CN114134009A - 一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置。该方法包括：1.细胞培养耗材运载：细胞培养耗材由固定装置锁定。所述细胞培养耗材底面为待划片的贴壁细胞层。所述细胞培养耗材固定装置经由丝杆电机将该耗材运载到划片刀具的工作位置。2.贴壁细胞层的机械化划片：耗材内的贴壁细胞层与刀具尖端接触，并控制接触力在1‑12N，再由导轨装置控制刀具的划片轨迹实现贴壁细胞层的机械化划片。3.细胞培养耗材返还：所述细胞培养耗材被运载至初始位置并取出，用于收集划分好的细胞成片，同时所有运动装置复位。本发明的创新性在于：提出并设计了贴壁细胞层的机械化划片方法及相应的微型装置，可取代现有的手工划片，提高了贴壁细胞层划片的效率和精度。

Description

一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置

技术领域

本发明涉及细胞培养基贴壁细胞层划片领域。更具体的，本发明涉及利用机电设备进行细胞培养基贴壁细胞层机械化划片的方法和装置。

背景技术

体外细胞培养是在生物体外对实验对象细胞进行无菌化培养的一类技术。通常体外细胞培养是在细胞培养耗材中进行。根据细胞特性和培养目的可进一步分为贴壁培养和悬浮培养。对于生物发育研究而言，细胞的体外诱导分化培养十分重要。这不仅提供了易于观察和操控的体外研究模型，亦为潜在的细胞产品应用提供了途径。如日本已于2019年成功投产体外大量诱导分化并扩增的血小板用于商用。在这一类分化研究模型中，具备生物全能性的干细胞是重要的研究对象。具备“干”性的细胞具备进一步分化为其他类型细胞的潜能。这类细胞表面表达一种表面粘附分子（如CD34）,故在体外培养时往往为贴壁状态。其后续分化潜能和状态不仅受细胞培养基成分的化学调节，亦受机械力、细胞形态、流体受力等多方面物理因素的影响。如人来源多能干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）单细胞存活和抗分化潜能较低，往往需要保证其成团培养。又如近年较为热点的类器官（organoid）研究需要从胚样体（embryonic body，EB）阶段开始培养，而EB的获取直接来源于ESCs的切片。故如何稳定获取特定尺寸、形态的贴壁细胞成片在这一类研究中尤为重要。可用于该类研究的微尺寸贴壁细胞层成片需要满足以下技术条件：1.尺寸可控，可针对不同细胞类型、培养目的进行调整；2.同一批用于研究的细胞培养耗材的尺寸形状尽可能保持一致；3.细胞层成片的边缘损伤率小且完整；4.不受到外界细菌污染。目前生物医学研究室中使用最广泛的方法就是贴壁细胞层手工划片法和化学消化法，其中又以手工划片法为主。

手工划片法的核心思想就是利用消毒后的划片工具，对细胞培养耗材中的贴壁细胞层在显微镜下进行划片操作，获得相应数量且尺寸足够小的贴壁细胞层成片，即所述微尺寸贴壁细胞层成片。手工划片的具体操作为：包含有贴壁细胞层的细胞培养耗材放置在无菌操作平台上，操作人员通过无菌操作平台的微型对外通道，并在显微镜的视角度量下手持划片工具对贴壁细胞层进行划片操作。由于需要保证划片的尺寸精度且降低边缘损伤，整个手工划片的速度不能过快，划片时刀具切头与贴壁细胞层的接触力也不能过大。对于批量培养的细胞，整个划片过程通常会持续一小时左右，尤其在涉及分化研究的多种类细胞共培养、胚样体（Embryonic Body）形成、类器官（Organoid）培养中均需要将贴壁细胞层划片为较小单位的细胞成片。该过程现阶段广泛使用镜下操作且依赖大量重复人工，对标准化控制、实验效率极为不利。手工划片法可以获得满足需求的微尺寸贴壁细胞层，但该方法的划片效率较低，划片质量不稳定。在长时间的划片过程中，一旦操作人员的注意力分散，就有可能导致划片速度加快、接触力过大、划片轨迹偏离等一个或多个后果，最终使得成片率降低，且切片尺寸不均。较长的操作时间也意味着长时间的室温环境暴露和较高概率的污染风险，不利于干细胞这一类PH、温度敏感细胞的状态维持（标准培养条件为37℃、5%二氧化碳），最终影响实验体系的长期稳定。现阶段应用于这一类实验操作的专属器材并未有注册专利和相应产品。有些功能与划片类似的机械产品主要应用于细胞划痕实验，即通过对贴壁细胞层造成划痕损伤观察划痕附近的细胞迁移行为研究细胞特性。这一类划痕工具均依赖手动操作，相应专利的专利号为：CN202744554U。

化学消化法依赖于化学试剂对贴壁细胞层粘附机制的消化作用，这种办法的原理是利用复合酶制剂作用于细胞间相互粘附的粘附层并将黏附层“消化”。市场上已有成熟的商品化产品，如来自STEM CELL公司的ReleSR。其针对hESC(人来源多能干细胞)进行温和消化能够使其与细胞培养耗材底部脱离的同时一定程度保持细胞之间的粘连性。用这个方法进行贴壁细胞层划片的主要局限在于此种方法非常难以精确控制成片尺寸形状，对于不同细胞状态、代次、细胞系种类均需对消化方式进行重新优化。对同一株细胞株亦存在随着细胞老化或培养条件变动引起的波动，难以建立稳定、精确的消化流程。最后对于消化得到的细胞层成片大小难以控制，后期主要依靠加样枪枪头、巴氏管吹打的手段将其打碎，难以稳定获取统一大小的团块。同时，这个方法无法对获取的团块数量进行计数，这对于要求细胞层片铺展空间充裕的实验设计是不可接受的，如多细胞共培养手段中要求hESC细胞层片能够有充分空间伸展，对于单个培养皿内的细胞层片数量有严格要求、否则无法进行下一阶段分化。

发明内容

基于此，有必要在现有手工划片法的基础上，提出一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，在同时满足划片速度尽量稳定且较快、划片尺寸形状标准以及划片接触力大小在一定范围内的前提下，利用机械装置代替手工进行划片的操作，并提出与细化贴壁细胞层机械化划片的步骤，达到提高划片效率、降低人工工作量、减小污染风险的目的，并可获得用于生物医学研究的尺寸微小、形状一致且边缘损伤率低的微尺寸贴壁细胞层成片。同时，对于不同细胞系、培养模型要求可实验并优化出最佳的划片参数，提高后续实验成功率，减少细胞浪费。

一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置包括以下方案：

1.划片装置整体结构：

一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其装置特征在于：划片装置本身为长宽高分别不超过200mm、200mm和300mm的微型机器，所述划片装置主要分为三个功能装置单元，分别为细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置和导轨装置。所述细胞培养耗材固定装置用于装载和固定细胞培养耗材，所述细胞培养耗材底面为待划片的贴壁细胞层；所述刀具夹持装置用于对划片所用玻璃刀具进行灵活的夹持，保证刀具划片时能够约束刀具自身位移，同时确保划片工作结束后刀具能够随时更换，所述刀具夹持装置能够直接或间接的测出刀具与细胞培养耗材之间的接触力；所述导轨装置主要负责：移动细胞培养耗材固定装置整体至刀具划片区域、控制刀具夹持装置带动划片刀具完成划片轨迹、完成划片后移动细胞培养耗材固定装置至初始位置;

1）细胞培养耗材固定装置主要分为承载板、细胞培养耗材固定下盘件和细胞培养耗材固定上盘件，装配关系从下到上分别为承载板、细胞培养耗材固定下盘件、细胞培养耗材以及细胞培养耗材固定上盘件。夹持固定的原理是利用细胞培养耗材固定下盘件和细胞培养耗材固定上盘件之间的压紧力，对细胞培养耗材自带的外延区域实施压紧，通过压紧后外延区域与细胞培养耗材固定上下盘件之间产生的摩擦力实现细胞培养耗材在环向与径向方向位移约束，细胞培养耗材轴向方向的位移约束由细胞培养耗材固定上下盘件实现;

2）刀具夹持装置主要分为刀具夹持机构、刀具夹持装置主体以及夹持装置上壳体，而刀具夹持机构由刀具夹持压紧头和刀具夹持环组成。两个刀具夹持压紧头的主体均为半圆柱形态，合拢后外形呈现为圆柱形态，所述两个刀具夹持压紧头均通过螺栓连接于刀具夹持装置主体，所述两个刀具夹持压紧头均能以连接点为圆心进行旋转，可以实现向两边分散和向中间轴线合拢的功能，所述刀具夹持压紧头完成合拢后，合拢轴线处会形成一个比刀具尺寸略小的刀具压紧通孔；刀具夹持环为圆环状，与刀具夹持装置主体之间以弹簧连接，所述刀具夹持环的内径与所述两个刀具夹持压紧头合拢后形成的圆柱外径一致，在弹簧自由放松时，所述刀具夹持环会包裹住所述刀具夹持压紧头，强迫两个刀具夹持压紧头保持合拢状态；刀具夹持装置主体负责放置测量接触力的机构，并且轴线处有个与刀具尺寸一致的约束刀具用通孔，方便刀具插入并接触到测力机构，同时完成刀具的径向位移约束，所述刀具夹持装置主体通过与夹持装置上壳体之间的连接将测力机构封闭。刀具夹持的步骤为：将刀具夹持环的弹簧从放松状态调整为压紧状态，使刀具夹持环不再包裹住刀具夹持压紧头，刀具夹持压紧头往两边分散，此时刀具插入刀具夹持装置主体的中心通孔并接触到测力机构，然后使刀具夹持环的弹簧从压紧状态变为放松状态，刀具夹持环将两个分散的刀具夹持压紧头强行合拢，通过合拢后的夹紧力实现刀具轴向与环向方向的位移约束，而刀具夹持装置主体的中心通孔可实现刀具径向方向的位移约束;

3）导轨装置主要分为丝杆、丝杆滑块、丝杆电机和单片机，其中竖直方向的丝杆及其丝杆滑块与所述细胞培养耗材固定装置的承载板连接，负责Z轴方向运动控制，而水平方向的丝杆及其丝杆滑块与所述刀具夹持装置中的夹持装置上壳体连接，负责X、Y轴方向运动，所述丝杆的转动均由丝杆电机控制。划片过程中，单片机通过控制X、Y、Z轴丝杆电机的转动方向和转动步长，进而控制细胞培养耗材固定装置的运载、刀具夹持装置上刀具的划片轨迹与速度，实现划片装置整体的机械化划片功能。连接所用电线经过了特殊的处理，防止表面塑料被腐蚀或者脆化；

2.利用划片装置进行机械化划片的方法步骤细化：

1）前期准备

将微型划片装置的整体至于紫外光消毒环境中至少消毒30分钟后，通过微型对外通道直接布置于无菌操作平台上，随后链接平台电源，并启动复位按钮，保证细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置以及导轨装置位于初始化位置;

2）刀具安装

调整刀具夹持装置中的刀具夹持环和刀具夹持压紧头，将已消毒好的刀具固定于所述刀具夹持装置中，并保证刀具末端与刀具夹持装置中的测力机构接触;

3）细胞培养耗材固定

调整细胞培养耗材固定装置中的紧固机构，将装有细胞培养基的细胞培养耗材放置于所述细胞培养耗材固定装置中，然后利用所述紧固机构将细胞培养耗材夹紧，准备贴壁细胞层的机械化划片;

4）细胞培养基与刀具的接触控制

启动运载开关，装载有细胞细胞培养耗材的细胞培养耗材固定装置靠丝杆运动至刀具划片区域，并使得刀具切头与贴壁细胞层进行划片的初始接触，通过所述刀具夹持装置中的所述测力机构将接触力调整为1-12N;

5）贴壁细胞层的标准化划片

启动导轨装置的丝杆电机，经由单片机控制电机的转动方向与转动步长进而控制所述刀具的划片运动轨迹;

6）完成划片后的细胞培养基收集

所述刀具完成预置的划片路径后，丝杆电机带动细胞培养耗材固定装置离开所述刀具划片区域并回到所述细胞培养耗材固定装置的初始位置，接着通过调整所述细胞培养耗材固定装置的固定机构取出细胞培养耗材，并收集细胞培养耗材中的贴壁细胞划片成片;

7）装置复位与刀具更换

启动复位按钮，将细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置和导轨装置的位置初始化，然后调整所述刀具夹持装置中的刀具夹持环和刀具夹持压紧头，取出刀具进行消毒，并重复步骤2）的操作将新的刀具重新固定于所述刀具夹持装置，准备下一次的划片工作;

8）划片工作结束

当步骤1）所述的整体划片装置受到外界细菌污染、步骤2）所述刀具不足或消毒尚未结束、步骤3）中的需要进行划片的贴壁细胞层已全部划片完毕等一个或多个原因下需要停止细胞培养基的机械化划片时，依次执行步骤7）中的装置复位操作、刀具拆取操作并断开步骤1）中的电源开关，将整体划片装置放置于紫外光消毒室中，完成细胞培养基的机械化划片工作。

进一步的，方法步骤1）中所述细胞操作平台为单一通道的封闭式结构，所述微型对外通道宽度不得超过300mm，优选为200mm，高度不得超过300mm，优选为200mm。

进一步的，方法步骤1）中所述微型划片装置整体主要由细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置和导轨装置三大部分组成，所述微型划片装置长宽高尺寸分别不得超过200、200和300mm，优选长宽高尺寸分别为180mm、180mm、280mm。

进一步的，方法步骤1）中所述微型划片装置整体材料为耐腐蚀、耐磨的金属、非金属材料。

进一步的，方法步骤1）中所述初始化位置中，刀具夹持装置位于细胞培养耗材固定装置的上方，所述刀具夹持装置在安装固定刀具后刀具最前端与细胞培养耗材固定装置表面的最小垂直距离不小于14mm，优选距离为15mm。

进一步的，方法步骤2）中所述刀具夹持装置中的夹持机构夹紧原理为外部约束部件强迫挤压。

进一步的，结构特征2）以及方法步骤2）中所述刀具夹持装置中的力测量机构的测力方式为弹簧测力、力传感器测力的其中一种。当使用弹簧测力时，弹性系数已确定的弹簧被约束于所述刀具夹持装置中，只保证轴向的压缩变形，通过刀具接触弹簧后所施加的压缩量进行接触力的判断。当使用力传感器测力时，压敏测力块被约束于所述刀具夹持装置中，刀具被插入所述刀具夹持装置时刀具底部能够刚好触碰到所述压敏测力块的压力感应区域。

进一步的，结构特征1）以及方法步骤3）中所述细胞培养耗材固定装置的紧固方式为螺栓压紧、弹簧压紧和磁铁压紧之任一，所述紧固方式可以在保证细胞培养耗材完全固定的前提下，满足对细胞培养耗材的随时拆装功能。

进一步的，方法步骤3）中所诉细胞培养耗材可以为α、β、γ型号培养皿之任一。当型号变化时，需要调整所述细胞培养耗材固定装置中所述紧固机构的尺寸。

进一步的，方法步骤4）中所述刀具划片区域的部件主要由刀具夹持装置与导轨装置组成，所述刀具安装于所述刀具夹持装置中心轴位置，所述刀具夹持装置装配于所述导轨装置的丝杆滑块上，所述丝杆滑块的初始位置即为刀具夹持装置的初始位置。

进一步的，方法步骤4）中所述接触力为一个范围值，即1-12N，低于这个范围会导致刀具进行划片时无法将细胞培养基切透，大于这个范围会对细胞培养耗材中培养基底部玻璃薄片造成破坏，进而造成细胞培养基的整体破坏。

进一步的，方法步骤4）中所述刀具为毛细玻璃管和玻璃薄片的其中一种，所述刀具与细胞培养基的划片初始接触点位刀具划片轨迹的起点，所述刀具前端的切头为烧熔毛线玻璃管得到的球状切头，所述球状切头直径不超过2mm，优选为1.4mm。

进一步的，方法步骤5）中所述划片运动轨迹的外轮廓线为可编程形状如矩形或圆形的其中一种，优选为细胞培养耗材的内接正方形。

进一步的，方法步骤6）中所述细胞培养基的划片块为可编程形状如矩形或圆形的其中一种，优选形状为长宽尺寸为均为1mm的正方形，所述划片块的尺寸误差不大于0.3mm，误差控制数值优选为0.1mm。

进一步的，方法步骤1）中从接通整体划片装置电源开始至方法步骤7）中完成刀具的更替，在保证不损伤贴壁细胞层的前提下，单一细胞培养耗材中的贴壁细胞层机械化划片时间范围为15-30分钟，划片时间优选为20分钟，所述划片时间可通过调整结构特征3）中步进电机旋转速度大小来控制。

进一步的，在方法步骤8）中所述断开电源开关后，建议用酒精消毒后的毛巾、棉花等擦拭所述细胞培养耗材固定装置和刀具夹持装置表面，清除贴壁细胞层在表面的可能溅落残留物，防止划片装置整体受到污染。

进一步的，结构特征3）中对所述连接电线的特殊处理，包括且不限于：在电线外端缠绕黑胶布、电线外端绝缘塑料换成黑色绝缘橡胶制品等。

本发明所取得的技术效果：

（1）本发明基于现有贴壁细胞层手工划片的思想，提出并设计出了一种实现贴壁细胞层机械化划片的思路、步骤以及装置，包括前期的准备、细胞培养耗材的固定与运载方法及装置、刀具夹持的装置与方法、划片的轨迹确定、划片完毕后的细胞培养耗材拆取与刀具更换等，填补了当下贴壁细胞层机械化划片的空白，在保证贴壁细胞层划片速度、划片精度和损伤率满足生物医学研究需求的同时，解放了现有划片人员的劳动力；

（2）本发明的机械装置整体尺寸结构以及操作充分满足现有生物医学实验室的划片需求。本发明的机械装置整体结构大规模采用标准件，成本较低；同时整体结构紧凑，尺寸较小，可以直接穿过细胞操作平台的微型通道布置于平台上；对于装置的手动操作内容只有细胞培养耗材的固定与拆取和各类按钮的开关，操作人员在装置划片过程中可以腾出手去处理其余事务；

（3）本发明中涉及的细胞培养耗材固定与刀具夹持均奉行灵活拆取原则，细胞培养耗材与刀具可以分别在各自的装置中实现灵活的安装与固定。同时，细胞培养耗材可以通过调整细胞培养耗材固定装置的尺寸实现不同型号的安装，而刀具与贴壁细胞层的接触力可以很好的控制，这保证了整体划片装置能够灵活的应对不同的细胞培养耗材和细胞培养基。

附图说明

图1为本发明实施例1的实现细胞培养基机械化划片的总装置结构图；

图2为本发明实施例1中的刀具夹持装置；

图3为本发明实施例1中的细胞培养耗材固定装置；

图4为本发明实施例2的实现细胞培养基机械化划片总装置的另一形式。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置作进一步详细说明。

实施例1

本实施例为实现贴壁细胞层机械化划片的一种具体装置，如图1所示：含有待划片贴壁细胞层的细胞培养耗材15被固定于细胞培养耗材固定装置16上，而细胞培养耗材固定装置16经由螺栓连接固定于装载板8上，所述装载板8的一边通过L型角铁7与光轴滑块6相连，所述光轴滑块6与光轴2配合，保证运载板8在带动细胞培养耗材固定装置16抬升时不会失去平衡，所述装载板8的另一边与竖直丝杆17相配合，竖直丝杆7由竖直电机13控制旋进方向和速度。刀具5被固定于刀具夹持装置4中，而刀具夹持装置4通过螺纹连接被固定于丝杆滑块14，所述丝杆滑块14与X轴丝杆3和Y轴丝杆12连接，所述X轴丝杆3由X方向电机10控制旋进方向和速度，所述Y轴丝杆12由Y方向电机1控制旋进方向和速度。螺纹杆11负责将X轴丝杆3、X方向电机10以及丝杆滑块12统合为一体，使得丝杆滑块12的X、Y方向的运动互不干涉。所有装置运动涉及到的单片机电路都统一放置于电箱9中。当细胞培养耗材15固定好后，启动运载开关，竖直电机13带动竖直丝杆17转动，并配合另一边的光轴滑块6与光轴2带动运载板8稳定的上升，直至细胞培养耗材15中的细胞培养基接触到刀具5并达到接触力的范围，此时单片机判定完成初始接触，随后单片机控制X方向电机10与Y方向电机1的旋转速度和旋转方向，最终通过丝杆滑块14的运动控制刀具5的划片轨迹。当单片机判定划片完毕后，竖直电机13再一次启动，带动运载板8将细胞培养耗材15降到初始位置，此时操作人员取出细胞培养耗材15，更换刀具5，一次划片过程结束。

本实施例为实施例1中刀具夹持装置4的一种具体结构，其测力原理为弹簧测力，如图2的轴测图（左）与半剖图（右）所示：螺纹柱20用于连接导轨滑块，外覆盖板21和夹持装置主体23将承载片28与弹簧27约束住，只保留了承载片28与控力弹簧27竖直方向的变形。刀具夹持头26分为左右两半，并拢后可以将刀具5夹紧，所述夹紧为约束刀具5的平面移动，但对刀具5竖直方向的运动进行保留。刀具夹持头26的并拢与放松受刀具夹持环25的控制，当压缩夹紧弹簧24时，刀具夹持环25往上抬，不再压迫刀具夹持头26，刀具夹持头26放松，此时可以进行刀具5的更换操作，当刀具5更换完毕后，放开夹紧弹簧24，刀具夹持环25压迫刀具夹持头26的外表面，进而对刀具5进行夹紧。开始划片时，刀具5接触到细胞培养基，受细胞培养基的支持力影响发生竖直向上运动，靠承载片28对控力弹簧27产生压缩力，通过控制刀具5竖直向上运动的位移量，配合控力弹簧27的弹性系数，可以得出接触力的大小，从而实现对接触力的控制。

本实施例为实施例1中细胞培养耗材固定装置16的一种具体结构，其压紧原理为磁铁吸引压紧，如图3所示：装置由细胞培养耗材固定装置下盘件37、下盘件磁铁约束环35、细胞培养耗材固定装置上盘件34以及上盘件磁铁约束环33组成，并由螺栓通过螺丝孔32进行装配连接。磁铁36首先被装于细胞培养耗材固定装置下盘件37和细胞培养耗材固定装置上盘件34中，然后从下往上依次叠放细胞培养耗材固定装置下盘件37、下盘件磁铁约束环35、细胞培养耗材、细胞培养耗材固定装置上盘件34和上盘件磁铁约束环33，并用螺栓约束住平面方面的自由度。由于磁铁36互相的吸引力，细胞培养耗材15被牢牢压紧，从而实现了细胞培养耗材环向与轴向自由度的约束。

实施例2

本实施例为实现细胞培养基机械化划片的另一类装置，其特征类似于实施例1，区别在于：本实施例的细胞培养耗材固定装置的抬升手段、结构布局、刀具与细胞培养基接触力的测力手段不同，如图4所示：标准手动抬升装置44代替了实施例1中竖直电机13与竖直丝杆17的抬升作用，操作人员可以操控标准手动抬升装置44的抬升杆并根据标准手动抬升装置44上的刻度将细胞培养耗材固定装置16抬升至于刀具接触，刀具夹持装置43带有力传感器，刀具与力传感器接触后的信息经由电线传递到显示屏42，实现对接触力的精确掌控。结构布局方面，实施例2的单片机电路与电机被放置到了细胞培养耗材固定装置16的侧面，分别放置于电路存放层41与电机安装层40。实施例2在尺寸上与实施例1相比，高度减小，宽度增大，仍然可以通过无菌操作平台的微型通道直接布置于平台上。

Claims (10)

1.一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：利用微型划片装置对贴壁细胞层进行机械划片操作以取代现有的手工划片，所述微型划片装置可穿过微型对外通道直接布置于超净台或者生物安全柜内，实现贴壁细胞层的无菌划片，所述微型划片装置利用内置的细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置以及导轨装置等装置部件实现细胞培养耗材的运载、返还和以及细胞培养耗材底部贴壁细胞层的机械化划片，最终可快速获得尺寸标准且损伤率低的微型细胞成片,主要步骤如下：

1）前期准备

将微型划片装置的整体至于紫外光消毒环境中至少消毒30分钟后，通过微型对外通道直接布置于无菌操作平台上，随后链接平台电源，并启动复位按钮，保证细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置以及导轨装置位于初始化位置;

2）刀具安装

调整刀具夹持装置中的刀具夹紧机构，将已消毒好的刀具固定于所述刀具夹持装置中，并保证刀具末端与刀具夹持装置中的测力机构接触;

3）细胞培养耗材固定

调整细胞培养耗材固定装置中的紧固机构，将装有贴壁细胞层的细胞培养耗材放置于所述细胞培养耗材固定装置中，然后利用所述紧固机构将细胞培养耗材夹紧，准备贴壁细胞层的机械化划片;

4）贴壁细胞层与刀具的接触控制

启动运载开关，装载有细胞细胞培养耗材的细胞培养耗材固定装置靠丝杆运动至刀具划片区域，并使得刀具切头与贴壁细胞层进行划片的初始接触，通过所述刀具夹持装置中的所述测力机构将接触力调整为1-12N;

5）贴壁细胞层的标准化划片

启动导轨装置的丝杆电机，经由单片机控制电机的转动方向与转动步长进而控制所述刀具的划片运动轨迹;

6）完成划片后的贴壁细胞层划片成片收集

所述刀具完成预置的划片路径后，丝杆电机带动细胞培养耗材固定装置离开所述刀具划片区域并回到所述细胞培养耗材固定装置的初始位置，接着通过调整所述细胞培养耗材固定装置的固定机构取出细胞培养耗材，并收集细胞培养耗材中的贴壁细胞划片成片;

7）装置复位与刀具更换

启动复位按钮，将细胞培养耗材固定装置、刀具夹持装置和导轨装置的位置初始化，然后调整所述刀具夹持装置中的刀具夹持环和刀具夹持压紧头，取出刀具进行消毒，并重复步骤2）的操作将新的刀具重新固定于所述刀具夹持装置，准备下一次的划片工作;

8）划片工作结束

当步骤1）所述的整体划片装置受到外界细菌污染、步骤2）所述刀具不足或消毒尚未结束、步骤3）中的需要进行划片的贴壁细胞层已全部划片完毕等一个或多个原因下需要停止贴壁细胞层的机械化划片时，依次执行步骤7）中的装置复位操作、刀具拆取操作并断开步骤1）中的电源开关，将整体划片装置放置于紫外光消毒室中，完成细胞培养基的机械化划片工作。

2.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤1）中所述无菌操作平台与外界相连的微型对外通道宽度不得超过300mm，优选为200mm，高度不得超过300mm，优选为200mm，步骤2）中所述刀具的直径不超过1mm，优选为0.9mm，所述刀具切头为烧熔毛线玻璃管得到的球状切头，所述球状切头直径不超过2mm，优选为1.4mm。

3.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤1）中所述的初始化位置中，刀具夹持装置位于细胞培养耗材固定装置上方，所述刀具夹持装置在安装固定刀具后刀具前端与细胞培养耗材固定装置表面的最小垂直距离不小于14mm，优选为15mm。

4.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤1）所述的整体划片装置由耐腐蚀、耐磨的金属与非金属材料制成，步骤2）中所述刀具的材料为玻璃。

5.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤2）中所述刀具夹持装置中的夹持机构夹紧原理为外部约束部件对刀具进行强迫挤压，所述刀具夹持装置中的力感应机机构的测力方式为弹簧测力、力传感器测力的其中一种。

6.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤3）中所述细胞培养耗材固定装置的紧固机构的压紧原理为螺栓压紧、弹簧压紧和磁铁压紧的其中一种，所述细胞培养耗材可以为

型号培养皿的其中一种。

7.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤4）中所述刀具划片区域的部件主要由刀具夹持装置与导轨装置组成，所述刀具装夹于所述刀具夹持装置中心轴位置，所述刀具夹持装置装配于所述导轨装置的丝杆滑块上。

8.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤4）所述初始接触点位置为所述导轨装置中滑块的初始化位置，所述划片运动轨迹的外轮廓线为矩形、圆形等可编程形状，优选为细胞培养耗材的内接正方形，所述划片运动轨迹为预置的标准化无重复划片路径，所述划片运动轨迹的起点与终点为同一点。

9.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤6）所述贴壁细胞层划片成片为长宽尺寸不超过1.5mm×1.5mm的矩形，优选长宽尺寸为1mm×1mm，最小分辨率尺寸为丝杆组件可控最小移动单位，所述划片块的尺寸误差维持在不大于0.3mm，优选为0.1mm。

10.根据权利要求1所述的一种贴壁细胞层机械化划片的方法及装置，其特征在于：步骤1）中从接通整体划片装置电源开始至方法步骤7）中完成刀具的更替，在保证不损伤贴壁细胞层的前提下，贴壁细胞层机械化划片的时间范围为15-30分钟，划片时间优选为20分钟，所述划片时间可通过调整结构特征3）中步进电机旋转速度大小来控制。

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