CN114126651A - 对二肽重复蛋白的抑制 - Google Patents

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Abstract

公开了用于通过使用有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂来降低由二肽重复蛋白(DRP)引起的细胞毒性以治疗神经退行性病症例如ALS和FTD的方法。

Description

对二肽重复蛋白的抑制
相关申请
本申请要求于2019年6月28日提交的美国临时申请No.62/868,267和2020年5月22日提交的美国临时申请No.63/028,753的优先权。这两份申请的内容通过引用在此并入。
背景技术
本发明涉及神经病症，例如肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)和额颞痴呆(Frontotemporal Dementia，FTD)的治疗。
ALS是一种进行性神经病症，其特征在于由脊柱和脑中的运动神经元变性导致的肌纤维萎缩。FTD是65岁以下人群中第二常见形式的早发性痴呆(仅次于阿尔茨海默病)。
最近已经报道了基因染色体9开放阅读框72(chromosome 9open reading frame72，C9ORF72)中六核苷酸(GGGGCC)重复序列的扩增可能是导致ALS和FTD二者发病的一个因素。参见，Jovicic etal.“Modifiers of C9orf72 DRP toxicity implicatenucleocytoplasmic transport impairments in c9FTD/ALS，”Nat Neurosci.2015Sep 18(9)1226-1229。从包含扩增的GGGGCC重复序列的突变C9ORF72基因转录的RNA通过非ATG起始机制翻译。这驱动了二肽重复蛋白(dipeptide repeat protein，DRP)的形成和胞内积累。从六核苷酸重复序列的有义或反义方向上的所有六个阅读框翻译的DRP导致五种DRP的表达：甘氨酸-丙氨酸(GA)、甘氨酸-精氨酸(GR)、脯氨酸-丙氨酸(PA)、脯氨酸-精氨酸(PR)和甘氨酸-脯氨酸(GP)。(特别地，GP可以由有义和反义阅读框二者生成。)然而，每种DRP对神经退行性病变的作用机制和贡献仍不清楚。
本发明的一个目的是提供新的通过抑制或降低由DRP引起的细胞毒性来治疗神经退行性疾病的方法。
发明概述
公开了用于降低由DRP引起的细胞毒性的方法。已经发现，两种类型的DRP，甘氨酸-精氨酸(GR)和脯氨酸-精氨酸(PR)，对细胞生存力特别不利，并且如果不加以控制，可导致细胞功能障碍或导致细胞死亡，尤其是在神经元细胞中。不受任何理论的束缚，在一些方面中，由DRP引起的毒性作用是由二肽重复序列内精氨酸底物的不对称甲基化驱动的，而不是由内源性蛋白质的异常甲基化驱动的。
在本发明的一个方面中，公开了这样的方法：其包括施用有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂以降低细胞中DRP的毒性，例如以消除由二肽重复序列内精氨酸底物的不对称甲基化产生的毒性。可用的I型PRMT抑制剂包括可以抑制PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和/或PRMT8中的至少一种的药剂。I型PRMT抑制剂的一些实例包括但不限于MS023、MS049、EPZ020411、GSK715(也称为GSK3368715或EPZ019997)和/或TP 064(在下文更详细地描述)。
I型PRMT抑制剂在降低由DRP引起的细胞毒性方面特别有用，所述DRP包含氨基酸精氨酸(R)，例如聚-甘氨酸-精氨酸(GR)和/或聚-脯氨酸-精氨酸(PR)二肽重复序列。本发明尤其可用于保护神经元细胞，例如感觉神经元、运动神经元和/或中间神经元免受DRP毒性。
特别地，当神经退行性疾病与对象神经元细胞中的DRP表达相关时，所述方法可用于治疗这样的神经退行性疾病。例如，所述方法可用于治疗C9ORF72相关的ALS或C9ORF72相关的FTD。
在又一方面中，治疗方法还包括施用第二治疗剂，例如利鲁唑(riluzole)和/或依达拉奉(edaravone)。或者，第二治疗剂是抗体或其抗原结合部分，例如阻断人CD40与CD40L相互作用的抗体。
本公开内容的其他特征和优点将从以下详细描述和实施例中变得明显，以下详细描述和实施例不应被解释为是限制性的。在本申请通篇引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和公开的专利申请的内容均通过引用明确地并入本文。
附图简述
图1A至1D是比较了通过WST-1测定测量的MS023(图1A和1B)和GSK591(图1C和1D)在NSC-34运动神经元样细胞中消除由3μM GR15诱导的代谢障碍的活性的图。
图2A至2D是比较了通过WST-1测定测量的MS023在NSC-34运动神经元样细胞中消除由3μM GR15(图2A和2B)或3μM PR15(图2C和2D)诱导的代谢障碍的活性的图。
图3A至3D是比较了较低剂量范围的DRP(0.01至3μM)对通过WST-1测定测量的MS023消除由3μM剂量的GR15(图3A和3B)或PR15(图3C和3D)诱导的代谢障碍的活性的影响的图。
图4A至4D是比较了通过LDH测定测量的MS023(1至60μM)消除由GR15(300nM)(图4A和4B)和PR15(300nM)(图4C和4D)产生的细胞毒性的活性的图。
图5A至5D是比较了通过LDH测定测量的MS023(1至60μM)消除由GR15(3μM)(图5A和5B)和PR15(3μM)(图5C和5D)产生的细胞毒性的活性的图。
图6A至6D是比较了通过LDH测定测量的MS023(0.01至3μM)消除由GR15(3μM)(图6A和6B)和PR15(3μM)(图6C和6D)产生的细胞毒性的活性的图。
图7A至7D是比较了通过胱天蛋白酶-3测定测量的MS023(1至60μM)消除由GR15(300nM)(图7A和7B)和PR15(300nM)(图7C和7D)诱导的凋亡活性的活性的图。
图8A至8D是比较了通过胱天蛋白酶-3测定测量的MS023(0.01至3μM)消除由GR15(3μM)(图8A和8B)和PR15(3μM)(图8C和8D)诱导的凋亡活性的活性的图。
图9A至9D是比较了通过BrdU ELISA测量的MS023(1至60μM)消除由GR15(300nM)(图9A和9B)和PR15(300nM)(图9C和9D)诱导的增殖抑制的活性的图。
图10A至10D是比较了神经元和非神经元细胞类型中DRP诱导的代谢障碍表型的图，其通过WST-1测定使用中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)和小鼠神经母细胞瘤-脊髓杂交(NSC-34)细胞以及富含精氨酸：GR15、PR15(图10A和10B)和非富含精氨酸：GP15、PA15(图10C和10D)、DRP(剂量为30和3μM)测量。
图11是示出了通过LDH测定确定的NSC-34细胞中DRP诱导的毒性的剂量响应模式的图。
图12是示出了通过胱天蛋白酶-3测定确定的NSC-34细胞中DRP诱导的凋亡活性的剂量响应模式的图。
图13是示出了通过BrdU ELISA确定的NSC-34细胞中DRP诱导的增殖抑制的剂量响应模式的图。
图14是示出了MS023降低NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化的图。
图15A和15B呈现了合成的GR15的体外精氨酸甲基化的定量图像分析。
图16A至16D是比较了通过LDH测定测量的MS049(0.2至100μM)消除由GR15(3μM)(图16A和16B)和PR15(3μM)(图16C和16D)产生的细胞毒性的活性的图。
图17是示出了MS049降低NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化的图。
图18A至18F是比较了通过WST-1测定测量的MS023(0.2至60μM)消除由GR15(3μM)(图18A和18B)和PR15(3μM)(图18C和18D)产生的代谢障碍的活性的图，阴性对照为MS094(0.2至60μM)(图18E和18F)。
图19A至19F是比较了通过LDH测定测量的MS023(0.2至60μM)消除由GR15(3μM)(图19A和19B)和PR15(3μM)(图19C和19D)产生的细胞毒性的活性的图，阴性对照为MS094(0.2至60μM)(图19E和19F)。
图20A至20D是比较了通过LDH测定测量的MS049(0.2至100μM)消除由GR15(3μM)(图20A和20B)和PR15(3μM)(图20C和20D)产生的细胞毒性的活性的图。
图21A至21D是比较了通过WST-1测定测量的EPZ020411(0.2至20μM)消除由GR15(3μM)(图21A和21B)和PR15(3μM)(图21C和21D)产生的代谢障碍的活性的图。
图22A至22D是比较了通过LDH测定测量的EPZ020411(0.2至20μM)消除由GR15(3μM)(图22A和22B)和PR15(3μM)(图22C和22D)产生的细胞毒性的活性的图。
图23A至23F是比较了通过WST-1测定测量的GSK3368715(0.1至10μM)消除由GR15(3μM)(图23A和23B)和PR15(3μM)(图23C和23D)产生的代谢障碍的活性的图，其中0.10％DMSO为对照(图23E和23F)。
图24A至24D是比较了通过WST-1测定测量的GSK3368715(0.1至10μM)(图24A和24B)和MS023(0.1至10μM)(图24C和24D)消除由GR15(3μM)产生的代谢障碍的活性的图。
图25A至25D是比较了通过LDH测定测量的GSK3368715(0.1至10μM)消除由GR15(3μM)(图25A和25B)和PR15(3μM)(图25C和25D)产生的细胞毒性的活性的图。
图26A至26D是比较了通过WST-1测定测量的GSK591(3至200μM)(图26A和26B)和MS023(0.1至60μM)(图26C和26D)消除由PR15(3μM)产生的代谢障碍的活性的图。
图27A至27E是比较了通过WST-1测定测量的由GR15和不对称二甲基化(ADMe)-GR15产生的代谢障碍的剂量响应模式的图。
图28A至28E是比较了通过LDH测定测量的由GR15和不对称二甲基化(ADMe)-GR15产生的细胞毒性的剂量响应模式的图。
图29A至29D、30A至30D和31A至31D是比较了通过WST-1测定测量的并在三个不同日期独立重复的MS023(0.1至10μM)消除由GR15和ADMe-GR15(3μM)产生的代谢障碍的活性的图。
图32A至32D是比较了通过LDH测定测量的MS023(0.1至10μM)消除由GR15(3μM)(图32A和32B)和ADMe-GR15(3μM)(图32C和32D)产生的细胞毒性的活性的图。
图33是总结了抑制二甲基化活性的IC50和消除由GR15或PR15攻击引起的毒性的EC50以及每种受试化合物的化学结构的表格。
图34是示出了本文中所述的测定结果的示意图。
发明详述
本发明提供了通过使细胞与有效量的I型PRMT抑制剂(例如，抑制PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6或PRMT8中的至少一种的药剂，例如MS023、MS049、EPZ020411、GSK715、TP 064、和/或其衍生物)接触来抑制细胞中DRP诱导的毒性(例如，消除由二肽重复序列中精氨酸底物(例如GR和/或PR)的不对称甲基化产生的毒性)的方法，其中细胞功能障碍或细胞死亡减少。本文中进一步提供了通过施用有效量的I型PRMT抑制剂来治疗与DRP的表达相关的神经退行性疾病(例如，ALS或FTD)的方法，以及I型PRMT抑制剂在治疗神经退行性疾病中的用途，或用于制造用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
I.定义
以下缩写在说明书通篇使用并且是本领域技术人员已知的；ALS(肌萎缩侧索硬化)；FTD(额颞痴呆)；C9ORF72(染色体9开放阅读框72)；SOD1(超氧化物歧化酶-1)；和PRMT(蛋白质精氨酸甲基转移酶)。
在以下描述中，以及在通过引用并入的文件中，广泛地使用了大量术语。提供以下定义以促进对本文中公开的方法和组合物的理解。
如本文中所使用的，“二肽重复蛋白”(DRP)是指由两个氨基酸的重复单元组成的肽。DRP的一些实例包括当从突变的C9ORF72基因(包含扩增的GGGGCC重复序列)转录的RNA通过非AUG起始机制翻译时形成的DRP。从六核苷酸重复序列的有义或反义方向上的所有六个阅读框翻译的DRP导致五种DRP的表达：甘氨酸-丙氨酸(GA)、甘氨酸-精氨酸(GR)、脯氨酸-丙氨酸(PA)、脯氨酸-精氨酸(PR)和甘氨酸-脯氨酸(GP；GP由有义和反义阅读框二者生成)。
已表明，DRP对细胞具有“毒性”，例如通过干扰基因(例如C9orf72基因)的正常功能以及干扰细胞蛋白质，从而导致细胞功能障碍、变性和死亡。因此，术语“毒性的”和“毒性”可互换使用，并且是指物质(例如，DRP或DRP的混合物)可损害细胞(例如，神经元细胞)和/或包含细胞的生物体(例如人、动物或细菌)的程度。这样的毒性作用包括，例如，细胞功能的丧失和/或细胞死亡。
如本文中所使用的，术语“甲基转移酶”是指能够将甲基从供体分子转移到接受体分子(例如蛋白质的氨基酸残基或DNA分子的核酸碱基)的一类转移酶。甲基转移酶通常使用与S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)中的硫结合的反应性甲基作为甲基供体。一种甲基转移酶类型的一个实例包括“蛋白质精氨酸甲基转移酶”(proteinargininemethyltransferase，PRMT)。PRMT催化精氨酸残基的甲基化(蛋白质的常见的翻译后修饰)。精氨酸的二甲基化通过中间体ω-NG-单甲基精氨酸进行，并且产生对称的ω-NGN′G-二甲基精氨酸或不对称的ω-NG，NG-二甲基精氨酸。PRMT根据其最终产物分为I型和II型酶。这两种类别都催化单甲基化精氨酸的形成。I型PRMT将中间体ω-NG-单甲基精氨酸转化为不对称二甲基精氨酸，而II型PRMT将中间体ω-NG-单甲基精氨酸转化为对称二甲基精氨酸。在哺乳动物中，I型PRMT包括PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8。
PRMT的“抑制剂”(例如，I型PRMT抑制剂)是“抑制”或“阻断”PRMT(例如，I型PRMT)的活性的分子。术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并且涵盖部分和完全抑制/阻断至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，如例如通过本文中所述的方法确定的。或者，抑制剂(例如，I型PRMT抑制剂)的抑制/阻断导致细胞活性和/或细胞寿命提高至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，如例如通过本文中所述的方法确定的。PRMT的抑制剂包括例如MS023、MS049、EPZ020411、GSK715和/或TP064。
术语“有效量”是指提供期望的生物学、治疗性和/或预防性结果的药剂的量。该结果可以是疾病的体征、症状或原因中一种或更多种的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或生物系统的任何其他期望的改变。组合物的治疗有效量可根据以下因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药理学药剂在个体中引发期望响应的能力。治疗有效量也是其中治疗有益作用超过药理学药剂的任何毒性或不利作用的量。
关于细胞毒性的降低，有效量，例如，包括足以使细胞增殖率恢复到与健康的、未经处理的细胞的增殖率相等的量，即没有异常增殖。关于神经退行性疾病(例如，ALS或FTD)的治疗，有效量是足以预防或延迟与疾病相关的症状(例如，肌无力和/或认知障碍)的量。有效量可以以一次或更多次施用来施用。在一个实例中，“有效量”是在临床上被证明引起与疾病(例如，ALS或FTD)相关的症状显著改善的I型PRMT的量。
如本文中所使用的，术语“固定剂量”、“平剂量(flat dose)”和“平固定剂量”可互换使用，并且是指不考虑患者的体重或体表面积(body surface area，BSA)而施用至患者的剂量。因此，固定或平剂量不是作为mg/kg剂量而是作为药剂(例如I型PRMT)的绝对量提供。
术语“神经元细胞”是指一种专化的、脉冲传导细胞，它是神经系统的功能单位，由细胞体及其过程、轴突和树突组成。神经元细胞包括感觉神经元、运动神经元和中间神经元。
术语“神经干细胞”或“神经祖细胞”或“神经前体细胞”是指这样的细胞：其可以产生为神经元细胞(例如神经元前体或成熟神经元)或神经胶质细胞(例如神经胶质前体，成熟的星形胶质细胞或成熟的少突胶质细胞)的后代。通常，细胞表达一些为神经谱系的特征的表型标志物。
如本文中所使用的，术语“对象”是人或其他动物，例如患有神经病症的人。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。对象的一些实例可以包括但不限于人、马、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、猪、山羊和绵羊。在一些实施方案中，“对象”通常是被诊断为ALS或FTD的人患者。
术语“C9ORF72相关的ALS”和“C9ORF72相关的FTD”分别是指影响携带扩增的六核苷酸(GGGGCC)重复序列突变(例如上述C9ORF72突变)之个体的ALS和FTD的形式。在一般群体(未受ALS或FTD影响)中，染色体9的开放框区域72通常显示出3至10且几乎总是少于20次重复的GGGGCC六核苷酸重复序列的束(tract)。因此，在染色体9的开放框区域72中具有多于20次六核苷酸重复或多于30次六核苷酸重复或更多、患有ALS或FTD的个体可患有“C9ORF72相关的ALS”或“C9ORF72相关的FTD”。
如本文中所使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”旨在涵盖预防发作、减缓进展、逆转或以其他方式改善神经病症，例如神经退行性病症和/或神经肌病症。
如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”是指以特定神经元群的进行性功能障碍、变性和死亡为特征的病症。神经退行性疾病的一些实例包括，例如，ALS和FTD，其包括“C9ORF72相关的ALS”和“C9ORF72相关的FTD”，它们可以以常染色体显性方式遗传，具有年龄依赖性外显率。
除非上下文另有明确指示，否则本文中和所附权利要求书中所使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。因此，例如，提及“分子”包括一个/种或更多个/种这样的分子，并且提及“方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可修改或替代本文中所述方法的等同步骤和方法。
术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，例如，特定目的所需的测量系统或精确度的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1或多于1标准偏差内。或者，“约”可以意指给定值的多至20％、优选多至10％、更优选多至5％并且仍更优选多至1％的范围。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应认为术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
II.组合物
还提供了用于本发明方法中的组合物，例如药物组合物。这样的组合物含有与可药用载体一起配制的I型PRMT抑制剂。I型PRMT抑制剂包括例如抑制PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和/或PRMT8的药剂，例如MS023、MS049、EPZ020411、GSK715和/或TP 064。
一种示例性的I型PRMT抑制剂是称为MS023的化合物，其具有以下化学式：
Figure BDA0003435616990000091
另一种示例性的I型PRMT抑制剂是称为MS049的化合物，其具有以下化学式：
Figure BDA0003435616990000092
另一种示例性的I型PRMT抑制剂是称为EPZ020411的化合物，其具有以下化学式：
Figure BDA0003435616990000101
另一种示例性的I型PRMT抑制剂是称为GSK715的化合物，其具有以下化学式：
Figure BDA0003435616990000102
另一种示例性的I型PRMT抑制剂是称为TP 064的化合物，其具有以下化学式：
Figure BDA0003435616990000103
更一般地，I型PRMT抑制剂还可以包括：例如，美国专利申请公开No.US2016/0137609和US2019/0077795(二者均转让给Cambridge MA的Epizyme，Inc.)中描述的化合物，或者US20100151506中描述的化合物(其转让给南卡罗来纳大学(University of SouthCarolina))，其公开内容通过引用整体并入本文。
如本文中所使用的，短语“可药用载体”意指参与携带或运输化学试剂的可药用材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。可药用载体的一些实例是生理上相容的溶剂、稀释剂、分散介质、悬浮助剂、表面活性剂、防腐剂、固体黏合剂、稳定剂、填充剂、黏结剂、润滑剂、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。Remington的Pharmaceutical Sciences(A.Osol et al.eds.，15th ed.1975)中公开了用于配制药物组合物的多种载剂和载体以及用于其制备的已知技术。可药用载体还可包含少量增强药理学药剂的保质期或有效性的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。
可药用载体还包括可药用盐，其中术语“可药用盐”包括用相对无毒性的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于本文中所述化合物上存在的特定取代基。可药用盐包括但不限于酸性或碱性基团的盐。本质上呈碱性的化合物能够与多种无机和有机酸形成广泛多种的盐。可用于制备这样的碱性化合物的可药用酸加成盐的酸是形成无毒性酸加成盐的那些酸，该无毒性酸加成盐即含有可药用阴离子的盐，包括但不限于：硫酸、硫代硫酸、柠檬酸、马来酸、乙酸、草酸、盐酸根、氢溴酸根、氢碘酸根、硝酸根、硫酸根、硫酸氢根、亚硫酸氢根、磷酸根、磷酸、异烟酸根、硼酸根、乙酸根、乳酸根、水杨酸根、柠檬酸根、柠檬酸、酒石酸根、油酸根、鞣酸根、泛酸根、酒石酸氢根、抗坏血酸根、琥珀酸根、马来酸根、龙胆酸根(gentismate)、富马酸根、葡糖酸根、葡醛酸根、糖酸根、甲酸根、苯甲酸根、谷氨酸根、甲烷磺酸根、乙烷磺酸根、苯磺酸根、对甲苯磺酸根、碳酸氢根、丙二酸根、甲磺酸根、乙磺酸根、napsydisyfate、甲苯磺酸根、苯磺酸根、正磷酸根、三氟乙酸根和双羟萘酸根(即，1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))的盐。包括氨基部分的化合物可以与除上述酸之外的多种氨基酸形成可药用盐。本质上呈酸性的化合物能够与多种药理学上可接受的阳离子形成碱盐。这样的盐的一些实例包括但不限于碱金属或碱土金属盐，特别是钙、镁、铵、钠、锂、锌、钾和铁盐。本发明还包括本文中所述化合物的季铵盐，其中所述化合物具有一个或更多个叔胺部分。
这样的载体能够使本发明化合物被配制成片剂、丸剂、糖衣丸剂(dragee)、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆料、混悬剂等，用于待治疗患者的经口摄入。合适的赋形剂特别是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果期望的话，可添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者藻酸或其盐(例如藻酸钠)。在一个实施方案中，甘露糖醇和硬脂酸镁用作可药用载体。
在一些优选的实施方案中，本发明的化合物与辅料(adiuvant)一起施用。术语“辅料”可以是可增强另一治疗剂的活性但单独施用时缺乏显著活性的化合物。在一些实施方案中，辅料选自缓冲剂、抗微生物防腐剂、表面活性剂、抗氧化剂、张力调节剂、消毒防腐剂、增稠剂和黏度改进剂。
本发明的药物组合物可以是多种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液剂(例如，可注射和可输注溶液剂)、分散体或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗性应用。在一个实施方案中，优选的施用方式是经口递送。
多种固体经口剂型可用于施用本发明的化合物，包括例如片剂、囊形片、胶囊剂、囊片剂、颗粒剂、锭剂和散装散剂的固体形式。
多种液体经口剂型也可用于施用本发明的化合物，包括水性和非水性溶液剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。这样的剂型还可包含本领域已知的合适的惰性稀释剂(例如水)和本领域已知的合适的赋形剂，例如防腐剂、润湿剂、甜味剂、调味剂，以及用于乳化和/或混悬本发明化合物的试剂。本发明的化合物可以以等张无菌溶液剂的形式注射，例如静脉内注射。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。组合物可以被配制成溶液剂、微乳剂、分散体、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液剂可以通过将所需量的活性化合物(即药理学药剂)与上面列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入到合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。
通常，通过将活性化合物并入到无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基本分散介质和来自上面列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和喷雾干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。溶液的适当流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂来维持。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
也可将补充活性化合物并入到组合物中。在某些实施方案中，I型PRMT抑制剂与可用于改善药理学药剂的药代动力学和/或治疗退行性疾病的一种或更多种另外的治疗剂共配制和/或共施用。
III.方法
本文中提供了用于治疗神经退行性疾病的临床方法，其包括通过本领域已知的多种方法施用I型PRMT抑制剂。可以调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗或预防响应)。例如，可施用单次推注(single bolus)，可随时间施用数个分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度所指示的按比例降低或提高剂量。在一个实施方案中，施用初始推注剂量，然后施用较小的维持剂量。以剂量单位形式配制组合物对于方便施用和剂量均匀是特别有利的。
本文中使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗哺乳动物对象的单位剂量的物理分散单元；每个单元包含经计算与所需药用载体联合产生期望治疗效果的预定量活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由以下决定并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗或预防效果，以及(b)复配这样的活性化合物的领域中针对个体中治疗敏感性的固有限制。
要注意的是，剂量值可以随待减轻的病症的类型和严重性而变化。还应理解，对于任何特定的对象，应根据个体需要和施用或监督该组合物的施用的人的专业判断，随时间调整具体剂量方案，并且本文中列出的剂量范围仅是示例性的而无意于限制所要求保护的组合物的范围或实践。
用于在人患者中治疗神经退行性疾病(例如，ALS或FTD)的合适治疗方案包括，例如，向患者施用有效量的I型PRMT抑制剂，其导致疾病的体征、症状或原因中一种或更多种的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解(例如，肌无力的减少)，或生物系统的任何其他期望的改变。或者，I型PRMT抑制剂以约0.01、0.03、0.1、0.3、1或3.0μM，优选约1.0μM或3.0μM的平剂量施用。
在另一些实施方案中，I型PRMT抑制剂的剂量按体重计算，例如mg/kg体重。在另一个实施方案中，I型PRMT抑制剂的剂量是平固定剂量。在另一个实施方案中，I型PRMT抑制剂的剂量随时间变化。例如，I型PRMT抑制剂可以最初以高剂量施用，并且可以随着时间降低。在另一个实施方案中，I型PRMT抑制剂抗体最初以低剂量施用并随时间增加。
在另一个实施方案中，所施用的I型PRMT抑制剂的量对于每个剂量是恒定的。在另一个实施方案中，所施用的抑制剂的量随每个剂量而变化。例如，抑制剂的维持(或后续)剂量可以高于首次施用的负荷剂量或与其相同。在另一个实施方案中，抑制剂的维持剂量可以低于负荷剂量或与其相同。
以下实施例仅是举例说明性的，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容的范围，因为在阅读本公开内容之后，许多变化方案和等同方案对于本领域技术人员而言将变得明显。
在本申请通篇引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和公开的专利申请的内容均通过引用明确地并入本文。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，但所述实施例不应被理解为进行进一步限制。所有附图以及在本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用明确地并入本文。
实施例
材料和方法
以下材料和方法用于下述实施例中。
WST-1测定：WST-1测定是一种测量细胞代谢的比色测定。具有健康代谢的细胞含有线粒体脱氢酶，该酶从某些分子中去除氢原子，从而释放能量，细胞可利用这些能量进行关键反应。在WST-1测定中，应用了水溶性四唑盐底物(称为WST-1)，其在施加之后很容易进入细胞及其线粒体。如果细胞有生存力，那么其线粒体脱氢酶将催化将这种WST-1底物转化为一种称为甲臜的有色产物的反应。可以使用分光光度计(板读取仪)对有生存力细胞产生的这种有色甲臜产物进行定量。越高的吸光度读取对应越高的代谢活性/细胞生存力。
LDH测定：LDH测定是一种测量细胞毒性和死亡的比色测定。当细胞暴露于细胞毒性化合物时，它们可能会经历称为坏死的类型的细胞死亡，这首先会导致细胞肿胀和细胞膜完整性的丧失。当细胞丧失膜完整性时，存在于活细胞中的称为乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)的酶被释放到垂死细胞周围的溶液中。为程序性细胞死亡形式的凋亡，以及其他形式的细胞死亡也最终导致细胞膜被破坏，导致LDH大量释放到胞外空间中。因此，LDH不仅是坏死的极好标志物，而且是所有细胞死亡实例的极好标志物。在LDH测定中，细胞周围的溶液样品被分离，并转移至含有LDH反应混合物的板。该反应混合物包含四唑盐中间体和其他反应成分，当暴露于LDH时，所述其他反应成分将四唑盐转化为有色的甲臜产物。这种甲臜产物可以通过分光光度法进行量化。越大的吸光度读取对应越多的细胞死亡。
胱天蛋白酶-3/CPP32测定：胱天蛋白酶-3测定是一种测量凋亡细胞死亡的荧光测定。凋亡是“程序性”细胞死亡的形式，其中细胞内的某些蛋白质家族触发导致细胞自我杀伤的一系列化学反应。参与该过程的一个蛋白质家族是胱天蛋白酶蛋白质家族。在胱天蛋白酶蛋白质中，胱天蛋白酶-2、8、9和10被称为“启动器(initiator)”，它们触发死亡级联反应，而胱天蛋白酶-3、6和7被称为“执行器(executioner)”，它们执行实际的细胞杀伤。在胱天蛋白酶-3测定中，用受试化合物处理的细胞被裂解，并向裂解物添加被称为DEVD-AFC的底物。如果裂解物中存在活性胱天蛋白酶-3酶，则它将从DEVD-AFC底物上切割AFC，从而产生可使用荧光微量滴定板读取仪量化的荧光信号。因此，可以量化用受试化合物处理的细胞的凋亡活性。越大的荧光读取对应越多的凋亡细胞死亡。
BrdU ELISA：BrdU ELISA是一种检测细胞增殖活性的ELISA。BrdU是一种嘧啶类似物，当它在细胞内时，可以代替胸苷并入到新合成的DNA链中。正如胸苷并入到DNA中所表明的那样，BrdU并入到细胞DNA中表明了DNA合成活性，这是细胞增殖所必需的。在BrdU ELISA中，细胞用受试化合物以及BrdU试剂处理，并随后孵育24小时，然后测试。在测试过程中，抗BrdU抗体检测在24小时内发生的BrdU并入到细胞DNA中，作为细胞增殖活性的替代物。然后，这种抗BrdU抗体用用有色底物标记的二抗进行标记，该有色底物可以通过分光光度法进行量化。越大的吸光度读取对应越多的细胞增殖活性。
PRMT抑制剂：在如表1中所列的实施例中测试了I型和II型PRMT抑制剂。还参见图33，其总结了抑制二甲基化活性的IC50和消除由GR15或PR15攻击引起的毒性的EC50以及每种受试化合物的化学结构。
表1
Figure BDA0003435616990000161
Figure BDA0003435616990000171
合成的二肽重复蛋白(DRP)：通过向细胞施用GR、PR、GP或PA的15聚体二肽重复序列来诱导DRP毒性。
表2
Figure BDA0003435616990000172
NSC-34细胞培养：NSC-34细胞(Cedarlane Laboratories，Burlington，ON，CA)在由补充有10％US-来源的胎牛血清(Thermo-Fisher Scientific，Cambridge，MA，USA)、1％200mM L-谷氨酰胺溶液(Thermo-Fisher Scientific，Cambridge，MA，USA)和1％10,000U/mL青霉素-链霉素溶液(Thermo-Fisher Scientific，Cambridge，MA，USA)的高葡萄糖杜氏改良Eagle培养基(Millipore-Sigma，Burlington，MA，USA)组成的完全培养基中培养。在制备NSC-34完全培养基之前，将L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素溶液等分并储存在-20℃下，并且DMEM/高葡萄糖储存在4℃下。在每次传代时，将细胞用含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲盐水(Thermo-Fisher Scientific，Cambridge，MA，USA)洗涤一次，并用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Thermo-Fisher Scientific，Cambridge，MA，USA)在37℃、5％CO2下处理5分钟以进行解离。所制备的完全培养基、DPBS和胰蛋白酶在使用之前始终在37℃水浴中加热，并在使用之间在4℃下储存。使用Hausser Scientific细胞计数室(Thermo-Fisher Scientific，Cambridge，MA，USA)进行平板接种细胞计数(cell count for plating)。
外源性二肽重复蛋白溶液的制备：合成蛋白质GR15和PR15(GenicBio Limited，Kowloon，Hong Kong，CN)和ADMe-GR15(Eurogentec，Leige，BE)均作为冻干粉末购买，并在重构之前在-20℃下在干燥器中储存。将蛋白质在无菌DMSO(Millipore-Sigma，Burlington，MA，USA)中重构为10mM的储液浓度，并储存在4℃下。
PRMT抑制剂溶液的制备：购买小分子PRMT抑制剂MS023和GSK591(TocrisBioscience，Briston，UK)、MS049(MS023的惰性类似物)和EPZ020411(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA)、GSK3368715(Medchem Express，Monmouth Junction，NJ，USA)和阴性对照MS094(Millipore-Sigma，Burlington，MA，USA)，并在重构之前和之后将其储存在-20℃下。在使用表中指定的溶剂重构之后，将储液等分成15至20μL，并立即储存在-20℃下。
表3：小分子PRMT抑制剂详细信息
Figure BDA0003435616990000181
平板接种NSC-34并用DRP和PRMT抑制剂给药：将NSC-34细胞以3.77×104个细胞/孔的密度平板接种在透明、平底、全体积、96孔组织培养基处理的板(Thermo-FisherScientific，Cambridge，MA，USA)中。板顶部和底部的一行以及板两侧的两列没有细胞，仅包含培养基以使实验孔体积蒸发最小化。平板接种之后，将细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时，然后添加DRP和/或PRMT抑制剂。在添加DRP/PRMT抑制剂时，通过在温热的培养基中稀释每种储液的等分试样来获得用于攻击的DRP的期望剂量和用于治疗的抑制剂的期望剂量。在使用PRMT抑制剂和DRP二者的实验中，总是先将PRMT抑制剂施加至孔，然后再施加DRP。载剂对照被包括在内，孔用与已经经过DRP处理、药物处理或两者处理的那些等同的DMSO浓度进行处理。抑制剂毒性对照被包括在内，孔用用于实验的药物的期望剂量进行处理，但没有DRP处理。DRP毒性对照被包括在内，孔仅用用于攻击的DRP剂量进行处理。给药之后，将板在37℃、5％CO2下孵育24小时，然后运行WST-1或LDH测定终点。这些方法的“WST-1测定”和“LDH测定”部分中指定了每个终点所需的另外的对照。
WST-1测定：使用这些方法的“平板接种NSC-34并用DRP和PRMT抑制剂给药”部分中描述的步骤对细胞进行平板接种和制备。该实验的其他对照包括：在培养基中仅含有细胞的孔，以及仅含有培养基的孔。在测试时，将培养基从孔中去除并替换为温热的、过滤灭菌的溶液，该溶液由含有钙和镁的DPBS和4.5g/L D-葡萄糖(Millipore-Sigma，Burlington，MA，USA)组成。向含有200μL DPBS-葡萄糖溶液的孔施加20μL/孔WST-1试剂(Millipore-Sigma，Burlington，MA)，并随后将板在37℃、5％CO2下孵育1小时，然后将板在SpectraMaxM3微板读取仪(Molecular Devices，San Jose，CA，USA)上在450nm下读取。实验包括每个条件三个重复。每个实验重复两次(总共执行3次)。
LDH测定：使用这些方法的“平板接种NSC-34并用DRP和PRMT抑制剂给药”部分中描述的步骤对细胞进行平板接种和制备。该实验的其他对照包括：在培养基中仅含有细胞的几组孔(一个一式三份指定为“未经处理的”，一个一式三份指定为“裂解的”阳性对照)，以及仅含有培养基的孔。在测试时仅添加至转移板的另外的对照是仅5μL LDH。使用比色法LDH-细胞毒性测定试剂盒II(Abcam，Cambridge，MA，USA)根据制造商的说明书进行测试。在SpectraMax M3微板读取仪(Molecular Devices，San Jose，CA，USA)上在450nm下进行最终读取。数据分析包括使用以下等式计算LDH释放％：
Figure BDA0003435616990000201
实验包括每个条件三个重复。每个实验重复两次(总共执行3次)。
实施例1：通过WST-1测定测量的MS023(PRMT I型抑制剂)和GSK591(PRMT II型，特 别是PRMT5抑制剂)在NSC-34运动神经元样细胞中消除由3μM GR15诱导的代谢障碍的比较。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为与每个孔将接受的处理相对应的交错体积(staggered volume)的培养基(以确保处理之后所有孔中的最终体积为200μL)。将10mM MS023储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释，以实现板中60、30、10、3和1μM的最终浓度。按照相同的方案，将10mM GSK591储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释，以实现板中200、100、33、10和3μM的最终浓度。此外，将10mM的GR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞用3μM GR15和GSK591的以下剂量之一处理：200μM、100μM、33μM、10μM、3μM。
·细胞仅用GSK591的以下剂量之一处理：200μM、100μM、33μM、10μM、3μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为200μLPBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)，该PBS-葡萄糖溶液在使用之前已在37℃水浴中从4℃温热10分钟。WST-1试剂等分试样在使用之前从-20℃解冻并平衡至室温。将20μL WST-1试剂添加至含有200μL PBS-葡萄糖的每孔。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1.25小时，每15分钟在Molecular Devices板读取仪(SpectraMax M3)上进行吸光度读取(450nm)。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图1A至1D所示，PRMT I型抑制剂MS023在NSC-34运动神经元样细胞中消除了3μM剂量的GR诱导的代谢障碍。PRMT5(一种II型PRMT)抑制剂GSK591在任何测试剂量下都没有消除GR诱导的代谢障碍。
实施例2：通过WST-1测定测量的，MS023(PRMT I型抑制剂)在NSC-34运动神经元样 细胞中消除了由3μM GR153μM PR15诱导的代谢障碍。
如实施例1将细胞平板接种并孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并如实施例1进行稀释。另外，将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为200μLPBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)，该PBS-葡萄糖溶液在使用之前已在37℃水浴中从4℃温热10分钟。WST-1试剂等分试样在使用之前从-20℃解冻并平衡至室温。将20μL WST-1试剂添加至含有200μL PBS-葡萄糖的每孔。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，每15分钟在Molecular Devices板读取仪(SpectraMax M3)上进行吸光度读取(450nm)。将数据从板读取仪的SoftMax Pro7.0软件导出到excel文件中。
如图2A至2D所示，3μM和1μM剂量的MS023(I型PRMT抑制剂)完全消除了NSC-34中由3μM剂量的GR15或PR15引起的代谢障碍。这些剂量还完全消除了先前实验中的代谢障碍(参见实施例1)。
实施例3：通过WST-1测定测量的MS023(I型PRMT抑制剂)的较低剂量范围(0.01至3 μM)对消除由3μM剂量的GR15或PR15诱导的代谢障碍的影响。
如实施例1将细胞平板接种在培养基中。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储备解冻至室温并在温热的培养基中稀释，以实现板中3、1、0.3、0.1、0.03和0.01μM的最终浓度。将10mMGR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为200μLPBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)，该PBS-葡萄糖溶液在使用之前已在37℃水浴中从4℃温热10分钟。WST-1试剂等分试样在使用之前从-20℃解冻并平衡至室温。将20μL WST-1试剂添加至含有200μL PBS-葡萄糖的每孔。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，每15分钟在Molecular Devices板读取仪(SpectraMax M3)上进行吸光度读取(450nm)。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图3A至3D所示，MS023以剂量依赖性方式消除了由3μM GR15和PR15诱导的代谢障碍。剂量依赖性代谢消除谱因二肽重复蛋白而略有不同：代谢活性的显著的部分消除在经GR处理的细胞中在低至0.1μM的MS023剂量下观察到，而在经PR处理的细胞中，在低至0.3μM的MS023剂量下观察到。换句话说，在该测定中，MS023更有效地消除了GR诱导的代谢障碍。
实施例4：通过LDH测定测量的MS023(1至60μM)和由GR15和PR15(300nM)产生的细胞 毒性的消除。
如实施例1将细胞平板接种在培养基中。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并如实施例1进行稀释。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中300nM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·低对照/“0％毒性”(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用300nM GR15处理)
·细胞用300nM GR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·仅PR(细胞仅用300nM PR15处理)
·细胞用300nM PR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。通过LDH测定测试细胞并分析数据。
如图4A至4D所示，在LDH测定中，当施加于用300nM剂量的GR15处理的NSC-34细胞时，MS023的两个最高剂量(60、30μM)显著增强细胞毒性。这种表型在用300nM PR15处理的NSC-34细胞中未观察到，在此情况下所施加的所有剂量的MS023至少部分消除了PR诱导的细胞毒性。这些结果表明两种富含精氨酸的DRP的作用机制存在差异。这种现象仅在每种蛋白质的300nM剂量下观察到，而未在3μM剂量下观察到(数据将在实验5中示出)。
实施例5：通过LDH测定测量的MS023(1至60μM)和由GR15和PR15(3μM)产生的细胞毒 性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并如实施例1进行稀释。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·低对照/“0％毒性”(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用300nM PR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。通过LDH测定测试细胞并分析数据。
如图5A至5D所示，MS023在所有测试剂量下均部分消除了GR诱导的毒性。MS023在10、30和60μM的剂量下部分消除了PR诱导的细胞毒性，并在1和3μM的剂量下完全消除了PR诱导的毒性。MS023在经GR处理的细胞和经PR处理的细胞中的消除能力的差异(如实施例4中所见)进一步表明富含精氨酸的DRP GR和PR的作用机制略有不同。
实施例6：通过LDH测定测量的MS023(0.01至3μM)和由GR15和PR15(3μM)产生的细胞 毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.01、0.03、0.1、0.3、1和3μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mMPR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·低对照/“0％毒性”(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图6A至6D所示，MS023有效且剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的毒性二者。MS023在0.01、0.03、0.1和0.3μM的剂量下部分消除了GR诱导的毒性，并在0.3、1和3μM的剂量下完全消除了GR诱导的毒性。MS023在0.01、0.03和0.1μM的剂量下部分消除了PR诱导的毒性，并在0.03、0.1、0.3、1和3μM的剂量下完全消除了PR诱导的毒性。与前面的实施例一致，MS023更有效地消除了PR诱导的毒性。
实施例7：通过胱天蛋白酶-3测定测量的MS023(1至60μM)和由和PR15(300nM)诱导的凋亡活性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并如实施例1进行稀释。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中300nM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理/“仅细胞”(细胞在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用300nM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·仅PR(细胞仅用300nM PR15处理)
·细胞用300nM PR15和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·阳性对照(细胞用5或16μM PAC-1胱天蛋白酶-3激活剂处理)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用胱天蛋白酶-3测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图7A至7D所示，MS023剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的凋亡活性。60、30和10μM剂量的MS023部分地消除了且3和1μM剂量的MS023完全地消除了300nM GR诱导的凋亡活性。所有剂量的MS023均完全消除了PR诱导的凋亡活性。
实施例8：通过胱天蛋白酶-3测定测量的MS023(0.01至3μM)和由GR15和PR15(3μM) 诱导的凋亡活性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中3、1、0.3、0.1、0.03和0.01μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理/“仅细胞”(细胞在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞仅用MS023的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·阳性对照(细胞用5或16μM PAC-1胱天蛋白酶-3激活剂处理)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用胱天蛋白酶-3测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图8A至8D所示，MS023剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的凋亡活性。在经GR处理的细胞和经PR处理的细胞二者中，所有剂量的MS023均部分地消除了GR诱导的和PR诱导的凋亡活性，并且3μM剂量的MS023完全地消除了GR诱导的和PR诱导的凋亡活性。
实施例9：通过BrdU ELISA测量的MS023(1至60μM)和由GR15和PR15(300nM)诱导的 增殖抑制的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mMMS023储液解冻至室温并如实施例1进行稀释。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中300nM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·仅培养基
·背景(细胞仅在培养基中，无BrdU试剂)
·未经处理(细胞仅在培养基中，有BrdU试剂)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)和BrdU试剂
·仅GR(细胞用300nM GR15和BrdU试剂处理)
·细胞用300nM GR15、BrdU试剂和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·仅PR(细胞仅用300nM PR15和BrdU试剂处理)
·细胞用300nM PR15、BrdU试剂和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞用BrdU试剂和MS023的以下剂量之一处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用BrdU ELISA试剂盒说明中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图9A至9D所示，在所有经测试的剂量下，MS023均消除了GR诱导的和PR诱导的增殖抑制，并且未诱导过度增殖。所有剂量的MS023均部分地消除了GR诱导的增殖抑制，并且3μM剂量的MS023完全地挽救了GR诱导的增殖抑制。所有剂量的MS023均完全地消除了PR诱导的增殖抑制。
实施例10：通过WST-1测定使用中国仓鼠卵巢(CHO)和小鼠神经母细胞瘤-脊髓杂 交(NSC-34)细胞以及富含精氨酸：GR15、PR15和非富含精氨酸：GP15、PA15、DRP(剂量为30和3μ M)测量的神经元和非神经元细胞类型中DRP诱导的代谢障碍表型的比较。
将细胞平板接种在2个96孔板中的200μL培养基中。在板1中，将CHO细胞以1×104个细胞/孔的密度进行平板接种，并且在板2中，将NSC-34细胞以2.5×104个细胞/孔的密度进行平板接种，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。两种细胞类型使用不同的密度，因为在之前的分析中CHO细胞已建立了比NSC-34细胞快2.5倍的生长。第二天，将GR15、PR15、GP15和PA15的10mM储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现每种蛋白质的两种浓度：600μM(在板中为30μM)和60μM(在板中为3μM)。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经DRP处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
i.DMSO对照1：对应于30μM DRP剂量的0.3％DMSO
ii.DMSO对照2：对应于3μM DRP剂量的0.03％DMSO
·细胞用30或3μM GR15处理
·细胞用30或3μM PR15处理
·细胞用30或3μM PA15处理
·细胞用30或3μM GP15处理
将板在37℃、5％CO2下孵育48小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在使用之前在37℃水浴中从4℃开始温热10分钟的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，并且每15分钟在Molecular Devices板读取仪(SpectraMax M3)上读取吸光度读数(450nm)。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图10A至10D所示，DRP攻击导致非神经元CHO和运动神经元样NSC-34细胞二者中的代谢功能受损。然而，当与CHO相比时，观察到NSC-34中代谢活性的降低显著更大。这些观察结果仅在用富含精氨酸的DRP GR15和PR15处理的细胞中观察到，表明运动神经元样NSC-34不仅对DRP攻击更敏感，而且特别地对富含精氨酸的DRP攻击更敏感。
实施例11：通过LDH测定确定的NSC-34细胞中DRP诱导的毒性的剂量响应模式。
将细胞以5×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将GR15、PR15、GP15和PA15的10mM储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现以下DRP浓度(在板中实现的浓度的10倍)：30、10、3、1、0.3、0.1μM。将10μL的每种浓度添加至板中的100μL基础培养基，以实现3、1、0.3、0.1、0.03和0.01μM DRP的最终浓度。
以下条件一式两份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·低对照/“0％毒性”(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经DRP处理的细胞所暴露的量的各个浓度下的DMSO处理)
i.对应于从最高(3μM至最低0.01μM)开始的DRP剂量的经测试的DMSO对照如下，并在培养基中稀释：
1. 0.03％DMSO
2. 0.01％DMSO
3. 0.003％DMSO
4. 0.001％DMSO
5. 0.0003％DMSO
6. 0.0001％DMSO
·细胞用GR15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用PR15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用GP15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用PA15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图11所示，当孵育24小时时，富含精氨酸的DRP(GR15、PR15)处理在NSC-34细胞中产生显著的剂量依赖性毒性，而非富含精氨酸的DRP(GP15、PA15)处理则无。约10％的GR15和PR15毒性使用低至300nM的浓度实现。GR15和PR15表现出几乎相同的剂量响应曲线，其中GR15和PR15分别产生50±26nM和56±20nM的EC50。
实施例12：通过胱天蛋白酶-3测定确定的NSC-34细胞中DRP诱导的凋亡活性的剂 量响应模式。
将细胞以5×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将GR15、PR15、GP15和PA15的10mM储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现以下DRP浓度(在板中实现的浓度的10倍)：30、10、3、1、0.3、0.1μM。将10μL的每种浓度添加至板中的100μL基础培养基，以实现3、1、0.3、0.1、0.03和0.01μM DRP的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理/“仅细胞”(细胞在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经DRP处理的细胞所暴露的量的各个浓度下的DMSO处理)
i.对应于从最高(3μM至最低0.01μM)开始的DRP剂量的经测试的DMSO对照如下，并在培养基中稀释：
1. 0.03％DMSO
2. 0.01％DMSO
3. 0.003％DMSO
4. 0.001％DMSO
5. 0.0003％DMSO
6. 0.0001％DMSO
·细胞用GR15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用PR15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用GP15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用PA15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·阳性对照(细胞用5或16μM PAC-1胱天蛋白酶-3激活剂处理)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用胱天蛋自酶-3测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图12所示，所有DRP均以剂量依赖性方式在NSC-34细胞中诱导凋亡活性。富含精氨酸的DRP GR15和PR15聚集在一起，产生最显著量的凋亡活性。当与DMSO处理的对照相比时，非富含精氨酸的GP15和PA15也聚集在一起，产生较低的稳健凋亡活性水平。
实施例13：通过BrdU ELISA确定的NSC-34细胞中DRP诱导的增殖抑制的剂量响应 模式。
将细胞以5×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将GR15、PR15、GP15和PA15的10mM储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现以下DRP浓度(在板中实现的浓度的10倍)：30、10、3、1、0.3、0.1μM。将10μL的每种浓度添加至板中的100μL基础培养基，以实现3、1、0.3、0.1、0.03和0.01μM DRP的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·仅培养基
·背景(细胞仅在培养基中，无BrdU试剂)
·未经处理(细胞仅在培养基中，有BrdU试剂)
·DMSO对照(细胞用BrdU试剂和经DRP处理的细胞所暴露的量的各个浓度下的DMSO处理)
i.对应于从最高(3μM至最低0.01μM)开始的DRP剂量的经测试的DMSO对照如下，并在培养基中稀释：
1. 0.03％DMSO
2. 0.01％DMSO
3. 0.003％DMSO
4. 0.001％DMSO
5. 0.0003％DMSO
6. 0.0001％DMSO
·细胞用BrdU试剂和GR15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用BrdU试剂和PR15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用BrdU试剂和GP15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
·细胞用BrdU试剂和PA15的以下剂量之一处理：3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用BrdU ELISA试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图13所示，与DMSO处理的对照相比，非富含精氨酸的DRP GP15和PA15未显著影响增殖活性。富含精氨酸的DRP GR15和PR15二者均以剂量依赖性方式显著抑制增殖活性，并且PR15是最强的抑制剂。
实施例14：MS023降低NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化。
在第0天，将NSC-34细胞平板接种在96孔板的48个孔中，并且将CHO细胞平板接种在同一96孔板的其他48个孔中。将NSC-34细胞平板接种在DMEM/高葡萄糖培养基中。将CHO细胞平板接种在Ham’s F-12K(Kaighn's)培养基中。两种细胞系均孵育过夜以实现约50％汇合。
在第1天，将NSC-34细胞的24个孔和CHO细胞的24个孔用以下浓度的MS023处理：1μM、3μM、6μM、10μM、30μM和60μM。随后将细胞孵育过夜。
在第2天，将未经处理的NSC-34细胞的18个孔和未经处理的CHO细胞的18个孔用与第1天的那些相同浓度的MS023处理。这使每种细胞系均剩下6个孔从未接受过MS023。一旦添加MS023，将细胞孵育过夜。
在第3天，去除96孔板中的所有培养基，并用3.7％多聚甲醛(PFA)固定细胞。随后用1X PBS/0.1％Triton X-100洗涤和透化细胞。
在去除PBS/Triton洗涤剂之后，将Odyssey封闭缓冲剂(LI-COR，927-40100)施加至所有孔中，并且将板在适度摇动90分钟的情况下在室温下放置。在90分钟之后，去除封闭缓冲剂，并用1∶500稀释的抗不对称二甲基精氨酸基序一抗(Cell SignalingTechnology，#13522)处理细胞。在无摇动的情况下与一抗在4摄氏度下继续孵育过夜。
在第4天，从板中去除一抗溶液，并用1X PBS/0.1％吐温20洗涤细胞。在洗涤之后，给予细胞包含1∶1000稀释的IRDye 800CW抗兔抗体(LI-COR，926-32211)和1∶500稀释的细胞标签700染色剂(LI-COR，926-41090)的二抗混合物。二抗混合物在轻轻摇动并避光的情况下在细胞上保持60分钟。
在60分钟之后，去除二抗混合物，并再次用1X PBS/0.1％吐温20洗涤细胞。随后去除所有洗涤缓冲剂，轻轻拍干板以去除过量溶液。随后在提供基于荧光的结果的LI-COROdyssey C1assic成像系统上读取该板。在该实验中，荧光是由于细胞的不对称精氨酸甲基化而发生的。在期望MS023降低细胞的不对称精氨酸甲基化的情况下，将MS023给予细胞24或48小时。每孔的细胞数是使用对细胞中的总蛋白质水平进行荧光标记的细胞标签700染色剂来计算的。为此，将来自每孔不对称精氨酸甲基化的荧光(800)除以来自每孔总蛋白质水平的荧光(700)以产生800/700的结果。
如图14所示，当与未经处理的细胞相比时，所有条件在其800/700读数方面均显著降低。在处理24小时的情况下，MS023在1μM下使NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化降低了约13％并且在60μM下降低了约45％。在处理48小时的情况下，MS023在1μM下使NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化降低了约33％并且在60μM下降低了约75％。
实施例15：合成GR15的体外精氨酸甲基化。
为了评估PRMT1与GR15之间的相互作用，开发了体外甲基化测定系统。该系统由重组PRMT1酶、作为甲基供体的S-(5’-腺苷)-L-甲硫氨酸碘化物(SAM)和PRMT1活性的潜在底物的混合物组成。对于该实验，准备了每个均包含不同量的以下组分的11个管：
·重组PRMT1蛋白(Active Motif，目录号31411)
·S-(5’-腺苷)-L-甲硫氨酸碘化物(SAM)(Sigma-Aldrich目录号A4377)
·GR15
·PR15
·来自人红细胞的SOD1(S9636-1KU)
根据表4(所有值均以微升(μl)计)将这些成分混合在0.5ml平盖管(ThermoFisher Scientific，AB0350)中。
表4
管 PRMT1 SAM H4 GR PR S001 10XPBS H2O 总
1 2 2 3 23 30
2 1 2 2 3 22 30
3 2 2 2 3 21 30
4 3 2 2 3 20 30
5 4 2 2 3 13 30
6 5 2 2 3 18 30
7 6 2 2 3 17 30
8 2 3 25 30
9 2 2 4 3 19 30
10 2 2 2 3 21 30
11 2 2 20 3 3 30
一旦准备了所有管，轻轻敲击每个管以确保混合，并将管置于37摄氏度的培养箱中2小时。在2小时之后，用添加的10μl NuPage LDS样品缓冲剂(Thermo FisherScientific，NP0007)终止反应混合物。轻轻敲击管以确保混合，并随后在95摄氏度的水浴中煮沸5分钟。随后将样品在用于SDS-PAGE的4至12％Bis-Tris凝胶(Thermo FisherScientific，NP0322BOX)中运行。
随后使用iBlot设备和iBlot 2硝化纤维素迷你堆(iBlot 2NitrocelluloseMiniStack)(Thermo Fisher Scientific，IB23002)来转移凝胶。在转移之后，将膜置于Superblock封闭缓冲剂(Thermo Fisher Scientific，37515)中，并在4摄氏度下封闭过夜。第二天，去除封闭缓冲剂，并将Superblock/0.2％吐温20中的1∶500的抗组蛋白4H4R3me2a(Active Motif，目录号39006)和1∶1000的抗C9ORF72/C9RANT(多-GR)抗体的一抗溶液(Millipore，mABN778)在室温下在轻轻摇动的情况下施加至膜上60分钟。去除一抗溶液，并用1X PBS/0.1％吐温20洗涤膜。将在Superblock/0.2％吐温20中的包含1∶10,000稀释的IRDye 800CW抗兔抗体和1∶10,000稀释的IRDye 680RD抗大鼠抗体(LI-COR，925-68076)的二抗溶液在室温下在轻轻摇动的情况下施加至膜上60分钟。去除二抗，并用1X PBS/0.1％吐温20洗涤膜。在洗涤步骤之后，在LI-COR Odyssey Classic成像系统上读取膜。
如图15A和15B所示，GR15被PRMT1不对称甲基化，并被组蛋白4抗H4R3me2a抗体检测到。该抗体针对包含甘氨酸-精氨酸对的组蛋白4蛋白区域产生。当从反应混合物中去除PRMT1或甲基供体SAM时，未进行GR15的不对称甲基化(图15A泳道2和9)。图15B表明GR15存在于每个孔中，并且因此其甲基化取决于其与PRMT1的相互作用。
实施例16：通过LDH测定测量的MS049(0.2至100μM)和由GR15和PR15(3μM)产生的细 胞毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在2个96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS049储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.2、1、2、10、20和100μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·低对照/“0％毒性”(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS049处理：100μM、20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的MS049处理：100μM、20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS049处理：100μM、20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图16A至16D所示，MS049剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的毒性二者。MS049在0.2、1、2、20和100μM的剂量下部分消除了GR诱导的和PR诱导的毒性，并在2和10μM的剂量下完全消除了GR诱导的和PR诱导的毒性。MS049在100和20μM的剂量下引起与GR和PR治疗无关的显著毒性，但在其他测试剂量下则无。
实施例17：MS049降低NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化。
在第0天，将NSC-34细胞平板接种在96孔板的48个孔中，并且将CHO细胞平板接种在同一96孔板的其他48个孔中。将NSC-34细胞平板接种在DMEM/高葡萄糖培养基中。将CHO细胞平板接种在Ham's F-12K(Kaighn's)培养基中。两种细胞系均孵育过夜以实现约50％汇合。
在第1天，将NSC-34细胞的24个孔和CHO细胞的24个孔用以下浓度的MS049处理：0.2μM、1μM、2μM、10μM、20μM和100μM。随后将细胞孵育过夜。
在第2天，将未经处理的NSC-34细胞的18个孔和未经处理的CHO细胞的18个孔用与第1天的那些相同浓度的MS049处理。这使每种细胞系均剩下6个孔从未接受过MS049。一旦添加MS049，将细胞孵育过夜。
在第3天，去除96孔板中的所有培养基，并用3.7％多聚甲醛(PFA)固定细胞。随后用1X PBS/0.1％Triton X-100洗涤和透化细胞。
在去除PBS/Triton洗涤剂之后，将Odyssey封闭缓冲剂(LI-COR，927-40100)施加至所有孔中，并且将板在适度摇动90分钟的情况下在室温下放置。在90分钟之后，去除封闭缓冲剂，并用1∶500稀释的抗不对称二甲基精氨酸基序一抗(Cell SignalingTechnology，#13522)处理细胞。在无摇动的情况下与一抗在4摄氏度下继续孵育过夜。
在第4天，从板中去除一抗溶液，并用1X PBS/0.1％吐温20洗涤细胞。在洗涤之后，给予细胞包含1∶1000稀释的IRDye 800CW抗兔抗体(LI-COR，926-32211)和1∶500稀释的细胞标签700染色剂(LI-COR，926-41090)的二抗混合物。二抗混合物在轻轻摇动并避光的情况下在细胞上保持60分钟。
在60分钟之后，去除二抗混合物，并再次用1X PBS/0.1％吐温20洗涤细胞。随后去除所有洗涤缓冲剂，轻轻拍干板以去除过量溶液。随后在提供基于荧光的结果的LI-COROdyssey Classic成像系统上读取该板。在该实验中，荧光是由于细胞的不对称精氨酸甲基化而发生的。在期望MS049降低细胞的不对称精氨酸甲基化的情况下，将MS049给予细胞24或48小时。每孔的细胞数是使用对细胞中的总蛋白质水平进行荧光标记的细胞标签700染色剂来计算的。为此，将来自每孔不对称精氨酸甲基化的荧光(800)除以来自每孔总蛋白质水平的荧光(700)以产生800/700的结果。
如图17所示，当与未经处理的细胞相比时，所有条件在其800/700读数方面均显著降低。在处理24小时的情况下，MS049在1μM下使NSC-34细胞的不对称精氨酸甲基化降低了约17％并且在100μM下降低了约39％。
实施例18：通过WST-1测定测量的MS023(0.2至60μM)和阴性对照MS094(0.2至60μ M)以及由GR15和PR15(3μM)产生的代谢障碍的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM的MS023和MS094储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.2、1、3、10、30和60μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与MS094处理孔等效的DMSO、与MS094和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的阴性对照MS094处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的阴性对照MS094处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的阴性对照MS094处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular DevicesSpectraMax M3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图18A至18F所示，MS023剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的代谢障碍二者。3μM和1μM剂量的MS023完全消除了由3μM GR15或PR15攻击诱导的代谢障碍。阴性对照MS094的剂量未消除由GR15或PR15攻击诱导的代谢障碍。测试的30和60μM的两个最高剂量的阴性对照MS094与未经处理的对照相比产生了代谢障碍，然而这可能归因于在对应于这些剂量的DMSO对照(0.30％和0.60％DMSO)中也可见的DMSO相关毒性。
实施例19：通过LDH测定测量的MS023(0.2至60μM)和阴性对照MS094(0.2至60μM) 以及由GR15和PR15(3μM)产生的细胞毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023和MS094储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.2、1、3、10、30和60μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与MS094处理孔等效的DMSO、与MS094和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的阴性对照MS094处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的阴性对照MS094处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的阴性对照MS094处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.2μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图19A至19F所示，MS023剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的细胞毒性(测量为％LDH释放)二者。3μM和1μM剂量的MS023完全消除了由3μM GR15攻击或PR15攻击诱导的细胞毒性。阴性对照MS094的剂量未消除由GR15攻击或PR15攻击诱导的细胞毒性。为60μM的最高剂量的MS023产生了显著的细胞毒性，然而，这不是所显示的完全消除由GR15或PR15攻击诱导的细胞毒性的剂量之一。测试的为10、30和60μM的三个最高剂量的阴性对照MS094与未经处理的对照相比产生了细胞毒性，然而在最高的2个剂量下，这可能归因于在对应于这些剂量的DMSO对照(0.30％和0.60％DMSO)中也可见的DMSO相关毒性。
实施例20：通过LDH测定测量的MS049(0.2至100μM)和由GR15和PR15(3μM)产生的细 胞毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS049储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.2、1、2、10、20和100μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞仅用经GR处理的细胞和经PR处理的细胞所暴露的量的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS049处理：100μM、20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μMPR15和以下剂量之一的MS049处理：100μM、20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS049处理：100μM、20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)
使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图20A至20D所示，MS049剂量依赖性地消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性二者。MS049在1和20μM的剂量下部分消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性，并在2和10μM的剂量下完全消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性。MS049在100和20μM的剂量下引起了与GR和PR攻击无关的显著的细胞毒性，但在其他测试剂量下则无。
实施例21：通过WST-1测定测量的EPZ020411(0.2至20μM)和由GR15和PR15(3μM)产 生的代谢障碍的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM EPZ020411储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.2、1、2、10和20μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与EPZ020411处理孔等效的DMSO、与EPZ020411和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的EPZ020411处理：20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的EPZ020411处理：20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的EPZ020411处理：20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular Devices SpectraMaxM3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图21A至21D所示，EPZ020411剂量依赖性地消除了GR15诱导的和PR15诱导的代谢障碍二者。EPZ020411在2、10和20μM的剂量下部分消除了GR15诱导的代谢障碍，其中在20μM处消除最大。另外，EPZ020411在10和20μM的剂量下完全消除了PR15诱导的代谢障碍。EPZ020411在10和20μM的剂量下引起与GR和PR攻击无关的显著的代谢障碍，但在其他测试剂量下则无。这不能归因于DMSO诱导的代谢障碍，因为对应的DMSO对照(0.10％、0.20％DMSO)不诱导代谢障碍。
实施例22：通过LDH测定测量的EPZ020411(0.2至20μM)和由GR15和PR15(3μM)产生 的细胞毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM EPZ020411储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.2、1、2、10和20μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与EPZ020411处理孔等效的DMSO、与EPZ020411和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的EPZ020411处理：20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的EPZ020411处理：20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·细胞仅用以下剂量之一的EPZ020411处理：20μM、10μM、2μM、1μM、0.2μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图22A至22D所示，EPZ020411剂量依赖性地消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性二者。EPZ020411在除0.2μM外的所有剂量下部分消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性，并且在20μM的剂量下作用最大。EPZ020411在10和20μM的剂量下引起与GR和PR攻击无关的显著的细胞毒性，但在其他测试剂量下则无。这不能完全归因于DMSO诱导的细胞毒性，因为仅对应于最高EPZ020411剂量的DMSO对照(0.20％DMSO)产生轻微的细胞毒性。
实施例23：通过WST-1测定测量的GSK3368715(0.1至10μM)和由GR15和PR15(3μM)产 生的代谢障碍的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM GSK3368715储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.1、0.3、1、3和10μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GSK3368715处理孔等效的DMSO、与GSK3368715和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。。
·细胞仅用以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular DevicesSpectraMax M3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图23A至23F所示，GSK3368715剂量依赖性地消除了GR15诱导的和PR15诱导的代谢障碍二者。当与对应的DMSO处理的对照(0.06％、0.034％DMSO)相比，GSK3368715在1和3μM的剂量下完全消除了GR15诱导的和PR15诱导的代谢障碍。测试的为10μM的最高剂量的GSK3368715诱导低水平的与GR15和PR15攻击无关的代谢障碍，然而这可能归因于溶剂作用，因为对应的0.10％DMSO对照显示出相似水平的代谢障碍。
实施例24：通过WST-1测定测量的MS023(0.1至10μM)和GSK3368715(0.1至10μM)以 及由GR15(3μM)产生的代谢障碍的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM的MS023和GSK3368715储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.1、0.3、1、3和10μM的最终浓度。将10mM GR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GSK3368715处理孔等效的DMSO、与GSK3368715和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·细胞仅用以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular Devices SpectraMaxM3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图24A至24D所示，GSK3368715以与MS023类似的模式剂量依赖性地消除了GR15诱导的和PR15诱导的代谢障碍二者。MS023和GSK3368715二者均在1μM和3μM的剂量下完全消除了GR15诱导的和PR15诱导的代谢障碍。测试的为10和3μM的最高剂量的GSK3368715诱导与GR15和PR15攻击无关的代谢障碍。测试的MS023剂量未诱导与GR15-PR15攻击无关的代谢障碍。
实施例25：通过LDH测定测量的GSK3368715(0.1至10μM)和由GR15和PR15(3μM)产生 的细胞毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM GSK3368715储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.1、0.3、1、3和10μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GSK3368715处理孔等效的DMSO、与GSK3368715和GR15或PR15处理孔等效的DMSO、或者与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·细胞仅用以下剂量之一的GSK3368715处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图25A至25D所示，GSK3368715剂量依赖性地消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性二者。GSK3368715在1μM的剂量下完全消除了GR15诱导的和PR15诱导的细胞毒性。另外，GSK3368715在3μM的剂量下几乎完全消除了PR15诱导的细胞毒性。所有剂量的GSK3368715均诱导低水平的与GR15和PR15攻击无关的细胞毒性，然而这可能归因于溶剂作用，因为所有对应的DMSO对照均显示出类似的剂量依赖性细胞毒性水平。
实施例26：通过WST-1测定测量的对称PRMT抑制剂GSK591(3至200μM)和不对称 PRMT抑制剂MS023(1至60μM)以及由PR15(3μM)产生的代谢障碍的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM的GSK591和MS023储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中3、10、33、100和200μM(GSK591)以及1、3、10、30和60μM(MS023)的最终浓度。将10mM PR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅PR(细胞仅用3μM PR15处理)
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞用3μM PR15和以下剂量之一的GSK591处理：200μM、100μM、33μM、10μM、3μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS023处理：60μM、30μM、10μM、3μM、1μM。
·细胞仅用以下剂量之一的GSK591处理：200μM、100μM、33μM、10μM、3μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular Devices SpectraMaxM3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图26A至26D所示，MS023剂量依赖性地消除了GR诱导的和PR诱导的代谢障碍二者。3μM和1μM剂量的MS023完全消除了由3μM PR15攻击诱导的代谢障碍。GSK591的剂量未消除由PR15攻击诱导的代谢障碍。与未经处理的对照相比，测试的为33、100和200μM的三个最高剂量的GSK591产生了与PR15攻击无关的代谢障碍。测试的MS023的剂量未产生与PR15攻击无关的代谢障碍。
实施例27：通过WST-1测定测量的由GR15和不对称二甲基化(ADMe)-GR15产生的代 谢障碍的剂量响应模式。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将10mM的GR15和ADMe-GR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中10nM至3μM的最终浓度范围。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GR15或ADMe-GR15处理孔等效的DMSO处理)
·细胞用以下剂量之一的GR15处理：10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM
·细胞用以下剂量之一的ADMe-GR15处理：10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular Devices SpectraMaxM3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
如图27A至27E所示，在24小时之后GR15攻击和ADMe-GR15攻击二者均在NSC-34中诱导剂量依赖性代谢障碍，并且与非甲基化GR15相比，ADMe-GR15始终产生更多的代谢障碍。
实施例28：通过LDH测定测量的由GR15和不对称二甲基化(ADMe)-GR15产生的细胞 毒性的剂量响应模式。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将10mM的GR15和ADMe-GR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中10nM至3μM的最终浓度范围。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GR15或ADMe-GR15处理孔等效的DMSO处理)
·细胞用以下剂量之一的GR15处理：10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM
·细胞用以下剂量之一的ADMe-GR15处理：10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图28A至28E所示，在24小时之后GR15攻击和ADMe-GR15攻击二者均在NSC-34中诱导剂量依赖性细胞毒性，并且与非甲基化GR15相比，ADMe-GR15始终产生更多的细胞毒性。
实施例29：通过WST-1测定测量的MS023(0.1至10μM)和由GR15和ADMe-GR15(3μM)产 生的代谢障碍的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.1、0.3、1、3和10μM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM ADMe-GR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·仅ADMe-GR(细胞仅用3μM ADMe-GR15处理)
·细胞用3μM ADMe-GR15和以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。在测试之前，立即去除培养基并替换为在37℃水浴中从4°开始温热的200μL PBS-葡萄糖溶液(4.5g/L，无菌)。在使用之前将WST-1试剂等分试样从-20℃开始解冻并平衡至室温。包含200μL PBS-葡萄糖的每个孔添加20μL WST-1试剂。将板与WST-1在37℃、5％CO2下孵育1小时，随后在Molecular Devices SpectraMaxM3板读取仪上读取450nm处的吸光度读数。将数据从板读取仪的SoftMax Pro 7.0软件导出到excel文件中。
图29A至29D、30A至30D和31A至31D代表在三个不同日期分别进行的上述实验的重复。如这些图中所示，MS023始终剂量依赖性地消除由GR15攻击诱导的代谢障碍，但未消除由ADMe-GR15攻击诱导的代谢障碍。
实施例30：通过LDH测定测量的MS023(0.1至10uM)和由GR15和ADMe-GR15(3μM)产生 的细胞毒性的消除。
将细胞以3.7×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板中的培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，在添加受试化合物之前，立即去除现有培养基并替换为如实施例1中的交错体积的培养基。将10mM MS023储液解冻至室温并在温热的培养基中稀释以实现板中0.1、0.3、1、3和10μμM的最终浓度。将10mM GR15储液和10mM ADMe-GR15储液平衡至室温并在温热的培养基中稀释，以实现孔中3μM的最终浓度。
以下条件一式三份地平板接种。样品被板靠外侧的填充有无菌磷酸盐缓冲盐水的边界孔包围，以防止在孵育期间实验孔中的体积蒸发：
·背景(仅培养基)
·未经处理(细胞仅在培养基中)
·DMSO对照(细胞用与GR15或PR15处理孔等效的DMSO处理)
·仅GR(细胞仅用3μM GR15处理)
·细胞用3μM GR15和以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·仅ADMe-GR(细胞仅用3μM ADMe-GR15处理)
·细胞用3μM ADMe-GR15和以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·细胞仅用以下剂量之一的MS023处理：10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM。
·高对照/“100％毒性”(细胞用裂解缓冲液裂解)
·阳性对照(5μL LDH溶液)
将板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用LDH测定试剂盒说明书中详述的程序测试细胞并分析数据。
如图32A至32D所示，MS023始终剂量依赖性地消除由GR15攻击诱导的细胞毒性，但未消除由ADMe-GR15攻击诱导的细胞毒性。
实施例31：毒性机制如以上实施例所示，与GR15和PR15相关的毒性与其在孵育24小时之后不对称二甲基化的能力有关(图33的第1行)。当添加I型PRMT抑制剂(例如MS023)时，毒性被消除，但其发生的确切机制仍不清楚(图33的第2行)。当用不对称二甲基化的GR15攻击细胞时，毒性作用仍然存在(图33的第3行)。然而，当在ADMe-GR15攻击期间添加MS023时，未观察到毒性的消除。因此，因为GR15已二甲基化，PRMT抑制对所观察到的作用无影响(图34的第4行)。总之，结果表明GR15的不对称二甲基化是毒性的驱动机制。
本公开内容的方法、组合物和实施方案不旨在穷举或将本公开内容限制为本文中所述的精确形式。相反，选择的组合物和实施例使得本领域的技术人员能够领会并理解本公开内容的原理和实践。然而，应当理解，可在保持在本公开内容的精神和范围内的同时做出许多变化和修改。除非技术上不可能，否则结合一个实施方案描述的任何特征或要素可与每个其他实施方案的任何其他特征或要素互换使用或另外地组合，并且所有这样的渗透均被本公开内容涵盖。
本说明书中的所有出版物、专利和专利申请均表示了本技术所属领域的普通技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请在本文中被具体且单独地描述。

Claims (53)

1.降低由二肽重复蛋白(DRP)引起的细胞毒性的方法，其包括使细胞与有效量的I型蛋白质精氨酸甲基转移酶(I型PRMT)抑制剂接触。
2.权利要求1所述的方法，其中所述DRP是通过基因染色体9开放阅读框72(C9ORF72)中的六核苷酸(GGGGCC)重复序列的扩增而产生的。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述DRP包含精氨酸(R)。
4.权利要求3所述的方法，其中所述DRP已被不对称地二甲基化。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述DRP包含至少一个聚-甘氨酸-精氨酸肽(GR)和/或至少一个聚-脯氨酸-精氨酸肽(PR)。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞。
7.权利要求6所述的方法，其中所述神经元细胞是感觉神经元、运动神经元或中间神经元。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂选自PRMT1抑制剂、PRMT3抑制剂、PRMT4抑制剂、PRMT6抑制剂和PRMT8抑制剂。
9.权利要求8所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT1抑制剂。
10.权利要求9所述的方法，其中所述I型PRMT1抑制剂是MS023、MS049、GSK715或EPZ020411。
11.权利要求8所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT3抑制剂。
12.权利要求11所述的方法，其中所述I型PRMT3抑制剂是MS023或MS049。
13.权利要求8所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT4抑制剂。
14.权利要求13所述的方法，其中所述I型PRMT4抑制剂是MS023、MS049或TP 064。
15.权利要求8所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT6抑制剂。
16.权利要求15所述的方法，其中所述I型PRMT6抑制剂是MS023、MS049、EPZ020411或TP064。
17.权利要求8所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT8抑制剂。
18.权利要求17所述的方法，其中所述I型PRMT8抑制剂是MS023、MS049、EPZ020411或TP064。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中由DRP引起的细胞毒性通过细胞膜渗漏的减少、细胞代谢功能的提高或细胞凋亡的减少来测量。
20.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中由DRP引起的细胞毒性通过以下测定中的一种或更多种来测量：WST-1、LDH、胱天蛋白酶3或BrdU。
21.降低由GR和/或PR DRP引起的细胞毒性的方法，其包括使细胞与有效量的I型PRMT抑制剂接触，其中所述抑制剂选自：
Figure FDA0003435616980000021
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000022
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000031
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000032
或其可药用盐或衍生物；和
Figure FDA0003435616980000041
或其可药用盐或衍生物。
22.权利要求20所述的方法，其中所述DRP已被不对称地二甲基化。
23.在对象中治疗与DRP的表达相关的神经退行性疾病的方法，其包括施用有效量的I型PRMT抑制剂。
24.权利要求23所述的方法，其中所述疾病是肌萎缩侧索硬化(ALS)或额颞痴呆(FTD)。
25.权利要求24所述的方法，其中所述疾病是ALS。
26.权利要求24所述的方法，其中所述疾病是FTD。
27.权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述DRP是通过C9ORF72中的六核苷酸(GGGGCC)重复序列的扩增而产生的。
28.权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述DRP包含精氨酸(R)。
29.权利要求28所述的方法，其中所述DRP已被不对称地二甲基化。
30.权利要求28所述的方法，其中所述DRP包含GR和/或PR。
31.权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂选自PRMT1抑制剂、PRMT3抑制剂、PRMT4抑制剂、PRMT6抑制剂和PRMT8抑制剂。
32.权利要求31所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT1抑制剂。
33.权利要求32所述的方法，其中所述I型PRMT1抑制剂是MS023、MS049、GSK715或EPZ020411。
34.权利要求31所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT3抑制剂。
35.权利要求34所述的方法，其中所述I型PRMT3抑制剂是MS023、GSK715或MS049。
36.权利要求31所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT4抑制剂。
37.权利要求36所述的方法，其中所述I型PRMT4抑制剂是MS023、MS049、GSK715或TP064。
38.权利要求31所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT6抑制剂。
39.权利要求38所述的方法，其中所述I型PRMT6抑制剂是MS023、MS049、EPZ020411、GSK715或TP 064。
40.权利要求31所述的方法，其中所述I型PRMT抑制剂是PRMT8抑制剂。
41.权利要求40所述的方法，其中所述I型PRMT8抑制剂是MS023、MS049、EPZ020411、GSK715或TP 064。
42.权利要求23至41中任一项所述的方法，其中由DRP引起的细胞毒性通过细胞膜渗漏的减少、细胞代谢功能的提高或细胞凋亡的减少来测量。
43.权利要求23至41中任一项所述的方法，其中由DRP引起的细胞毒性通过以下测定中的一种或更多种来测量：WST-1、LDH、胱天蛋白酶3或BrdU。
44.权利要求23至43中任一项所述的方法，其还包括施用第二治疗剂的步骤。
45.权利要求44所述的方法，其中所述第二治疗剂是利鲁唑和/或依达拉奉。
46.权利要求27所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗体或其抗原结合部分。
47.权利要求46所述的方法，其中所述抗体阻断人CD40与CD40L的相互作用。
48.在对象中治疗C9ORF72相关的ALS的方法，其包括施用有效量的I型PRMT抑制剂，其中所述抑制剂选自：
Figure FDA0003435616980000061
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000062
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000063
或其可药用盐或衍生物；和
Figure FDA0003435616980000071
或其可药用盐或衍生物。
49.在对象中治疗C9ORF72相关的FTD的方法，其包括施用有效量的I型PRMT抑制剂，其中所述抑制剂选自：
Figure FDA0003435616980000072
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000073
或其可药用盐或衍生物；
Figure FDA0003435616980000081
或其可药用盐或衍生物；和
Figure FDA0003435616980000082
或其可药用盐或衍生物。
50.权利要求48或49所述的方法，其中所述疾病与DRP的表达相关。
51.权利要求50所述的方法，其中所述DRP是通过C9ORF72中的六核苷酸(GGGGCC)重复序列的扩增而产生的。
52.权利要求49所述的方法，其中所述DRP包含精氨酸(R)。
53.权利要求50所述的方法，其中所述DRP已被不对称地二甲基化。
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