图；
图2.本发明的磁稳定流化床结构示意图。1.流化床主体      2.滤网        3.支撑板      4.液体分布板      5.培养基入口6.灭菌蒸汽入口    7.排水口      8.培养基出口  9.废弃培养基出口  10.压力平衡口11.排气口         12.微载体加入口     13.接种口      14.Helmholtz线圈15.充氧装置       16.充氧装置的培养基入口            17.充氧装置的培养基出口18.富氧空气或纯氧入口           19.溶液pH值传感器    20.溶解氧传感器21.温度传感器     22.控制装置   23.酸或碱储罐        24.控温执行机构25.富氧空气或纯氧源             26.恒流泵      27.空气过滤器    28.气路阀门29.液面           30.新鲜培养基 31.蒸汽        32.空气
图1是按照将控制元件和传感器全部安装在充氧装置上绘制的，其控制元件和传感器也可以安装在磁稳定流化床主体上；图中未画出视窗、人孔和非生产必需但在设备维护、检修或清洗时需要的阀门、管路和进出口等；图1中未画出供分析、检测、控制的其它设备、传感器和取样装置，如尾气分析、培养基成分分析等；充氧装置中可选用机械消泡装置或采用消泡剂，未画出；部件、设备的连接方式未画出，如法兰盘、螺栓、螺母、喉箍、焊接点等及其规格、尺寸，这些取决于设备规模和制造工艺；连接管路、阀门、传感器、过滤器等的材质、型号、规格均未标出；图1中的控制装置仅为示意图，可根据需要选购不同档次、功能和规格的产品；图中所绘磁稳定流化床主体为有扩大段的磁稳定流化床，对小型磁稳定流化床可以不要扩大段；充氧装置的冷却或加热方式未画出，这些取决于设备规模、制造工艺和成本；充氧装置内的气体分散方式未画出，可以用分布板、挡板、机械搅拌或膜组件；培养基储罐未画出；直流电源未画出；图中各罐体顶盖上的压力表未画出；培养基储罐和充氧装置的灭菌蒸汽入口、出口和排水口未画出；为保证系统内所有容器、管路、阀门充分灭菌而必需的辅助管路、阀门未画出；管路中必要的流量计和除菌装置未画出。
图2是本发明磁稳定流化床结构示意图。培养基从下端进入流化床，从上端离开。磁稳定流化床1内装有磁敏性微载体，用Helmholtz线圈14加上纵向磁场。磁稳定流化床主体1的上部为锥形扩大段，目的是使液体离开颗粒层后速度降低，减少颗粒夹带；磁稳定流化床主体1的下部为锥形，以消除死角；磁稳定流化床主体1的下端有滤网2，以防止颗粒泄露；滤网2下有支撑板3，以支撑滤网2；支撑板3下有液体分布板4，使液体均匀分布；滤网2、支撑板3和液体分布板4的材质以能蒸汽灭菌且不污染培养液为准，如陶瓷或不锈钢。磁稳定流化床主体1的下端设有5、6、7三个接口，5是培养基入口，6是灭菌蒸汽入口，7是排水口。磁稳定流化床扩大段的侧面设有8、9两个接口，8是培养基出口，9是废弃培养基出口。磁稳定流化床的上端面设有蒸汽或空气的排气口11，设有微载体加入口12，用以加入微载体颗粒，设有接种口13，手工接种时可用12作接种口。
实施例1：
磁稳定流化床的结构和操作工艺参数如下：磁稳定流化床主体内径10厘米，高50厘米；扩大段内径15厘米，高15厘米；扩大段与主体的连接部分高5厘米；主体下端的锥部高4厘米；培养的细胞为137代Vero细胞；细胞培养基为添加8％胎牛血清的M199培养基；所用的磁敏性微载体为核壳式结构，内核由1μm-3μm的铁氧体粉末(Fe3O1)与苯乙烯(单体)和二乙烯基苯(交联剂)共聚合而成，外壳是明胶并经过DEAE修饰，铁氧体粉末的含量为40％；磁敏性微载体的粒径范围为100μm-150μm，矫顽力为20安培/米，湿比重为1.3g/cm3；用氧气钢瓶供氧；磁场的磁感应强度为12mT；床内的液体表观流速为15厘米/分钟；细胞接种密度为5×106个细胞/ml；培养细胞时温度设定为37℃，溶液pH值设定为7.0，溶解氧设定为30％空气饱和度；所用的微孔滤膜均为Millipore公司产品。
1)在磁场关闭的状态下，清洗磁稳定流化床动物细胞培养系统内的所有容器、管路；设定细胞培养所需的溶液pH值范围、溶解氧范围及反应温度；
2)将1.6公斤磁敏性微载体用pH值7.0的磷酸缓冲液于37℃溶胀3小时，用磷酸缓冲液洗三次，然后由12号口加入磁稳定流化床，再加入1升pH值7.0的磷酸缓冲液。向系统内通入灭菌蒸汽，灭菌30分钟；
3)系统冷却后将磁稳定流化床内的液体由7号口排出；经微孔滤膜由5号口向磁稳定流化床内注入细胞培养基2升，浸泡磁敏性微载体12小时；
4)由13号口加入已制备好的Vero细胞悬液(种子液)；
5)经过微孔滤膜由6号口按0.2升/分钟的流量通入氧气3分钟，使颗粒悬浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气；每隔半小时重复“关闭磁场——通气——开启磁场——停止通气”的过程，至接种后3小时；其中的“通气”是指前述的“经过微孔滤膜由6号口按0.2升/分钟的流量通入氧气3分钟”；经过微孔滤膜补足细胞培养基使之充满充氧装置和管路；
6)启动控制装置和充氧装置，让细胞培养基循环；12小时后开始连续补充新鲜的细胞培养基，同时弃去等量的由培养基出口流出的细胞培养基；培养基补充速率每隔12小时递增一次，依次为10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、30ml/分钟、40ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、120ml/分钟、160ml/分钟。接入细胞120小时后停止补充细胞培养基，关闭磁稳定流化床动物细胞培养系统的控制装置和充氧装置，停止细胞培养基的循环；在细胞培养过程中，每隔6小时将磁场关闭一下，再重新开启；此时细胞密度为1.2×108个细胞/ml；
7)关闭磁场；将微载体由12号口水洗排出，进行后处理。

Claims (1)

1、一种旧磁稳定流化床培养贴壁依赖性动物细胞的方法，其特征在于该方法的步骤为：
(1)在磁场关闭的状态下，清洗磁稳定流化床动物细胞培养系统；设定细胞培养所需的溶液pH值范围、溶解氧范围及反应温度；
(2)将磁敏性微载体预处理后加入到磁稳定流化床中，通入蒸汽灭菌；或加入缓冲液至浸没磁敏性微载体再通入蒸汽灭菌，所述的缓冲液为磷酸缓冲液；或将磁敏性微载体单独灭菌后在无菌环境下加入到已经灭菌的磁稳定流化床中；其中磁敏性微载体的加入量按视体积计为磁稳定流化床工作体积的10％～95％，磁敏性微载体的矫顽力低于200安培/米，粒径为50μm～2mm，湿比重为1.1～2.5g/cm3，磁稳定流化床的液体表观流速为5厘米/分钟～25厘米/分钟，磁场强度为3～100mT；
(3)冷却后将磁稳定流化床内的液体排出；经过微孔滤膜向磁稳定流化床内注入细胞培养基至浸没磁敏性微载体但不超过磁稳定流化床的工作体积的95％，浸泡磁敏性微载体；
(4)加入已制备好的细胞种子液；
(5)经过气体过滤装置通入能使磁敏性微载体量浮的无菌空气或富氧空气，持续5秒钟以上，使磁敏性微载体颗粒悬浮并与液体充分混合，然后开启磁场，停止通气，20-30分钟后关闭磁场、通气、开启磁场、停止通气；以后每隔20-30分钟重复关闭磁场、通气、开启磁场、停止通气的过程，直至细胞在磁敏性微载体上贴壁完全；其中的通气是指前述的经过气体过滤装置通入能使磁敏性微载体悬浮的无菌空气或富氧空气并持续5秒钟以上；经过微孔滤膜补足细胞培养基使之充满充氧装置和管路；
(6)启动磁稳定流化床动物细胞培养系统的控制装置和充氧装置，让细胞培养基循环，进行细胞培养过程；经过微孔滤膜连续或分批补充新鲜细胞培养基；关闭磁稳定流化床动物细胞培养系统的控制装置和充氧装置，停止细胞培养基的循环；在细胞培养过程中，每隔2-12小时将磁场关闭一下，再重新开启；
(7)关闭磁场，将贴有细胞的磁敏性微载体水洗排出进行后处理，或将贴有细胞的磁敏性微载体留在磁稳定流化床中，进行其它操作。
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