CN114099717A

CN114099717A - 一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂及其制备和应用

Info

Publication number: CN114099717A
Application number: CN202111163152.XA
Authority: CN
Inventors: 张兵波; 杨维涛; 徐琰
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2022-03-01

Abstract

本发明属于磁共振成像技术领域，公开了一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂及其制备和应用，其中，该靶向磁共振造影剂包括：成纤维细胞活化蛋白靶向分子和顺磁性离子螯合分子。本发明制备的磁共振造影剂具有靶向性高，成像时间窗口宽、造影性能好以及肿瘤普适性等优点，能有效提高肿瘤诊断效率和精准度。本发明还公开了所述靶向磁共振造影剂的制备方法，所述方法操作简单、步骤少、无污染、效率高。

Description

一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂及其制备和应用

技术领域

本发明属于磁共振成像技术领域，涉及一种磁共振造影剂及其制备和应用，具体涉及一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂及其制备和应用。

背景技术

磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)凭借其高分辨率、无组织穿透深度限制、无辐射等优势，可以提供三维、全方位、高清晰的组织结构信息，成为肿瘤诊断中不可或缺的重要辅助检查手段。磁共振造影剂作为磁共振影像检查的重要补充手段，通过改变组织内自由水的弛豫时间，增强肿瘤组织和周边正常组织间的对比度，有效提高肿瘤诊断效率和精准度。

目前临床上常用的磁共振造影剂主要为含钆的小分子配合物，如二乙基三胺五乙酸(DTPA)-Gd和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)-Gd等，这类造影剂通过缩短水分子的纵向弛豫时间(T₁)，使肿瘤组织相对正常组织信号变亮，但目前其也存在较多的局限性，例如弛豫率较低、成像时间窗口窄(易代谢、体内循环时间短)、肿瘤靶向性差等。此外，临床常用的马根维显为代表的阳性磁共振造影剂也存在代谢过快、靶向性差等问题。因此，开发肿瘤靶向性高的磁共振造影剂就显得尤为重要。

发明内容

成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein，FAP)是一种由760个氨基酸组成的II型跨膜糖蛋白，是丝氨酸蛋白酶家族的一员。FAP高表达于上皮来源肿瘤相关的间质成纤维细胞，而人体正常器官和组织仅只包含少量处于休止状态的成纤维细胞，基本检测不到FAP的表达。本发明以纤维细胞活化蛋白为靶点构建具有高靶向性等优异性能的磁共振造影剂，以期获得对肿瘤诊断更具特异性的试剂。

本发明的目的是为了克服现有磁共振造影剂靶向性差等缺点，提供一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白FAP靶向磁共振造影剂及其制备和应用。

为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的，本发明提供一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白FAP靶向磁共振造影剂，包括：

成纤维细胞活化蛋白靶向分子、磁共振成像离子和磁共振成像离子螯合分子。其中，成纤维细胞活化蛋白靶向分子和磁共振成像离子螯合分子通过酰胺化反应偶联即通过酰胺键偶联，所述磁共振成像离子与磁共振成像离子螯合分子通过配位反应结合。

所述成纤维细胞活化蛋白靶向分子为肿瘤成纤维细胞活化蛋白抑制剂分子。

所述磁共振成像离子为顺磁性金属离子，选自Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺中的一种或多种；

所述磁共振成像离子螯合分子为顺磁性金属离子螯合分子，选自DOTA、NOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A中的一种或几种。

本发明所述磁共振造影剂能够靶向肿瘤成纤维细胞活化蛋白。

本发明的另一种目的还在于提供一种成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂的用途，所述靶向造影剂应用于靶向与FAP相关的疾病或病症的磁共振成像诊断。

本发明另一目的是提供所述磁共振造影剂的治疗用途，通过载药或者载基因处理在进行显像实现病情监测后可进行靶向药物释放实现智能给药。

本发明另一目的是提供一种药物组合物，所述磁共振造影剂包含如上所述的磁共振造影剂，治疗药物，以及药学上可接受的载体、介质中的一种或几种。

本发明另一目的是提供所述磁共振造影剂的制备方法，所述方法包括以下制备步骤(示意图如图4所示)：

1)通过酰胺化反应将成纤维细胞活化蛋白靶向分子和磁共振成像离子螯合分子偶联；

2)将上述偶联物分子溶于水，加入磁共振成像离子，调整反应体系pH为弱酸性，使磁共振成像离子与磁共振成像离子螯合分子进行配位反应，即得到所述磁共振造影剂。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂具有高靶向性和良好的生物相容性等特性，能有效解决目前临床磁共振造影剂存在的靶向性差等多种问题。

本发明的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂使用较低的造影剂量，即可获得增强诊断成像模式的图像质量。

本发明的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂具有成像时间窗口宽、造影性能好等优点，能有效提高肿瘤诊断效率和精准度。

本发明的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂具有广泛的普适性，可以用于多种肿瘤的靶向磁共振成像诊断，更好地服务于临床显像用于疾病诊断。

本发明的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂的制备方法，操作简单、步骤少、无污染、效率高；制备的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂具有稳定性高、安全性高等特点。

附图说明

图1为实施例1中制备而成的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂DOTA^Gd-FAPI在1.5T磁场下的纵向弛豫率测试曲线图。

图2为实施例2中制备而成的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂NOTA^Gd-FAPI在3.0T磁场下不同浓度的T₁加权成像图。

图3为实施例1中制备而成的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂DOTA^Gd-FAPI在乳腺癌荷瘤小鼠上的成像效果。

图4为本发明成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂合成示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

目前临床使用的磁共振造影剂的缺点是无靶向性。本发明首次构建了成纤维细胞活化蛋白靶向的磁共振造影剂，用于磁共振靶向成纤维细胞活化蛋白，靶向性高，能有效减少正常组织造影剂的停留，也可以减少造影剂注射剂量，更有效点亮病灶，特异性强，更能方便医生进行诊断。

本发明提供了一种肿瘤成纤维细胞活化蛋白FAP靶向磁共振造影剂，包括成纤维细胞活化蛋白靶向分子、磁共振成像离子和磁共振成像离子螯合分子。所述成纤维细胞活化蛋白靶向分子与磁共振成像离子螯合分子通过氨基与羧基反应形成的酰胺键结合，所述磁共振成像离子与磁共振成像离子螯合分子通过配位反应结合；所述靶向磁共振造影剂为肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂。

本发明中，所述肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向分子为成纤维细胞活化蛋白FAP抑制剂分子(FAPI)，优选地，所述FAP抑制剂分子选自FAP-2、FAP-4；进一步优选地，所述FAP-4结构如下式I所示：

本发明中，所述磁共振成像离子为顺磁性金属离子，选自Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺中的一种或多种，可以为Gd³⁺、Mn²⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺，或Gd³⁺、Cu²⁺，或Gd³⁺、Ni³⁺，或Mn²⁺、Fe³⁺，或Mn² ⁺、Cu²⁺，或Mn²⁺、Ni³⁺，或Fe³⁺、Cu²⁺，或Fe³⁺、Ni³⁺，或Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Cu² ⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，或Mn²⁺、Fe³⁺、Ni³⁺，或Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，或Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺。优选地，为Gd³⁺。其中Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺成像性能依次递减。所述顺磁性金属离子由顺磁性金属盐提供，所述顺磁性金属盐包括氯化钆、硝酸钆、醋酸钆、氯化锰、硝酸锰、醋酸锰、氯化铁以及硝酸铁中的一种或多种。

本发明中，所述磁共振成像离子螯合分子为顺磁性离子螯合剂，选自DOTA、NOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A中的一种或几种；其中，DOTA、NOTA、DTPA的结构如下所示：

本发明还提供了一种如上所述的磁共振造影剂的制备方法，所述方法包括以下制备步骤：

2)向上述反应混合物中加入磁共振成像离子，使顺磁性金属离子与螯合剂配位，得到所述磁共振造影剂；

步骤1)中，所述肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向分子为成纤维细胞活化蛋白FAP抑制剂分子(FAPI)。所述FAP抑制剂分子选自FAP-2、FAP-4；优选地，所述FAP-4结构如下式I所示：

步骤1)中，所述磁共振成像离子螯合分子为顺磁性离子螯合剂，选自DOTA、NOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A中的一种或几种，可以是DOTA、NOTA，或DOTA、DTPA，或DOTA、BOPTA，或DOTA、HPDO3A，或NOTA、DTPA，或NOTA、BOPTA，或NOTA、HPDO3A，或DTPA、BOPTA，或DTPA、HPDO3A，或BOPTA、HPDO3A，或DOTA、NOTA、DTPA，或DOTA、NOTA、BOPTA，或DOTA、NOTA、HPDO3A，或DOTA、DTPA、BOPTA，或DOTA、DTPA、HPDO3，或DOTA、BOPTA、HPDO3A，或NOTA、DTPA、BOPTA，或NOTA、DTPA、HPDO3A，或DTPA、BOPTA、HPDO3A，或NOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A，或DOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A，或DOTA、NOTA、BOPTA、HPDO3A，或DOTA、NOTA、DTPA、HPDO3A，或DOTA、NOTA、DTPA、BOPTA，或DOTA、NOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A；其中，DOTA、NOTA、DTPA的结构如下所示：

步骤2)中，所述pH为5-6.5；可以是5-5.1、5.1-5.2、5.2-5.3、5.3-5.4、5.4-5.5、5.5-5.6、5.6-5.7、5.7-5.8、5.8-5.9、5.9-6.0、6.0-6.1、6.1-6.2、6.2-6.3、6.3-6.4、6.4-6.5；优选地，为5.5。可以采用本领域常用的缓冲溶液调节反应液的pH值。在一具体实施方式中，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节反应液的pH值。

步骤2)中，所述配位反应(搅拌)的温度为30-45℃，可以是30-32℃、32-34℃、34-36℃、36-38℃、38-40℃、40-42℃、42-45℃；优选地，为37℃。

步骤2)中，所述配位反应的时间为4-8小时，可以说4-5小时、5-6小时、6-7小时、7-8小时；优选地，为6小时。

步骤2)中，所述磁共振成像离子为顺磁性金属离子，选自Gd³⁺、Mn²⁺中的一种或多种；可以是Gd³⁺、Mn²⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺，或Gd³⁺、Cu²⁺，或Gd³⁺、Ni³⁺，或Mn²⁺、Fe³⁺，或Mn²⁺、Cu²⁺，或Mn²⁺、Ni³⁺，或Fe³⁺、Cu²⁺，或Fe³⁺、Ni³⁺，或Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，或Mn²⁺、Fe³⁺、Ni³⁺，或Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺，或Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Ni³⁺，或Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺。其中Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺成像性能依次递减。所述顺磁性金属离子由顺磁性金属盐提供，所述顺磁性金属盐包括氯化钆、硝酸钆、醋酸钆、氯化锰、硝酸锰、醋酸锰、氯化铁以及硝酸铁中的一种或多种。

步骤3)中，可以采用本领域公知的方法进行分离，优选地，本发明采用的分离方法为柱层析分离。

步骤3)中，可以采用本领域公知的方法进行纯化，优选地，本发明采用的纯化方法为透析。

步骤3)中，可以采用本领域公知的方法进行干燥，所述的干燥为冷冻干燥。

在一具体实施方式中，本发明提供的磁共振造影剂的制备方法包括以下制备步骤：

1)通过酰胺化反应将成纤维细胞活化蛋白靶向分子和顺磁性离子螯合分子偶联并纯化；

2)将上述分子溶于水，加入顺磁性离子水溶液，调整反应体系pH为弱酸性，搅拌使顺磁性金属离子与螯合剂配位；

3)后经分离、纯化和干燥，即得到所述的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂。

本发明还提供了所述成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂的用途，所述靶向造影剂可用于与FAP相关的疾病或病症的成像诊断或用于制备磁共振造影产品。

本发明中，所述与FAP相关的疾病或病症选自癌症、炎症或纤维化疾病、组织重塑和瘢痕病。

所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝癌(或肝细胞癌)、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤癌(或骨髓瘤细胞癌)、膀胱癌、胆管癌(或胆管细胞癌)、透明肾癌(或透明细胞肾癌)、前列腺癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、原发性未知癌、胸腺癌、胶质瘤、神经胶质瘤、星型细胞瘤、子宫颈癌、白血病、骨癌、脑癌、支气管癌、室管膜瘤癌、成视网膜瘤癌、胃癌、胃肠道癌、心脏癌、黑素瘤癌、肾癌、淋巴瘤癌、间皮瘤癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、甲状腺癌、垂体癌、肾癌、唾液腺癌、肉瘤癌和皮肤癌中的一种或几种。

所述炎症或纤维化疾病选自骨关节炎、类风湿关节炎、肉芽组织、非酒精性脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、原发性硬化性胆管炎、炎性肠病、硬皮病、肺纤维化、放射诱导纤维化、心力衰竭、肥大型心肌病、心肌梗塞、心房纤颤、糖尿病肾病、系统性红斑狼疮、多囊性肾病、慢性阻塞性肺病、肺高血压、肾小球肾炎、末期肾疾病、动脉粥样硬化、青光眼、糖尿病视网膜病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、手术粘连、囊性纤维化。

在一些实施方式中，本发明所述成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂应用于靶向乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞癌、膀胱癌、胆管细胞癌、透明细胞肾癌和前列腺癌等的磁共振成像诊断。

本发明另一目的是提供所述磁共振造影剂的治疗用途，所述磁共振造影剂通过载药或者载基因用于与FAP相关的疾病或病症的治疗。在一具体实施方式中，本发明所述磁共振造影剂通过载药或者载基因处理，在进行显像实现病情监测后可进行靶向药物释放实现定向给药。

本发明的靶向磁共振造影剂用于磁共振成像，提供了使用可能较低的造影剂量来增强磁共振诊断成像模式的图像质量的技术，这为提高医学成像的价值提供了新机会。

本发明提供的上述FAP靶向磁共振造影剂，可以用活在体外、活体内和/或离体条件下，例如，以它们在药学上适用的盐类和/或以它们和至少一种药学上适用的载体的相混合的医药组合制剂的形式，作为诊断试剂和/或治疗药剂。例如，这些有效成分用于制备适于成像或者辅助成像的各种药剂，包括核磁共振成像(MRI)，或者用于制备适用于该用途的成像剂或者辅助成像剂。这包括它们在活体内用作各种有效造影剂，通过肉眼观察器官、血管系统、肝胆系统或者肾脏泌尿系统或坏死组织，通过肉眼观察、识别疾病和病理过程。本发明这一方面所涉及的疾病为与FAP相关的疾病或病症的成像诊断。所述与FAP相关的疾病或病症选自癌症、炎症或纤维化疾病、组织重塑和瘢痕病。

这些药剂也可以用于追踪治疗过程，例如坏死的进展。尤其是这些造影剂可以用于涉及坏死以及和坏死有关的病理过程，如，由病理性或治疗性坏死引起的局部缺血，或者由包括治疗切除、放射治疗和/或化疗时发生的外伤、辐射作用和/或化学品引起病理性或治疗性坏死等方面的医学用途。对于这些方面，可将所述FAP靶向磁共振造影剂施用于人体，最好是内用或经肠胃外使用，作为治疗和/或诊断用药剂。

本发明还提供了一种组合物，所述组合物除包含上述FAP靶向磁共振造影剂外，还包括可用于和本发明FAP靶向磁共振造影剂混合的在医药学上适用的各种载体，各种载体在药学领域中是熟知的，且可根据对对象(如哺乳动物，尤其是人类)给药的方式而进行选择。所述组合物适于任何形式的给药方式，可以是口服或胃肠外给药，例如，可以是经肺、经鼻、经直肠和/或静脉注射，更具体可以是真皮内、皮下、肌内、关节内、腹膜内、肺部、口腔、舌下含服、经鼻、经皮、阴道、口服或胃肠外给药；注射给药包括静脉注射、肌内注射和皮下注射等，经皮给药等。

如本文所用，所述组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等，再例如，适合于胃肠外给药的制剂形式可以是包括但不限于溶液、悬浮液、可复水的干制剂或喷雾剂等，再例如，适合于直肠给药的通常可以是栓剂，再例如，适合注射给药的可以是注射剂、注射用无菌粉末等。在一具体实施方式中，合适的制剂是在生理上适用的液体制剂，宜为包括常用表面活性剂如聚乙二醇的水溶液或乳剂或悬浮剂。

本发明中，所述组合物还包括药学上可接受的载体或介质，可接受的载体或介质等。所述载体、介质必须与该组合物的活性成分相容。所述可接受的载体、介质例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

在一具体实施方式中，本发明还提供了所述的FAP靶向磁共振造影剂或所述的组合物在制备用于成像的组合物中的应用。在一些实施方式中，本发明还提供了所述的FAP靶向磁共振造影剂或所述的组合物在制备使哺乳动物组织成像的组合物中的应用。在另一些实施方式中，本发明还提供了所述的FAP靶向磁共振造影剂或所述的组合物在制备在哺乳动物中进行核磁共振成像的组合物中的应用。在另一些实施方式中，本发明还提供了所述的FAP靶向磁共振造影剂或所述的组合物在制备可使哺乳动物身体的至少一部分形成图像的药物中的用途。在另一些实施方式中，本发明还提供了所述的FAP靶向磁共振造影剂或所述的药物组合物在制备在哺乳动物的一种器官、器官一部分或一组器官上使用的造影剂中的用途。

本发明提供的上述FAP靶向磁共振造影剂可以用活在体外、活体内和/或离体条件下。

本发明还提供一种用于对象体内成像的方法。给予所述对象FAP靶向磁共振造影剂，等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点累积的一段时间；和，采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。给予所述造影剂的对象中的分子具有改良的纵向弛豫时间，可以通过图像得以反映。所述非侵入性成像技术可以是磁共振成像。

本发明还提供一种对对象的感兴趣区域成像的方法。给予所述对象FAP靶向磁共振造影剂，使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极化磁场。对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电。控制经设置以向该对象施加激励场的射频(RF)系统来从中获得磁共振(MR)图像数据，并且从该MR图像数据重建感兴趣区域的图像。所述磁共振造影剂还可以包含具有发射正电子的锰同位素，当采用磁共振造影剂时，可采用多个检测器来检测从对象发出的γ射线，并检测γ射线所对应的信号，从所述信号重建该对象的感兴趣区域的一系列医学图像。

在另一实施方案中，本发明涉及用于形成对象组织或器官的至少一部分的图像的方法，包括给哺乳动物全身或者局部施用有效量的FAP靶向磁共振造影剂。在一具体实施方式中，本发明的FAP靶向磁共振造影剂可通过包括静脉注射的低剂量胃肠外施用作为诊断剂全身使用，即，当使用可络合的金属如钆时，其剂量约为每千克体重35-300微摩尔钆，宜为每千克体重15-80微摩尔钆，当全身应用时，这一范围的低限部分仍旧可在活体内生效。

在另一实施方案中，本发明的FAP靶向磁共振造影剂也可以施用于局部，例如，包括对患有心肌梗塞的对象冠脉内给药。根据具体的情况，本发明的造影剂有效的局部剂量，可以是受治疗的对象每千克体重1-3微摩尔钆。

在某些实施方案中，所述磁共振造影剂或组合物被制备成微球。也就是说，在一些实施方案中，微球负载有、结合有、或以其它方式包含FAP靶向磁共振造影剂。在一些实施方案中，本发明的微球可以通过荧光检查到，并且包括药物。在一些实施方案中，所述微球基本上为球形，其包含FAP靶向磁共振造影剂和抗血管发生药或抗肿瘤药。在一些实施方案中，所述微球基本上为球形，其包含FAP靶向磁共振造影剂和化疗药或抗炎药。

本发明中载药是所提供的造影剂的附加功能，药物根据需要可以在微球核心内进行吸附、包载或者连接，也可以直接在外壳上进行包载。

本发明的微球能够通过例如注射的方式植入机体的各个位置。用于本发明的微球材料对组织和细胞是无毒的，并且是可生物相容的，即通常不会引起炎症。在某些实施方案中，用于本发明的微球是可生物相容的且是亲水的。在一些实施方案中，用于本发明的微球是基本上为球形和无毒的，并且包括至少一种聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物为亲水聚合物。在具体实施方案中，所述聚合物是高吸水性或超吸水性聚合物。在一些实施方案中，干燥形式的微球在接触或以其它方式暴露于液体如水、盐水溶液、缓冲液或生理流体时是可膨胀的。

本发明的微球在悬浮时是稳定的，可以将微球配制成悬浮液并贮存在其中，并用不同的液体注射。微球的亲水性允许其置于悬浮液中，尤其是可注射溶液的形式中，能够避免形成聚集物或者粘附到导管、注射器、针头等的壁上。

采用的本发明的微球植入期望的位置后，通常微球能够保持原来的形状。本发明的微球是可压缩的，在具体实施方案中，能够通过很小的针头注射。本发明的微球是柔性的，能够容易地进入并通过注射装置和小的导管，性质不会受影响。本发明所述微球还可耐受在植入过程之中和之后产生的肌肉收缩压力。本发明所述微球还可以是热稳定的，不易受到外界环境如灭菌、冷冻或冻结等的影响。

在某些实施方案中，微球基本上为球形。在一些实施方案中，本发明所述微球的表面是光滑的。在某些实施方案中，微球具有均匀的尺寸。在本发明一个实施方式中，所述微球粒径为200～2000nm。微球之间的直径差异很小。在一些实施方案中，微球的直径差异为100μm或更小、约50μm或更小、约25μm或更小、约10μm或更小或约5μm或更小。

在一些实施方案中，微球包括约1％重量至约95％重量FAP靶向磁共振造影剂。在某些实施方案中，微球所含的FAP靶向磁共振造影剂的量选自1％重量、约5％重量、约10％重量、约15％重量、约20％重量、约25％重量、约30％重量、约35％重量、约40％重量、约45％重量、约50％重量、约55％重量、约60％重量、约65％重量、约70％重量、约75％重量、约80％重量、约85％重量、约90％重量、约95％重量、约96％重量、约97％重量、约98％重量。

可以通过悬浮聚合、逐滴聚合或本领域已知的任何其它方法来制备微球。所采用的微球制备模式通常将取决于期望的性质，例如所得微球的大小、孔径和化学组成等。本发明的微球能够通过本领域描述的标准聚合方法制备。

本发明中，所述制备方法可以任选地使微球与FAP靶向磁共振造影剂接触。如果微球还负载药物，则FAP靶向磁共振造影剂的负载没有进行至完全饱和的程度。为此，首先确定微球能够吸收的液体量；然后用被包含造影剂的溶液完全饱和所必需的溶液量的约5％重量、约10％重量、约20％重量、约30％重量、约40％重量、约50％重量、约60％重量、高至约70％重量或约80％重量甚至约90％重量饱和干燥微球；然后可以用包括一种或多种药物或其它药剂的溶液将微球负载至部分或完全饱和。或者，可以首先用药物溶液将微球负载至部分或完全饱和，随后(或同时)负载造影剂。在本发明一个实施方式中，所述微球装载有荧光标记物。

因此，能够通过下述方法，在施用药物溶液之前、同时或之后施用已经负载了药物和/或FAP靶向磁共振造影剂的微球、或者还未负载或只部分负载了药物和/或FAP靶向磁共振造影剂的微球。

本发明还涉及包括任何上述微球和药学上可接受的液体或其它可生物相容的载体的药物组合物。组合物可以是悬浮液、水凝胶或乳液的形式。组合物还可以是所述微球在所述液体内的悬浮液。在一些实施方案中，组合物是无菌的。在一些实施方案中，组合物可以包括约10％～90％重量的微球。

在一些实施方案中，所述组合物中，药物在特定的小时数、天数或周数内释放。在一个实施方案中，在特定的时间段后，例如在约1小时、约2小时、约5小时、约10小时后，或在约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天后，或在约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或更长时间后，从微球中释放了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％的药物。释药性质将部分取决于所用具体药物的性质，但可由本领域技术人员容易地确定。

本发明还提供了所述微球在用于治疗、控制或预防对象与FAP相关的疾病或病症中的应用。在一些实施方案中，对象感染有丙型肝炎病毒。

本发明还提供了一种预防和/或治疗与FAP相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象中给予本发明所述的微球，以使得向局部(或全身)递送由本发明所述微球释放的药物。在一具体实施方式中，通过FAP靶向磁共振造影剂的成像作用，跟踪药物的治疗效果。

本发明提供的装载造影剂和药物的微球纳米粒形态是较为均一的圆球状，分散均匀；有穿过肿瘤毛细血管内皮间隙的可能性，从而实现被动靶向，满足肿瘤靶向显像对造影剂的粒径要求；内部存在的Gd³⁺、Mn²⁺和Fe³⁺等元素且具有超顺磁特性，有助于纳米造影剂进行核磁造影。

本发明提供的装载造影剂和药物的微球稳定性好，在4℃的条件下能稳定保存，其对易降解的药物、基因的保护作用更长。

本发明提供的装载造影剂和药物的微球具有缓释作用，有利于减少其在体内循环过程中的药物、基因释放。在一具体实施方式中，在治疗超声的刺激下能促发微球内药物的突释，有助于药物在靶向部位智能释放，从而提高药物局部浓度，实现精准治疗。

本发明还涉及试剂盒或药盒。所述试剂盒或药盒包含如上所述的FAP靶向磁共振造影剂或含所述FAP靶向磁共振造影剂的组合物或含所述FAP靶向磁共振造影剂的微球。在一些实施方式中，所述试剂盒或药盒包括一个或多个容器，其中一种、两种、三种或多种组分可以处于一个、两个、三个或多个小瓶内。本文所述的任何测定或方法的试剂均可以被包括作为试剂盒或药盒的组分。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本申请实施例中，化合物DOTA、NOTA以及DTPA购买于上海阿拉丁生化科技有限公司，化合物式I所示FAPI购买于西安瑞禧生物有限公司。

DOTA：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，化学式：C16H28N4O8。

NOTA：2-S-(4-氨基苯)-1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(P-NH_2-Bn-NOTA,简写为NOTA)，为双功能螯合剂。

DTPA：二乙烯五乙酸盐。

实施例1成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂DOTA^Gd-FAPI(DOTA^Gd-FAPI探针)

一、制备DOTA-FAPI

(1.1)将DOTA(100mg，0.168mmol)，式I所示的FAPI(106mg，0.278mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(48mg，0.251mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(29mg，0.251mmol)和N，N-二异丙基乙胺(65mg，0.503mmol)溶于25mL的N，N-二甲基甲酰胺中，45℃下搅拌加热12小时。

(1.2)将反应液降至室温后，减压浓缩后加入20mL水和30mL乙酸乙酯萃取两次，饱和食盐水洗涤一次，然后将乙酸乙酯相加入5g无水硫酸钠静置10分钟后过滤。

(1.3)将滤液经硅胶层析柱分离纯化得到产品化合物DOTA-FAPI，产率52％。

二、制备DOTA^Gd-FAPI

(2.1)按照DOTA-FAPI与顺磁性钆离子摩尔比为1:4量取硝酸钆水溶液，滴加到DOTA-FAPI水溶液，继续搅拌反应，进行钆离子螯合，得到反应液；

(2.2)用醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节反应液的pH值为5.0；

(2.3)经硅胶层析柱分离纯化得到DOTA^Gd-FAPI。

图1为本实施例中制备而成的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂DOTA^Gd-FAPI在1.5T磁场下的纵向弛豫率测试曲线图。由图1可以看出，本实施例中制备的磁共振造影剂的纵向弛豫效率为4.36mM^-1s^-1，与临床所用磁共振造影剂马根维显造影性能持平。

实施例2：成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂NOTA^Gd-FAPI(NOTA^Gd-FAPI探针)

一、制备化合物NOTA-FAPI

(1.1)将NOTA(100mg，0.168mmol)，FAPI(106mg，0.278mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(48mg，0.251mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(29mg，0.251mmol)和N，N-二异丙基乙胺(65mg，0.503mmol)溶于25mL的N，N-二甲基甲酰胺中，45℃下搅拌加热12小时。

(1.3)将滤液经硅胶层析柱分离纯化得到产品化合物NOTA-FAPI，产率52％。

二、制备NOTA^Gd-FAPI

(2.1)按照NOTA-FAPI与顺磁性钆离子摩尔比为1:4量取硝酸钆水溶液，滴加到DOTA-FAPI水溶液，继续搅拌反应，进行钆离子螯合，得到反应液；

(2.2)用醋酸-醋酸钠缓冲溶液来调节反应液的pH值为6.5；

(2.3)经硅胶层析柱分离纯化得到NOTA^Gd-FAPI。

图2为本实施例中制备而成的成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂NOTA^Gd-FAPI溶液在3.0T磁场下不同浓度的T₁加权磁共振成像图，由图2可以看出，本实施例中制备的磁共振造影剂NOTA^Gd-FAPI溶液随着浓度升高，其信号越来越亮，证明T1加权信号越来越强。

实施例3：成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂DTPA^Gd-FAPI(DTPA^Gd-FAPI探针)

一、制备DTPA-FAPI

(1.1)将DTPA(100mg，0.168mmol)，FAPI(106mg，0.278mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(48mg，0.251mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(29mg，0.251mmol)和N，N-二异丙基乙胺(65mg，0.503mmol)溶于25mL的N，N-二甲基甲酰胺中，45℃下搅拌加热12小时。

(1.3)将滤液经硅胶层析柱分离纯化得到产品化合物DTPA-FAPI，产率52％。

二、制备DTPA^Gd-FAPI

(2.1)按照DTPA-FAPI与顺磁性钆离子摩尔比为1:4量取硝酸钆水溶液，滴加到DOTA-FAPI水溶液，继续搅拌反应，进行钆离子螯合，得到反应液；

(2.2)用醋酸-醋酸钠缓冲溶液来调节反应液的pH值为6.5；

(2.3)经硅胶层析柱分离纯化得到DTPA^Gd-FAPI。

实施例4：实施例1制备的DOTA^Gd-FAPI探针在乳腺癌中的应用

(1)乳腺癌模型建立：将培养好的将4T1细胞消化下来计数，每只小鼠注射100微升，约1×10⁶个细胞，一周左右乳腺癌4T1荷瘤小鼠模型建立成功。

(2)注射探针之前，先将小鼠置于3.0T磁共振仪器中采集肿瘤信号，随后尾静脉注射实施例1制备的DOTA^Gd-FAPI探针，每隔一小时采集一次磁共振信号，观察肿瘤部位的信号强度。

(3)如图3显示，在注射实施例1制备的DOTA^Gd-FAPI探针化合物后5h后，肿瘤部位磁共振信号显著增强，说明DOTA^Gd-FAPI探针能有效靶向FAP高表达的肿瘤部位。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种磁共振造影剂，其特征在于，所述磁共振造影剂包括成纤维细胞活化蛋白靶向分子、磁共振成像离子和磁共振成像离子螯合分子。

2.根据权利要求1所述的磁共振造影剂，其特征在于，所述成纤维细胞活化蛋白靶向分子与磁共振成像离子螯合分子通过氨基与羧基反应形成的酰胺键偶联，所述磁共振成像离子与磁共振成像离子螯合分子通过配位反应结合；和/或，所述磁共振造影剂为肿瘤成纤维细胞活化蛋白靶向磁共振造影剂。

3.根据权利要求1所述的磁共振造影剂，其特征在于，选自以下特征(1)～(3)中的一个或多个：

(1)所述成纤维细胞活化蛋白靶向分子为FAPI，其结构如下所示：

(2)所述磁共振成像离子为顺磁性金属离子，选自Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni³⁺中的一种或多种；

(3)所述磁共振成像离子螯合分子为顺磁性金属离子螯合分子，选自DOTA、NOTA、DTPA、BOPTA、HPDO3A中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的磁共振造影剂，其特征在于，所述顺磁性金属离子螯合分子选自以下结构中的一种或几种：

5.根据权利要求1所述的磁共振造影剂，其特征在于，所述顺磁性金属离子由顺磁性金属盐提供，所述顺磁性金属盐包括氯化钆、硝酸钆、醋酸钆、氯化锰、硝酸锰、醋酸锰、氯化铁以及硝酸铁中的一种或多种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的磁共振造影剂在制备与FAP相关的疾病或病症的磁共振造影产品或在制备预防和/或治疗与FAP相关的疾病或病症的药剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述与FAP相关的疾病或病症选自癌症、炎症或纤维化疾病、组织重塑和瘢痕病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症选自乳腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、头颈癌、卵巢癌、肝细胞癌、食道癌、下咽癌、鼻咽癌、喉癌、骨髓瘤细胞癌、膀胱癌、胆管细胞癌、透明细胞肾癌、前列腺癌、神经内分泌肿瘤、致癌性骨软化症、肉瘤、原发性未知癌、胸腺癌、胶质瘤、神经胶质瘤、星型细胞瘤、子宫颈癌、前列腺癌、白血病、骨癌、脑癌、支气管癌、室管膜瘤癌、成视网膜瘤癌、胃癌、胃肠道癌、心脏癌、黑素瘤癌、肾癌、淋巴瘤癌、间皮瘤癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、甲状腺癌、垂体癌、肾癌、唾液腺癌、肉瘤癌和皮肤癌中的一种或几种；

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-5任一项所述的磁共振造影剂，治疗药物，以及药学上可接受的载体、介质中的一种或几种。

10.一种如权利要求1-5任一项所述的磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下制备步骤：

2)将步骤1)制备的偶联物溶于水，加入磁共振成像离子，调整反应体系pH为弱酸性，使磁共振成像离子与磁共振成像离子螯合分子进行配位反应，即得到所述磁共振造影剂。

11.根据权利要求10所述的磁共振造影剂的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述配位反应的温度为30-45℃；和/或，所述弱酸性的pH值为5-6.5；和/或，在进行配位反应后，还包括进行分离、纯化和干燥的步骤，制备纯化的磁共振造影剂，其中，所述分离为柱层析分离，所述干燥为冷冻干燥。