CN114107047A - 基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道 - Google Patents
基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，包括：软光刻加工流道、双光子光刻微支架；其中，软光刻加工流道上开设有第一流道入口、第二流道入口和流道出口，双光子光刻微支架嵌合于软光刻加工流道内；双光子光刻微支架包括第一空心架体和第二空心架体，第一空心架体的第一端与第一流道入口连通，第二端与流道出口连通；第二空心架体套设于第一空心架体内，第二空心架体的第一端与第二流道入口连通，第二端与流道出口连通；第二空心架体的第二端沿其周向开设有与第一空心架体连通的交互孔。本申请解决了相关技术中无法实现复杂立体的三维微流道，导致难以进行动态流动条件下对多细胞交互机理行为的研究的问题。
Description
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道。
背景技术
人造3D生物微流道和微支架在针对多细胞共培养的组织工程和生物医学研究中发挥着愈发重要的影响。现已有多种制备可供不同种类细胞相互作用的3D生物微流道和微支架的方法，包括：以不同种类光刻胶为基础，基于双光子光刻技术打印构造不同细胞生物微支架刚度、多样细胞微支架形态和复杂细胞微支架机械特性，可随意改变支架构型，适应多种不同类型细胞表面培养；基于软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构，制作简单、观测方便、成本低廉，可为流道内生物环境提供动态流动条件，仿生模拟生物细胞体内真实环境，有效提高研究可靠性。
然而，由于采用双光子光刻技术打印的支架为较为微观的结构，难以实现培养液的定向流动。若采用双光子光刻技术打印一个密闭的空间来构建流动条件就需要将支架打印的较为宏观，导致构建的流道壁较厚，而由于配套的光刻胶自带荧光属性，在流道壁较厚的情况下，难以观测到细胞的生长。
而基于软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构，虽然可以实现动态条件下的多细胞共培养，但由于制作工艺的限制，只能加工复杂的二维形状流道或二维流道堆叠成的简单三维流道，无法实现复杂立体的三维微流道，而这恰恰是影响细胞生长的最关键因素之一。为了实现动态流动条件下对多细胞交互机理行为的研究，需要一种更复杂更接近真实生长环境的多细胞共培养新型三维组合流道。
发明内容
本申请的主要目的在于提供一种基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，以解决相关技术中无法实现复杂立体的三维微流道，导致难以进行动态流动条件下对多细胞交互机理行为的研究的技术问题。
为了实现上述目的，本申请提供了一种基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，该基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道包括：软光刻加工流道、双光子光刻微支架和多细胞共培养位；其中，
所述软光刻加工流道上开设有第一流道入口、第二流道入口和流道出口，所述双光子光刻微支架嵌合于所述软光刻加工流道内；
所述双光子光刻微支架包括第一空心架体和第二空心架体，所述第一空心架体的第一端与所述第一流道入口连通，第二端与所述流道出口连通；
所述第二空心架体套设于所述第一空心架体内，所述第二空心架体的第一端延伸出所述第一空心架体后与所述第二流道入口连通，第二端延伸入所述第一空心架体内并与所述流道出口连通；
所述第二空心架体的第二端沿其周向开设有与所述第一空心架体连通的交互孔，以形成所述多细胞共培养位。
进一步的，第一流道入口和所述第二流道入口沿所述流道出口的中心线对称分布。
进一步的，第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口与所述软光刻加工流道的截面与所述软光刻加工流道的底面之间的夹角均为锐角。
进一步的，第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口与所述软光刻加工流道的截面与所述软光刻加工流道的底面之间的夹角均为60°。
进一步的，第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口与所述软光刻加工流道的截面均为弧面，
所述第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口的外端的上下两侧和左右两侧分别互相平行。
进一步的，软光刻加工流道内部呈中空设置，所述软光刻加工流道的内顶面与所述第一空心架体的上端面之间具有打印间距。
进一步的，软光刻加工流道设置为圆台形的中空结构。
进一步的，交互孔设置为多个并沿所述第二空心架体的第二端的轴向和周向均匀分布；
所述交互孔的直径略小于动物细胞直径。
进一步的，第一空心架体和所述第二空心架体均呈弧形；
所述第一空心架体的轴线与所述第二空心架体的轴线位于同一水平面。
进一步的，第一空心架体的轴线与所述第二空心架体的轴线的弯曲方向相反。
根据本申请的另一方面，提供一种多细胞培养装置，该多细胞培养装置包括上述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，以及培养容器和细胞流道；其中，
所述培养容器设置为三个，并分别与所述第一流道入口、第二流道入口和流道出口对应；
所述细胞流道设置为三个，每个所述细胞流道的第一端均与对应的所述培养容器连通，第二端则与对应的所述第一流道入口或第二流道入口或流道出口连通。
在本申请实施例中，通过设置软光刻加工流道、双光子光刻微支架和多细胞共培养位；其中，软光刻加工流道上开设有第一流道入口、第二流道入口和流道出口，双光子光刻微支架嵌合于软光刻加工流道内；双光子光刻微支架包括第一空心架体和第二空心架体，第一空心架体的第一端与第一流道入口连通，第二端与流道出口连通；第二空心架体套设于第一空心架体内，第二空心架体的第一端延伸出第一空心架体后与第二流道入口连通，第二端延伸入第一空心架体内并与流道出口连通；第二空心架体的第二端沿其周向开设有与第一空心架体连通的交互孔，以形成多细胞共培养位，达到了将较为微观的双光子光刻微支架和较为宏观的软光刻加工流道进行结合，以较为宏观的第一流道入口、第二流道入口和流道出口配合实现培养液的定向流动，以较为微观且复杂的第一空心架体和第二空心架体共同形成三维微流道，使不同类型的细胞可在第一空心架体和第二空心架体内定向生长并进行多细胞共培养的目的，从而实现了定向流动下不同类型细胞3D共培养，便于研究动态培养下的多细胞交互作用机理的技术效果，进而解决了相关技术中无法实现复杂立体的三维微流道，导致难以进行动态流动条件下对多细胞交互机理行为的研究的技术问题。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是根据本申请实施例的结构示意图；
图2是根据本申请实施例中双光子光刻微支架的结构示意图；
图3是图2的剖视结构示意图；
其中，1软光刻加工流道，2双光子光刻微支架，21第一空心架体，22第二空心架体，23交互孔，3培养容器，4流道出口，5第二流道入口，6第一流道入口，7细胞流道。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例。
在本申请中，术语“上”、“下”、“内”、等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。
并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。
此外，术语“设置”、“设有”、“连接”、“固定”等应做广义理解。例如，“连接”可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
另外，术语“多个”的含义应为两个以及两个以上。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
相关技术中对于细胞培养而言一般单独采用双光子光刻技术打印构造的细胞生物微支架或者单独采用软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构。
然而，对于单独采用双光子光刻技术打印构造的细胞生物微支架而言，由于该细胞生物微支架为较为微观的结构，难以实现培养液的流入和流出，从而难以构建一个定向流道。若采用双光子光刻技术打印一个密闭的空间来构建流动条件就需要将支架打印的较为宏观，导致构建的流道壁较厚，而由于配套的光刻胶自带荧光属性，在流道壁较厚的情况下，难以观测到细胞的生长。
而基于软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构，虽然为较为宏观的结构，可以实现动态条件下的多细胞共培养，但由于制作工艺的限制，只能加工复杂的二维形状流道或二维流道堆叠成的简单三维流道，无法实现复杂立体的三维微流道，而这恰恰是影响细胞生长的最关键因素之一。
因此，为了实现动态流动条件下对多细胞交互机理行为的研究，需要一种更复杂更接近真实生长环境的多细胞共培养新型三维组合流道。为解决该问题，如图1至图3所示，本申请实施例提供了一种基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，该基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道包括：软光刻加工流道1、双光子光刻微支架2和多细胞共培养位；其中，
软光刻加工流道1上开设有第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4，双光子光刻微支架2嵌合于软光刻加工流道1内；
双光子光刻微支架2包括第一空心架体21和第二空心架体22，第一空心架体21的第一端与第一流道入口6连通，第二端与流道出口4连通；
第二空心架体22套设于第一空心架体21内，第二空心架体22的第一端延伸出第一空心架体21后与第二流道入口5连通，第二端延伸入第一空心架体21内并与流道出口4连通；
第二空心架体22的第二端沿其周向开设有与第一空心架体21连通的交互孔23，以形成多细胞共培养位。
本实施例中，该基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道主要是将较为宏观但简单的软光刻技术制备的单层或多层PDMS微流道结构和较为微观但复杂的双光子光刻技术打印构造的细胞生物微支架进行结合而形成新的三维微支架嵌合流道。因此该三维微支架嵌合流道主要包括软光刻加工流道1和嵌合在软光刻加工流道1内的双光子光刻微支架2，而多细胞共培养位则是双光子光刻微支架2内部性的用于多类型细胞的交互培养区域。
具体的，需要说明的是，本实施中的软光刻加工流道1作为该三维微支架嵌合流道的外围结构，其采用软光刻技术制备的PDMS微流道结构，为透明结构，在使用时可直接观测到软光刻加工流道1内部的结构。通过较为宏观的软光刻加工流道1可利于培养液的流入和流出，从而进行定向流道的构建。本申请中的三维微支架嵌合流道需要用于多细胞的共同培养，要求构建的定向流道至少要包括两个流道入口和一个流道出口4。因此，本实施中在软光刻加工流道1上开设有第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4。单从结构上看，第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4的结构相同，三者的区别在于功能不同，第一流道入口6用于一种细胞流入，第二流道入口5则用于另一种细胞流入，而流道出口4则用于培养液流出，从而构建多细胞培养的定向流动。
双光子光刻微支架2作为该三维微支架嵌合流道的内部结构，作为细胞的生长支架，其采用双光子光刻技术打印嵌合在软光刻加工流道1内。由于采用双光子光刻技术打印，因此使得双光子光刻微支架2可具有更为复杂的三维结构。
具体的，在本实施例中，如图2至图3所示，该双光子光刻微支架2主要由第一空心架体21和第二空心架体22组成，第一空心架体21的第一端与第一流道入口6连通，第二端与流道出口4连通。而第二空心架体22则套设于第一空心架体21内，且在二者的连接处为密封结构，第二空心架体22的第一端延伸出第一空心架体21后与第二流道入口5连通，第二端延伸入第一空心架体21内并与流道出口4连通。
第一空心架体21和第二空心架体22分别作为一种类型的细胞生长支架，使得两种类型的细胞在双光子光刻微支架2内被分隔开，使其可单独进行生长。同时，本实施例在第二空心架体22延伸入第一空心架体21内的一端还开设有交互孔23，而交互孔23则与第一空心架体21内部连通，形成多细胞共培养位，使得位于第一空心架体21内的细胞和位于第二空心架体22内的细胞可通过交互孔23进行交互生长。
在使用时，通过软光刻加工流道1上的第一流道入口6和第二流道入口5分别灌注不同种类细胞到第一空心架体21和第二空心架体22内，不同种类细胞通过交互孔23在多细胞共培养位进行交互，在细胞贴壁后通过向第一流道入口6和第二流道入口5灌注定向流动的培养液，观测并分析定向流动影响下多种细胞共培养情况。
两入口不同类型的细胞分别贴壁后，在流道出入口加入不等量细胞正常生长所需培养液，入口侧培养液体积略大于出口侧，在流道内形成定向流动，双光子光刻微支架2受到定向流动的流体作用，观测并分析定向流动影响下多细胞共培养界面上的细胞共培养情况。
本实施例达到了将较为微观的双光子光刻微支架2和较为宏观的软光刻加工流道1进行结合，以较为宏观的第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4配合实现培养液的流入和流出，以较为微观且复杂的第一空心架体21和第二空心架体22共同形成三维微流道，使不同类型的细胞可在第一空心架体21和第二空心架体22内定向生长并进行多细胞共培养的目的，从而实现了定向流动下不同类型细胞3D共培养，便于研究动态培养下的多细胞交互作用机理的技术效果，进而解决了相关技术中无法实现复杂立体的三维微流道，导致难以进行动态流动条件下对多细胞交互机理行为的研究的技术问题。
为使培养液在第一空心架体21和第二空心架体22内的流动均匀，第一流道入口6和第二流道入口5沿流道出口4的中心线对称分布。
由于双光子光刻微支架2嵌合在软光刻加工流道1内，且双光子光刻微支架2和软光刻加工流道1的材质不同，二者之间还具有一定的间距。因此，当从外部对双光子光刻微支架2的细胞生长进行观测时，由于光线折射作用导致观测的内容与实际内容在位置上存在偏差。
因此为解决该技术问题，第一流道入口6、所述第二流道入口5和所述流道出口4与所述软光刻加工流道1的截面与所述软光刻加工流道1的底面之间的夹角均为锐角。作为一种优选的方式，第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4与软光刻加工流道1的底面之间均为60°。
如图2至图3所示，第一流道入口6、所述第二流道入口5和所述流道出口4与所述软光刻加工流道1的截面均为弧面，第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4的外表面为弧面，且其外侧开口端的上下两侧和左右两侧分别互相平行，以形成类似长方形的开口结构，从而便于软光刻加工流道1的打印。为便于在软光刻加工流道1内进行双光子光刻微支架2的打印，软光刻加工流道1内部呈中空设置，且软光刻加工流道1的内顶面与第一空心架体21的上端面之间具有打印间距，即软光刻加工流道1和双光子光刻微支架2在Z轴上不接触。
具体的，需要说明的是，本实施例中，第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4的直径均为2mm，厚度均为4mm，软光刻加工流道1设置为圆台形的中空结构且顶部封闭，使得软光刻加工流道1的外观更为美观。对圆台形的软光刻加工流道1而言，第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4的外侧为软光刻加工流道1的外圆曲面，并且软光刻加工流道1的外圆曲面与底面之间呈60°的夹角，用以避免由于PDMS、聚合光刻胶和未聚合光刻胶折射率不同引起的阴影效应。
如图2至图3所示，第一流道入口6和第二流道入口5在培养液的流动方向上开口逐渐减小，从而才能够实现与较为微观的第一空心架体21和第二空心架体22的连接。具体的，第一流道入口6与第一空心架体21连接端的截面为200μm*80μm，第二流道入口5与第一空心架体21连接端的截面为100μm*80μm。
软光刻加工流道1和双光子光刻微支架2的嵌合打印方式为：利用抽吸入软光刻加工流道1的IP-L光刻胶进行双光子光刻加工，得到可施加定向流动的内部嵌有3D光刻胶生物微支架的流道，用于在多细胞共培养界面研究定向流动条件下不同种类细胞共培养特性。
为实现不同类型细胞分层生长和多孔交互共同培养，交互孔23设置为多个并沿第二空心架体22的第二端的轴向和周向均匀分布，交互孔23的直径略小于动物细胞直径，使得细胞的主体无法通过交互孔23，而细胞的轴突，细胞的一些分泌物则可通过交互孔23进行交互，每个交互孔23的直径可为8μm。
第一空心架体21和第二空心架体22均为空心圆柱形结构，并且第一空心架体21和第二空心架体22在走向上均呈弧形，使得培养液的流动更为稳定，从而利于细胞在第一空心架体21和第二空心架体22内进行生长；第一空心架体21的轴线与第二空心架体22的轴线位于同一水平面。
第一空心架体21和第二空心架体22的长度可为80μm，第一空心架体21作为外层圆柱形结构，外径、内径分别为92μm、88μm，而第二空心架体22作为内层圆柱形结构，外径、内径分别为44μm、36μm。
由于第一流道入口6和第二流道入口5对称分布，且第二空心架体22套接在第一空心架体21内，因此，第一空心架体21的轴线与第二空心架体22的轴线的弯曲方向相反。
如图1所示，根据本申请的另一方面，提供一种多细胞培养装置，该多细胞培养装置包括上述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，以及培养容器3和细胞流道7；其中，
培养容器3设置为多个，并分别与第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4对应；
细胞流道7设置为多个，每个细胞流道7的第一端均与对应的培养容器3连通，第二端则与对应的第一流道入口6或第二流道入口5或流道出口4连通。
本实施例中，培养容器3和细胞流道7均设置为3个并一一对应，细胞流道7的截面与第一流道入口6、第二流道入口5和流道出口4的截面匹配。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，包括：软光刻加工流道、双光子光刻微支架和多细胞共培养位；其中，
所述软光刻加工流道上开设有第一流道入口、第二流道入口和流道出口，所述双光子光刻微支架嵌合于所述软光刻加工流道内；
所述双光子光刻微支架包括第一空心架体和第二空心架体，所述第一空心架体的第一端与所述第一流道入口连通，第二端与所述流道出口连通；
所述第二空心架体套设于所述第一空心架体内，所述第二空心架体的第一端延伸出所述第一空心架体后与所述第二流道入口连通，第二端延伸入所述第一空心架体内并与所述流道出口连通；
所述第二空心架体的第二端沿其周向开设有与所述第一空心架体连通的交互孔，以形成所述多细胞共培养位。
2.根据权利要求1所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述第一流道入口和所述第二流道入口沿所述流道出口的中心线对称分布。
3.根据权利要求2所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口与所述软光刻加工流道的截面与所述软光刻加工流道的底面之间的夹角均为锐角。
4.根据权利要求3所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口与所述软光刻加工流道的底面之间的夹角均为60°。
5.根据权利要求4所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口与所述软光刻加工流道的截面均为弧面；
所述第一流道入口、所述第二流道入口和所述流道出口的外端的上下两侧和左右两侧分别互相平行。
6.根据权利要求3至5任一项所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述软光刻加工流道内部呈中空设置，所述软光刻加工流道的内顶面与所述第一空心架体的上端面之间具有打印间距。
7.根据权利要求6所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述交互孔设置为多个并沿所述第二空心架体的第二端的轴向和周向均匀分布；
所述交互孔的直径略小于动物细胞直径。
8.根据权利要求7所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述第一空心架体和所述第二空心架体均呈弧形；
所述第一空心架体的轴线与所述第二空心架体的轴线位于同一水平面。
9.根据权利要求8所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，其特征在于，所述第一空心架体的轴线与所述第二空心架体的轴线的弯曲方向相反。
10.一种多细胞培养装置，其特征在于，包括如权利要求1至9任一项所述的基于双光子光刻的多细胞共培养三维微支架嵌合流道，以及培养容器和细胞流道；其中，
所述培养容器设置为三个，并分别与所述第一流道入口、第二流道入口和流道出口对应；
所述细胞流道设置为三个，每个所述细胞流道的第一端均与对应的所述培养容器连通，第二端则与对应的所述第一流道入口或第二流道入口或流道出口连通。
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Also Published As
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