CN114096261A - T细胞制备组合物和方法 - Google Patents

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克里斯蒂娜·墨菲·库克辛
约斯特·赫伊伯特·凡丹伯格
雷纳特·德贝尔
努尔·巴克
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Abstract

通过受控的离体诱导或扩充产生抗原特异性T细胞可以提供高度特异性和有益的T细胞疗法。本公开提供了T细胞制备方法和治疗性T细胞组合物，其可用于治疗患有癌症和其他病况、疾病和病症的受试者，个体抗原特异性T细胞疗法。

Description

T细胞制备组合物和方法
交叉引用
本申请要求2019年5月8日提交的第62/845,251号美国临时申请的权益，该美国临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
肿瘤疫苗通常由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如佐剂、细胞因子或TLR配体)组成，它们共同作用以诱导识别并裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。这类疫苗含有共有的组织限制性肿瘤抗原或完整肿瘤细胞制品形式的共有抗原和患者特异性抗原的混合物。共有的组织限制性肿瘤抗原是在许多个体的肿瘤中具有选择性表达的理想的免疫原性蛋白质，并且通常作为合成肽或重组蛋白递送给患者。相比之下，完整肿瘤细胞制品作为自体辐照的细胞、细胞裂解物、细胞融合物、热休克蛋白制品或总mRNA递送给患者。由于完整肿瘤细胞是从自体患者中分离的，因此该细胞可以包括患者特异性肿瘤抗原以及共有的肿瘤抗原。最后，还有第三类肿瘤抗原——很少在疫苗中使用的新抗原，其由具有导致氨基酸序列改变的肿瘤特异性突变(可以是患者特异性的或共有的)的蛋白质组成。这类突变蛋白质是：(a)作为突变对肿瘤细胞是独特的，并且其相应的蛋白质仅存在于肿瘤中；(b)避免中枢耐受，因此更有可能具有免疫原性；(c)提供出色靶标以供免疫识别，包括被体液免疫和细胞免疫识别。
过继免疫疗法或过继细胞疗法(ACT)是将淋巴细胞转移至受试者以进行疾病的治疗。过继免疫疗法尚未实现其治疗众多疾病的潜力，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷。然而，大多数(如果不是全部)过继免疫疗法都需要T细胞活化和扩充步骤来产生临床有效的治疗剂量的T细胞。由于活细胞培养的固有复杂性以及患者之间的差异，目前用于产生治疗剂量的T细胞(包括工程化T细胞)的技术仍然受到繁琐的T细胞制备工艺的限制。现有的T细胞制备工艺不容易放大、不可重复、不可靠或者低效，并且常常产生劣质的T细胞产品，其可能易于耗竭并丧失效应免疫细胞功能。迄今为止，工程化T细胞过继免疫疗法仅获得了有限的成功，并且常规地表现出可变的临床活性。因此，这类疗法不适合广泛的临床使用。因此，仍然需要开发用于扩充和诱导具有有利表型和功能的抗原特异性T细胞的组合物和方法。
发明内容
本公开提供了用于临床开发和应用的新的、改进的T细胞治疗剂。尽管自体T细胞治疗剂使用起来是安全的，但为了满足治疗标准，还需要进行一些大幅度的改进，而且该领域的发展既迅速又充满困难。申请人先前公开的申请提供了用于癌症T细胞疗法的组合物和方法的标志性进展(WO2019/094642)。本申请源于一个令人惊讶的发现，即在离体免疫细胞制备的不同阶段消耗某些表达特定标志物的细胞提供了高度免疫原性的细胞组合物。本公开还部分源自用于抗原刺激的新的改进方法的发现，从而导致用于治疗剂开发的改进的细胞组合物。本文提供了新的方法和组合物，其中，至少部分地，来自离体刺激和细胞扩充环境的某些免疫细胞的选择性消耗提供了新的治疗性组合物和改进的方法。
本文提供了一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括：从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；以及在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；扩充所述包含经刺激的T细胞的细胞群体，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白；以及将所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体施用于所述人类受试者，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体包含1x108至1x1011个总细胞。
本文提供了一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括：从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；以及在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；扩充所述包含经刺激的T细胞的细胞群体，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白；以及将所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体施用于所述人类受试者，其中所述人类受试者：患有不可切除的黑素瘤，先前曾接受过PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂和包含CTLA-4抑制剂的方案并且有疾病进展，或者曾接受过或目前正在接受PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂至少3个月，并且病情稳定或疾病有无症状进展。
本文提供了一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括：从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；以及在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和编码包含至少两个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列的多肽的mRNA；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；以及扩充所述包含经刺激的T细胞的细胞群体，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白。
本文提供了一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括：从以下样品中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞：(i)直接从来自人类受试者的经洗涤和/或冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)样品，(ii)从来自人类受试者的PBMC样品，其含有的未成熟树突细胞(DC)的百分比与该人类受试者外周血中未成熟DC的百分比大致相同，(iii)来自人类受试者的PBMC样品，其含有的成熟DC的百分比与该人类受试者外周血中成熟DC的百分比大致相同，(iv)来自人类受试者的PBMC样品，其中未成熟DC与成熟DC之比与该人类受试者外周血中未成熟DC与成熟DC之比大致相同，(v)来自人类受试者的PBMC样品，该样品尚未经历未成熟DC成熟为成熟DC的步骤，(vi)来自人类受试者的PBMC样品，其中APC占总细胞群体的百分比与该人类受试者外周血中APC占总细胞群体的百分比大致相同，(vii)来自人类受试者的PBMC样品，其中DC占总细胞群体的百分比与该人类受试者外周血中DC占总细胞群体的百分比大致相同，(viii)来自人类受试者的PBMC样品，其中CD303+细胞占总细胞群体的百分比与该人类受试者外周血中CD303+占总细胞群体的百分比大致相同，(ix)来自人类受试者的PBMC样品，其中CD141+细胞占总细胞群体的百分比与该人类受试者外周血中CD141+占总细胞群体的百分比大致相同，(x)来自人类受试者的PBMC样品，其中巨噬细胞占总细胞群体的百分比与该人类受试者外周血中巨噬细胞占总细胞群体的百分比大致相同，或(xi)来自人类受试者的PBMC样品，其中CD19+占总细胞群体的百分比与该人类受试者外周血中CD19+占总细胞群体的百分比大致相同；从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的PBMC群体；以及(b)在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；以及扩充所述包含经刺激的T细胞的细胞群体，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述人类受试者施用所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体。
在一些实施方案中，孵育包括在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：(i)FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(ii)编码包含至少两个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列的多肽的mRNA。
在一些实施方案中，引入包括电穿孔或核转染(nucleofecting)。在一些实施方案中，在不将来自步骤(a)的APC和T细胞第一群体的T细胞与APC分离的情况下进行所述电穿孔或核转染。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述人类受试者施用所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体。在一些实施方案中，孵育包括在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：(i)FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(ii)编码包含至少两个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列的多肽的mRNA。
在一些实施方案中，所述mRNA包含5’帽。在一些实施方案中，所述5’帽是CAP-1。在一些实施方案中，所述mRNA包含3’聚A尾。在一些实施方案中，所述聚A尾的长度为120至135个核苷酸。在一些实施方案中，所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的第一肿瘤抗原表位序列通过接头序列连接至所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的第二肿瘤抗原表位序列。在一些实施方案中，所述5’帽通过接头序列可操作地连接至编码所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的序列。在一些实施方案中，所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列被表达为单条多肽链。在一些实施方案中，孵育包括在LPS和IFNγ的存在下孵育包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的长度各自为8至12个氨基酸。在一些实施方案中，所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的长度各自为15至25个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体包含1x108至1x1011个总细胞。在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体包含1x108至1x1011个CD3+细胞。
在一些实施方案中，所述人类受试者患有不可切除的黑素瘤。与可切除的黑素瘤不同，无法从不可切除的黑素瘤中获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；因此，TIL无法用于治疗不可切除的黑素瘤。本文提供的方法和组合物的一个优点是它们可用于治疗不可切除的黑素瘤。
在一些实施方案中，人类受试者先前曾接受过PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂和包含CTLA-4抑制剂的方案并且有疾病进展。
在一些实施方案中，人类受试者曾接受过或目前正在接受PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂至少3个月，并且病情稳定或疾病有无症状进展。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD3+细胞的百分比为总细胞群体的至少40％或50％或60％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少10％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少5％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中IFNγ+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少15％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+和IFNγ+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少2％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+和CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少0.5％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中IFNγ+和CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少5％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+和IFNγ+和CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少0.1％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为幼稚T细胞(CD62L+和CD45RA+)的CD4+ T细胞的百分比至多为15％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应记忆T细胞(CD62L-和CD45RA-)的CD4+ T细胞的百分比至少为60％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应T细胞(CD62L-和CD45RA+)的CD4+ T细胞的百分比至多为5％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为中央记忆T细胞(CD62L+和CD45RA-)的CD4+ T细胞的百分比至少为10％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为幼稚T细胞(CD62L+CD45RA+)的CD8+ T细胞的百分比至多为25％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应记忆T细胞(CD62L-CD45RA-)的CD8+ T细胞的百分比至少为60％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应T细胞(CD62L-CD45RA+)的CD8+ T细胞的百分比至多为10％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为中央记忆T细胞(CD62L+CD45RA-)的CD8+ T细胞的百分比至少为15％。
在一些实施方案中，所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体产生细胞因子，并在识别靶细胞后引起脱粒。
在一些实施方案中，所述人类受试者对于抗检查点抑制剂疗法是难治性的。
在一些实施方案中，所述人类受试者的年龄为18至75岁。
在一些实施方案中，所述人类受试者在BRAF基因中具有突变，并且先前曾接受过B-raf抑制剂或B-raf/MEK联合疗法。
在一些实施方案中，消耗包括从来自人类受试者的外周血单核细胞(PBMC)样品中消耗CD14+细胞和CD25+细胞，该样品尚未经历单核细胞成熟为成熟树突细胞(DC)的步骤。
在一些实施方案中，消耗进一步包括从来自人类受试者的外周血单核细胞(PBMC)样品中消耗CD11b+细胞，该样品尚未经历单核细胞成熟为成熟树突细胞(DC)的步骤。
在一些实施方案中，步骤(b)和(c)在少于28天内进行。
在一些实施方案中，在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD8+肿瘤抗原特异性T细胞占CD8+ T细胞总数的比例至少是所述生物样品中CD8+肿瘤抗原特异性T细胞占CD8+ T细胞总数的比例的两倍。
在一些实施方案中，在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD4+肿瘤抗原特异性T细胞占CD4+ T细胞总数的比例至少是所述生物样品中CD4+肿瘤抗原特异性T细胞占CD4+ T细胞总数的比例的两倍。
在一些实施方案中，在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中至少0.1％的CD8+ T细胞是来源于幼稚CD8+ T细胞的CD8+肿瘤抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中至少0.1％的CD4+ T细胞是来源于幼稚CD4+ T细胞的CD4+肿瘤抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，扩充包括(A)使包含经刺激的T细胞的细胞群体与第二成熟APC群体接触，其中所述第二成熟APC群体(i)已经与FLT3L一起孵育，并且(ii)呈递至少一个肿瘤抗原表位序列；以及(B)将所述包含经刺激的T细胞的细胞群体扩充第二时间段，从而形成经扩充的T细胞群体。
在一些实施方案中，在使包含经刺激的T细胞的细胞群体与第二成熟APC群体接触之前，所述第二成熟APC群体已与FLT3L孵育至少1天。
在一些实施方案中，所述生物样品是外周血样品、白细胞分离(leukapheresis)样品或血液成分分离(apheresis)样品。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括收获所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，冷冻保存所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，或制备含有所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体的药物组合物。
在一些实施方案中，孵育包括在FLT3L和编码所述多肽的RNA的存在下孵育包含APC和T细胞第一群体的CD14/CD25耗尽的免疫细胞群体第一时间段。
在一些实施方案中，所述患有癌症的人类受试者是从中获得所述生物样品的人类受试者。
在一些实施方案中，所述多肽的长度为8至50个氨基酸。
在一些实施方案中，所述多肽包含至少两个肿瘤抗原表位序列，每个序列由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达。
在一些实施方案中，从包含APC和T细胞第一群体的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞包括使包含APC和T细胞第一群体的免疫细胞群体与CD14结合剂和/或CD25结合剂接触。
在一些实施方案中，消耗进一步包括从包含APC和T细胞第一群体的免疫细胞群体中消耗CD19+细胞。
本文提供了一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的离体方法，该方法包括：从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD11b+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD11b耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；以及在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD11b耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；以及扩充所述包含经刺激的T细胞的细胞群体，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白。
本文提供了一种药物组合物，其包含通过本文所述的方法产生的包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体；以及药学上可接受的载体。
本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)来自生物样品的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)刺激的T细胞，所述T细胞包含对多肽的表位具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中(i)所述免疫细胞群体中表达CD11b的免疫细胞的量成比例地低于所述生物样品中表达CD11b的免疫细胞的量，和/或(ii)所述免疫细胞群体中表达CD11c的免疫细胞的量成比例地高于所述生物样品中表达CD11c的免疫细胞的量；以及(b)药学上可接受的赋形剂。
本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)来自生物样品的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)刺激的T细胞，所述T细胞包含对多肽的表位具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中所述APC刺激的T细胞已与细胞因子一起孵育；(b)所述细胞因子；以及(c)药学上可接受的赋形剂。
本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)来自已施用fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受试者的生物样品的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)刺激的T细胞，所述T细胞包含对多肽的表位具有特异性的T细胞受体(TCR)；以及(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体来自受试者的生物样品。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体来自已施用fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受试者的生物样品。
在一些实施方案中，所述APC刺激的T细胞已经与细胞因子一起孵育，并且其中所述药物组合物进一步包含细胞因子。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体中表达CD11b的免疫细胞的量成比例地低于所述生物样品中表达CD11b的免疫细胞的量。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体中表达CD11c的免疫细胞的量成比例地高于所述生物样品中表达CD11c的免疫细胞的量。
在一些实施方案中，所述群体中表达CD14的免疫细胞的量成比例地低于所述生物样品中表达CD14的免疫细胞的量。
在一些实施方案中，所述群体中表达CD25的免疫细胞的量成比例地低于所述生物样品中表达CD25的免疫细胞的量。
在一些实施方案中，所述群体中表达CD19的免疫细胞的量成比例地低于所述生物样品中表达CD19的免疫细胞的量。
在一些实施方案中，所述APC是FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC。
在一些实施方案中，所述APC刺激的T细胞是用FLT3L刺激的APC刺激的T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-7或IL-15或IL-21。
在一些实施方案中，所述APC刺激的T细胞包括由在MHC I类或MHC II类分子上呈递表位的负载抗原的APC刺激的T细胞。
在一些实施方案中，所述负载抗原的APC包括类浆细胞树突细胞(pDC)、CD11c+DC、CD1c+DC或CD141+DC。
在一些实施方案中，所述CD11b细胞包括CD16+单个核细胞。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含促进细胞离体生长和维持的试剂，包括生长因子、细胞因子、氨基酸、补充剂或其组合。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体中表达CD1c的免疫细胞的量成比例地高于所述生物样品中表达CD1c的免疫细胞的量。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群体中表达CD141的免疫细胞或APC的量成比例地高于所述生物样品中表达CD141的免疫细胞或APC的量。
在一些实施方案中，所述包含负载抗原的APC的细胞群体包含多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于60％或多于70％的CD11c+细胞。
在一些实施方案中，所述APC刺激的T细胞包括由含有少于20％、少于15％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％或少于5％的CD11b+细胞的细胞群体刺激的T细胞。
在一些实施方案中，所述APC刺激的T细胞包括由含有多于90％的CD11c+细胞的细胞群体刺激的T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含由细胞群体刺激的T细胞，该细胞群体含有多于70％的新抗原肽表达细胞，即CD11c+、CDlc+或CD141+细胞。
在一些实施方案中，所述药物组合物在该药物组合物中包含至少60％的对表位具有特异性的T细胞。
在一些实施方案中，与通过将分离的T细胞与负载抗原的APC接触而不减少或消耗CD11b+和/或CD19+细胞而获得的细胞组合物相比，本文所述的药物组合物包含更高比例的诱导或转化为新抗原引发的T细胞的幼稚T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含多于35％的幼稚T细胞，所述幼稚T细胞被诱导或转化为对表位具有特异性的抗原特异性活化T细胞。
在一些实施方案中，与通过将分离的T细胞与负载抗原的APC接触而不减少或消耗CD11b+细胞和/或CD19+细胞而获得的细胞组合物相比，本文所述的药物组合物包含更高比例的癌症新抗原特异性CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含至少30％的CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，与通过将分离的T细胞与负载抗原的APC接触而不减少或消耗CD11b+细胞和/或CD19+细胞而获得的细胞组合物相比，本文所述的药物组合物包含更高比例的记忆T细胞。
本文提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。
本文提供了一种制备包含对多肽的表位具有特异性的T细胞受体(TCR)的T细胞的方法，该方法包括(a)从包含抗原呈递细胞和T细胞的免疫细胞群体中消耗表达CD11b的细胞，从而形成包含T细胞的CD11b耗尽的免疫细胞群体；以及(b)孵育或扩充所述包含T细胞的CD11b耗尽的免疫细胞群体；其中包含对所述表位具有特异性的TCR的记忆T细胞被扩充，或者包含对所述表位具有特异性的TCR的幼稚T细胞被诱导。
本文提供了一种制备包含对表位具有特异性的T细胞受体(TCR)的T细胞的方法，该方法包括(a)针对表达CD11c的细胞富集包含APC和T细胞的免疫细胞群体，从而形成包含T细胞的CD11c富集的免疫细胞群体；以及(b)孵育或扩充所述包含T细胞的CD11c富集的免疫细胞群体；其中包含对所述表位具有特异性的TCR的记忆T细胞被扩充，或者包含对所述表位具有特异性的TCR的幼稚T细胞被诱导。在一些实施方案中，所述APC制备方法包括FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括制备APC制品。
在一些实施方案中，所述制备APC制品的方法包括将APC与FLT3L一起孵育。
在一些实施方案中，所述制备APC制品的方法包括将APC与所述多肽或编码该多肽的多核苷酸一起孵育。
本文提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用来自生物样品的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)刺激的T细胞，所述T细胞包含对抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，并且其中所述受试者已经施用fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)。
本文提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括：(a)向所述受试者施用FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)；以及(b)向所述受试者施用来自生物样品的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)刺激的T细胞，所述T细胞包含对抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)。
本文提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括：(a)向所述受试者施用来自生物样品的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体包含抗原呈递细胞(APC)刺激的T细胞，所述T细胞包含对抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)；以及(b)向所述受试者施用包含所述抗原肽序列的多肽或编码所述抗原肽序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用所述免疫细胞群体之前向所述受试者施用FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)。
附图说明
图1A描绘了抗原特异性T细胞制备方案的示例示意图。
图1B描绘了抗原特异性T细胞制备方案的示例示意图。
图1C描绘了抗原特异性T细胞制备方案的示例替代示意图。
图2描绘了示例结果，其显示由长肽或短肽诱导的抗原特异性CD8+记忆T细胞的分数。“Bulk”表示含有用于诱导的T细胞的样品是完全的外周血单核细胞(PBMC)。“Treg”表示含有用于诱导的T细胞的样品是耗尽了表达CD25的细胞的PBMC。
图3描绘了示例流式细胞术分析，其显示了用GAS 7肽诱导的抗原特异性CD8+幼稚T细胞的分数。
图4描绘了示例结果，其显示了抗原特异性CD8+T细胞对HIV短肽、先前鉴定的短新抗原(PIN)或长PIN的肽池的应答。“完全PBMC”表示包含用于诱导的T细胞的样品是完全的PBMC。“CD25 PBMC”表示含有用于诱导的T细胞的样品耗尽了CD25+细胞。短、短肽或短聚体(shortmer)；长、长肽或长聚体(longmer)。
图5A描绘了在所示条件下，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对单个先前鉴定的新抗原(PIN)的应答的示例流式细胞术分析。
图5B描绘了在所示条件下，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对单个先前鉴定的新抗原(PIN)的应答的示例流式细胞术分析。
图6描绘了示例结果，其显示了使用来自两个人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+T细胞对所示肽的应答。
图7描绘了在健康供体中，在刺激之前和最多三轮刺激之后，抗原特异性CD8+T细胞对所示突变表位的应答的示例流式细胞术图。
图8A描绘了示例性条形图，其显示了抗原特异性记忆CD8+T细胞对病毒抗原的应答的结果。在最多三轮刺激之后，所有CD8+T细胞中约50％对所示病毒表位(CMV pp65、EBVYVL、EBV BMLF1和Mart-1)是特异性的。
图8B描绘了回忆测定的示例结果，该回忆测定涉及抗原特异性记忆CD8+T细胞对负载肽的抗原呈递细胞的应答，然后与负载有和不负载病毒抗原的APC一起孵育。图中描绘了释放所示细胞因子的两个时间点的CD8+T细胞分数。
图9描绘了用于评估诱导的T细胞培养物是否可以杀死表达抗原的肿瘤系的细胞毒性测定的示例结果。显示了活的和死亡的胱天蛋白酶3阳性肿瘤细胞相对于总肿瘤细胞的分数。胱天蛋白酶3阳性活肿瘤细胞表明细胞正在经历早期细胞死亡。
图10描绘了示例流式细胞术分析，其涉及抗原特异性CD4+T细胞对负载肽的抗原呈递细胞的应答，然后与负载有和不负载PIN的APC一起孵育。显示了释放IFNγ的CD4+T细胞的百分比。
图11描绘了用突变型肽或野生型肽重新刺激后释放IFNγ的抗原特异性CD4+T细胞的百分比的示例结果。
图12描绘了示例流式细胞术分析，其显示了抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短HTV5肽的应答。显示了短期和长期诱导。
图13描绘了示例性流式细胞术分析，其显示了使用来自人类供体的完全PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短ME1肽的应答的分数。
图14描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用来自人类供体的完全PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短HTV3肽的应答。
图15描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用来自人类供体的完全PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对长CSNK1A1肽的应答。
图16描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对长CSNK1A1肽的应答。
图17描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短GAS7肽的应答。
图18描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短ACTN4肽的应答。
图19A描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短ACTN4肽的应答。显示了短期诱导。
图19B描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短HIV3肽的应答。显示了长期诱导。
图20描绘了使用来自人类供体的完全PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短HIV5肽的应答的示例流式细胞术分析。显示了短期和长期诱导。
图21描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用来自人类供体的完全PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短HIV3肽的应答。显示了短期诱导。
图22描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短PRDX5肽的应答。显示了极短期和长期诱导。
图23描绘了示例流式细胞术分析，其显示了使用耗尽CD25+细胞的来自人类供体的PBMC样品，抗原特异性CD8+幼稚T细胞对短HIV5肽的应答。显示了短期和长期诱导。
图24描绘了用于产生治疗性T细胞组合物的方法的实例的示意图，该方法包括记忆性T细胞的扩充和幼稚T细胞的诱导。
图25描绘了测试T细胞的功能性、表型和/或功能和/或T细胞应答的示例性方法。
图26描绘了用来测试T细胞的功能性、表型和/或功能和/或T细胞应答的回忆测定的实例。
图27A描绘了示例流式细胞术分析，其显示了在回忆测定中单独地或作为混合物获取的经标记的样品对多路化样品去卷积的能力。独特标记的样品得到解析，而与其他条形码不发生或发生最小的交叉污染。
图27B描绘了示例流式细胞术分析，其显示了在回忆测定中通过对九种独特标记的样品的混合物进行多聚体染色来检测抗原特异性CD8+T细胞。
图28A描绘了使用六种独特条形码标记的样品进行的回忆测定的示例流式细胞术分析，其中用未负载的DC和负载新抗原的DC进行回忆。
图28B描绘了在回忆应答测定中，与负载所示浓度的肽的DC一起孵育的具有功能数的CD4+T细胞的百分比的示例条形图。在不进行条形码标记的情况下单独分析或与无关样品混合地分析含有从头CD4+T细胞应答的两种诱导培养物的样品。条形码标记没有改变可检测的功能性。从细胞中引发的功能数和应答量级在样品条形码标记的情况下并没有显著改变。
图29A描绘了示例性条形图，其显示了抗原特异性记忆CD8+T细胞对病毒抗原的应答的结果。对CMV pp65、MART-1和EBV BRLF1和BMLF1表位的CD8+记忆应答可以从起始健康供体材料中的CD8+T细胞的0.23％升高至>60％。
图29B描绘了回忆测定的示例结果，该回忆测定涉及抗原特异性记忆CD8+T细胞对病毒抗原的应答，然后用负载有和未负载病毒抗原的DC进行回忆。图中描绘了释放所示细胞因子的两个时间点的CD8+T细胞分数。
图30A描绘了通过在相同培养物中对具有多种特异性的从头诱导的CD4+响应进行检测和功能表征来进行命中鉴定的示例结果。在所示的示例中，在针对10个HIV衍生表位的四个复制培养物中进行了诱导，这些表位是HIV阴性健康供体的初次靶标。在4/4个生物学重复中检测到抗原特异性应答，应答的量级有所不同。
图30B描绘了通过在相同培养物中对具有多种特异性的从头诱导的CD4+应答进行检测和功能表征来进行池去卷积的示例结果。在每个测试的重复中均检测到多个应答，在每种情况下，相同的两个表位(HIV#5和HIV#7)产生了最高量级的应答。
图30C描绘了通过在相同培养物中对具有多种特异性的从头诱导的CD4+响应进行检测和功能表征来确定灵敏度的示例性结果。在池去卷积分析中，对于每个应答观察到相似的量级。对HIV#5、HIV#6和HIV#4的应答显示EC50分别为0.45μM、0.43μM和9.1μM。
图31描绘了抗原特异性T细胞制备方案的示例示意图。
图32描绘了T细胞诱导方案的示例示意图。
图33描绘了树突细胞产生方案的示例示意图。
图34描绘了示例性pMHC多聚体图，其显示了来自针对患者特异性表位SRSF1E>K、ARAP1Y>H和PKDREJG>R的黑素瘤患者和针对患者特异性表位(AASDH neoORF和七种模型新抗原：ACTN4K>N、CSNK1A1S>L、DHX40neoORF、GLI3P>L QARSR>W、FAM178BP>L和RPS26P>L)的黑素瘤患者的白细胞分离材料中诱导的CD8+ T细胞应答。第一行和第二行中的第一幅图指示记忆应答，其余的图指示从头应答。
图35描绘了SRSF1E>K和ARAP1Y>H在肽刺激之前和之后的pMHC多聚体图的示例数据(左图)，饼图描绘了用负载有新抗原的DC再次攻击后新抗原特异性T细胞的功能性；对pMHC多聚体+CD8+或CD4+T细胞进行门控。在黑色素瘤患者中诱导的CD8+记忆、CD8+从头和CD4+从头应答的多功能谱由1、2或3种功能的组合示出(例如，一种或多种功能是选自IFNγ、TNFα、CD107a和4-1BB的一种或多种因子的产生)。
图36描绘了在黑素瘤患者中针对突变型和野生型肽诱导的记忆和从头应答的特异性。SRSF1E>K和ARAP1Y>H特异性T细胞应答用负载有不同浓度(X轴：0μM，0.05μM，0.2μM，0.8μM和3.2μM)的突变型或野生型新抗原肽的DC进行攻击，并测量样品中总CD8+ T细胞的IFN-γ+和/或TNFα+和/或CD107a+(Y轴)；两种应答均显示出与0μM浓度的显著差异，而对野生型新抗原肽无反应性。统计分析：FDR调整p值，P值：*≤0.05，***≤0.001，****≤0.0001。
图37A描绘了根据CD8+CD107a+T细胞的频率量化的，在黑素瘤患者中诱导的记忆应答的细胞毒性谱。它还描绘了这些T细胞应答的靶细胞杀伤，如根据aCAS3+肿瘤细胞的频率所量化的。通过用突变型或野生型新抗原转导的肿瘤细胞重新攻击来评估诱导的CD8+ T细胞应答的细胞毒性能力。使用未转导的肿瘤细胞(亲代A375系)或用200aa构建体转导的肿瘤细胞。该构建体包含突变型或野生型序列，在中心的突变。共培养后测量了CD8+ T细胞上CD107a的上调和肿瘤细胞上活性胱天蛋白酶3的上调。目标比例：3.3:1(SRSF1E>K)。
图37B描绘了根据CD8+CD107a+T细胞的频率量化的，在黑素瘤患者中诱导的记忆应答的细胞毒性谱的另一个实例。它还描绘了这些T细胞应答的靶细胞杀伤，如根据aCAS3+肿瘤细胞的频率所量化的。通过用突变型或野生型新抗原转导的肿瘤细胞重新攻击来评估诱导的CD8+ T细胞应答的细胞毒性能力。使用未转导的肿瘤细胞(亲代A375系)或用200aa构建体转导的肿瘤细胞。该构建体包含突变型或野生型序列，在中心的突变。共培养后测量了CD8+ T细胞上CD107a的上调和肿瘤细胞上活性胱天蛋白酶3的上调。红色圆圈突出显示pMHC+部分。效:靶比：5:1(SRSF1E>K)。统计分析：未配对T检验，**≤0.01，****≤0.0001。
图37C描绘了根据CD8+CD107a+T细胞的频率量化的，在黑素瘤患者中诱导的从头应答的细胞毒性谱。它还描绘了这些T细胞应答的靶细胞杀伤，如根据aCAS3+肿瘤细胞的频率所量化的。通过用突变型或野生型新抗原转导的肿瘤细胞重新攻击来评估诱导的CD8+ T细胞应答的细胞毒性能力。使用未转导的肿瘤细胞(亲代A375系)或用200aa构建体转导的肿瘤细胞。该构建体包含突变型或野生型序列，在中心的突变。共培养后测量了CD8+ T细胞上CD107a的上调和肿瘤细胞上活性胱天蛋白酶3的上调。圆圈突出显示pMHC+部分。效:靶比：0.66:1(ARAP1Y>H)。统计分析：未配对T检验，**≤0.01，****≤0.0001。
图38A描绘了黑素瘤患者中新抗原特异性CD4+ T细胞应答的鉴定。基于当用突变型新抗原肽负载的DC(0.8μM)再次攻击时IFN-γ和TNFα的产生(Y轴)来鉴定应答。MKRN1S>L、CREBBPS>L和TPCN1K>E被鉴定为阳性应答。
图38B描绘了针对所示突变型和野生型肽的在图38A中描绘的CD4+ T细胞应答的特异性。在验证性研究中，图38A中所示的CD4 T细胞应答用不同浓度(X轴-0μM，0.05μM，0.2μM，0.8μM和3.2μM)的突变型和野生型新抗原肽进行攻击，并测量样品中总CD4+的IFNγ+和/或TNFα+(Y轴)。CD4+ T细胞应答中的两个(MKRN1S>L和CREEBPS>L)显示出对10μM浓度的显著差异，并且对野生型新抗原肽无反应性，但是TPCN1K>E应答对突变型和野生型新抗原肽均具有反应性。统计分析：FDR调整p值，P值<0.05；
图38C描绘了这些CD4+ T细胞应答的多功能性谱，如1、2、3或4个功能的组合所示(例如，一个或多个功能是一种或多种选自IFNγ、TNFα、CD107a和4-1BB的因子的产生)。通过用突变型新抗原肽负载的DC(0.8μm)再次攻击来评估鉴定的CD4+ T细胞应答的多功能性。饼图中的百分比表示功能性CD4+ T细胞(1、2和/或3个功能)的百分比。所描绘的代表性数据是由患者体内诱导的刺激后CD4+ T细胞应答产生的。
图39描绘了在添加或不添加Epacadostat的情况下，在两个健康供体中诱导的记忆应答的功能性，如1、2或3个功能的组合所示(例如，一个或多个功能是一种或多种选自IFNγ、TNFα和CD107α的因子的产生)。
图40描绘了在添加或不添加Epacadostat的情况下，在六次重复诱导中诱导的从头CD8+T细胞应答百分比(“命中率”，在四个健康供体中取平均)。
图41A描绘了在添加或不添加PD-1阻断抗体的情况下，在用本文提供的T细胞制备方案诱导后，来自健康供体的抗原特异性细胞的绝对数。
图41B描绘了在添加或不添加PD-1阻断抗体的情况下，在用本文提供的T细胞制备方案诱导后，来自健康供体的抗原特异性细胞的绝对数。
图42A描绘了在添加或不添加IL-12的情况下，作为来自从头CD8+ T细胞区室的CD8+T细胞的百分比的多聚体阳性频率。
图42B描绘了在添加或不添加IL-12的情况下，来自从头CD8+ T细胞区室的CD8+ T细胞的百分比的示例性图形表示。
图43描绘了在使用来源于健康供体的PBMC进行不同抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，幼稚CD8细胞对其有响应的高免疫原性和低免疫原性抗原的命中率百分比的示例性图形表示。还描绘了在使用来源于健康供体的PBMC使用Mart-1肽或高免疫原性和低免疫原性抗原进行不同抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，抗原特异性细胞绝对数的示例性图形表示。
图44A描绘了在使用来自三个不同健康供体的PBMC进行所示的抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，CD123阳性细胞的示例性流式细胞术结果。
图44B描绘了在使用来自健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，所示的CD11c+细胞亚组的绝对数的示例性图形表示。处理是：基础Flt3L，单独的FLT3L处理；CD11b，FLT3L处理和CD11b表达细胞的消耗；CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗。
图45描绘了在使用来自健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，CD8 T细胞的总数和所示的细胞比率的示例性图形表示。处理是：基础Flt3L，单独的FLT3L处理；CD11b，FLT3L处理和CD11b表达细胞的消耗；CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗。
图46描绘了在使用来自三个不同健康供体的PBMC进行所示的抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，CD11b阳性细胞的示例性流式细胞术结果。
图47描绘了在使用来自三个不同健康供体的PBMC进行所示的抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，CD19阳性细胞的示例性流式细胞术结果。
图48描绘了在进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，细胞扩充倍数的示例性图形表示。处理是：基础Flt3L，单独的FLT3L处理；CD11b，FLT3L处理和CD11b表达细胞的消耗；CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗。
图49A描绘了示例性数据，其表明在使用来源于健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，幼稚CD8 T细胞所响应的特定抗原的数目。结果在三个健康供体中取平均。处理是：基础Flt3L，单独的FLT3L处理；CD11b，FLT3L处理和CD11b表达细胞的消耗；CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗。数据的示例性图形表示在下图中显示。
图49B描绘了在使用来源于健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，幼稚CD8细胞所响应的高免疫原性(左)和低免疫原性(右)抗原的命中率百分比的示例性图形表示。结果在三个健康供体中取平均。处理是：基础Flt3L，单独的FLT3L处理；CD11b，FLT3L处理和CD11b表达细胞的消耗；CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗。
图50描绘了在使用来源于健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，被T细胞所响应的高免疫原性和低免疫原性抗原激活的细胞群体中抗原特异性细胞数的示例性图形表示。处理是：基础Flt3L，单独的FLT3L处理；CD11b，FLT3L处理和CD11b表达细胞的消耗；CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗。
图51A描绘了在使用来源于健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，活细胞百分比的示例性图形表示。处理是：基础，单独的FLT3L处理；基础+CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗；+APC，将额外的PBMC部分添加到基础+CD11b-/CD19-，其中额外的部分耗尽了表达CD3、CD19、CD11b、CD25和CD14的细胞。
图51B描绘了在使用来源于健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，活细胞百分比的示例性图形表示。处理是：基础，单独的FLT3L处理；基础+CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗；+APC，将额外的PBMC部分添加到基础+CD11b-/CD19-，其中额外的部分耗尽了表达CD3、CD19、CD11b、CD25和CD14的细胞。
图51C描绘了在使用来源于健康供体的PBMC进行三种抗原呈递细胞富集和抗原加载方案后，活细胞百分比的示例性图形表示。处理是：基础，单独的FLT3L处理；基础+CD11b-/CD19-，FLT3L处理及CD11b表达细胞和CD19表达细胞的消耗；+APC，将额外的PBMC部分添加到基础+CD11b-/CD19-，其中额外的部分耗尽了表达CD3、CD19、CD11b、CD25和CD14的细胞。
图51D描绘了示例性数据，其表明使用示例性抗原呈递细胞富集方案，每个供体的CD8细胞所响应的特定抗原的数目。
图51E描绘了在三个健康供体中取平均的，CD8细胞所响应的所示肽的命中率百分比的示例性图形表示。
图52A描绘了来自实验的示例性流式细胞术分析结果，在该实验中，在不同时间添加到培养过程的细胞群体用膜渗透性胺反应性染料(例如，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯或TagIT VioletTM)标记，然后再用负载抗原的APC刺激。当应用于第二次刺激时，已经培养了14天的细胞群体用一种染料标记，而含有负载抗原的APC和T细胞的新制品的另一细胞群体用另一种染料标记，然后将两个细胞群体混合在一起进行重新刺激或扩充。通过每种染料的存在和稀释率记录这些群体中的每一个对总抗原特异性T细胞池的相对贡献。在所有情况下，将细胞群体培养14天(第1次刺激)，用一种染料标记，然后将其添加到已经提前1天(标准方案)、提前4天(5天领先开始(head start))或提前6天(7天领先开始)进行抗原刺激的用另一种染料标记的另一细胞群体中。
图52B显示了三种不同T细胞扩充方案的示例性示意图，每种具有两个刺激，包括在与T细胞接触前2或5或7天抗原加载APC的领先开始。
图52C显示了使用图52B中描绘的三种不同T细胞扩充方案的抗原特异性T细胞数随时间变化的示例性图示。1，标准方案；2，5天领先开始；3，7天领先开始。
图53显示了用所示的新抗原肽(pep)或新抗原RNA处理的培养物的扩充倍数的示例性图示。CD14/CD25耗尽的PBMC细胞，在分离或去除CD3淋巴细胞后，用抗原(肽或编码抗原的mRNA)刺激。重新引入CD3淋巴细胞并刺激14天。
图54显示了用所示的新抗原肽(pep)或新抗原RNA核转染的培养物中多聚体阳性抗原特异性细胞的数目的示例性图示。在存在T细胞或不存在T细胞(-CD3)的情况下对培养物进行核转染。Irr，经辐射的。
图55描绘了示例性流式细胞术分析，其显示了在短期诱导方案中使用病毒肽或编码该肽的RNA的抗原特异性CD8+记忆应答和使用新抗原编码肽或RNA的幼稚
Figure BDA0003463384270000251
应答。
图56A描绘了用于生成包含编码新抗原的序列的RNA并使用它们加载PBMC和激活T细胞的示例性过程的示意图。
图56B描绘了用于生成包含编码新抗原的序列并使用它们加载PBMC和激活T细胞的示例性过程的示意图。
图57A描绘了编码新抗原串的示例性RNA多联体构建体的示意图。
图57B描绘了在图57A所示的构建体内新抗原串以5’-3’方向的示例性排列的示意图。
图58A描绘了示例性mRNA序列的示意图，其用于将5’-帽结构并入编码串联的新抗原串的mRNA中以供在PBMC中表达。在mRNA串中添加“A”核苷酸是用于与
Figure BDA0003463384270000252
技术兼容。
图58B描绘了在PBMC中表达编码具有不同5’-帽结构的串联的新抗原串的mRNA后24小时，活细胞百分比的示例性图形表示。
图58C描绘了在PBMC中表达编码具有不同5’-帽结构的串联的新抗原串的mRNA后24小时，GFP阳性细胞总数的示例性图形表示。
图59A描绘了说明使用修饰的核苷酸制备mRNA的示例性结果。通过替换mRNA内的全部(Full)或部分(Part)尿苷(U)和胞苷(C)残基来修饰mRNA。例如，部分C(Part C)组中30％的C残基被甲基胞苷替换。结果显示了随时间推移对mRNA编码肽在转染的PBMC中的表达的影响。
图59B描绘了示例性数据，其比较了包含取代尿苷和/或胞苷的mRNA的商业和内部制备对生成用负载有mRNA的PBMC刺激的多聚体特异性T细胞的影响。
图59C描绘了示例性数据，其比较了如图59B所述生成的经刺激的T细胞的扩充。
图60A描绘了用于在细胞中表达的使用短聚体(9-10个氨基酸，上图)和长聚体(25个氨基酸，下图)的mRNA构建体的示例性示意图。
图60B描绘了作为总CD8+细胞的百分比的多聚体特异性CD8+细胞的示例性图示。示出了用于多聚体测定的抗原。
图60C描绘了检测多聚体阳性CD8+ T细胞的示例性流式细胞术分析，其比较了短聚体(9-10个氨基酸)和长聚体(25个氨基酸)肽刺激的APC和包含编码相同短聚体(9-10个氨基酸)和长聚体(25个氨基酸)肽的APC。
图61A描绘了转染图61B-61D所示实验的细胞的示例性RNA构建体的示意图。
图61B描绘了来自多聚体测定的结果的示例性图形表示。在PBMC处理的所有三种条件下，RNA转染的PBMC在生成抗原特异性T细胞方面优于负载肽的PBMC。对于Gli3抗原，与负载肽的PBMC相比，注意到多聚体阳性细胞增加10倍以上。
图61C描绘了示例性流式细胞术数据，其显示了在CD3细胞消耗和未消耗的情况下，在每个所示组中对Gli3多聚体阳性T细胞的检测。与消耗CD14和CD25细胞的PBMC或从冷冻储备液解冻的PBMC相比，CD25+PBMC的直接转染产生更多的多聚体阳性细胞。
图61D描绘了来自多聚体测定的结果的示例性图形表示。用FTL3L细胞处理过夜的PBMC或CD25耗尽的PBMC用编码25个氨基酸长度的新抗原序列(长聚体)或表位长度的新抗原序列(短聚体)的RNA进行电穿孔。使用多聚体技术测定培养物中新抗原阳性细胞的百分比。
图61E描绘了来自图61D所述实验的扩充倍数结果的示例性图形表示。用FTL3L细胞处理过夜的PBMC或CD25耗尽的PBMC用编码25个氨基酸长度的新抗原序列(长聚体)或表位长度的新抗原序列(短聚体)的RNA进行电穿孔。描绘了培养26天和两次刺激后细胞的扩充倍数。
图62A描绘了转染图62B-62D所示实验的细胞的示例性RNA构建体的示意图。
图62B描绘了用X轴上所示的组合成熟后第26天，来自两个供体的ACTN4和Gli3响应性活T细胞的数目的示例性图形表示。
图62C描绘了来自在所示成熟混合物的存在下生长的活细胞的Gli3响应性T细胞百分比的示例性数据。
图62D描绘了示例性流式细胞术数据，其显示了在所示成熟混合物的存在下生长的Gli3多聚体阳性T细胞的检测。
图63A描绘了代表性质谱数据，其显示了使用放射性同位素掺入检测PBMC对所示Gli3表位的呈递。用编码多个表位(包括Gli3表位)的mRNA转染的PBMC和肽的表达使用以较重同位素标记的参考肽进行检测。
图63B描绘了在用编码每个表位的mRNA转染PBMC后，HLA-A02:01对所示表位的最大呈递的百分比随时间变化的示例性图形表示。通过质谱法检测每个同位素标记的表位。在转染后6小时观察到最大表面呈递。
图64A描绘了来自回忆测定的示例性图形表示，其显示了对于用浓度逐渐增加的用于加载APC的所示肽攻击的新抗原特异性-CD8 T细胞，TNFα和/或IFNγ的产生的变化百分比(左)或CD107a阳性细胞的百分比(右)。
图64B描绘了来自多聚体测定的示例性图形表示，其显示了对于用浓度逐渐增加的用于加载APC的所示肽攻击的新抗原特异性-CD8 T细胞，TNFα和/或IFNγ的产生的变化百分比(左)或CD107a阳性细胞的百分比(右)。
图65描绘了使用mRNA作为免疫原，产生最佳产品个人T细胞治疗剂所考虑的标准的示例性维恩图。
图66描绘了示例性流程图，其显示了选择肽序列来制备患者特异性T细胞产品的步骤。
图67举例说明了对于使用通过图1A所示的方法制备的T细胞的临床方法有利的多个方面。
图68描绘了示例性的代表性流式细胞术数据，其显示了通过多重工程化运行制备的患者特异性T细胞产品的表征。描绘了CD3+占活细胞的比例(上图)以及CD8+和CD4+占活CD3+ T细胞的比例(下图)。
图69A描绘了数据的示例性图形表示，其显示了通过多重工程化运行制备的患者特异性T细胞产品的表征。显示了多聚体阳性CD8阳性细胞的百分比。
图69B描绘了示例性的代表性流式细胞术数据，其显示了通过多重工程化运行制备的患者特异性T细胞产品的表征。显示了针对所示表位的多聚体A阳性和多聚体B阳性CD8细胞的百分比。
图69C描绘了示例性饼图，其显示了与未负载的DC相比，在用负载突变新抗原的DC再次攻击后鉴定的pMHC+CD8+T细胞的多功能性。
图70描绘了代表性数据，其指示通过多重工程运行制备的患者特异性T细胞产品的CD4+细胞产生IFNγ和/或TNFα的变化。还描绘了示例性代表性数据，其显示了通过多重工程化运行制备的患者特异性T细胞产品中IFNγ+和/或TNFα+和/或CD107a+CD4+细胞的表征。
图71描绘了示例性图形表示，其显示了在通过多重工程化运行制备的患者特异性T细胞产品中的中央记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)、效应T细胞(Teff)和幼稚T细胞
Figure BDA0003463384270000291
的分数。中央记忆T细胞(Tcm)：CD62L+CD45RA-，效应记忆T细胞(Tem)：CD62L-CD45RA-，效应T细胞(Teff)：CD62L-CD45RA+，幼稚T细胞
Figure BDA0003463384270000292
CD62L+CD45RA。
图72描绘了来自多聚体测定的数据的示例性图形表示，其显示了样品中用不同浓度的负载肽的DC攻击后，测量的IFN-γ+和/或TNFα+和/或CD107a+细胞占总CD8+细胞(上图)或总CD4+T细胞(下图)的百分比。示出了每幅图使用的肽。
图73描绘了数据的示例性图形表示，其指示CD8+T细胞上的CD107a(顶行)和肿瘤细胞上的活性胱天蛋白酶3(底行)的上调。在未转导或用200个氨基酸的构建体转导的A375肿瘤细胞系或负载或未负载肽的A375肿瘤细胞系中共培养后获得测量结果。
图74描绘了数据的示例性图形表示，其指示诱导的T细胞能够杀死表达抗原的细胞。通过回忆应答测定测试新抗原特异性T细胞识别自体肿瘤或负载肽的自体肿瘤。读出：pMHC+(CD8+的％)和pMHC-(CD8+的％)T细胞的IFN-γ+和/或TNFα+和/或CD107a+(Y轴)。使用单因素ANOVA指定显著性，P<0.05。
图75描绘了用于临床研究(NEO-PTC-01)的群组和剂量的示例性示意图。
具体实施方式
预计T细胞治疗剂是相对安全且耐受性良好的过继T细胞产品。然而，根据对产品相关风险的评估，一般有3类与T细胞治疗剂相关的潜在毒性：(a)由于淋巴耗竭、细胞输注或细胞因子释放综合征引起的治疗相关毒性；(b)由于自身反应性克隆的扩充或新抗原特异性T细胞的交叉反应性引起的肿瘤外、靶外毒性；以及(c)由于新抗原在非肿瘤组织上的呈递导致的肿瘤外、靶上毒性。本文描述了新型免疫治疗剂及其用途，这是基于由对个体肿瘤独特的突变事件引起的新抗原的发现。因此，本文描述的本公开提供了创建用于治疗疾病的抗原特异性免疫细胞，例如T细胞的方法和方案。
本文提出了一种用于癌症免疫疗法的新抗原反应性T细胞的组合物。尽管过继T细胞疗法是一种有前景的癌症治疗新方法，但它仍需多项改进。通常，T细胞必须对癌细胞具有足够的细胞毒性，必须不影响体内的非癌细胞，在肿瘤环境中不应失去免疫原性，并且应提供长期保护。另外，病毒转导的细胞的使用有其自身的挑战。因此，要取得适当的平衡以获得特异性靶向癌细胞、不影响健康细胞、延缓疾病进展、导致改善或至少显著的肿瘤消退并防止癌症复发的治疗有效组合物，需要在复杂过程的几乎所有步骤上进行一些改进。
为了便于理解本公开，下面定义了许多术语和短语。
抗原是身体的外来物质，其诱导免疫应答。“新抗原”是指由蛋白质的肿瘤特异性改变产生的一类肿瘤抗原。新抗原包括但不限于由例如蛋白质序列的置换、移码突变、融合多肽、框内缺失、插入和内源性逆转录病毒多肽的表达产生的肿瘤抗原。
“新表位”是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。
“突变”是指与参考核酸相比核酸序列的变化或差异(例如，核苷酸置换、添加或缺失)。“体细胞突变”可发生在除生殖细胞(精子和卵子)之外的身体的任何细胞中并且不会传递给孩子。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病。在一些实施方案中，突变是非同义突变。“非同义突变”是指导致翻译产物中的氨基酸改变如氨基酸置换的突变(例如，核苷酸置换)。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生“移码”，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。
“抗原加工”或“加工”是指将多肽或抗原降解成加工产物(该加工产物是所述多肽或抗原的片段(例如，多肽降解成肽))以及将这些片段中的一个或多个(例如，经由结合)与MHC分子缔合以供由细胞(例如，抗原呈递细胞)呈递给特定T细胞。
“抗原呈递细胞”(APC)是指在其细胞表面上呈递与MHC分子关联的蛋白质抗原的肽片段的细胞。该术语包括专职抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、郎格汉斯细胞)以及其他抗原呈递细胞(例如，角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)。
术语“亲和力”是指结合对的两个成员(例如，人白细胞抗原(HLA)结合肽与I类或II类HLA，或肽-HLA复合物与T细胞受体(TCR))之间结合强度的量度。KD是指结合对的两个成员之间的解离常数，并且具有摩尔浓度单位。KA是指结合对的两个成员之间的亲和常数，是解离常数的倒数。亲和力可以通过实验确定，例如使用市售Biacore SPR单元通过表面等离子体共振(SPR)确定。Koff是指结合对的两个成员的解离速率常数(例如，HLA结合肽与I或II类HLA或肽-HLA复合物与TCR的解离速率常数)。Kon是指结合对的两个成员的缔合速率常数(例如，HLA结合肽与I或II类HLA或肽-HLA复合物与TCR的缔合速率常数)。
在整个公开内容中，“结合数据”结果可以用“IC50”来表示。亲和力也可以被表示为抑制浓度50(IC50)，或50％的结合对第一成员(例如肽)被替代时的浓度。同样，ln(IC50)是指IC50的自然对数。例如，IC50可以是结合测定中观察到标记的参考肽结合的50％抑制时测试肽的浓度。考虑到运行测定的条件(例如，限制HLA蛋白浓度和/或标记的参考肽浓度)，这些值可接近KD值。用于确定结合的测定是本领域公知的，并且详细描述于例如PCT公开WO94/20127和WO 94/03205以及其他出版物如Sidney等人,Current Protocols inImmunology 18.3.1(1998)；Sidney等人,J.Immunol.154:247(1995)；和Sette等人,Mol.Immunol.31:813(1994)中。或者，结合可以相对于参考标准肽的结合来表示。结合也可以使用其他测定系统来确定，包括使用以下系统的测定系统：活细胞(例如，Ceppellini等人,Nature 339:392(1989)；Christnick等人,Nature 352:67(1991)；Busch等人,Int.Immunol.2:443(1990)；Hill等人,J.Immunol.147:189(1991)；del Guercio等人,J.Immunol.154:685(1995))、使用去污剂裂解物的无细胞系统(例如，Cerundolo等人,J.Immunol.21:2069(1991))、固定化纯化的MHC(例如，Hill等人,J.Immunol.152,2890(1994)；Marshall等人,J.Immunol.152:4946(1994))、ELISA系统(例如，Reay等人,EMBOJ.11:2829(1992))、表面等离子体共振(例如，Khilko等人,J.Biol.Chem.268:15425(1993))；高通量可溶相测定(Hammer等人,J.Exp.Med.180:2353(1994))以及I类MHC稳定化或组装的测量(例如，Ljunggren等人,Nature 346:476(1990)；Schumacher等人,Cell 62:563(1990)；Townsend等人,Cell 62:285(1990)；Parker等人,J.Immunol.149:1896(1992))。
当用来讨论表位时，术语“衍生的”是“制备的”的同义词。衍生的表位可以从天然来源分离或者可以根据本领域的标准方案合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然氨基酸残基。衍生的或制备的表位可以是天然表位的类似物。术语“来源于”是指起源或来源，并且可以包括天然存在的、重组的、未纯化的、纯化的或分化的分子或细胞。例如，扩充或诱导的抗原特异性T细胞可以来源于T细胞。例如，扩充或诱导的抗原特异性T细胞可以来源于生物样品中的抗原特异性T细胞。例如，成熟的APC(例如，专职APC)可以来源于未成熟的APC(例如，未成熟APC)。例如，APC可以来源于单核细胞(例如，CD14+单核细胞)。例如，树突细胞可以来源于单核细胞(例如，CD14+单核细胞)。例如，APC可以来源于骨髓细胞。
“表位”是分子的特征集合(例如，肽的电荷以及一级、二级和三级肽结构)，它们一起形成被另一分子(例如，免疫球蛋白、T细胞受体、HLA分子或嵌合抗原受体)识别的位点。例如，表位可以是参与被特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基；主要组织相容性复合物(MHC)受体；或者在T细胞的情况下，被T细胞受体蛋白和/或嵌合抗原受体识别的那些残基。表位可以通过从天然来源分离来制备，或者它们可以根据本领域的标准方案进行合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基——氨基酸模拟物(如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或非天然存在的氨基酸残基)。在整个公开内容中，表位在一些情况下可以被称为肽或肽表位。在某些实施方案中，对本公开的肽的长度具有限制。当包含本文所述表位的蛋白质或肽包含与天然序列具有100％同一性的区域(即，连续的一系列氨基酸残基)时，发生长度受限的实施方案。为了避免表位的定义例如在整个天然分子上读取，对与天然肽序列具有100％同一性的任何区域的长度进行限制。因此，对于包含本文所述表位及与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽，与天然序列具有100％同一性的区域通常具有以下长度：少于或等于600个氨基酸残基、少于或等于500个氨基酸残基、少于或等于400个氨基酸残基、少于或等于250个氨基酸残基、少于或等于100个氨基酸残基、少于或等于85个氨基酸残基、少于或等于75个氨基酸残基、少于或等于65个氨基酸残基以及少于或等于50个氨基酸残基。在某些实施方案中，本文所述的“表位”被包含在具有以低至5个氨基酸残基的任一增量少于51个氨基酸残基的区域的肽中，该区域与天然肽序列具有100％的同一性；具有例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。
“T细胞表位”是指以肽-MHC(pMHC)复合物的形式被MHC分子结合的肽序列。肽-MHC复合物可以被T细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞)的TCR识别并结合。
“T细胞”包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞还包括T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。T细胞可以通过本申请中描述的方法产生，用于临床应用。此处提到的T细胞或过继T细胞，如用于临床应用的那些，是从生物来源分离、离体操作和培养并制备成用于特定疗法(例如癌症，如黑素瘤)的候选药物的细胞。当候选药物细胞通过适用于临床应用的特定定性和定量标准时，该候选药物可被指定为药物产品。在一些情况下，药物产品是从许多候选药物中选择的。在本申请的上下文中，药物产品是T细胞，更具体地，T细胞群体，或更具体地，具有异质特性和亚型的T细胞群体。例如，如本文所公开的药物产品可具有包含CD8+ T细胞、CD4+ T细胞的T细胞群体，至少高于一定量的细胞表现出抗原特异性，一定百分比的每种细胞表现出记忆表型，等等。
“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞是造血来源的，并且包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
“免疫原性”肽或“免疫原性”表位或“免疫原性”肽表位是这样的肽，其与HLA分子结合，并且诱导细胞介导的应答或体液应答，例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、辅助性T淋巴细胞(HTL)应答和/或B淋巴细胞应答。本文所述的免疫原性肽能够与HLA分子结合，之后诱导针对该肽的细胞介导的应答或体液应答(例如，CTL(细胞毒性)应答或HTL应答)。
“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”是指针对来源于致病性抗原(例如，肿瘤抗原)的抗原的CTL和/或HTL应答，其以某种方式阻止或至少部分地阻止疾病症状、副作用或进展。免疫应答还可以包括通过刺激辅助T细胞促进的抗体应答。
“T细胞受体”(“TCR”)是指天然的或部分或完全合成产生的分子，其发现于识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原的T淋巴细胞(T细胞)的表面。T细胞识别与多种疾病(例如，癌症)或传染性生物体相关的抗原的能力由其TCR赋予，TCR由alpha(α)链和beta(β)链或由gamma(γ)和delta(δ)链构成。构成这些链的蛋白质由DNA编码，其采用独特的机理生成了TCR的巨大多样性。这种多亚单元免疫识别受体与CD3复合物相关联，并与抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC I类和II类蛋白质所呈递的肽相结合。TCR与APC上的肽的结合是T细胞活化中的核心事件。
如本文所用的，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指抗原结合蛋白，其包括免疫球蛋白抗原结合域(例如免疫球蛋白可变域)和T细胞受体(TCR)恒定域。如本文所用的，TCR多肽的“恒定域”包括膜近端TCR恒定域、TCR跨膜域和/或TCR胞质域或其片段。例如，在一些实施方案中，CAR是单体，其包括包含与TCRβ恒定域连接的免疫球蛋白重链可变域的多肽。在一些实施方案中，CAR为二聚体，其包括：包含与TCRα或TCRβ恒定域连接的免疫球蛋白重链或轻链可变域的第一多肽，以及包含与TCRβ或TCRα恒定域连接的免疫球蛋白重链或轻链可变域(例如，κ或λ可变域)的第二多肽。
“主要组织相容性复合物”或“MHC”是在控制导致生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”可包括任何类别的MHC分子，如MHC I类和MHC II类分子，并且涉及在所有脊椎动物中存在的基因的复合物。在人类中，MHC复合物也被称为人白细胞抗原(HLA)复合物。因此，“人白细胞抗原”或“HLA”是指人主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(参见，例如，Stites等人,Immunology,第8版,LangePublishing,Los Altos,Calif.(1994))。关于MHC和HLA复合物的详细描述，参见Paul,Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993)。
基因组中的主要组织相容性复合物包含遗传区域，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合和呈递内源性和/或外源性抗原至关重要，并且因此用于调节免疫过程。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导至关重要。MHC蛋白或分子结合肽并将其呈递以供T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质可以在细胞表面上表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入微生物的片段)。MHC结合肽可以由蛋白质抗原的蛋白水解切割产生，并代表潜在的淋巴细胞表位(例如，T细胞表位和B细胞表位)。MHC可以将肽转运到细胞表面，并在那里将其呈递给特定的细胞，如细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞或B细胞。MHC区域可分为三个子组：I类、II类和III类。MHC I类蛋白可包含α链和β2-微球蛋白(不是15号染色体编码的MHC的一部分)。它们可以将抗原片段呈递给细胞毒性T细胞。MHC II类蛋白可包含α和β链，它们可以将抗原片段呈递给T辅助细胞。MHC III类区域可编码其他免疫成分，如补体成分和细胞因子。MHC既可以是多基因的(有若干个MHC I类和MHC II类基因)，也可以是多态性的(每个基因有多个等位基因)。
“受体”是指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用来在细胞、细胞形成或生物体中传递信息。受体包含至少一个受体单元，例如，其中每个受体单元可以由蛋白质分子组成。受体具有与配体的结构互补的结构，并且可以作为结合配偶体与配体复合。具体通过配体在细胞表面上复合后受体的构象变化来传递信息。在一些实施方案中，受体应被理解为尤其是指能够与配体(特别是合适长度的肽或肽片段)形成受体/配体复合物的MHC I类和II类的蛋白质。“配体”是指具有与受体的结构互补的结构并且能够与该受体形成复合物的分子。在一些实施方案中，配体应被理解为意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，以使得肽或肽片段能够与诸如MHC I类或MHC II类蛋白的MHC蛋白质形成复合物。在一些实施方案中，“受体/配体复合物”还应被理解为意指“受体/肽复合物”或“受体/肽片段复合物”，其包括呈递肽或肽片段的MHC分子，如MHC I类或II类分子。
“天然”或“野生型”序列是指在自然界中发现的序列。如本文所用的，术语“天然存在的”是指对象可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界的来源中分离并且在实验室中没有被人工有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
术语“肽”和“肽表位”在本说明书中可以与“寡肽”互换使用，是指通常通过相邻氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基。“合成肽”是指从非天然来源中获得的肽，例如是人造的。可以使用诸如化学合成或重组DNA技术等方法产生这类肽。“合成肽”包括“融合蛋白”。
术语“基序”是指所限定长度的氨基酸序列中的残基模式，例如，长度小于约15个氨基酸残基或长度小于约13个氨基酸残基的肽，例如，对于I类HLA基序，具有约8至约13个(例如，8、9、10、11、12或13个)氨基酸残基，而对于II类HLA基序，具有约6至约25个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个)氨基酸残基，其被特定的HLA分子所识别。对于由给定的人HLA等位基因编码的每种HLA蛋白，基序通常是不同的。这些基序的一级和二级锚定残基的模式不同。在一些实施方案中，MHC I类基序识别长度为7、8、9、10、11、12或13个氨基酸残基的肽。在一些实施方案中，MHC II类基序识别长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个氨基酸残基的肽。“交叉反应性结合”肽是指与结合对成员类别的多于一个成员结合的肽(例如，被I类HLA分子和II类HLA分子均结合的肽)。
术语“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物并入肽或蛋白质中或者被核酸(DNA或RNA)编码的氨基酸残基或氨基酸模拟残基。用来描述肽或蛋白质的命名法遵循常规实践。氨基呈现于每个氨基酸残基的左侧(氨基端或N-末端)且羧基呈现于右侧(羧基端或C-末端)。当在肽表位中提及氨基酸残基位置时，在氨基至羧基方向上对氨基酸残基进行编号，其中第一个位置是位于表位或表位可能是其一部分的肽或蛋白质的氨基末端的残基。在代表本发明所选择的具体实施方案的通式中，除非另有说明，否则氨基端和羧基端基团(尽管没有具体显示)是它们在生理pH值下呈现的形式。在氨基酸结构式中，每个残基通常用标准的三字母或单字母命名表示。氨基酸残基的L-形式由大写单字母或首字母大写的三字母符号表示，而具有D-形式的那些氨基酸残基的D-形式由小写单字母或小写三字母符号表示。然而，当使用没有大写字母的三字母符号或全名时，它们也可以指L氨基酸残基。甘氨酸没有不对称碳原子，并简称为“Gly”或“G”。本文所述的肽的氨基酸序列通常使用标准单字母符号表示。(A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸)。
“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。鉴定不消除肽功能的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的。
“药学上可接受的”是指通常无毒、惰性和/或生理学相容的组合物或组合物组分。“药用赋形剂”或“赋形剂”包括诸如佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。“药用赋形剂”为药学上可接受的赋形剂。
根据本公开，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答(例如细胞或体液免疫应答)的药物制品(药物组合物)或产品，其识别并攻击病原体或病变细胞，如癌细胞。疫苗可以用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”或“个性化癌症疫苗”、“个人癌症疫苗”涉及特定癌症患者，并且意指癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可以互换使用，并且指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA(例如，mRNA)。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。在一些实施方案中，多核苷酸和核酸可以是体外转录的mRNA。在一些实施方案中，使用本发明方法施用的多核苷酸是mRNA。
术语“分离的”或“生物学纯的”是指这样的材料，其实质上或基本上不含在其天然状态下被发现时通常伴随该材料的组分。因此，本文所述的分离的肽不含有在其原位环境中通常与该肽关联的一些或全部物质。例如，“分离的”表位可以是不包括衍生出该表位的蛋白质的全序列的表位。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存物质中分离出的相同的多核苷酸或肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者这样的多核苷酸或肽可以是组合物的一部分，并且仍然是“分离的”，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。分离的RNA分子包括本文所述的DNA分子的体内或体外RNA转录物，并且还包括以合成方式产生的这类分子。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。如本文所用的术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的物质。
在两个或更多个核酸或多肽的语境中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当针对最大对应度进行比较和比对(如果必要，引入空位)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸置换作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量百分比同一性。可用来获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域公知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其变化形式。在一些实施方案中，本文所述的两种核酸或多肽基本上相同，意指当针对最大对应度进行比较和比对时，如使用序列比较算法或通过目视检查所测量的，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％并且在一些实施方案中具有至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，在长度为至少约10、至少约20、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基或其间任何整数值个残基的序列区域中存在同一性。在一些实施方案中，同一性存在于长于60-80个残基如至少约80-100个残基的区域中，并且在一些实施方案中，该序列在所比较的序列的全长，如肽的氨基酸序列或核苷酸序列的编码区上基本相同。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。通常，在提到人类受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症有效的治疗剂的量。治疗有效量的药物具有治疗效果，因此可以预防疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的进展；在一定程度上缓解与疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。
术语“治疗”或“缓解”是指：(1)治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或病症的症状，和/或中止该病理状况或病症的进展的治疗措施；和(2)预防或减缓目标病理状况或病症的发展的预防性或防范性措施。因此，需要治疗的受试者包括已经患有该病症的受试者；易于患该病症的受试者；以及要预防该病症的受试者。
当用于描述细胞样品(例如，外周血单核细胞(PBMC)样品)时，术语“耗尽的”是指其中细胞亚群已被去除或消耗的细胞样品。例如，耗尽了表达CD25的细胞的免疫细胞样品是指其中已经除去或耗尽了表达CD25的细胞的免疫细胞样品。例如，一种或多种结合剂可用于从样品中去除或消耗一种或多种细胞或细胞类型。例如，可以例如通过使用与CD14结合的抗体从PBMC样品中消耗或去除CD14+细胞。
“刺激”是指通过刺激分子与其同源配体的结合诱导的反应，从而介导信号转导事件。例如，对T细胞的刺激可以指T细胞的TCR与肽-MHC复合物的结合。例如，对T细胞的刺激可以指方案1或方案2中的步骤，其中PBMC与负载肽的APC一起培养。
术语“富集”是指其中目标种类已经部分纯化的组合物或级分，使得目标种类的浓度大大高于未富集的最终产物中自然存在的种类水平。术语“诱导的细胞”是指已经用影响细胞的蛋白质表达、基因表达、分化状态、形状、形态、活力等的诱导性化合物、细胞或细胞群体处理过的细胞。
“参考”可以用来将本公开的方法中获得的结果与疾病标本相关联并且/或者进行比较。通常，“参考”可以基于一个或多个正常标本获得，特别是不受疾病影响的标本，其获自个体或一个或多个不同的个体(例如健康个体)，如同一物种的个体。“参考”可以通过检测足够大量的正常标本来凭经验确定。
如本文所用的，除非另有说明，否则肿瘤是癌性肿瘤，并且术语癌症和肿瘤在整个文件中可互换使用。虽然肿瘤是实体组织的癌症，但本文所述的几种组合物和方法原则上适用于血液癌症，白血病。
T细胞疗法的概述
通过T细胞(例如自体T细胞)的受控离体诱导或扩充来产生抗原特异性T细胞可以提供高度特异性和有益的T细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)。本公开提供了T细胞制备方法和治疗性T细胞组合物，其可用于治疗患有癌症和其他病况、疾病和病症的受试者。目的是扩充和诱导具有良好表型和功能的抗原特异性T细胞。本公开提供了用于制备可用于抗原特异性T细胞疗法(例如，个人或个性化T细胞疗法)的T细胞的组合物和方法。本文提供的T细胞组合物可以是个人抗原特异性T细胞疗法。图1用图形表示了与T细胞疗法相关的过程的概述：一方面，其包括在患有癌症的受试者中鉴定癌症和癌症特异性抗原，导致新抗原肽的产生；另一方面，制备用于免疫疗法的活化抗原特异性细胞并施用细胞产品。
用于基于T细胞的疗法的新抗原
传统的抗原靶向免疫疗法侧重于肿瘤相关抗原(TAA)、包括癌症睾丸抗原(通常是在肿瘤中异常表达的种系限制性基因产物)在内的抗原或源自显示出组织特异性表达的基因的抗原。然而，肿瘤也展示出被称为新抗原的突变基因的蛋白质产物。使用下一代测序方法可以容易地确定突变的数目和类型，其包括单氨基酸错义突变、融合蛋白和新型开放阅读框(neoORF)，其长度从1个到100个或更多个氨基酸不等。新抗原是在表位中包含非沉默突变的抗原，并且相同的抗原不在同一人体内的非癌细胞中表达。基于突变的抗原特别有价值，因为它们绕过了中枢耐受(在去除自身反应性T细胞的正常胸腺发育过程中发生的过程)，并表现出精细的肿瘤特异性。每个非同义(即蛋白质编码)突变都有产生可以被患者T细胞识别的新抗原的能力。识别这些新抗原的T细胞既可以直接杀死肿瘤细胞，又可以催化更广泛的针对该肿瘤的免疫应答。本文所述的方法旨在以患者特异性方式诱导并扩充此类新抗原反应性T细胞，并将这些细胞用于过继细胞疗法。
在一些实施方案中，本文使用的新抗原包含点突变。
在一些实施方案中，本文使用的新抗原包含移码突变。
在一些实施方案中，本文使用的新抗原包含交叉突变。
在一些实施方案中，本文使用的新抗原包含由插入一个或多于一个核苷酸引起的插入突变。
在一些实施方案中，本文使用的新抗原包含由一个或多于一个核苷酸的缺失引起的缺失突变。
在一些实施方案中，所述新抗原可由插入-缺失(in-del)突变引起。
在一些实施方案中，抗原或新抗原肽结合HLA蛋白(例如，HLA I类或HLA II类)。在具体的实施方案中，抗原或新抗原肽以比相应的野生型肽更大的亲和力结合HLA蛋白。在具体的实施方案中，抗原或新抗原肽的IC50或KD至少低于5000nM、至少低于500nM、至少低于100nM、至少低于50nM或更低。
在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的长度可以是约8至约50个氨基酸残基，或约8至约30，约8至约20，约8至约18，约8至约15，或约8至约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的长度可以是约8至约500个氨基酸残基，或约8至约450、约8至约400、约8至约350、约8至约300、约8至约250、约8至约200、约8至约150、约8至约100、约8至约50或约8至约30个氨基酸残基。
在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，新抗原肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更少的氨基酸残基。在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更少的氨基酸残基。
在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的总长度为至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸。
在一些实施方案中，抗原或新抗原肽的总长度为至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450或至多500个氨基酸。
在一些实施方案中，新抗原肽可以具有约0.5至约12、约2至约10或约4至约8的pI值。在一些实施方案中，新抗原肽可以具有至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更高的pI值。在一些实施方案中，新抗原肽可以具有至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更低的pI值。
在一些实施方案中，抗原或新抗原肽可以具有约1pM至约1mM、约100pM至约500μM、约500pM至约10μM、约1nM至约1μM或约10nM至约1μM的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，抗原或新抗原肽可以具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900μM或更高的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，抗原或新抗原肽可以具有至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900μM的HLA结合亲和力。
在一些实施方案中，本文所述的抗原或新抗原肽可以包括诸如本领域公知的那些载体，例如甲状腺球蛋白、诸如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸残基(诸如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸)、流感病毒蛋白、乙型肝炎病毒核心蛋白等。
在一些实施方案中，本文所述的抗原或新抗原肽可以通过末端-NH2酰化(例如通过烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基乙酰化)、末端羧基酰胺化(例如氨、甲胺等)进行修饰。在一些实施方案中，这些修饰可以提供用于与支持体或其他分子连接的位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原或新抗原肽可以包含修饰，诸如但不限于糖基化、侧链氧化、生物素化、磷酸化、添加表面活性物质(例如脂质)，或可以进行化学修饰，例如乙酰化等。此外，肽中的键可以是除了肽键之外的键，例如共价键、酯键或醚键、二硫键、氢键、离子键等。
在一些实施方案中，本文所述的抗原或新抗原肽可以包含置换以改变所得肽的物理性质(例如，稳定性或溶解性)。例如，可以通过用α-氨基丁酸(“B”)置换半胱氨酸(C)来修饰抗原或新抗原肽。由于其化学性质，半胱氨酸具有形成二硫键的倾向，并且在结构上充分改变肽以降低结合能力。用α-氨基丁酸置换C不仅可以缓解这个问题，而且在某些情况下实际上改善了结合和交叉结合能力。用α-氨基丁酸置换半胱氨酸可以发生在抗原或新抗原肽的任何残基上，例如在肽内表位或类似物的锚定或非锚定位置或肽的其他位置上。
在一些实施方案中，本文所述的抗原肽或新抗原肽可以包含氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基，例如D-或L-萘丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2-噻吩基丙氨酸；D-或L-1、2、3或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟-甲基)-苯丙氨酸；D-ρ-氟苯丙氨酸；D-或L-ρ-联苯基-苯丙氨酸；D-或L-ρ-甲氧基联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙氨酸；以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸残基。非天然氨基酸的芳环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。具有各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基的修饰肽是特别有用的，因为它们倾向于显示增加的体内稳定性。这样的肽还可以具有改善的保质期或制备性质。
在一些实施方案中，所述肽与免疫细胞接触，以激活所述细胞并使它们成为抗原反应性的。
在一些实施方案中，所述肽与免疫细胞离体接触。
在一些实施方案中，所述肽与免疫细胞在活体系统，例如人体中接触。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是抗原呈递细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。
本公开涉及用于制备对免疫原性抗原为特异性的T细胞的方法。
本公开还涉及包含用APC刺激的抗原特异性T细胞的组合物。在一些实施方案中，将一种或多种抗原肽加载到APC上，其中然后用负载肽的APC刺激T细胞以产生抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，该抗原是新抗原。在一些实施方案中，用于肽加载的APC是树突细胞。
在一些实施方案中，肽序列包含在受试者的非癌细胞中不存在的突变。在一些实施方案中，肽由受试者的癌细胞的基因或表达的基因所编码。在一些实施方案中，肽序列的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个或更多个天然存在的氨基酸。
在一些实施方案中，肽序列结合由I类HLA等位基因编码的蛋白质，并且具有8-12个天然氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽序列结合由II类HLA等位基因编码的蛋白质，并且具有16-25个天然存在的氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽序列包含多个抗原肽序列。在一些实施方案中，多个抗原肽序列包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个抗原肽序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗原是新抗原。候选免疫原性新抗原序列可以通过本领域已知的任何合适方法来鉴定。本公开的方法可用于例如产生针对受试者疾病的特异性疗法或产生针对疾病的疫苗。候选免疫原性新抗原可以是先前鉴定的新抗原。在一些实施方案中，候选免疫原性新抗原可能先前未被鉴定。用于本文所述的方法和组合物中的候选免疫原性新抗原可以对受试者是特异性的。在一些实施方案中，用于本文描述的方法和组合物中的候选新抗原可以对多个受试者是特异性的。
在动物和人类中，突变的表位在诱导免疫应答或激活T细胞方面都可能有效。在一个实施方案中，可以确定受试者中诸如病毒的传染原的潜在免疫原性表位。在一个实施方案中，可以确定患有疾病如癌症的受试者的潜在的免疫原性突变的表位。在一些实施方案中，供本文描述的方法使用的潜在的免疫原性抗原或新抗原可以是在肿瘤和产生它们的组织类型的细胞中表达的分化抗原。在一些实施方案中，供本文所述方法使用的潜在的免疫原性抗原或新抗原可以是在另一分化组织中未表达的癌症/种系抗原。在一些实施方案中，供本文所述方法使用的潜在的免疫原性抗原或新抗原可以是突变的抗原。例如，供本文所述方法使用的候选免疫原性抗原或新抗原肽可包含错义点突变或通过基因区段的肿瘤特异性易位产生的融合蛋白的抗原或新抗原。在一些实施方案中，供本文所述方法使用的潜在的免疫原性抗原或新抗原可以是过表达的抗原。在一些实施方案中，可以在肿瘤中发现潜在的免疫原性抗原或新抗原。例如，供本文所述方法使用的潜在的免疫原性抗原或新抗原可以包括其表达在分化的正常组织的细胞中受到严格调节的蛋白质。
可以使用下一代测序技术，通过对癌症患者的肿瘤组织和健康组织进行基因组或外显子组测序来确定潜在的免疫原性突变表位。例如，可以使用下一代测序技术对基于其突变频率和充当抗原或新抗原的能力选择的基因进行测序。在一个实施方案中，可以分析测序数据以鉴定可以结合受试者的HLA分子的潜在的免疫原性突变的肽。在一个实施方案中，可以使用计算机来分析数据。在另一个实施方案中，可以分析序列数据中抗原或新抗原肽的存在。在一实施方案中，可以通过潜在的免疫原性抗原或新抗原肽对MHC分子的亲和力来确定。
潜在的免疫原性抗原或新抗原肽可以通过直接蛋白质测序来确定。例如，使用多维质谱技术(例如，串联质谱(MS/MS))的酶促蛋白消化物的蛋白质测序可用于鉴定供本文所述方法使用的潜在的免疫原性抗原或新抗原肽。
用于未知蛋白质从头测序的高通量方法可用于鉴定潜在的免疫原性抗原或新抗原肽。例如，用于未知蛋白质的从头测序的高通量方法，例如meta-shotgun蛋白质测序，可用于分析受试者肿瘤的蛋白质组，以鉴定潜在的免疫原性表达的新抗原。
还可以使用MHC多聚体来鉴定潜在的免疫原性抗原或新抗原肽，以鉴定抗原特异性T细胞应答。例如，可以使用基于MHC四聚体的筛选技术对患者样品中的抗原特异性T细胞应答进行高通量分析。基于四聚体的筛选技术可用于潜在免疫原性肿瘤特异性抗原的初步鉴定，或者可替代地用作二次筛选方案，以评估患者可能已经接触过哪些潜在免疫原性抗原，从而有助于选择供本文所述方法使用的潜在的免疫原性抗原。
在一些实施方案中，特定新抗原被靶向用于免疫疗法。在一些实施方案中，合成新抗原肽。本文使用的新抗原肽被设计为使得每个肽对HLA抗原具有特异性，并且可以以高结合亲和力和特异性结合HLA抗原。在一些实施方案中，本文使用的肽基于由发明人产生的高性能HLA结合预测模型来设计，并且已在例如以下专利申请/公开文本中描述：WO2011143656、WO2017184590以及美国临时申请62/783,914和62/826,827；所有这些都通过引用并入本文。NetMHCIIpan可能是当前的预测标准，但可能认为其并不准确。在三个II类基因座(DR、DP和DQ)中，可能仅HLA-DR的某些常见等位基因存在数据。简言之，新生成的预测模型有助于鉴定免疫原性抗原肽，并且可用于开发药物，如个性化医疗药物，以及抗原特异性T细胞的分离和表征，其中机器学习HLA-肽呈递预测模型包括：至少基于训练数据确定的多个预测变量，其中所述训练数据包含：由细胞中表达的HLA蛋白呈递并通过质谱法鉴定的肽的序列的序列信息；包含氨基酸位置信息的训练肽序列信息，其中所述训练肽序列信息与细胞中表达的HLA蛋白相关；以及代表作为输入接收的氨基酸位置信息与基于所述氨基酸位置信息和预测变量作为输出生成的呈递可能性之间的关系的函数。CD4+ T细胞应答可具有抗肿瘤活性。在现有的预测方法中，不使用II类预测(例如，NeoVax研究中60％的SLP表位(NT-001中的49％)和BioNTech研究中48％的mRNA表位)，可以显示出高CD4+ T细胞应答率。可能不清楚这些表位是否通常(由肿瘤或吞噬性DC)天然呈递。因此，希望通过改进对自然呈递的II类表位的鉴定，将高CD4+ T应答率转化为治疗效果。基因表达、酶切和途径/定位偏好的作用可能尚未得到强有力的量化。可能尚不清楚是自噬(肿瘤细胞的II类呈递)还是吞噬作用(APC对肿瘤表位的II类呈递)是更相关的途径，尽管大多数现有MS数据可能被推定来源于自噬。可能有不同的数据生成方法来学习II类呈递的规则，包括现场标准和提议的方法。现场标准可包括亲和力测量，这可能是NetMHCIIpan预测器的基础，提供低通量并且需要放射性试剂，并且它省略了处理的作用。新方法包括质谱法，其中来自细胞系/组织/肿瘤的数据可以帮助确定自噬的处理规则(大部分数据已经公布)，而单等位基因MS可以允许确定等位基因特异性结合规则(假设多等位基因MS数据对于有效学习而言过于复杂。新生成的预测方法包括训练机器学习HLA-肽呈递预测模型，其中训练包括使用计算机处理器将从来自表达HLA II类等位基因的细胞的一个或多个HLA-肽复合物中分离的HLA-肽的氨基酸位置信息序列输入到所述HLA-肽呈递预测模型中；所述机器学习HLA-肽呈递预测模型包括：至少基于训练数据确定的多个预测变量，所述训练数据包含：由细胞中表达的HLA蛋白呈递并通过质谱法鉴定的肽的序列的序列信息；包含训练肽的氨基酸位置信息的训练肽序列信息，其中所述训练肽序列信息与细胞中表达的HLA蛋白相关；以及代表作为输入接收的氨基酸位置信息与基于所述氨基酸位置信息和预测变量作为输出生成的呈递可能性之间的关系的函数。在一些实施方案中，所述呈递模型在0.1％-10％的召回率下具有至少0.25的阳性预测值。在一些实施方案中，所述呈递模型在0.1％-10％的召回率下具有至少0.4的阳性预测值。在一些实施方案中，所述呈递模型在0.1％-10％的召回率下具有至少0.6的阳性预测值。在一些实施方案中，所述质谱法是单等位基因质谱法。在一些实施方案中，所述肽通过自噬由在细胞中表达的HLA蛋白呈递。在一些实施方案中，所述肽通过吞噬作用由在细胞中表达的HLA蛋白呈递。在一些实施方案中，通过使用多个质量度量来提高训练数据的质量。在一些实施方案中，所述多个质量度量包括常见污染物肽去除、高评分峰强度、高评分和高质量准确度。在一些实施方案中，评分峰值强度至少为50％。在一些实施方案中，评分峰值强度至少为70％。在一些实施方案中，由细胞中表达的HLA蛋白呈递的肽是由细胞中表达的单一免疫沉淀的HLA蛋白呈递的肽。在一些实施方案中，所述多个预测变量包括肽-HLA亲和力预测变量。在一些实施方案中，所述多个预测变量包括源蛋白质表达水平预测变量。在一些实施方案中，所述多个预测变量包括肽可切割性预测变量。在一些实施方案中，由HLA蛋白呈递的肽包括通过使用反转数据库搜索策略搜索肽数据库而鉴定的肽。在一些实施方案中，所述HLA蛋白是HLA-DR和HLA-DP或HLA-DQ蛋白。在一些实施方案中，所述HLA蛋白是选自HLA-DR和HLA-DP或HLA-DQ蛋白的HLA-DR蛋白。在一些实施方案中，所述HLA蛋白是选自下组的HLA-DR蛋白：HLA-DPB1*01:01/HLA-DPA1*01:03、HLA-DPB1*02:01/HLA-DPA1*01:03、HLA-DPB1*03:01/HLA-DPA1*01:03、HLA-DPB1*04:01/HLA-DPA1*01:03、HLA-DPB1*04:02/HLA-DPA1*01:03、HLA-DPB1*06:01/HLA-DPA1*01:03,HLA-DQB1*02:01/HLA-DQA1*05:01,HLA-DQB1*02:02/HLA-DQA1*02:01、HLA-DQB1*06:02/HLA-DQA1*01:02,HLA-DQB1*06:04/HLA-DQA1*01:02、HLA-DRB1*01:01、HLA-DRB1*01:02、HLA-DRB1*03:01、HLA-DRB1*03:02、HLA-DRB1*04:01、HLA-DRB1*04:02、HLA-DRB1*04:03、HLA-DRB1*04:04、HLA-DRB1*04:05、HLA-DRB1*04:07、HLA-DRB1*07:01、HLA-DRB1*08:01、HLA-DRB1*08:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*08:04、HLA-DRB1*09:01、HLA-DRB1*10:01、HLA-DRB1*11:01、HLA-DRB1*11:02、HLA-DRB1*11:04、HLA-DRB1*12:01、HLA-DRB1*12:02、HLA-DRB1*13:01、HLA-DRB1*13:02、HLA-DRB1*13:03、HLA-DRB1*14:01、HLA-DRB1*15:01、HLA-DRB1*15:02、HLA-DRB1*15:03、HLA-DRB1*16:01、HLA-DRB3*01:01、HLA-DRB3*02:02、HLA-DRB3*03:01、HLA-DRB4*01:01和HLA-DRB5*01:01)。在一些实施方案中，由HLA蛋白呈递的肽包括通过将HLA-肽的MS/MS谱与肽数据库中的一种或多种HLA-肽的MS/MS谱进行比较而鉴定的肽。
在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变和基因融合突变。
在一些实施方案中，由HLA蛋白呈递的肽具有15-40个氨基酸的长度。在一些实施方案中，由HLA蛋白呈递的肽包括通过以下方式鉴定的肽：(a)从表达单个HLA II类等位基因的细胞系中分离一种或多种HLA复合物；(b)从所述一种或多种分离的HLA复合物中分离一种或多种HLA-肽；(c)获得所述一种或多种分离的HLA-肽的MS/MS谱；以及(d)从肽数据库中获得与所述一种或多种分离的HLA-肽的MS/MS谱相对应的肽序列；其中从步骤(d)获得的一种或多种序列鉴定所述一种或多种分离的HLA-肽的序列。
各种抗原肽可用于诱导或扩充T细胞。各种抗原肽可用于激活抗原呈递细胞(APC)，而抗原呈递细胞(APC)又通过将T细胞与负载抗原的APC接触来激活T细胞。
在一些实施方案中，肽包含选自以下的突变：(A)点突变，(B)剪接位点突变，(C)移码突变，(D)通读突变，(E)基因融合突变，及其组合。在一些实施方案中，肽包含点突变，并且以比相应野生型肽更大的亲和力结合受试者的HLA蛋白。
在一些实施方案中，肽以小于500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的IC50结合受试者的HLA蛋白。在一些实施方案中，肽以小于500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的IC50或KD结合受试者的HLA蛋白。在一些实施方案中，每个肽结合由受试者表达的HLA等位基因所编码的蛋白质。在一些实施方案中，诱导或扩充的抗原特异性T细胞的TCR以小于500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的IC50或KD结合肽-HLA复合物。在一些实施方案中，TCR以小于500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的IC50或KD结合肽-HLA复合物。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列中的每一个包含在受试者的非癌细胞中不存在的突变。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列中的每一个由受试者的癌细胞的基因或表达的基因编码。
在一些实施方案中，肽的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个或更多个天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，肽结合由I类HLA等位基因编码的蛋白质，并且具有8-12个天然存在的氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽结合由II类HLA等位基因编码的蛋白质，并且具有16-25个天然存在的氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽包含多个肽。在一些实施方案中，所述多个肽包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个或更多个抗原肽。
在一些方面，本公开提供了使用上文所简述的方法鉴定的肽(例如，具有肿瘤特异性突变的肽、病毒肽或与非癌性疾病相关的肽)或编码该肽的多核苷酸。
在一些实施方案中，使用光学方法来选择或鉴定免疫原性抗原。在一些实施方案中，使用条形码探针来选择或鉴定免疫原性抗原。在一些实施方案中，使用包含靶标特异性区域和条形码化区域的条形码化探针来选择或鉴定免疫原性抗原。在一些实施方案中，靶标特异性区域包含与靶多核苷酸的核酸序列杂交或具有至少约90％、95％或100％序列互补性的核酸序列。
制备活化的抗原特异性T细胞
本文提供了刺激T细胞的方法。例如，本文提供的方法可用来刺激抗原特异性T细胞。本文提供的方法可用来诱导或激活T细胞。例如，本文提供的方法可用来扩充活化的T细胞。例如，本文提供的方法可用来诱导幼稚T细胞。例如，本文提供的方法可用来扩充抗原特异性CD8+T细胞。例如，本文提供的方法可用来扩充抗原特异性CD4+T细胞。例如，本文提供的方法可用来扩充具有记忆表型的抗原特异性CD8+T细胞。例如，治疗性组合物可包含抗原特异性CD8+ T细胞。例如，治疗性组合物可包含抗原特异性记忆T细胞。
T细胞可以用包含新抗原肽或编码新抗原肽的多核苷酸的组合物离体激活。
T细胞可以用包含负载抗原的抗原呈递细胞的组合物离体激活。
在一些实施方案中，APC和/或T细胞来源于从受试者获得的生物样品。
在一些实施方案中，APC和/或T细胞来源于作为外周血单核细胞(PBMC)的生物样品。
在一些实施方案中，在获得用于制备APC和/或T细胞的生物样品之前向受试者施用FLT3L。
在一些实施方案中，APC和/或T细胞来源于作为白细胞分离样品的生物样品。
在一些实施方案中，抗原呈递细胞首先离体加载新抗原肽，并用来制备新抗原激活的T细胞。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含被APC如预负载抗原肽的APC刺激的T细胞。所述组合物可包含免疫细胞群体，该免疫细胞群体包含来自样品(例如生物样品)的T细胞，其中所述T细胞包括APC刺激的T细胞。在一些实施方案中，将编码一种或多种新抗原肽的mRNA引入APC中以供新抗原肽的表达。此类APC用于刺激或激活T细胞。
在一些实施方案中，所述生物样品包含组合物中至少一种抗原特异性T细胞的百分比为至少约0.00001％、0.00002％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％。在一些实施方案中，所述生物样品包含来源于外周血或白细胞分离术的生物样品中总细胞计数的少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或少于10％的抗原激活的T细胞。在一些实施方案中，所述生物样品包含来源于外周血或白细胞分离术的生物样品中总细胞计数的少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％的抗原激活的T细胞。
在一些实施方案中，所述生物样品包含抗原幼稚T细胞。在一些实施方案中，所述生物样品包含来源于外周血或白细胞分离术的生物样品中总细胞计数的高于约0.00001％、0.00002％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的抗原幼稚细胞。
在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD8+T细胞的百分比小于来源于外周血或白细胞分离术的生物样品中的约0.00001％、0.00002％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％。在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD4+T细胞的百分比至少为来源于外周血或白细胞分离术的生物样品中的约0.00001％、0.00002％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。
在一些实施方案中，所述生物样品中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比为总免疫细胞的至多约0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。在一些实施方案中，所述生物样品中至少一种抗原特异性CD8+T细胞的百分比为总免疫细胞的至多约0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。在一些实施方案中，所述生物样品中至少一种抗原特异性CD4+T细胞的百分比为总免疫细胞的至多约0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。在一些实施方案中，所述生物样品中抗原特异性T细胞的百分比至多为约0.5％。在一些实施方案中，所述生物样品中新抗原特异性CD8+T细胞的百分比至多为约0.5％。在一些实施方案中，所述生物样品中抗原特异性CD4+T细胞的百分比至多为所述生物样品的约0.5％。
制备负载新抗原的APC
在一些实施方案中，组合物包含已经与一种或多种细胞因子、生长因子或配体如与APC或T细胞的细胞表面受体结合的配体一起孵育的免疫细胞群体。此类细胞因子、生长因子和配体的非限制性实例包括但不限于GM-CSF、IL-4、IL-7、FLT3L、TNF-α、IL-1β、IL-15、PGE1、IL-6、IFN-α、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40和聚I:C。在一些实施方案中，组合物包含已经与一种或多种APC或APC制品一起孵育的免疫细胞群体。例如，组合物可以包含已经与一种或多种细胞因子、生长因子和/或配体刺激的APC或细胞因子、生长因子和/或配体刺激的APC制品一起孵育的免疫细胞群体。例如，组合物可以包含已经与一种或多种细胞因子刺激的APC或细胞因子刺激的APC制品一起孵育的免疫细胞群体。例如，组合物可包含已经与一种或多种生长因子刺激的APC或生长因子刺激的APC制品一起孵育的免疫细胞群体。例如，组合物可包含已经与一种或多种配体刺激的APC或配体刺激的APC制品一起孵育的免疫细胞群体。
在一些实施方案中，APC是自体APC、同种异体APC或人工APC。
免疫细胞的特征在于细胞表面分子。在一些实施方案中，优选地基于细胞表面标志物选择免疫细胞，例如，通过使用能够结合细胞表面受体的抗体从生物样品中选择。在一些实施方案中，对一些细胞进行负选择，以富集不表达它们针对其进行负选择的细胞表面分子的一种或多种细胞类型。
在一些实施方案中，通过从APC或前体细胞中选择而从生物样品制备抗原呈递细胞(APC)，所述细胞可在新抗原肽的存在下培养，以产生用于激活T细胞的负载新抗原的APC。下面描述了一些用于选择和/或富集一组细胞的相关细胞表面标志物。
CD1(分化簇1)是在各种人类抗原呈递细胞表面上表达的糖蛋白家族。它们与I类MHC分子有关，并且参与将脂质抗原呈递给T细胞。
CD11b或整联蛋白αM(ITGAM)是一种形成异二聚体整联蛋白α-Mβ-2(αMβ2)分子的蛋白质亚基，也称为巨噬细胞-1抗原(Mac-1)或补体受体3(CR3)。ITGAM也称为CR3A和分化簇分子11b(CD11b)。αMβ2的第二条链是被称为CD18的共同整联蛋白β2亚基，因此整联蛋白αMβ2属于β2亚家族(或白细胞)整联蛋白。αMβ2在参与先天免疫系统的许多白细胞表面上表达，这些细胞包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。它通过调节白细胞粘附和迁移来介导炎症，并参与多种免疫过程，如吞噬作用、细胞介导的细胞毒性、趋化性和细胞活化。由于其结合失活的补体成分3b(iC3b)的能力，它参与补体系统。整联蛋白αMβ2的ITGAM(α)亚基直接参与引起细胞的粘附和扩散，但在不存在β2(CD18)亚基的情况下不能介导细胞迁移。
CD11c，也称为整联蛋白αX(补体成分3受体4亚基)(ITGAX)，是编码CD11c的基因。CD11c是整联蛋白αX链蛋白。整联蛋白是由α链和β链组成的异二聚体整合膜蛋白。这种蛋白质与β2链(ITGB2)组合形成被称为灭活C3b(iC3b)受体4(CR4)的白细胞特异性整联蛋白。αXβ2复合物似乎与αMβ2整联蛋白在嗜中性粒细胞和单核细胞与经刺激的内皮细胞的粘附以及补体包被颗粒的吞噬方面的性质重叠。CD11c是一种I型跨膜蛋白，在大多数人树突细胞上高水平发现，但也在单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和一些B细胞上发现，其诱导细胞活化并帮助触发嗜中性粒细胞呼吸爆发；在毛细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病和一些B细胞慢性淋巴细胞白血病中表达。
CD14是优先在单核细胞/巨噬细胞上表达的表面抗原。它与其他蛋白质协同介导对细菌脂多糖的先天免疫应答。可变剪接导致编码相同蛋白质的多个转录变体。CD14以两种形式存在，一种通过糖基磷脂酰肌醇尾(mCD14)锚定在膜上，另一种是可溶性形式(sCD14)。可溶性CD14或者在mCD14(48kDa)脱落后出现，或者直接从细胞内囊泡分泌(56kDa)。CD14充当共受体(与Toll样受体TLR 4和MD-2一起)用于检测细菌脂多糖(LPS)。CD14仅在脂多糖结合蛋白(LBP)的存在下才能结合LPS。尽管认为LPS是其主要配体，但CD14还识别其他病原体相关分子模式，如脂磷壁酸。
CD25由常规T细胞在刺激后表达，并且已经表明，在人外周血中，只有CD4+CD25hi T细胞是“抑制物”。
在一些实施方案中，APC包括树突细胞(DC)。在一些实施方案中，APC来源于CD14+单核细胞。在一些实施方案中，APC可获自皮肤、脾脏、骨髓、胸腺、淋巴结、外周血或脐带血。在一些实施方案中，CD14+单核细胞来自包含PBMC的来自受试者的生物样品。例如，可以从包含PBMC的来自受试者的生物样品中分离、富集或纯化CD14+单核细胞。在一些实施方案中，用一种或多种细胞因子或生长因子刺激CD14+单核细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子或生长因子包括GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IL-15、IFN-γ、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、聚I:C或其组合。在一些实施方案中，CD14+单核细胞来自包含PBMC的第二生物样品。
在一些实施方案中，分离的APC群体可以是富集的或基本上富集的。在一些实施方案中，分离的APC群体是至少30％、至少50％、至少75％或至少90％同质的。在一些实施方案中，分离的APC群体是至少60％、至少75％或至少90％同质的。APC，如APC，可以包括，例如，在培养中衍生自单核树突前体的APC，以及存在于诸如外周血、脐带血、皮肤、脾脏、骨髓、胸腺和淋巴结等组织中的内源衍生的APC。
可以通过本发明另外提供的方法分离APC和基本上富集APC的细胞群体。该方法通常包括获得包括APC前体的细胞群体，将APC前体分化成未成熟或成熟的APC，并且还可以包括从分化的未成熟或成熟APC群体中分离APC。
APC前体细胞可以通过本领域已知的方法获得。可以通过例如密度梯度分离、荧光激活细胞分选(FACS)、免疫细胞分离技术如淘选、补体裂解、玫瑰花结、磁性细胞分离技术、尼龙毛分离以及这类方法的组合来分离APC前体。免疫选择APC的方法包括，例如，使用针对与APC前体缔合的细胞表面标志物的抗体，例如偶联至基底的抗CD34和/或抗CD14抗体。
也可以获得富集的APC前体群体。获得这类富集的前体群体的方法是本领域已知的。例如，可以通过选择性去除粘附在基底上的细胞从组织来源中分离出富集的APC前体群体。使用诸如骨髓或外周血的组织来源，可以使用商业处理的塑料基底(例如，珠或磁珠)从细胞制品中去除粘附的单核细胞，以获得非粘附性APC前体富集的群体。
单核细胞APC前体也可以通过使用APC前体粘附基底从组织来源获得。例如，使通过例如白细胞分离术分离的外周血白细胞与具有高表面积:体积比的单核APC前体粘附基底接触，并分离粘附的单核APC前体。在另外的实施方案中，偶联的基底可以是具有高表面:体积比的颗粒状或纤维状基底，例如微珠、微载体珠、丸粒、颗粒、粉末、毛细管、微孔膜等。此外，颗粒或纤维状基底可以是玻璃、聚苯乙烯、塑料、玻璃涂覆的聚苯乙烯微珠等。
还可以在体外培养APC前体以供分化和/或扩充。APC前体的分化/扩充方法是本领域已知的。通常，可通过在至少一种诱导APC(例如树突细胞)分化/增殖的细胞因子的存在下培养前体来实现扩充。通常，这些细胞因子是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞/噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。另外，其他试剂可用于抑制培养物中非APC细胞类型的增殖和/或成熟，从而进一步富集APC前体群体。通常，此类试剂包括细胞因子，例如，IL-13、IL-4或IL-15等。
培养分离的APC前体群体并进行分化，以获得未成熟或成熟的APC。合适的组织培养基包括，例如但不限于
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RPMI 1640、DMEM、X-VIVO等。组织培养基通常补充有氨基酸、维生素、二价阳离子和细胞因子，以促进前体向APC表型的分化。通常，促进分化的细胞因子是GM-CSF和/或IL-4。
此外，在APC表型的扩充、分化和成熟期间，APC前体的培养物可以包括血浆以促进APC的发展。典型的血浆浓度约为5％。另外，例如在通过粘附至基底而分离APC前体的情况下，在粘附步骤期间可在培养基中包含血浆，以促进培养早期的CD14+表型。粘附过程中的典型血浆浓度约为1％或更高。
单核细胞APC前体可以培养任何合适的时间。在某些实施方案中，用于使前体分化为未成熟APC的合适的培养时间可以是约1天至约10天，例如约4天至约7天。可以通过本领域技术人员已知的方法，例如通过存在或不存在细胞表面标志物(例如，CD11c+、CD83低、CD86-/低、HLA-DR+)，来监测从前体分化未成熟APC。还可以在适当的组织培养基中培养未成熟的APC，以保持未成熟的APC处于进一步分化或抗原摄取、加工和呈递的状态。例如，未成熟的APC可以在GM-CSF和IL-4的存在下维持。
在一些实施方案中，APC前体可以在分化之前分离。在一些实施方案中，分离的群体可以富集或基本上富集APC前体。在一些实施方案中，用CD14特异性探针分离APC前体。在一个示例性的实施方案中，使用直接缀合至荧光分子(例如，FITC或PE)的CD14特异性探针，或用对CD14为特异性的未标记抗体和对第一抗体为特异性的标记的第二抗体，通过FACS检测表达CD14的细胞。也可以通过FACS分选将CD14+细胞与CD14低和CD14-细胞分离。可以参考例如PBMC来源的单核细胞上的CD14染色来确定CD14高阳性的门控。通常，CD14特异性结合剂是，例如，抗CD14抗体(例如，其单克隆或抗原结合片段)。许多适用于本发明的抗CD14抗体是技术人员公知的，并且许多可以商业购得。分离后可发生向未成熟APC(CD14阴性)的分化。
在另一个实施方案中，将CD14特异性探针偶联至基底，并且通过亲和力选择分离CD14+细胞。将包括CD14+细胞的细胞群体暴露于偶联的基底，并使CD14+细胞特异性粘附。然后从基底上洗去未粘附的CD14-细胞，然后洗脱粘附的细胞以获得基本上富集APC前体的分离的细胞群体。CD14特异性探针可以是，例如，抗CD14抗体。基底可以是例如可商购获得的组织培养板或珠子(例如，玻璃或磁珠)。使用基底偶联的表面标志物特异性的抗体来亲和分离细胞群体的方法是众所周知的。
在培养过程中，未成熟的APC可以任选地暴露于预定抗原。合适的预定抗原可包括希望对其进行T细胞调节的任何抗原。在一个实施方案中，未成熟的APC在前列腺特异性膜抗原(PSMA)的存在下培养，以用于癌症免疫治疗和/或肿瘤生长抑制。其他抗原可包括例如细菌细胞、病毒、部分纯化或纯化的细菌或病毒抗原、肿瘤细胞、肿瘤特异性或肿瘤相关抗原(例如，肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞膜制品、从肿瘤分离的抗原、融合蛋白、脂质体等)、在其表面表达抗原的重组细胞、自身抗原和其他任何抗原。任何抗原也可以作为肽或重组产生的蛋白质或其部分呈现。与抗原接触后，可以将细胞培养任何合适的时间，以允许抗原摄取和加工，以扩大抗原特异性APC群体等。
例如，在一个实施方案中，可以在抗原摄取后培养不成熟的APC，以促进不成熟的APC成熟为在MHC分子的环境中呈递抗原的成熟APC。APC成熟的方法是已知的。例如，可以通过在已知的成熟因子如细胞因子(例如，TNF-α、IL-1β或CD40配体)、细菌产物(例如，LPS或BCG)等的存在下培养来进行这样的成熟。可以通过本领域已知的方法，例如，通过测量细胞表面标志物的存在与否(例如CD83、CD86和MHC分子的上调)或使用例如寡核苷酸阵列检测成熟APC特异性mRNA或蛋白质的表达，来监测未成熟的APC向成熟APC的成熟。
任选地，可以在合适的组织培养基中培养未成熟的APC以扩充细胞群体和/或保持未成熟的APC处于用于进一步分化或抗原摄取的状态。例如，可以在GM-CSF和IL-4的存在下维持和/或扩充未成熟的APC。也可以在抗炎分子例如抗炎细胞因子(例如IL-10和TGF-β)的存在下培养未成熟的APC，以抑制未成熟的APC成熟。
在另一方面，分离的APC群体富集成熟的APC。通过在如上所述的成熟因子(例如，细菌产物和/或促炎细胞因子)的存在下培养分化的未成熟APC群体，从而诱导成熟，可以获得分离的成熟APC群体。可以通过去除CD14+细胞来分离未成熟的APC。
根据本发明的又一个方面，例如，可以在暴露于合适的抗原之前或之后通过冷冻保存来保存APC。可以使用的冷冻保存剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、异赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇、D-乳糖、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯和无机盐。受控的缓慢冷却速率可能是关键的。不同的冷冻保护剂和不同的细胞类型通常具有不同的最佳冷却速率。水变成冰的熔化阶段的热量通常应当是最小的。冷却过程可以通过使用例如可编程冷冻装置或甲醇浴程序来进行。可编程的冷冻设备允许确定最佳冷却速率，并有助于标准的可重复冷却。可编程控制速率的冷冻器，如Cryomed或Planar，允许将冷冻方案调整到所需的冷却速率曲线。
在彻底冷冻后，APC可以迅速转移到长期低温储存容器中。在典型的实施方案中，可以将样品在液氮(-196℃)或其蒸气(-165℃)中低温存储。对于造血干细胞，特别是来自骨髓或外周血的造血干细胞的操作、冷冻保存和长期保存的考虑因素和程序，在很大程度上适用于本发明的APC。
冷冻的细胞优选地快速解冻(例如在保持在37-41℃的水浴中)，并在解冻后立即冷却。为了防止细胞在解冻时结块，可能需要处理细胞。为了防止结块，可以使用各种程序，包括但不限于在冷冻之前和/或之后添加DNA酶、低分子量葡聚糖和柠檬酸盐、羟乙基淀粉等。如果冷冻保护剂对人体有毒，则应在融化的APC进行治疗性使用之前将其去除。除去冷冻保护剂的一种方法是稀释至极微小的浓度。一旦冷冻的APC已经融化并回收，就可以如本文关于非冷冻的APC所述将它们用于激活T细胞。
在一方面，用于T细胞激活的组合物包含已经耗尽一种或多种类型的免疫细胞的免疫细胞群体。例如，组合物可以包含已经耗尽表达一种或多种蛋白质，例如一种或多种细胞表面受体的一种或多种类型的免疫细胞的免疫细胞群体。在一些实施方案中，组合物包含来自生物样品的免疫细胞群体，该生物样品包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中该群体中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量与该生物样品中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量成比例地不同。例如，组合物可包含来自生物样品的免疫细胞群体，该生物样品包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中该群体中表达CD14的免疫细胞的量与该生物样品中表达CD14的免疫细胞的量成比例地不同。例如，组合物可包含来自生物样品的免疫细胞群体，该生物样品包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中该群体中表达CD25的免疫细胞的量与该生物样品中表达CD25的免疫细胞的量成比例地不同。例如，组合物可包含来自生物样品的免疫细胞群体，该生物样品包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中该群体中表达CD14和CD25的免疫细胞的量与该生物样品中表达CD14和CD25的免疫细胞的量成比例地不同。例如，组合物可包含来自生物样品的免疫细胞群体，其中该群体中表达CD14和CD25的免疫细胞的量成比例地小于在该生物样品中表达CD14和CD25的免疫细胞的量。
本文提供了一种制备用于癌症免疫疗法的细胞组合物的方法，其包括：I.制备负载抗原的抗原呈递细胞(APC)，其包括：(a)从用fms样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)预处理的受试者中获得外周血单核细胞(PBMC)；(b)使所述PBMC与以下物质离体接触：(i)多种癌症新抗原肽，或编码所述多种癌症新抗原肽的一种或多种多核苷酸，并且其中，每种癌症新抗原肽或其部分与由在该受试者中表达的HLA等位基因编码的蛋白质结合，(ii)用于激活细胞的刺激物，(iii)促进细胞离体生长和维持的试剂，从而获得细胞群体，以及(iv)用于从该细胞群体中减少或消耗CD11b+细胞的试剂，以获得CD11b低或CD11b耗尽的负载抗原的APC；II.使分离的T细胞与所述CD11b低或CD11b耗尽的负载抗原的APC离体接触；III.制备抗原引发的T细胞，以供用于癌症免疫疗法的细胞组合物使用。
本文提供了一种用于离体制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的方法，该方法包括：(a)从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；(b)在以下物质的存在下，将来自步骤(a)的APC和T细胞第一群体孵育第一时间段：FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；(c)扩充来自步骤(b)的经刺激的T细胞，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)来自步骤(b)(ii)的所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白。本文提供了一种方法，其包括将来自(c)的经扩充的细胞群体施用于所述人类受试者，其中来自步骤(c)的经扩充的细胞群体包含1x108至1x1011个总细胞。
在一些实施方案中，在分离PBMC或白细胞分离术前至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或1周用FLT3L预处理受试者。在一些实施方案中，在分离PBMC或白细胞分离术前至少约1周、2周、3周、4周或5周用FLT3L预处理受试者。
在一些实施方案中，所述细胞群体针对CD11c+细胞进行富集。在一些实施方案中，负载抗原的APC包含树突细胞(DC)。在一些实施方案中，负载抗原的APC包括类浆细胞树突细胞(pDC)。在一些实施方案中，负载抗原的APC包含CD1c+DC。在一些实施方案中，负载抗原的APC包含CD141+DC。在一些实施方案中，所述细胞群体包含巨噬细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞群体中减少或消耗CD19+细胞，以用于激活或富集新抗原激活的T细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞群体中减少或消耗CD11b+和CD19+细胞，以用于激活或富集新抗原激活的T细胞。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞群体中减少或消耗CD14+细胞，以用于制备和富集抗原激活的T细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞群体中减少或消耗CD25+细胞，以用于制备和富集抗原激活的T细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从细胞群体中减少或消耗CD19+、CD14+、CD25+或CD11b+细胞中的一种或多种，以用于激活或富集新抗原激活的T细胞。
在一些实施方案中，用于激活细胞的刺激物包括FL3TL。
在一些实施方案中，促进细胞离体生长和维持的试剂包括生长因子、细胞因子、氨基酸、补充剂或其组合。
在一些实施方案中，负载抗原的APC可以刺激T细胞2、3、4、5、6或7天。
在一些实施方案中，所述多种癌症新抗原肽中的每一种为8-30个氨基酸长。
在一些实施方案中，所述多种新抗原肽中的每一种都包含新抗原表位。在一些实施方案中，所述多种癌症新抗原肽包含2、3、4、5、6、7或8种新抗原肽；并且所述多种新抗原肽中的每一种都具有如前一节所述的新抗原肽特性。
在一些实施方案中，用于制备负载抗原的APC的新抗原肽是包含至少20个氨基酸，或至少30个氨基酸或至少40个氨基酸或至少50个氨基酸，或介于两者之间的任意数目的氨基酸的长肽。在一些实施方案中，用于制备负载抗原的APC的新抗原肽包含位于突变任一侧的侧翼的氨基酸，其促进新抗原肽的内源性加工，以提高向T细胞呈递的速率。
可以用几种方式设计较长的免疫原性肽。在一些实施方案中，当HLA结合肽被预测或已知时，较长的免疫原性肽可以由以下组成：(1)向每个相应基因产物的N-末端及C-末端延伸2-5个氨基酸的单个结合肽；或(2)一些或所有结合肽与每个结合肽的延伸序列的串接。在其他实施方案中，当测序揭示肿瘤中存在长(>10个残基)表位序列，例如新表位时(例如，由于导致新的肽序列的移码、通读或内含子包含)，较长的新抗原肽可由作为单个较长的肽或几个重叠的较长肽的整个新肿瘤特异性氨基酸段组成。在一些实施方案中，推测使用较长的肽允许患者细胞进行内源性加工，并且可以导致更有效的抗原呈递和T细胞应答诱导。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种肽，其中肽重叠并铺在长的新抗原肽上。
在一些实施方案中，所述多种新抗原肽中的每一种都包含相同的新抗原表位。在一些实施方案中，所述多种新抗原肽包含一个以上的新抗原表位。
在一些实施方案中，编码所述多种癌症新抗原肽的一种或多种多核苷酸是DNA。
在一些实施方案中，将编码所述多种癌症新抗原肽的一种或多种多核苷酸插入一种或多种哺乳动物表达载体中。
在一些实施方案中，编码所述多种癌症新抗原肽的一种或多种多核苷酸是信使RNA。
在一些实施方案中，本发明提供了包含经修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子。
在一些实施方案中，本发明提供了包含所述RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的基因治疗载体。
在一些实施方案中，本发明提供了包含以上这些的基因治疗方法和基因转录沉默方法。
在一些实施方案中，所述多核苷酸编码一种新抗原肽。
在一些实施方案中，所述一种多核苷酸编码一种以上的新抗原肽。
在一些实施方案中，所述多核苷酸是信使RNA。在一些实施方案中，每个信使RNA包含两个或更多个串联的新抗原肽的编码序列。
在一些实施方案中，每个信使RNA包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个串联的新抗原肽的编码序列。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在一些实施方案中，该mRNA是自扩增mRNA。在本发明的上下文中，mRNA可以通过DNA模板的体外转录生成。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。
可以改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，RNA可以被稳定化，并且其翻译通过一种或多种具有稳定作用和/或提高RNA翻译效率的修饰而增加。例如，在PCT/EP2006/009448中描述了这样的修饰，该文献通过引用并入本文。为了增加根据本发明使用的RNA的表达，可以在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内修饰该RNA，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，从而增加GC含量以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，从而增强在细胞中的翻译。
在一些实施方案中，mRNA可以包括多个新抗原表位。在一些实施方案中，可以使用长的多核糖核苷酸序列，其可以编码neo-ORF，例如，编码neo-ORF的突变GATA3序列。在一些情况下，将包含编码新抗原肽的序列的基因的大部分或甚至整个编码区的mRNA递送到免疫细胞中用于抗原的内源性加工和呈递。
在一些实施方案中，每个新抗原肽的编码序列长24-120个核苷酸。
在一些实施方案中，所述mRNA长50-10,000个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长100-10,000个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长200-10,000个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长50-5,000个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长100-5,000个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长100-1,000个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长300-800个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长400-700个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA长450-600个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA至少长200个核苷酸。在一些实施方案中，所述mRNA的长度大于250个核苷酸、大于300个核苷酸、大于350个核苷酸、大于400个核苷酸、大于450个核苷酸、大于500个核苷酸、大于550个核苷酸、大于600个核苷酸、大于650个核苷酸、大于700个核苷酸、大于750个核苷酸、大于800个核苷酸、大于850个核苷酸、大于900个核苷酸、大于950个核苷酸、大于1000个核苷酸、大于2000个核苷酸、大于3000个核苷酸、大于4000个核苷酸或大于5000个核苷酸。
在一些实施方案中，对编码一种或多种新抗原肽的mRNA进行修饰，其中该修饰涉及5’-UTR。在一些实施方案中，该修饰涉及提供在5’-UTR中具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’端上发现的帽结构，并且通常由经由不寻常的5’至5’三磷酸键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一些实施方案中，这种鸟苷在7位上被甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽、7-甲基鸟苷帽(m G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构的5’-帽类似物，并且被修饰为具有稳定RNA和/或增强体内和/或细胞内的RNA翻译(如果与RNA附接)的能力。在一些实施方案中，mRNA被共转录地加帽。
在一些实施方案中，编码一种或多种新抗原肽的mRNA包含含有聚A尾的3’-UTR。在一些实施方案中，聚A尾的长度为100-200bp。在一些实施方案中，聚A尾长于20个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于50个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于60个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于70个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于80个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于90个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于100个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于110个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于120个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于130个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于140个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于150个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于160个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于170个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于180个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于190个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于200个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于210个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于220个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于230个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于100个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于240个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾长于100个核苷酸。在一些实施方案中，聚A尾约为250个核苷酸。
在一些实施方案中，聚A尾包含100-250个腺苷单元。在一些实施方案中，聚A尾包含120-130个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾包含120个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾包含121个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾包含122个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾包含123个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾包含124个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾包含125个腺嘌呤单元。在一些实施方案中，聚A尾为129个碱基。
在一些实施方案中，两个连续新抗原肽的编码序列被间隔区或接头隔开。
在一些实施方案中，所述间隔区或接头包含多达5000个核苷酸残基。示例性间隔区序列是GGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGC。另一个示例性间隔区序列是GGCGGCAGCCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGC。另一个示例性间隔区序列是GGCGTCGGCACC。另一个示例性间隔区序列是CAGCTGGGCCTG。另一个示例性间隔区序列是编码赖氨酸的序列，如AAA或AAG。另一个示例性间隔区序列是CAACTGGGATTG。
在一些实施方案中，所述mRNA包含一种或多种附加结构，以增强APC对抗原表位的加工和呈递。
在一些实施方案中，所述接头或间隔区可含有切割位点。切割位点确保将包含表位序列串的蛋白质产物切割成单独的表位序列以供呈递。优选的切割位点与某些表位相邻放置，以避免无意中切割序列内的表位。在一些实施方案中，编码表位串的mRNA上的表位和切割区的设计为非随机的。
在某些实施方案中，将编码本发明的新抗原肽的mRNA施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，待施用的mRNA包含至少一个修饰的核苷-磷酸。
在一些实施方案中，由人工抗原呈递细胞用新抗原肽激活T细胞。在一些实施方案中，使用人工支架用新抗原肽激活T细胞，所述人工支架负载有与MHC抗原偶联的新抗原肽，该新抗原肽可以以高亲和力结合该MHC抗原。
在一些实施方案中，所述附加结构包括编码来自蛋白质的特定结构域，其选自MITD、SP1和第10个纤连蛋白结构域：10FnIII。
在一些实施方案中，将来源于外周血或白细胞分离术的细胞与多种癌症新抗原肽或编码所述多种癌症新抗原肽的一种或多种多核苷酸接触一次或一次以上，以制备负载抗原的APC。
在一些实施方案中，所述方法包括将一种或多种APC制品中的APC与包含至少一种细胞因子或生长因子的第一介质一起孵育第一时间段。
在一些实施方案中，所述方法包括将一种或多种APC制品与至少一种肽一起孵育第二时间段。
在一些实施方案中，富集的细胞进一步包括CD1c+细胞。
在一些实施方案中，所述细胞群体针对CD11c+和CD141+细胞进行富集。
在一些实施方案中，所述包含负载抗原的APC的细胞群体包含多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的CD11c+细胞。
在一些实施方案中，所述包含负载抗原的APC的细胞群体包含少于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、20％、10％、8％、7％、6％、5％、4％或更少的表达CD11b+的细胞。
在一些实施方案中，所述包含负载抗原的APC的细胞群体包含多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的为CD11c+的新抗原肽表达细胞。
在一些实施方案中，所述包含负载抗原的APC的细胞群体包含多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的作为CD11c+CD1c+或CD141+细胞的新抗原肽表达细胞。
在一些实施方案中，所述负载新抗原的APC包括成熟APC。
在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得生物样品，该生物样品包含至少一种APC和至少一种PBMC或至少一种T细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括从生物样品中消耗表达CD14和/或CD25和/或CD19的细胞，从而获得CD14和/或CD25和/或CD19细胞耗尽的样品。
在一些实施方案中，所述方法包括将CD14和/或CD25和/或CD19细胞耗尽的样品与FLT3L一起孵育第一时间段。
在一些实施方案中，所述方法包括将至少一种肽与CD14和/或CD25和/或CD19细胞耗尽的样品一起孵育第二时间段，从而获得第一成熟APC肽负载的样品。
使用负载新抗原的APC制备新抗原激活的T细胞
在一些实施方案中，将通过上述方法制备的负载新抗原的APC(APC)与T细胞一起孵育，以获得抗原激活的T细胞。该方法可包括生成至少一种抗原特异性T细胞，其中该抗原是新抗原。在一些实施方案中，生成至少一种抗原特异性T细胞包括生成多种抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，T细胞获自来自受试者的生物样品。
在一些实施方案中，T细胞获自来自衍生出APC的同一受试者的生物样品。在一些实施方案中，T细胞获自来自与衍生出APC的受试者不同的受试者的生物样品。
在一些实施方案中，APC和/或T细胞来源于作为外周血单核细胞(PBMC)的生物样品。在一些实施方案中，APC和/或T细胞来源于作为白细胞分离样品的生物样品。
在一些实施方案中，所述APC包括树突细胞(DC)。
在一些实施方案中，所述APC来源于CD14+单核细胞，或是CD14富集的APC，或是CD141富集的APC。
在一些实施方案中，所述CD14+单核细胞从包含外周血单核细胞(PBMC)的来自受试者的生物样品中富集。
在一些实施方案中，所述APC是PBMC。在一些实施方案中，该PBMC是新鲜分离的PBMC。在一些实施方案中，该PBMC是冷冻的PBMC。在一些实施方案中，该PBMC是从受试者或患者中分离的自体PBMC。
在一些实施方案中，PBMC负载有抗原，其中所述抗原可以是肽或多肽或编码所述肽和多肽的多核苷酸，如mRNA。PBMC(单核细胞，DC、吞噬细胞)可以通过吞噬作用吸收抗原，加工并将其呈递在表面上以供T细胞激活。负载在PBMC上的肽或多肽可以补充有佐剂以增加免疫原性。在一些实施方案中，PBMC负载有核酸抗原。核酸抗原可以是mRNA的形式，包含编码一种或多种抗原的序列。在一些实施方案中，mRNA抗原加载不需要补充佐剂，因为，例如，RNA可以自行充当佐剂。
在一些实施方案中，PBMC从冷冻样品中直接分离或解冻，并经受与一种或多种抗原如新抗原、或包含新抗原的组合物、或编码所述一种或多种抗原的一种或多种核酸或多核苷酸的孵育。在一些实施方案中，在使PBMC暴露于一种或多种抗原或编码所述一种或多种抗原的核酸前，PBMC样品不进一步培养以供分化或经受PBMC内的一种或多种细胞组分的进一步成熟(例如，抗原呈递细胞的成熟，或单核细胞向树突细胞的分化)。在一些实施方案中，在使细胞暴露于一种或多种抗原或编码所述一种或多种抗原的核酸或与之一起孵育之前，从新鲜分离的PBMC细胞群体或新鲜解冻的PBMC群体中消耗或去除一种或多种细胞类型。在一些实施方案中，从PBMC中消耗CD14+细胞。在一些实施方案中，从PBMC中消耗CD25+细胞。在一些实施方案中，从PBMC中消耗CD11b+细胞。在一些实施方案中，在与一种或多种抗原或编码所述一种或多种抗原的一种或多种核酸一起孵育之前，从PBMC中消耗CD14+和CD25+细胞。在一些实施方案中，从PBMC中消耗CD11b+和/或CD14+和/或CD25+细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过从来自人类受试者的PBMC样品中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞来制备肿瘤抗原特异性T细胞，该样品中包含的未成熟树突细胞(DC)的百分比与该人类受试者的外周血中未成熟DC的百分比大致相同。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过从来自人类受试者的PBMC样品中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞来制备肿瘤抗原特异性T细胞，该样品中包含的成熟DC的百分比与该人类受试者的外周血中成熟DC的百分比大致相同。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过从来自人类受试者的PBMC样品中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞来制备肿瘤抗原特异性T细胞，该样品中未成熟DC与成熟DC之比与该人类受试者的外周血中未成熟DC与成熟DC之比大致相同。在一些实施方案中，本文提供的方法包括通过从来自人类受试者的PBMC样品中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞来制备肿瘤抗原特异性T细胞，该样品尚未经历未成熟DC成熟为成熟DC的步骤。
在一些实施方案中，用一种或多种细胞因子或生长因子刺激CD14+单核细胞。
在一些实施方案中，一种或多种细胞因子或生长因子包括GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、聚I:C或其组合。
在一些实施方案中，CD14+单核细胞来自包含PBMC的第二生物样品。
在一些实施方案中，第二生物样品来自同一受试者。
在一些实施方案中，所述生物样品包含外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞在包含IL-7、IL-15、吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO)抑制剂、抗PD-1抗体、IL-12或其组合的介质中进行刺激。
在一些实施方案中，该IDO抑制剂是epacadostat、navoximod、1-甲基色氨酸或其组合。
在一些实施方案中，在获得用于制备APC和/或T细胞的生物样品之前向受试者施用FLT3L。
在一些实施方案中，如本公开的前面部分所述，从来自受试者的生物样品获得T细胞。
在一些实施方案中，所述生物样品从受试者新鲜获得或是冷冻的样品。
在一些实施方案中，所述孵育在至少一种细胞因子或生长因子的存在下进行，其包括GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IL-15、IFN-γ、IFN-α、IL-15、R848、LPS、ss-rna40、聚I:C或其任意组合。
在一些实施方案中，方法包括用IL-7、IL-15或其组合刺激T细胞。在一些实施方案中，方法包括在IDO抑制剂、PD-1抗体或IL-12的存在下用IL-7、IL-15或其组合刺激T细胞。在一些实施方案中，在所述一个或多个肿瘤抗原表位序列或负载有所述一个或多个肿瘤抗原表位序列的APC或负载有(例如表达)编码所述一个或多个肿瘤抗原表位序列的核酸序列(如mRNA序列)的APC、一种或多种细胞因子或生长因子(包括GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IL-15、IFN-γ、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、聚I:C、FLT3L或其组合)的存在下，在合适的离体T细胞生长条件下，扩充经刺激的T细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括将抗原特异性T细胞施用于受试者。
在一些实施方案中，所述方法包括在包含至少一种细胞因子或生长因子的培养基的存在下将如先前部分所述制备的APC与T细胞一起孵育，以生成新抗原激活的T细胞。
在一些实施方案中，所述孵育包括将所述APC制品的第一APC制品与所述T细胞孵育超过7天。在一些实施方案中，孵育的T细胞是在APC制品、细胞因子和生长因子的存在下在体外扩充超过7天的经刺激的T细胞。
在一些实施方案中，所述孵育包括将APC制品的第一APC制品与T细胞一起孵育超过7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
在一些实施方案中，所述一个或多个时间段中的第一时间段为大约1、2、3、4、5、6、7、8或9天。
在一些实施方案中，所述单独的时间段的总时间段少于28天。在一些实施方案中，所述单独的时间段的总时间段为20-27天。在一些实施方案中，所述单独时间段的总时间段为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39天。
在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第一APC制品与T细胞一起孵育超过7天。在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第一APC制品与T细胞一起孵育超过7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第一APC制品与T细胞一起孵育7-20、8-20、9-20、10-20、11-20或12-20天。在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第一APC制品与T细胞一起孵育约10-15天。
在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第二APC制品与T细胞一起孵育5-9天。在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第二APC制品与T细胞一起孵育5、6、7、8或9天。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述第三时间段之后且开始所述第四时间段之前去除所述第二介质的所述一种或多种细胞因子或生长因子。
在一些实施方案中，方法包括将APC制品的第三APC制品与T细胞一起孵育5-9天。在一些实施方案中，该方法包括将APC制品的第三APC制品与T细胞一起孵育5、6、7、8或9天。
在一些实施方案中，所述方法包括将APC制品的第一APC制品与T细胞一起孵育约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22天，将APC制品的第二种APC制品与T细胞一起孵育约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22天，并将APC制品的第三种APC制品与T细胞一起孵育约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22天。
在一些实施方案中，所述方法离体进行。在一些实施方案中，T细胞在含有细胞因子的培养基中培养。在一些实施方案中，细胞因子的实例包括IL-7。在一些实施方案中，细胞因子的实例包括IL-15。在一些实施方案中，细胞因子的实例包括IL-7和IL-15。在一些实施方案中，将T细胞在包含IL-7和/或IL-15的培养基中培养。在一些实施方案中，T细胞培养物或培养基中的细胞因子的终浓度为至少0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL或20ng/mL。在一些实施方案中，T细胞培养物或培养基中的IL-7的终浓度为至少0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL或20ng/mL。在一些实施方案中，T细胞培养物或培养基中的IL-15的终浓度为至少0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL或20ng/mL。在一些实施方案中，将T细胞在进一步包含FLT3L的培养基中培养。在一些实施方案中，T细胞培养物或培养基中的FLT3L的终浓度为至少1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、12ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL或200ng/mL。在一些实施方案中，将T细胞在含有FLT3L的培养基中孵育、诱导或刺激第一时间段。在一些实施方案中，将T细胞在含有另外添加的FLT3L的培养基中孵育、诱导或刺激第二时间段。在一些实施方案中，将T细胞在含有额外添加的FLT3L的培养基中孵育、诱导或刺激第三时间段。在一些实施方案中，将T细胞在含有额外添加的FLT3L的培养基中孵育、诱导或刺激第四、第五或第六时段，在每个时段中用新鲜添加的FLT3L。
在一些实施方案中，T细胞在新抗原，例如由APC呈递的新抗原的存在下培养，其中培养基包含高钾[K]+含量。在一些实施方案中，在与APC或T细胞孵育期间，在培养基中存在高[K]+含量的情况下培养T细胞至少一段时间。在一些实施方案中，在与APC或T细胞孵育期间，培养基中的[K]+含量改变至少一段时间。在一些实施方案中，培养基中的含量在T细胞离体培养期间保持恒定。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥5mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥6mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥7mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥8mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥9mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥10mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥11mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥12mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥13mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥14mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥15mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥16mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥17mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥18mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥19mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥20mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥22mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥25mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥30mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥35mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量≥40mM。在一些实施方案中，T细胞培养基中的[K]+含量约为40mM。
在一些实施方案中，在T细胞与新抗原孵育期间的至少一段时间，T细胞培养基中的[K]+含量约为40mM。在一些实施方案中，新抗原可由负载新抗原的APC呈递。在一些实施方案中，在[K]+的存在下测试T细胞的T效应子功能、CD8+细胞毒性、细胞因子产生和记忆表型。在一些实施方案中，在高[K]+的存在下生长的T细胞表达效应T细胞表型。在一些实施方案中，在高[K]+的存在下生长的T细胞表达记忆细胞标志物。在一些实施方案中，在高[K]+的存在下生长的T细胞不表达T细胞耗尽标志物。
在一些实施方案中，经刺激的T细胞是包含用包含新抗原肽-MHC复合物的APC刺激的活化T细胞的免疫细胞群体。在一些实施方案中，方法可以包括将来自生物样品的免疫细胞群体与包含肽-MHC复合物的APC一起孵育，从而获得经刺激的免疫细胞样品；确定经刺激的免疫细胞样品中至少一种免疫细胞的一种或多种细胞标志物的表达；以及确定经刺激的免疫细胞样品中至少一种免疫细胞与肽-MHC复合物的结合；其中确定某些细胞表面标志物或其他决定性标志物如细胞内因子或释放的物质如细胞因子等的表达和确定与新抗原肽-MHC复合物的结合同时进行。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞标志物包括TNF-α、IFN-γ、LAMP-1、4-1BB、IL-2、IL-17A、酶B、PD-1、CD25、CD69、TIM3、LAG3、CTLA-4、CD62L、CD45RA、CD45RO、FoxP3或其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞标志物包括细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞标志物包括脱粒标记物。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞标志物包括细胞表面标志物。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞标志物包括蛋白质。在一些实施方案中，确定刺激的免疫细胞样品的至少一种免疫细胞与肽-MHC复合物的结合包括确定刺激的免疫细胞样品的至少一种免疫细胞与包含所述肽和肽-MHC复合物的MHC的MHC四聚体的结合。在一些实施方案中，该MHC是I类MHC或II类MHC。在一些实施方案中，肽-MHC复合物包含一种或多种标记物。
在一些实施方案中，T细胞的激活通过检测活化的T细胞释放细胞因子来验证。在一些实施方案中，该细胞因子是以下一种或多种：TNF-α、IFN-γ或IL-2。在一些实施方案中，T细胞的激活通过其特异性抗原结合和细胞因子释放来验证。在一些实施方案中，T细胞的激活通过其在体外杀死肿瘤细胞的能力来验证。活化的T细胞的样品可用来验证T细胞的活化状态。在一些实施方案中，从T细胞培养物中取出来自T细胞的样品，以通过流式细胞术确定细胞组成和活化状态。
在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为5％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为7％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为10％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为12％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为15％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为20％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为25％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为30％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为40％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为50％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为60％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为70％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为80％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比约为90％。
在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为5％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为7％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为10％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为12％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为15％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为20％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为25％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为30％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为40％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比约为50％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+T细胞的百分比约为60％。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性CD8+T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的约70％。
在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD4+ T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些实施方案中，所述生物样品中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至多约0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。
在一些实施方案中，所述生物样品中所述至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至多约0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。
在一些实施方案中，所述生物样品中所述至少一种抗原特异性CD4+ T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至多约0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。
在一些实施方案中，所述抗原是新抗原、肿瘤相关抗原、过表达的抗原、病毒抗原、次要组织相容性抗原或其组合。
在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的数目是至少约1x10^6、2x10^6、5x10^6、1x10^7、2x10^7、5x10^7、1x10^8、2x10^8或5x10^8个抗原特异性CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD4+ T细胞的数目是至少约1x10^6、2x10^6、5x10^6、1x10^7、2x10^7、5x10^7、1x10^8、2x10^8或5x10^8个抗原特异性CD4+ T细胞。
药物组合物
本文提供了包含免疫细胞群体的组合物(例如药物组合物)。所述组合物可以包含至少一种包含T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞。所述组合物可以包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)。
可以使用一种或多种生理学上可接受的载体来配制药物组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性剂加工成可药用的制品。合适的制剂可取决于选定的给药途径。任何公知的技术、载体和赋形剂均可作为如本领域所理解的合适的技术、载体和赋形剂。
在一些情况下，将药物组合物配制成基于细胞的治疗剂，例如T细胞治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物包含基于肽的疗法、基于核酸的疗法、基于抗体的疗法和/或基于细胞的疗法。在一些实施方案中，药物组合物包含基于肽的治疗剂或基于核酸的治疗剂，其中该核酸编码多肽。在一些实施方案中，药物组合物包含基于肽的治疗剂或基于核酸的治疗剂，其中该核酸编码多肽；其中该基于肽的治疗剂或基于核酸的治疗剂包含在细胞中，其中该细胞是T细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含基于抗体的治疗剂。组合物可包含对两种或更多种免疫原性抗原或新抗原肽具有特异性的T细胞。
在一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含(a)包含来自生物样品的T细胞的免疫细胞群体，其中所述T细胞包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞是APC刺激的T细胞并包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，其中所述APC是FLT3L刺激的APC；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)来自生物样品的免疫细胞群体，所述生物样品包含至少一种抗原特异性T细胞，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，和(b)药学上可接受的赋形剂；其中群体中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量与生物样品中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的数量成比例地不同。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含至少一种APC刺激的T细胞。在一些实施方案中，所述群体中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量成比例地小于所述生物样品中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量。在一些实施方案中，所述群体中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量成比例地大于所述生物样品中表达CD14和/或CD25的免疫细胞的量。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含至少一种CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含至少一种CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含至少一种CD4富集的T细胞。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含至少一种CD8富集的T细胞。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含记忆T细胞。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含记忆CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述至少一种抗原特异性T细胞包含记忆CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中所述至少一种抗原特异性T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，所述组合物中至少一种抗原特异性CD8+ T细胞的百分比为总CD4+ T细胞、总CD8+ T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
除了活性成分以外，药物组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员公知的其他物质。这样的物质应该是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质将取决于给药途径。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂是那些在所用剂量和浓度下对接受者无毒的载体、赋形剂或稳定剂，并且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如
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或聚乙二醇(PEG)。
可接受的载体对施用的患者而言在生理学上是可接受的，并且保持所施用的化合物的治疗特性。可接受的载体及其制剂一般性地描述于例如，Remington’pharmaceuticalSciences(第18版,A.Gennaro,Mack Publishing Co.,Easton,PA 1990)中。载体的一个实例是生理盐水。药学上可接受的载体是参与从一个器官或身体部分的给药部位到另一个器官或身体部分，或在体外测定系统中，携带或转运主题化合物的药学上可接受的物质、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。可接受的载体与制剂的其他成分相容，并且对被施用的受试者无害。可接受的载体也不应改变新抗原的比活性。
在一个方面，本文提供了药学上可接受的或生理学上可接受的组合物，其包含与药物施用相容的溶剂(水性或非水性)、溶液、乳液、分散介质、包衣材料、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。因此，药物组合物或药物制剂是指适合于在受试者中药物使用的组合物。组合物可配制成与特定给药途径(即全身或局部)相容。因此，组合物包含适合于通过各种途径给药的载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，组合物可以进一步包含可接受的添加剂，以改善免疫细胞在组合物中的稳定性。可接受的添加剂可以不改变免疫细胞的比活性。可接受的添加剂的实例包括但不限于糖，如甘露醇、山梨醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。可接受的添加剂可以与可接受的载体和/或赋形剂如右旋糖组合。或者，可接受的添加剂的实例包括但不限于用来增加肽的稳定性并减少溶液的胶凝的表面活性剂，如聚山梨酯20或聚山梨酯80。表面活性剂可以以溶液的0.01％至5％的量添加至组合物中。这类可接受的添加剂的添加增加了组合物在储存中的稳定性和半衰期。
药物组合物可以例如通过注射施用。用于注射的组合物包括水溶液(其为水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。例如，可通过使用诸如卵磷脂等涂层，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持流动性。抗细菌剂和抗真菌剂包括，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。可在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。所得的溶液可以被包装以供原样使用，或冻干；冻干的制品随后可在施用前与无菌溶液合并。对于静脉内注射，或在患处注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。可通过将所需量的活性成分与以上列举的一种成分或成分的组合(如果需要)一起并入合适的溶剂中，然后过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性成分并入含有碱性分散介质和以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥，该方法从其先前过滤除菌的溶液得到活性成分加任何附加所需成分的粉末。
例如，组合物可以常规地静脉内施用，例如通过注射单位剂量。对于注射，活性成分可以是肠胃外可接受的水溶液的形式，其基本不含热原，并具有合适的pH、等渗性和稳定性。可以使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。另外，组合物可经由雾化施用。
当考虑将组合物用于药品或本文提供的任何方法时，预期该组合物可基本不含热原，从而使得该组合物在施用于人类患者时不会引起炎性反应或不安全的变态反应。测试组合物的热原以及制备基本不含热原的组合物是本领域普通技术人员公知的，并且可以使用可商购获得的试剂盒来完成。
可接受的载体可含有充当稳定剂、增加或延迟吸收或者增加或延迟清除的化合物。这样的化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；低分子量蛋白质；减少肽的清除或水解的组合物；或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲液。延迟吸收的试剂包括，例如，单硬脂酸铝和明胶。去污剂也可用来稳定或增加或减少药物组合物(包括脂质体载体)的吸收。为了防止被消化，可将化合物与组合物复合，以使其对酸和酶促水解具有抗性，或者可将化合物在适当的抗性载体如脂质体中复合。保护化合物免遭消化的手段是本领域已知的(例如，Fix(1996)Pharm Res.13:1760 1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119135；和美国专利5,391,377)。
组合物可以以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力以及期望的结合能力的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且对于每个个体是特定的。用于初始施用和加强注射的合适方案也是不同的，但典型的是先初始施用，然后通过随后的注射或其他施用以一个或多个小时的间隔进行重复给药。或者，考虑足以维持血液浓度的连续静脉内输注。
在一些实施方案中，本发明涉及一种免疫原性组合物，例如能够引发新抗原特异性应答(例如，体液或细胞介导的免疫应答)的药物组合物。在一些实施方案中，该免疫原性组合物包含与肿瘤特异性抗原或新抗原相对应的本文所述的新抗原治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物能够引起特异性细胞毒性T细胞应答、特异性辅助T细胞应答或B细胞应答。
在一些实施方案中，抗原多肽或多核苷酸可以作为含有这类多肽或多核苷酸的抗原呈递细胞(例如，树突细胞)而提供。在其他实施方案中，这类抗原呈递细胞用来刺激用于患者的T细胞。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。在相关实施方案中，该树突细胞是用新抗原肽或核酸脉冲的自体树突细胞。该新抗原肽可以是产生适当T细胞应答的任何合适的肽。在一些实施方案中，该T细胞是CTL。在一些实施方案中，该T细胞是HTL。因此，本公开的一个实施方案是一种免疫原性组合物，其含有至少一种用一种或多种本文所述新抗原多肽或多核苷酸脉冲或加载的抗原呈递细胞(例如树突细胞)。在一些实施方案中，这样的APC是自体的(例如，自体树突细胞)。或者，从患者中分离的外周血单核细胞(PBMC)可以离体加载新抗原肽或多核苷酸。在相关实施方案中，将这样的APC或PBMC注射回患者体内。所述多核苷酸可以是能够转导树突细胞的任何合适的多核苷酸，从而导致新抗原肽的呈递和免疫的诱导。在一些实施方案中，这样的抗原呈递细胞(APC)(例如，树突细胞)或外周血单核细胞(PBMC)用来刺激T细胞(例如，自体T细胞)。在相关实施方案中，该T细胞是CTL。在其他相关的实施方案中，该T细胞是HTL。在一些实施方案中，该T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，该T细胞是CD4+T细胞。然后将这样的T细胞注射到患者体内。
在一些实施方案中，将CTL注射到患者体内。在一些实施方案中，将HTL注射到患者体内。在一些实施方案中，将CTL和HTL均注射到患者体内。任一治疗剂的施用可以同时或依次且以任何顺序进行。
在一些实施方案中，本文所述的用于治疗性处置的药物组合物(例如免疫原性组合物)可被配制用于肠胃外、局部、经鼻、口服或外部给药。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物通过肠胃外施用，例如静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。在一些实施方案中，该组合物可以肿瘤内施用。可以在手术切除部位施用该组合物以诱导对肿瘤的局部免疫应答。在一些实施方案中，本文描述了用于肠胃外施用的组合物，其包含新抗原肽的溶液，并且将免疫原性组合物溶解或悬浮在可接受的载体例如水性载体中。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的公知灭菌技术灭菌，或者可以过滤除菌。所得的水溶液可以被包装以供原样使用，或冻干，在施用前将冻干的制品与无菌溶液合并。该组合物可含有为接近生理条件所需的药学上可接受的辅助性物质，如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
佐剂增加对抗原的免疫应答的能力通常体现为免疫介导的反应的显著增加或疾病症状的减少。例如，体液免疫的增加可以体现为针对抗原的抗体滴度的显著增加，并且T细胞活性的增加可以体现为增加的细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌。佐剂还可以改变免疫应答，例如，通过将主要为体液或2型T辅助细胞的应答改变为主要为细胞或1型T辅助细胞的应答。
合适的佐剂是本领域已知的(参见WO2015/095811)，并且包括但不限于聚(I:C)、聚-ICLC、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
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载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒小体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、衍生自皂苷的Aquila的QS21刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物以及其他专有佐剂，如Ribi的Detox.Quil或Superfos。已经描述了几种对树突细胞特异性的免疫佐剂(Dupuis M等人,Cell Immunol.1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92:3-11)(Mosca等人,Frontiers in Bioscience,2007；12:4050-4060)(Gamvrellis等人,Immunol&Cell Biol.2004；82:506-516)。也可以使用细胞因子。几种细胞因子与影响树突细胞向淋巴组织迁移(例如TNF-α)、加速树突细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1β、IL-4、IL-6和CD40L)(美国专利5,849,589，其通过引用整体并入本文)以及充当免疫佐剂(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人,J Immunother EmphasisTumor Immunol.1996(6):414-418)直接相关。
还报道了CpG免疫刺激性寡核苷酸在治疗环境中增强佐剂的效果。不受理论束缚，CpG寡核苷酸通过经由Toll样受体(TLR)(主要是TLR9)激活先天(非适应性)免疫系统起作用。CpG触发的TLR9活化增强对多种抗原的抗原特异性体液和细胞应答，该抗原包括肽或蛋白质抗原、活病毒或杀死的病毒、树突细胞免疫原性药物组合物、自体细胞免疫原性药物组合物和预防性及治疗性免疫原性药物组合物二者中的多糖缀合物。重要的是，它增强了树突细胞的成熟和分化，从而导致增强的TH1细胞的活化和强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成，即使在不存在CD4+ T细胞帮助的情况下。即使在诸如明矾或不完全弗氏佐剂(IFA)等通常促进TH2偏倚的佐剂的存在下，由TLR9刺激所诱导的TH1偏倚也得以维持。当与其他佐剂一起配制或共同施用或在制剂如微粒、纳米颗粒、脂质乳剂或类似制剂中时，CpG寡核苷酸显示出甚至更大的佐剂活性，这对于在抗原相对较弱时诱导强烈应答尤其有用。它们还可以加速免疫应答并使抗原剂量能够降低，在一些试验中与不含CpG的全剂量免疫原性药物组合物具有相当的抗体应答(Arthur M.Krieg,Nature Reviews,Drug Discovery,5,2006年6月,471-484)。美国专利6,406,705描述了组合使用CpG寡核苷酸、非核酸佐剂和抗原来诱导抗原特异性免疫应答。一种可商购获得的CpG TLR9拮抗剂是Mologen(Berlin,DE)的dSLIM(双茎环免疫调节剂)，其为本文所述的药物组合物的组分。还可以使用其他TLR结合分子，如RNA结合TLR7、TLR8和或TLR9。
有用的佐剂的其他实例包括但不限于化学修饰的CpG(例如CpR，Idera)、聚(I和/或聚C)(例如聚I:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA、针对TLR8的ssRNA40以及免疫活性小分子和抗体，如环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐珠单抗、西乐葆(Celebrex)、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、ZD2171、AZD2171、伊匹木单抗、曲美木单抗和SC58175，它们可以治疗性地和/或作为佐剂起作用。可用于本发明上下文中的佐剂和添加剂的量和浓度可由技术人员容易地确定，而无需过多的实验。另外的佐剂包括集落刺激因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭)。
在一些实施方案中，根据本公开的免疫原性组合物可包含超过一种不同的佐剂。此外，本发明包括药物组合物，其包含任何佐剂物质，包括上述任何佐剂及其组合。在一些实施方案中，该免疫原性组合物包含新抗原治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)，并且佐剂可以以任何合适的顺序单独施用。
脂化可以分为几种不同的类型，如N-肉豆蔻酰化、棕榈酰化、GPI-锚添加、异戊烯化和几种其他类型的修饰。N-肉豆蔻酰化是肉豆蔻酸酯(C14饱和酸)与甘氨酸残基的共价附接。棕榈酰化是长链脂肪酸(C16)与半胱氨酸残基的硫酯连接。GPI-锚添加是通过酰胺键的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接。异戊烯化是类异戊二烯脂质(例如法呢基(C-15)、香叶酰香叶酰(C-20))与半胱氨酸残基的硫醚连接。其他类型的修饰可包括通过半胱氨酸的硫原子的S-二酰基甘油的附接、经由丝氨酸或苏氨酸残基的O-辛酰基缀合、与半胱氨酸残基的S-archaeol缀合以及胆固醇附接。
用于生成脂化肽的脂肪酸可包括C2至C30饱和的、单不饱和的或多不饱和的脂肪酰基。示例性脂肪酸可包括棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基和癸酰基。在一些情况下，具有佐剂性质的脂质部分附接至目的多肽，以在不存在外源佐剂的情况下引发或增强免疫原性。脂化肽或脂肽可以被称为自身佐剂脂肽。上文和本文其他地方描述的任何脂肪酸可以引发或增强目的多肽的免疫原性。可以引发或增强免疫原性的脂肪酸可包括棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基和癸酰基。
可以将诸如裸肽或脂化肽的多肽并入脂质体中。有时，可以将脂化肽并入脂质体中。例如，脂化肽的脂质部分可以自发地整合到脂质体的脂双层中。因此，脂肽可以呈现于脂质体的“表面”上。适合并入制剂中的示例性脂质体包括但不限于多层囊泡(MLV)、寡层囊泡(OLV)、单层囊泡(UV)、小单层囊泡(SUV)、中等尺寸单层囊泡(MUV)、大单层囊泡(LUV)、巨单层囊泡(GUV)、多泡囊泡(MVV)、通过反相蒸发法制备的单层或寡层囊泡(REV)、通过反相蒸发法制备的多层囊泡(MLV-REV)、稳定的多层囊泡(SPLV)、冷冻和解冻的MLV(FATMLV)、通过挤出法制备的囊泡(VET)、通过弗式压碎器制备的囊泡(FPV)、通过融合制备的囊泡(FUV)、脱水-再水化囊泡(DRV)和泡沫体(BSV)。
取决于制备方法，脂质体可以是单层或多层的，并且可以在尺寸上不等，直径范围为约0.02μm至大于约10μm。脂质体可以吸附许多类型的细胞，然后释放并入的试剂(例如，本文所述的肽)。在一些情况下，脂质体与靶细胞融合，由此脂质体的内容物随后排空到靶细胞中。脂质体可以被吞噬细胞内吞。内吞作用之后可以是脂质体脂质的溶酶体内降解和包封剂的释放。
本文提供的脂质体还可包含载体脂质。在一些实施方案中，该载体脂质是磷脂。能够形成脂质体的载体脂质包括但不限于二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(PC；卵磷脂)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)。其他合适的磷脂还包括二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)；二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)等或其组合。在一些实施方案中，脂质体还包含调节脂质体形成的甾醇(例如胆固醇)。载体脂质可以是任何已知的非磷酸极性脂质。
可以使用已知的技术将药物组合物包封在脂质体内。可生物降解的微球也可以用作本发明药物组合物的载体。
药物组合物可以在脂质体或微球(或微粒)中施用。制备用于施用于患者的脂质体和微球的方法是本领域技术人员已知的。基本上，将材料溶解在水溶液中，加入适当的磷脂和脂质以及表面活性剂(如果需要)，并且按照需要对材料进行透析或超声处理。
由聚合物或蛋白质形成的微球体是本领域技术人员公知的，并且可以适合于通过胃肠道直接进入血流。或者，可以并入化合物并植入微球或微球复合物，以供在数天至数月的时间内缓慢释放。
基于细胞的免疫原性药物组合物也可以施用于受试者。例如，基于抗原呈递细胞(APC)的免疫原性药物组合物可以使用如本领域所理解的任何已知的技术、载体和赋形剂配制。APC包括单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。有时，基于APC的免疫原性药物组合物可以是基于树突细胞的免疫原性药物组合物。
基于树突细胞的免疫原性药物组合物可通过本领域已知的任何方法制备。在一些情况下，可以通过离体或体内方法制备基于树突细胞的免疫原性药物组合物。该离体方法可包括使用以本文所述的多肽离体脉冲的自体DC，以在施用于患者之前激活或负载DC。该体内方法可包括使用与本文所述的多肽相偶联的抗体靶向特异性DC受体。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含DC激活剂，如TLR3、TLR-7-8和CD40激动剂。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含佐剂和药学上可接受的载体。
佐剂可用来增强在接受免疫原性药物组合物的患者中引发的免疫应答(体液和/或细胞应答)。有时，佐剂可引发Th1型应答。其他时候，佐剂可引发Th2型应答。Th1型应答的特征可在于产生诸如IFN-γ等细胞因子，相反，Th2型应答的特征可在于产生诸如IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子。
在一些方面，基于脂质的佐剂，如MPLA和MDP，可以与本文公开的免疫原性药物组合物一起使用。例如，单磷酰脂质A(MPLA)是引起脂质体抗原向特异性T淋巴细胞的呈递增加的佐剂。另外，胞壁酰二肽(MDP)也可以作为合适的佐剂与本文所述的免疫原性药物制剂一起使用。
佐剂还可包含刺激分子，如细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括：CCL20、α-干扰素(IFNα)、β-干扰素(IFNβ)、γ-干扰素(IFNγ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、表皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮细胞趋化因子(MEC)IL-12、IL-15,、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI和TAP2。
其他佐剂包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
在一些方面，佐剂可以是toll样受体的调节剂。toll样受体调节剂的实例包括TLR9激动剂，并且不限于toll样受体的小分子调节剂，如咪喹莫特。有时，佐剂选自细菌类毒素、聚氧丙烯-聚乙二醇嵌段聚合物、铝盐、脂质体、CpG聚合物、水包油乳液或其组合。有时，佐剂是水包油乳液。水包油乳液可包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)且生物相容的。乳液中的油滴直径可小于5μm，甚至可具有亚微米级直径，这些小尺寸通过微流化器实现以提供稳定的乳液。尺寸小于220nm的小液滴可以进行过滤除菌。
在一些情况下，免疫原性药物组合物可包括载体和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐溶液、右旋糖和甘油水溶液、调味剂、着色剂、防粘剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂，达到近似的生理条件所需的其他药学上可接受的辅助物质，如pH缓冲剂、张度调节剂、乳化剂、润湿剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。在另一种情况下，药物制品基本上不含防腐剂。在其他情况下，药物制品可含有至少一种防腐剂。应当认识到，虽然本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可用于施用本文所述的药物组合物，但载体的类型将根据给药模式而不同。
免疫原性药物组合物可包括防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。在一些情况下，免疫原性药物组合物基本上不含(例如，<10μg/mL)汞物质，例如，不含硫柳汞。α-生育酚琥珀酸酯可用作汞化合物的替代物。
为了控制张度，免疫原性药物组合物中可包含生理盐，如钠盐。其他盐可包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠和/或氯化镁等。
免疫原性药物组合物可具有200mOsm/kg至400mOsm/kg、240-360mOsm/kg或290-310mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。
免疫原性药物组合物可包含一种或多种缓冲液，如Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。在一些情况下，缓冲液以5-20或10-50mM包含在内。
免疫原性药物组合物的pH可以是约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5或约7.0至约7.8。
免疫原性药物组合物可以是无菌的。免疫原性药物组合物可以是无热原的，例如，每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，且每剂量可为<0.1EU。该组合物可以不含麸质。
免疫原性药物组合物可包含去污剂，例如，聚氧乙烯失水山梨醇酯表面活性剂(称为“吐温”)或辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(Triton X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。去污剂可以仅以痕量存在。免疫原性药物组合物可包含各自小于1mg/mL的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。痕量的其他残余组分可以是抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
免疫原性药物组合物可在本领域公知的合适的媒介物中配制成无菌溶液或悬浮液。药物组合物可以通过常规的公知灭菌技术灭菌，或者可以过滤除菌。所得的水溶液可以被包装以供原样使用，或冻干，在施用前将冻干的制品与无菌溶液合并。
例如包含活性剂(如本文公开的免疫细胞)的药物组合物与一种或多种佐剂组合可以配制成具有一定的摩尔比。例如，可以使用活性剂如本文所述的免疫细胞与一种或多种佐剂组合的约99:1至约1:99的摩尔比。在一些情况下，活性剂如本文所述的免疫细胞与一种或多种佐剂组合的摩尔比的范围可选自约80:20至约20:80；约75:25至约25:75、约70:30至约30:70、约66:33至约33:66、约60:40至约40:60；约50:50；以及约90:10至约10:90。活性剂如本文所述的免疫细胞与一种或多种佐剂组合的摩尔比可以是约1:9，并且在一些情况下可以是约1:1。活性剂如本文所述的免疫细胞与一种或多种佐剂组合，可以一起配制在同一剂量单位中，例如一个小瓶、栓剂、片剂、胶囊、气雾剂喷剂中；或者每种药剂、形式和/或化合物可以配制在单独的单位中，例如两个小瓶、两个栓剂、两个片剂、两个胶囊、一个片剂和一个小瓶、气雾剂喷剂等中。
在一些情况下，免疫原性药物组合物可与附加药剂一起施用。附加药剂的选择可以至少部分地取决于所治疗的病况。附加药剂可包括，例如，检查点抑制剂，如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3剂(例如，抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3抗体)；或对病原体感染(例如病毒感染)具有治疗效果的任何药剂，包括，例如，用来治疗炎性状况的药物，如NSAID，例如，布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、酮洛芬或阿司匹林。例如，检查点抑制剂可以是PD-1/PD-L1激动剂，其选自：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO)、派姆单抗(MK-3475，KEYTRUDA)、pidilizumab(CT-011)和MPDL328OA(ROCHE)。作为另一个实例，制剂可以另外含有一种或多种补充剂，如维生素C、E或其他抗氧化剂。
包含活性剂如本文所述的免疫细胞与一种或多种佐剂的组合的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，该生理学上可接受的载体包括赋形剂、稀释剂和/或助剂，例如促进将活性剂加工成可以施用的制品的载体。合适的制剂可以至少部分依赖于所选的给药途径。本文所述的药剂可以使用多种给药途径或模式(包括口服、颊部、局部、直肠、经皮、经粘膜、皮下、静脉内和肌肉内施用，以及通过吸入)递送至患者。
活性剂可以被配制用于肠胃外给药(例如，通过注射，例如，团注或连续输注)，并且可以在安瓿、预填充注射器、小体积输注中或在添加防腐剂的多剂量容器中以单位剂量形式呈现。该组合物可以采取诸如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，例如在水性聚乙二醇中的溶液。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含防腐剂或稳定剂。在一些实施方案中，该防腐剂或稳定剂选自细胞因子、生长因子或佐剂或化学物质。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种通过至少一个冻融循环帮助保持细胞活力的试剂。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种通过至少超过一个冻融循环帮助保持细胞活力的试剂。
对于可注射制剂，媒介物可以选自本领域已知合适的那些，包括水溶液或油性悬浮液或乳液(具有麻油、玉米油、棉子油或花生油)，以及酏剂，甘露糖醇、右旋糖或无菌水溶液，以及类似的药物媒介物。该制剂还可包含可生物相容的、可生物降解的聚合物组合物，如聚(乳酸-共-乙醇酸)。这些材料可以制成微米球或纳米球，负载药物，并进一步包覆或衍生化以提供优异的持续释放性能。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括，例如，治疗剂在注射级水、脂质体及适合于亲脂性物质的媒介物中的悬浮液。用于眼周或眼内注射的其他媒介物是本领域公知的。
在一些情况下，药物组合物按照常规程序配制成适合于对人体静脉内施用的药物组合物。一般而言，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。当需要时，该组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，成分分开供应或混合在一起以单位剂型供应，例如，作为在指示活性剂的量的密封容器如安瓿或小药囊(sachette)中的干冻干粉或无水浓缩物。当通过输注施用组合物时，其可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿以使成分可以在给药前混合。
制备方法
本文提供了抗原特异性T细胞的制备方法。本文提供了制备T细胞组合物如治疗性T细胞组合物的方法。例如，方法可以包括扩充或诱导抗原特异性T细胞。制备(例如，诱导或扩充)T细胞也可以指制备T细胞，并且广泛涵盖分离、刺激、培养、诱导和/或扩充任何类型的T细胞(例如，CD4+T细胞和CD8+T细胞)的程序。在一个方面，本文提供了一种制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括将APC与来自耗尽表达CD14和/或CD25的细胞的生物样品的免疫细胞群体一起孵育。在一些实施方案中，该方法包括制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞，该方法包括将APC与来自耗尽表达CD11b和/或CD19的细胞的生物样品的免疫细胞群体一起孵育。在一些实施方案中，该方法包括将APC与来自耗尽表达任何CD11b和/或CD19和/或CD14和/或CD25或其任意组合的细胞的生物样品的免疫细胞群体一起孵育。
在第二方面，本文提供了一种制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括将FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC与来自生物样品的免疫细胞群体一起孵育。
在第三方面，本文提供了一种制备药物组合物的方法，该药物组合物包含至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞，所述方法包括：将FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)与来自生物样品的免疫细胞群体一起孵育第一时间段；之后将生物样品的至少一种T细胞与APC一起孵育。
在第四方面，本文提供了一种制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育一个或多个单独时间段，所述时间段是从所述免疫细胞群体与所述一种或多种APC制品中的第一APC制品孵育起不到28天，其中至少一种抗原特异性记忆T细胞被扩充，或者至少一种抗原特异性幼稚T细胞被诱导。
在第五方面，本文提供了一种制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与3个或更少的APC制品一起孵育3个或更少的时间段，其中至少一种抗原特异性记忆T细胞被扩充，或者至少一种抗原特异性幼稚T细胞被诱导。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育一个或多个单独时间段，从而刺激T细胞成为抗原特异性T细胞，其中抗原特异性T细胞的百分比为总CD4+T细胞、总CD8+T细胞、总T细胞或总免疫细胞的至少约0.00001％、0.00002％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括包括将来自生物样品的免疫细胞群体与3种或更少的APC制品一起孵育3个或更少的单独时间段，从而刺激T细胞成为抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与2种或更少的APC制品一起孵育2个或更少的单独时间段，从而刺激T细胞成为抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种方法，其包括将来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育一个或多个单独的时间段，从而刺激T细胞成为抗原特异性T细胞，其中该APC制品是PBMC细胞群体，在APC群体加载抗原之前，从该细胞群体中消耗表达一种或多种细胞表面标志物的细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD14+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD25+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD19+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD3+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD25+细胞和CD14+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+和CD25+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+和CD14+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+、CD14+和CD25+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+和CD19+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+、CD19+和CD25+细胞。在一些实施方案中，在APC群体加载抗原之前消耗CD11b+、CD14+、CD19+和CD25+细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向上述任何消耗的APC群体中添加CD3+细胞耗尽的APC富集的细胞PBMC衍生群体。在一些实施方案中，该APC富集的细胞PBMC衍生群体耗尽了CD3+，并且细胞耗尽了CD11b+、CD14+、CD19+或CD25+中的任何一种或多种。
在一些实施方案中，生物样品包含外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述方法包括向PBMC样品中添加包含一种或多种抗原肽或其编码核酸的组合物，从而向PBMC内的APC上加载抗原，以用于将抗原呈递给PBMC中的T细胞。
在一些实施方案中，方法包括：(a)从受试者获得生物样品，该生物样品包含至少一种抗原呈递细胞(APC)；(b)从生物样品富集表达CD11c的细胞，从而获得CD11c+细胞富集的样品；(c)将CD11c+细胞富集的样品与至少一种细胞因子或生长因子一起孵育第一时间段；(d)将至少一种肽与(c)的CD11c+富集的样品一起孵育第二时间段，从而获得APC肽负载的样品；(e)将APC样品与一种或多种细胞因子或生长因子一起孵育第三时间段，从而获得成熟APC样品；(f)将成熟APC样品的APC与包含PBMC的CD11b和/或CD14和/或CD25耗尽的样品一起孵育第四时间段；(g)将PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第五时间段；(h)将PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第六时间段；(i)将PBMC的至少一种T细胞施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，方法包括：(a)从受试者获得生物样品，该生物样品包含至少一种抗原呈递细胞(APC)；(b)从生物样品富集表达CD14的细胞，从而获得CD14+细胞富集的样品；(c)将CD14+细胞富集的样品与至少一种细胞因子或生长因子一起孵育第一时间段；(d)将至少一种肽与(c)的CD14+富集的样品一起孵育第二时间段，从而获得APC肽负载的样品；(e)将APC肽负载的样品与一种或多种细胞因子或生长因子一起孵育第三时间段，从而获得成熟APC样品；(f)将成熟APC样品的APC与包含PBMC的CD14和/或CD25耗尽的样品一起孵育第四时间段；(g)将PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第五时间段；(h)将PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第六时间段；(i)将PBMC的至少一种T细胞施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，方法包括：(a)从受试者获得生物样品，该生物样品包含至少一种APC和至少一种PBMC；(b)从生物样品中消耗表达CD11b和/或CD19的细胞，从而获得CD11b和/或CD19细胞耗尽的样品；(c)将CD11b和/或CD19细胞耗尽的样品与FLT3L一起孵育第一时间段；(d)将至少一种肽与(c)的CD11b和/或CD19细胞耗尽的样品一起孵育第二时间段，从而获得APC肽负载的样品；(e)将APC肽负载的样品与至少一种PBMC一起孵育第三时间段，从而获得第一刺激的PBMC样品；(f)将第一刺激的PBMC样品的PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第四时间段，从而获得第二刺激的T细胞样品；(g)将第二刺激的PBMC样品的PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第五时间段，从而获得第三刺激的PBMC样品；(h)将第三刺激的PBMC样品中的至少一种T细胞施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，方法包括：(a)从受试者获得生物样品，该生物样品包含至少一种APC和至少一种PBMC；(b)从生物样品中消耗表达CD11b和/或CD19和/或CD14和/或CD25的细胞，从而获得CD11b和/或CD19细胞耗尽的样品；(c)将CD11b和/或CD19和/或CD14和/或CD25细胞耗尽的样品与FLT3L一起孵育第一时间段；(d)将至少一种肽与(c)的CD11b和/或CD19和/或CD14和/或CD25细胞耗尽的样品一起孵育第二时间段，从而获得APC肽负载的样品；(e)将APC肽负载的样品与至少一种PBMC一起孵育第三时间段，从而获得第一刺激的PBMC样品；(f)将第一刺激的PBMC样品的PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第四时间段，从而获得第二刺激的T细胞样品；(g)将第二刺激的PBMC样品的PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第五时间段，从而获得第三刺激的PBMC样品；(h)将第三刺激的PBMC样品中的至少一种T细胞施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，方法包括：(a)从受试者获得生物样品，该生物样品包含至少一种APC和至少一种PBMC；(b)从生物样品中消耗表达CD14和/或CD25的细胞，从而获得CD14和/或CD25细胞耗尽的样品；(c)将CD14和/或CD25细胞耗尽的样品与FLT3L一起孵育第一时间段；(d)将至少一种肽与(c)的CD14和/或CD25细胞耗尽的样品一起孵育第二时间段，从而获得APC肽负载的样品；(e)将APC肽负载的样品与至少一种PBMC一起孵育第三时间段，从而获得第一刺激的PBMC样品；(f)将第一刺激的PBMC样品的PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第四时间段，从而获得第二刺激的T细胞样品；(g)将第二刺激的PBMC样品的PBMC与成熟APC样品的APC一起孵育第五时间段，从而获得第三刺激的PBMC样品；(h)将第三刺激的PBMC样品中的至少一种T细胞施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将APC与来自耗尽表达CD14和/或CD25的细胞的生物样品的免疫细胞群体一起孵育。
在一些实施方案中，本文提供了一种制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育一个或多个单独时间段，所述时间段是从所述免疫细胞群体与所述一种或多种APC制品中的第一APC制品孵育起不到28天，其中至少一种抗原特异性记忆T细胞被扩充，或者至少一种抗原特异性幼稚T细胞被诱导。在一些实施方案中，本文提供了一种制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与3种或更少的APC制品一起孵育3个或更少的单独时间段，其中至少一种抗原特异性记忆T细胞被扩充，或者至少一种抗原特异性幼稚T细胞被诱导。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括使免疫细胞(例如，PBMC)群体与APC接触。在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将免疫细胞(例如，PBMC)群体与APC一起孵育一段时间。在一些实施方案中，免疫细胞群体来自生物样品。在一些实施方案中，该免疫细胞群体来自耗尽了表达CD14的细胞的样品(例如，生物样品)。在一些实施方案中，该免疫细胞群体来自耗尽了表达CD25的细胞的样品(例如，生物样品)。在一些实施方案中，免疫细胞群体来自耗尽了表达CD14的细胞和表达CD25的细胞的样品(例如，生物样品)。
在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC与来自生物样品的免疫细胞群体一起孵育。在一些实施方案中，本文提供了制备包含至少一种抗原特异性T细胞的药物组合物的方法，所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)，所述方法包括：将FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)与有来自生物样品的免疫细胞群体一起孵育第一时间段；之后将该生物样品的至少一种T细胞与APC一起孵育。
在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括使来自样品(例如，生物样品)的免疫细胞群体与FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)接触。在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括使来自样品(例如，生物样品)的免疫细胞群体与FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC接触。在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自样品(例如，生物样品)的免疫细胞群体与FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC一起孵育。在一些实施方案中，制备包含至少一种抗原特异性T细胞(所述至少一种抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR))的药物组合物的方法包括将FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)与来自生物样品的免疫细胞群体一起孵育(例如一段时间)；然后将该生物样品的T细胞与APC接触。在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括使来自样品(例如，生物样品)的免疫细胞群体与一种或多种APC制品接触。在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自样品(例如，生物样品)的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育一个或多个单独时间段。在一些实施方案中，制备至少一种包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自样品(例如，生物样品)的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单独时间段。在一些实施方案中，从免疫细胞群体与所述一种或多种APC制品中的第一APC制品一起孵育起计算，所述一个或多个单独时间段少于28天。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将免疫细胞群体与APC一起孵育一段时间，其中该免疫细胞群体来自包含PBMC的生物样品。在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将免疫细胞群体与APC一起孵育一段时间，其中该免疫细胞群体来自耗尽了表达CD14和/或CD25的细胞的生物样品。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC一起孵育一段时间。
在一些实施方案中，制备包含抗原特异性T细胞(所述抗原特异性T细胞包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR))的药物组合物的方法包括将FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)与来自生物样品的免疫细胞群体一起孵育；然后将该生物样品的T细胞与APC接触。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品孵育一个或多个单独时间段，从而诱导或扩充抗原特异性T细胞，其中从免疫细胞群体与所述一种或多种APC制品中的第一APC制品一起孵育起计算，所述一个或多个单独时间段少于28天。在一些实施方案中，来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品孵育一个或多个单独时间段在含有IL-7、IL-15或其组合的介质中进行。在一些实施方案中，该介质进一步包含吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO)抑制剂、抗PD-1抗体、IL-12或其组合。该IDO抑制剂可以是epacadostat、navoximod、1-甲基色氨酸或其组合。在一些实施方案中，IDO抑制剂可以增加抗原特异性CD8+细胞的数目。在一些实施方案中，IDO抑制剂可以维持记忆CD8+T细胞应答的功能谱。PD-1抗体可以增加抗原特异性记忆CD8+ T细胞应答的绝对数。PD-1抗体可以增加用这种抗体处理的细胞的增殖速率。IL-12的添加可以导致抗原特异性细胞的增加和/或CD8+T细胞的频率增加。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与一种或多种APC制品一起孵育一个或多个单独时间段，从而扩充或诱导抗原特异性T细胞，其中抗原特异性T细胞、抗原特异性CD4+T细胞或抗原特异性CD8+T细胞的百分比为总T细胞、总CD4+T细胞、总CD8+T细胞、总免疫细胞或总细胞的至少约0.00001％、0.00002％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些实施方案中，制备包含对至少一个抗原肽序列具有特异性的T细胞受体(TCR)的抗原特异性T细胞的方法包括将来自生物样品的免疫细胞群体与3种或更少的APC制品一起孵育3个或更少的单独时间段，从而刺激T细胞成为抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞群体来自耗尽了表达CD14和/或CD25的细胞的生物样品。在一些实施方案中，APC是FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)刺激的APC。在一些实施方案中，所述APC包含一种或多种APC制品。在一些实施方案中，所述APC制品包含3种或更少的APC制品。在一些实施方案中，将APC制品与免疫细胞在一个或多个单独时间段内顺序地孵育。
在一些实施方案中，所述生物样品来自受试者。在一些实施方案中，所述受试者是人。例如，所述受试者可以是患者或供体。在一些实施方案中，所述受试者患有疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症为癌症。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞包含CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述抗原特异性T细胞包含CD4富集的T细胞和/或CD8富集的T细胞。例如，可以从包含PBMC的来自受试者的生物样品中分离、富集或纯化CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞是幼稚CD4+和/或幼稚CD8+T细胞。在一些实施方案中，抗原特异性T细胞是记忆CD4+和/或记忆CD8+T细胞。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原肽序列包含选自以下的突变：(A)点突变，并且癌抗原肽以小于500nM的IC50和比相应野生型肽更大的亲和力结合受试者的HLA蛋白，(B)剪接位点突变，(C)移码突变，(D)通读突变，(E)基因融合突变，及其组合。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列中的每一个与受试者表达的HLA等位基因所编码的蛋白质结合。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列中的每一个包含在受试者的非癌细胞中不存在的突变。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列中的每一个由受试者的癌细胞的表达基因编码。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列中的一个或多个具有8-50个天然存在的氨基酸的长度。在一些实施方案中，所述至少一个抗原肽序列包含多个抗原肽序列。在一些实施方案中，所述多个抗原肽序列包含2-50、3-50、4-50、5-50、6-50、7-50、8-50、9-50或10-50个抗原肽序列。
在一些实施方案中，APC包括负载有一种或多种抗原肽的APC，所述一种或多种抗原肽包含至少一个抗原肽序列中的一个或多个。在一些实施方案中，APC是自体APC或同种异体APC。在一些实施方案中，APC包括树突细胞(DC)。
在一些实施方案中，方法包括从生物样品中消耗表达CD14和/或CD25的细胞。在一些实施方案中，消耗CD14+细胞包括使CD14结合剂与APC接触。在一些实施方案中，APC来源于CD14+单核细胞。在一些实施方案中，APC从生物样品富集。例如，可以从包含PBMC的来自受试者的生物样品中分离、富集或纯化APC。
在一些实施方案中，用一种或多种细胞因子或生长因子刺激APC。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子或生长因子包括GM-CSF、IL-4、FLT3L或其组合。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子或生长因子包括IL-4、GM-CSF、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7或其组合。
在一些实施方案中，APC来自第二生物样品。在一些实施方案中，第二生物样品来自同一受试者。
在一些实施方案中，所述方法中抗原特异性T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，该方法中抗原特异性T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的约0.1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至65％或约65％至约70％。在一些实施方案中，该方法中抗原特异性CD8+T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，该方法中抗原特异性幼稚CD8+T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，该方法中抗原特异性记忆CD8+T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，该方法中抗原特异性CD4+T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，该方法中抗原特异性CD4+T细胞的百分比为总T细胞或总免疫细胞的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，生物样品中抗原特异性T细胞的百分比为至多约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，生物样品中抗原特异性CD8+T细胞的百分比为至多约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，生物样品中抗原特异性幼稚CD8+T细胞的百分比为至多约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，生物样品中抗原特异性记忆CD8+T细胞的百分比为至多约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，生物样品中抗原特异性CD4+T细胞的百分比为至多约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
在一些实施方案中，生物样品从受试者新鲜获得或是冷冻的样品。
在一些实施方案中，方法包括将一种或多种APC制品与包含至少一种细胞因子或生长因子的第一介质一起孵育第一时间段。在一些实施方案中，第一时间段为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或18天。在一些实施方案中，第一时间段不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18天。在一些实施方案中，第一时间段是至少1、2、3、4、5、6、7、8或9天。在一些实施方案中，第一时间段不超过3、4、5、6、7、8、9或10天。在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或生长因子包括GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-γ、LPS、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40、聚I:C或其任意组合。
在一些实施方案中，方法包括将一种或多种APC制品与至少一种肽一起孵育第二时间段。在一些实施方案中，第二时间段不超过1小时。
在一些实施方案中，方法包括将一种或多种APC制品与包含一种或多种细胞因子或生长因子的第二种介质一起孵育第三时间段，从而获得成熟的APC。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子或生长因子包括GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、IL-4、FLT3L、IFN-γ、LPS、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848(瑞喹莫德)、LPS、ss-rna40、聚I:C、CpG或其组合。在一些实施方案中，第三时间段不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18天。在一些实施方案中，第三时间段是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17天。在一些实施方案中，第三时间段不超过2、3、4或5天。在一些实施方案中，第三时间段是至少1、2、3或4天。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述第三时间段之后且开始所述第四时间段之前去除所述第二介质的所述一种或多种细胞因子或生长因子。
用于体外T细胞诱导的负载抗原的PBMC
在一些实施方案中，本文提供的方法包括从人血液样品中分离PBMC，并直接向PBMC加载抗原。与抗原直接接触的PBMC可以容易地通过吞噬作用吸收抗原，并将抗原呈递给可能存在于培养物中或添加到培养物中的T细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法包括从人血液样品中分离PBMC，并将编码一种或多种抗原的多核苷酸如mRNA核转染或电穿孔到PBMC中。在一些实施方案中，抗原递送至PBMC，而不是成熟为DC的抗原呈递细胞，在时间和制备效率方面提供了极大的优势。PBMC可以进一步耗尽一种或多种细胞类型。在一些实施方案中，在抗原加载的初始阶段，PBMC可以耗尽CD3+细胞，并且CD3+细胞返回到PBMC的培养物中以刺激CD3+ T细胞。在一些实施方案中，PBMC可以耗尽CD25+细胞。在一些实施方案中，PBMC可以耗尽CD14+细胞。在一些实施方案中，PBMC可以耗尽CD19+细胞。在一些实施方案中，PBMC可以耗尽CD14和CD25表达细胞。在一些实施方案中，在抗原加载之前从PBMC样品中消耗CD11b+细胞。在一些实施方案中，在抗原加载之前从PBMC样品中消耗CD11b+和CD25+细胞。
在一些实施方案中，在加载抗原之前，可以尽可能最低程度地处理从人血液样品中分离的PBMC。增加对PBMC的处理，例如冷冻和解冻细胞、多个细胞消耗步骤等，可能会损害细胞的健康和活力。
在一些实施方案中，PBMC对于治疗受试者而言是同种异体的。在一些实施方案中，PBMC对于采用抗原特异性T细胞的过继细胞疗法的受试者而言是同种异体的。
在一些实施方案中，PBMC对于治疗受试者而言是HLA匹配的。在一些实施方案中，PBMC是同种异体的，并且对于受试者的HLA亚型而言是匹配的，而CD3+ T细胞是自体的。PBMC负载有各自的抗原(例如，从肽呈递分析平台如RECON的分析所确定的)，与受试者的包含T细胞的PBMC共培养，以刺激抗原特异性T细胞。
在一些实施方案中，mRNA用作摄取和抗原呈递的免疫原。使用mRNA胜过肽抗原加载PBMC的一个优点是RNA自行充当佐剂，而不需要额外的佐剂。使用mRNA的另一个优点是，肽是内源性加工和呈递的。在一些实施方案中，mRNA包含短聚体(shortmer)构建体，其编码包含表位的9-10个氨基酸的肽。在一些实施方案中，mRNA包含长聚体(longmer)构建体，其编码大约25个氨基酸的肽。在一些实施方案中，mRNA包含多个表位的串联。在一些实施方案中，多联体可包含来自相同抗原性蛋白质的一个或多个表位。在一些实施方案中，多联体可包含来自几种不同抗原性蛋白质的一个或多个表位。在实施例部分描述了几个实施方案。通过抗原加载向PBMC加载抗原可包括将核酸递送及掺入PBMC中的各种机制。在一些实施方案中，递送或掺入机制包括转染、电穿孔、核转染、化学递送，例如脂质包封的或脂质体介导的递送。
使用负载抗原的PBMC刺激T细胞可以节省在T细胞刺激之前从PBMC样品生成DC的方法中所需要的成熟时间。在一些实施方案中，使用负载抗原的PBMC，例如负载mRNA的PBMC作为APC，将总制备时间缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一些实施方案中，使用负载抗原的PBMC作为APC将总制备时间缩短3天。在一些实施方案中，使用负载抗原的PBMC作为APC将总制备时间缩短4天。在一些实施方案中，使用负载抗原的PBMC作为APC将总制备时间缩短5天。在一些实施方案中，使用负载抗原的PBMC作为APC将总制备时间缩短6天。在一些实施方案中，使用负载抗原的PBMC作为APC将总制备时间缩短7天。
在一些实施方案中，使用mRNA作为抗原可能是优选的，因为它易于设计和制备核酸，并且易于转染PBMC。在一些实施方案中，负载mRNA的PBMC可以刺激T细胞并生成更多抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，负载mRNA的PBMC可以刺激T细胞并生成更高产量的抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，负载mRNA的PBMC可以刺激T细胞并生成具有输入抗原的更高呈现的，即对多种多样的抗原具有反应性的抗原特异性T细胞。在一些实施方案中，负载mRNA的PBMC可以刺激在扩充细胞池中具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种抗原反应性的T细胞。在一些实施方案中，负载mRNA的PBMC可以刺激与常规负载抗原的APC(如负载肽的DC)相比具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种抗原反应性的T细胞。
治疗方法
本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括：I.使负载癌症新抗原的抗原呈递细胞(APC)与分离的T细胞离体接触，其中，所述负载癌症新抗原的抗原呈递细胞(APC)是CD11b耗尽的；II.制备癌症新抗原引发的T细胞，以供用于离体癌症免疫疗法的细胞组合物使用；以及III.在受试者中施用所述用于癌症免疫疗法的细胞组合物，其中该施用减轻或改善了至少一种或多种与癌症相关的状况或症状，从而治疗所述受试者，其中所述负载癌症新抗原的APC和癌症新抗原引发的T细胞各自表达由在该受试者中表达的HLA等位基因编码的蛋白质，并且所述新抗原可以特异性结合该蛋白质。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述至少一种抗原特异性T细胞中的一种或多种施用于受试者。在一些实施方案中，包含T细胞的治疗性组合物通过注射施用。在一些实施方案中，包含T细胞的治疗性组合物通过输注施用。当通过注射施用时，活性剂可以在水性溶液中配制，特别是在生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格液或生理盐水缓冲液中配制。该溶液可含有配制用剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在另一个实施方案中，药物组合物不包含佐剂或其他任何为了增强被肽刺激的免疫应答而添加的物质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述至少一种抗原特异性T细胞中的一种或多种作为本文所述的药物组合物施用于受试者。在一些实施方案中，所述药物组合物包含防腐剂或稳定剂。在一些实施方案中，该防腐剂或稳定剂选自细胞因子、生长因子或佐剂或化学物质。在一些实施方案中，在从受试者收集PBMC样品起28天内向该受试者施用至少一种抗原特异性T细胞。
除了先前描述的制剂外，活性剂也可以被配制成贮库型(depot)制品。这样的长效制剂可通过植入或经皮递送(例如皮下或肌肉内)、肌肉内注射或使用透皮贴剂来施用。因此，例如，药剂可以与合适的聚合物材料或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或者配制为微溶的衍生物，例如，配制为微溶的盐。
本文还提供了治疗患有疾病、病症或病况的受试者的方法。治疗方法可包括向患有疾病、病症或病况的受试者施用本文公开的组合物或药物组合物。
本公开提供了包括免疫原性疗法的治疗方法。提供了治疗疾病(如癌症或病毒感染)的方法。方法可以包括根据本文提供的方法向受试者施用有效量的包含免疫原性抗原特异性T细胞的组合物。在一些实施方案中，该抗原包括病毒抗原。在一些实施方案中，该抗原包括肿瘤抗原。
可以制备的治疗剂的非限制性实例包括基于肽的治疗剂、基于核酸的治疗剂、基于抗体的治疗剂、基于T细胞的治疗剂和基于抗原呈递细胞的治疗剂。
在一些其他方面，本文提供了组合物或药物组合物在制备用于治疗的药物中的用途。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的T细胞。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的TCR，例如在T细胞中表达的TCR。
在一些实施方案中，所述癌症选自癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状上皮癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、头颈癌、结直肠癌、直肠癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、B细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中等级/滤泡性NHL、中等级弥漫性NHL、高等级免疫原性NHL、高等级淋巴细胞NHL、高等级小型非裂解细胞NHL、大肿块疾病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、骨髓瘤、毛细胞白血病、慢性成髓细胞白血病和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，与斑痣性错构瘤病、水肿、Meigs综合征相关的异常血管增生，及其组合。
本文描述的方法在个性化医学环境中特别有用，其中根据本文描述的方法鉴定的免疫原性新抗原肽被用于为同一个体开发治疗剂(如疫苗或治疗性抗体)。因此，治疗受试者疾病的方法可以包括根据本文所述的方法鉴定受试者中的免疫原性新抗原肽；合成所述肽(或其前体，如编码该肽的多核苷酸(例如，mRNA))；以及制备对已鉴定出的新抗原具有特异性的T细胞；并将新抗原特异性T细胞施用于受试者。在一些实施方案中，治疗受试者疾病的方法可以包括根据本文所述的方法鉴定受试者中的免疫原性新抗原肽；合成编码所述免疫原性新抗原肽或其前体的多核苷酸，如mRNA；以及制备对已鉴定出的新抗原具有特异性的T细胞；并将新抗原特异性T细胞施用于受试者。
本文提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案如手术、放射、化学疗法和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关)联合使用。例如，可以使用本文所述的方法鉴定一组肿瘤抗原，并且其可用于例如大部分癌症患者中。
在一些实施方案中，除包含免疫原性治疗剂的组合物外，还可以施用至少一种或多种化疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种化疗剂可属于不同类别的化疗剂。
在实施本文提供的治疗或使用方法时，可以将治疗有效量的治疗剂施用于患有疾病或病况的受试者。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力和其他因素而广泛地变化。
受试者可以是，例如，哺乳动物、人、孕妇、老年人、成年人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿、婴儿、新生儿或新生婴儿。受试者可以是患者。在一些情况下，受试者可以是人。在一些情况下，受试者可以是儿童(即青春期以下的年轻人)。在一些情况下，受试者可以是婴儿。在一些情况下，受试者可以是配方奶粉喂养的婴儿。在一些情况下，受试者可以是加入临床研究的个体。在一些情况下，受试者可以是实验室动物，例如哺乳动物或啮齿动物。在一些情况下，受试者可以是小鼠。在一些情况下，该受试者可以是肥胖的或超重的受试者。
在一些实施方案中，受试者先前已经用一种或多种不同的癌症治疗方式进行了治疗。在一些实施方案中，受试者先前已经用放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种进行了治疗。在一些实施方案中，受试者已经用一、二、三、四或五线先前疗法进行了治疗。在一些实施方案中，先前的疗法是细胞毒性疗法。
在一些实施方案中，可以用本文公开的方法治疗的疾病或病况是癌症。癌症是细胞的异常生长，往往以不受控制的方式增殖，在某些情况下会转移(扩散)。肿瘤可以是癌性或良性的。良性肿瘤是指肿瘤可以生长但不能扩散。癌性肿瘤是恶性的，这意味着它可以生长并扩散到身体的其他部位。如果癌症扩散(转移)，则新肿瘤与原始(原发)肿瘤的名称相同。
本公开的方法可以用来治疗本领域已知的任何类型的癌症。通过本公开的方法治疗的癌症的非限制性实例可包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。
另外，本文提供的疾病或病况包括使用本发明的治疗方法可抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。在一些实施方案中，通过本公开的治疗方法治疗的癌症选自癌、鳞状癌、腺癌、肉瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、结肠癌、结直肠癌、生殖器区域的鳞状细胞癌、黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、甲状腺癌、喉癌、唾液腺癌、食管癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮瘤、肉瘤、血液系统癌症、白血病、淋巴瘤、神经瘤及其组合。在一些实施方案中，通过本公开的方法治疗的癌症包括，例如，癌、鳞状癌(例如子宫颈管、眼睑、结膜、阴道、肺、口腔、皮肤、膀胱、舌头、喉和食道的癌症)和腺癌(例如，前列腺、小肠、子宫内膜、子宫颈管、大肠、肺、胰腺、食道、直肠、子宫、胃、乳腺和卵巢的癌症)。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症进一步包括肉瘤(例如，肌原性肉瘤)、白血病、神经瘤、黑素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是结直肠癌。
在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有实体瘤。在一些实施方案中，该实体瘤是黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰腺癌或Merkel细胞癌。在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有血液系统癌症。在一些实施方案中，患者患有血液系统癌症，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(“DLBCL”)、霍奇金淋巴瘤(“HL”)、非霍奇金淋巴瘤(“NHL”)、滤泡性淋巴瘤(“FL”)、急性髓样白血病(“AML”)或多发性骨髓瘤(“MM”)。在一些实施方案中，待治疗的患者或患者群体的癌症选自卵巢癌、肺癌和黑素瘤。
根据本公开可以预防和/或治疗的癌症的具体实例包括但不限于以下：肾癌、肾脏癌、多形性胶质母细胞瘤、转移性乳腺癌；乳腺癌；乳腺肉瘤；神经纤维瘤；神经纤维瘤病；小儿肿瘤；神经母细胞瘤；恶性黑素瘤；表皮癌；白血病，例如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，如成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病，以及骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨髓瘤骨病、多发性骨髓瘤、胆脂瘤诱发的骨肉瘤、佩吉特骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；脑瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质瘤、听神经鞘瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、小管性乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病(包括青少年佩吉特病)和炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、VIP瘤、分泌促生长素抑制素的肿瘤以及类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库欣病、分泌催乳素的肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，以及视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌，如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界瘤、胚细胞瘤和基质肿瘤；食管癌，例如但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈状(息肉样)、溃疡性、浅表扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；结直肠癌；KRAS突变结直肠癌；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，如腺癌；胆管癌，例如但不限于乳头状、结节状和弥漫性；肺癌，如KRAS突变的非小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；肺癌；睾丸癌，例如但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精细胞癌、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，前列腺癌，例如但不限于雄激素非依赖性前列腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；松果体癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、痣样恶性黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或输尿管(uterer))；肾癌；维尔姆斯瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。
在一些实施方案中，采用由本文所述方法生成的过继T细胞的治疗针对对特定患者群体的治疗。在一些实施方案中，过继T细胞针对对某种疗法为难治性的患者群体的治疗。例如，T细胞针对对于抗检查点抑制剂疗法为难治性的患者群体的治疗。在一些实施方案中，该患者是黑素瘤患者。在一些实施方案中，该患者是转移性黑素瘤患者。在一些实施方案中，本文提供了治疗不可切除黑素瘤患者的方法。在一些实施方案中，选择不可切除黑素瘤患者进行本文所述的T细胞疗法(如NEO-PTC-01)。不可切除黑素瘤受试者可能不是采用肿瘤浸润淋巴细胞的治疗的候选者。在一些实施方案中，采用由本文所述方法生成的过继T细胞的治疗针对对转移性和不可切除黑素瘤患者的治疗。在一些实施方案中，该患者对于抗PD1疗法是难治性的。在一些实施方案中，该患者对于抗CTLA-4疗法是难治性的。在一些实施方案中，该患者对于抗PD1和抗CTLA-4疗法均是难治性的。在一些实施方案中，该疗法通过静脉内施用。在一些实施方案中，该疗法通过注射或输注施用。在一些实施方案中，该疗法经由单次剂量或2、3、4、5、6、7、8、9或10次剂量施用。在一些实施方案中，该治疗或药物组合物每剂量包含约10^9个或更高总数的细胞。在一些实施方案中，该治疗或药物组合物每剂量包含10^10个或更高总数的细胞。在一些实施方案中，该治疗或药物组合物每剂量包含10^11个或更高总数的细胞。在一些实施方案中，该治疗或药物组合物每剂量包含10^12个或更高总数的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用每剂量具有约10^10个至约10^11个总细胞的如本文所述的治疗性组合物，其中所述细胞已经过质量验证并且已经通过发布标准。
试剂盒
本文所述的方法和组合物可以与给药说明书一起以试剂盒形式提供。通常，该试剂盒可包括在容器中的单位剂型形式的所需新抗原治疗组合物和给药说明书。该试剂盒中还可包括附加治疗剂，例如细胞因子、淋巴因子、检查点抑制剂、抗体。其他可能需要的试剂盒组分包括，例如，无菌注射器、加强剂量和其他所需的赋形剂。
本文还提供了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。该试剂盒可含有一种或多种类型的免疫细胞。该试剂盒还可含有可用于如本文所述产生抗原特异性免疫细胞(例如新抗原特异性T细胞)的试剂、肽和/或细胞。该试剂盒可以进一步含有组成和递送该抗原特异性免疫细胞所必需的佐剂、试剂和缓冲液。
该试剂盒还可包括载具、包装或容器，该容器被区室化为容纳一个或多个容器如小瓶、管等，每个容器包含将在本文描述的方法中使用的一种单独元素，如多肽和佐剂。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。该容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和预期给药和治疗模式的包装材料。试剂盒一般包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。还可包括一套说明书。
实施例
将通过以下具体实施例更详细地描述本公开内容。提供以下实施例是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生根据本发明的替代实施方案的多种非关键参数。本文列出的所有专利、专利申请和印刷出版物均通过引用整体并入本文。
实施例的概述：
下面的实施例1和2是T细胞制备方案(方案1和方案2)的示例。示例方案的示意图在图1B和图1C中示出。实施例21-23描述了制备APC和这两个方案的步骤。实施例12和14-16以及表2-5总结了从方案1和2获得的结果。实施例13描述了将要测试的方案的参数。
实施例3-7和20是使用方案1和方案2的CD4+记忆T细胞扩充和CD8+幼稚T细胞诱导的结果的实施例。流式细胞术分析结果示于图2B、图5A和B、图7、图10和图12-23中。
实施例8-11和16-19是用于评估使用本文所述方法扩充或诱导的T细胞的特异性、表型和/或功能的测定结果的实例。图25描绘了T细胞制备过程和这些测定分析T细胞的特异性、表型和/或功能的总体概述。
实施例1–T细胞制备方案1
该实施例提供了如图1B和1C所示的T细胞制备方案1的示例。
材料：
DC培养基(Cellgenix)
CD14微珠，人，Miltenyi#130-050-201
细胞因子和/或生长因子
T细胞培养基(AIM V+RPMI 1640glutamax+血清+PenStrep)
肽储备液-每种肽1mM(HIV A02–5-10种肽，HIV B07-5-10种肽，
DOM-4-8种肽，PIN-6-12种肽)
程序：
步骤1：用于DC制备的单核细胞分离
1.根据每个供体的预期DC产量，计算要解冻的PBMC的大约数目。
2.解冻PBMC，并以约1x106-1x108个细胞/mL的浓度重悬于DC培养基中。
3.加入benzonase(1:1000稀释)，然后将盖拧松放入培养箱中。
4.按照制造商方案进行CD14+单核细胞富集。
5.在含有一种或多种选自GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40和聚I:C的细胞因子和/或生长因子的DC培养基中，以每孔1x105-1x107在6孔板中接种富集的细胞。
步骤2：肽加载和成熟
1.对DC进行计数并根据实验条件将细胞分入15mL试管中；每个条件0.01-1百万个细胞。
2.以1200rpm旋转5分钟，然后重悬于50-400μL DC培养基中。加入肽，并将盖拧松放入培养箱中放置0.5-3小时。计算每种肽在浓度为1mM下的肽池体积。对于每种肽的终浓度0.001-100μM，每孔添加一定体积的A02(5种肽)和B07(5种肽)的单独的池。
3. 0.5-3小时后，将200μL加入含成熟混合物的1.5mL DC培养基中，并将细胞转移至24孔板。成熟混合物包含一种或多种选自GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40和聚I:C的细胞因子。
步骤3：建立长期刺激(LTS)实验
1.小心地从DC板的孔中取出所有培养基，然后将每个孔转移到24孔深孔模块中的单独孔中。
2.用0.5-3mL T细胞培养基洗涤每个孔，并在深孔模块中与DC培养基混合。
3.将100μL添加至每孔2mL T细胞培养基中。
4.以1200rpm旋转DC 5分钟。
5.除去所有上清液，将DC重悬于100μL至2mL T细胞培养基中，然后转移回正确的孔中。
6.在T细胞培养基中解冻PBMC，并以0.5x106–4x106个细胞/mL的浓度重悬于含有IL-7和IL-15的T细胞培养基中。
7.向每个孔中添加0.5-3mL准备好的PBMC。
步骤4：进料LTS
用葡萄糖仪检查培养基是否为黄色。如果葡萄糖水平仍然很高，则向孔中供应含有IL-7和IL-15的培养物。如果葡萄糖水平低，则将细胞扩大至6孔板(4mL/孔)并补充IL-15和IL-7。如果葡萄糖水平非常低，则在6孔板中扩大至6mL/孔。
步骤5：进料LTS
每1-4天供应培养物，添加新鲜的IL-15/IL-7，并在葡萄糖浓度变低时根据需要扩大培养体积。
步骤6：重新刺激
进行T细胞计数，并在新一批负载肽的DC上从步骤3开始重复。冷冻剩余的细胞以供分析。
步骤7：进料LTS
每-1-5天供应一次培养物。
步骤8：重新刺激
进行T细胞计数，并在新一批负载肽的DC上从步骤3开始重复。冷冻剩余的细胞以供分析。
步骤9：进料LTS
每1-5天供应一次培养物。
步骤10
进行T细胞计数，并冷冻以供分析。
实施例2-T细胞制备方案2
该方案可以替代实施例1中描述的方案。
实施例2提供了如图1所示的示例T细胞制备方案(方案2)。
材料：
AIM V培养基(Invitrogen)
培养基1(RPMI 1640谷氨酰胺+血清+PenStrep)
培养基2(AIM V+RPMI 1640谷氨酰胺+血清+PenStrep)
程序：
步骤1：在24孔板的每个孔中，将400万个PBMC接种于培养基2中，其中含有一种或多种细胞因子。所述一种或多种细胞因子选自GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40和聚I:C。
步骤2：培养基2中的肽加载和成熟
1.在各个孔中制备感兴趣的储备肽池(无肽条件除外)，短聚体的最终浓度为0.001-100μM，长聚体的最终浓度为0.001-100μM，并混合。
2.孵育0.5-3小时。
3.制备储备成熟混合物，并在孵育和混合后添加到每个孔中。成熟混合物包含选自以下的一种或多种细胞因子：GM-CSF、IL-4、FLT3L、TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-6、IL-7、IFN-α、R848、LPS、ss-rna40和聚I:C。
步骤3：将人血清以2.5-20％(体积)的最终浓度添加到每个孔中并混合。
步骤4：用新鲜的培养基1小心地替换50-90％的培养基，培养基1中补充有IL-7和IL-15，至终浓度均为0.005-500ng/mL。
步骤5：每1-5天用新鲜的培养基1小心地替换50-90％的培养基，培养基1中补充有IL-7和IL-15，至终浓度均为0.005-500ng/mL。
如果孔在非供应日从橙色变为黄色(在透明培养基的情况下，葡萄糖读数)，则用新鲜的培养基1和IL-7/IL-15更换25-75％的现有培养基。
步骤6：计数并冷冻(或进行以下步骤以使T细胞刺激转至方案1的步骤8和/或步骤10)。
在步骤1到步骤6的培养步骤中，可以根据方案1“步骤1”和“步骤2”中的程序并行制备负载肽的DC。
进行T细胞计数，并用新一批负载肽的DC刺激T细胞。冷冻剩余的细胞以供分析。T细胞刺激程序可以按照方案1“步骤3”中的程序进行。
步骤7：对新一批负载肽的DC进行T细胞计数，并按照方案1“步骤3”重复T细胞刺激程序。冷冻剩余的细胞以供分析。
步骤8：进行T细胞计数，并冷冻以供分析。
实施例3–CD8+T细胞诱导
根据方案1或方案2使用来自人类供体的PBMC样品进行抗原特异性T细胞诱导。在使用不同的方案制备T细胞之后，分析了CD8+记忆和幼稚T细胞的诱导。可以在不同时间点取细胞样品进行分析。pMHC多聚体用于监测诱导培养物中抗原特异性CD8+T细胞的比例，并用于通过组合编码并行检测多个T细胞应答。图2描绘了示例性结果，其显示了使用方案1(方案1)和方案2(方案2)由长肽或短肽诱导的抗原特异性CD8+记忆T细胞的分数。“Bulk”表示含有用于诱导的T细胞的样品是完全的PBMC。“Treg”表示含有用于诱导的T细胞的样品是耗尽了表达CD25的细胞的PBMC。图3描绘了T细胞应答测定的示例性结果，其显示了在短期刺激或诱导后通过流式细胞术分析的对GAS7肽应答的抗原特异性CD8+幼稚T细胞的分数。短期刺激后，可以观察到抗原特异性记忆T细胞和幼稚PIN特异性T细胞的分数增加。“长”或“长聚体”是用作免疫原的肽，长度约为16-25个氨基酸。“短”或“短聚体”是用作免疫原的肽，长度约为8-12个氨基酸。
实施例4–CD8+T细胞诱导
使用不同的方案制备T细胞后，分析了CD8+T细胞的诱导。将诱导的T细胞与不同抗原肽在测试孔中孵育，并通过流式细胞术分析对肽有反应的T细胞的分数。pMHC多聚体用于监测诱导培养物中抗原特异性CD8+T细胞的比例，并用于通过使用组合编码平行检测多个T细胞应答。命中率可用于描述T细胞对抗原肽的反应程度。命中率被定义为阳性反应测试孔的数目除以测试孔的总数。一式两份进行实验，并在双份孔中证实了命中率。图4描绘了结果的示例，其显示了使用方案1(方案1)和方案2(方案2)诱导后，用HIV短肽、先前鉴定的新抗原(PIN)短肽或PIN长肽诱导的CD8+T细胞的分数。“完全PBMC”表示包含用于诱导的T细胞的样品是完全的PBMC。“CD25 PBMC”表示含有用于诱导的T细胞的样品耗尽了CD25+细胞。显示了长诱导和短诱导。图6描绘了示例性结果，其显示了细胞的分数，所述细胞是来自两个人类供体通过所示长和短诱导所诱导的多聚体阳性CD8 T细胞。
实施例5–CD4+T细胞应答
可以使用离体诱导方案如上述方案1或2诱导CD4+T细胞对先前鉴定的新抗原(PIN)的应答。在该实施例中，通过使用方案1以抗原特异性方式监测IFNγ的产生来鉴定CD4+T细胞应答。图10显示了这类流式细胞术分析的代表性实例。最后，通过用突变型或野生型肽刺激诱导的T细胞群体，显示了CD4+T细胞对突变型肽具有特异性，而对野生型则没有(图11)。
实施例6–幼稚CD8+T细胞诱导
在使用方案1或方案2进行T细胞制备后，通过流式细胞术分析幼稚CD8+T细胞诱导。PBMC样品来自人类供体1或人类供体2，是完全PBMC或CD25-耗尽的PBMC。根据图1中的方案在短期或长期诱导后分析细胞样品。针对不同的肽分析了诱导的CD8+T细胞的幼稚CD8+应答，并绘制在图12-23中。
实施例7–CD8+幼稚T细胞应答
实施例1中的T细胞制备方案可以成功地用于从幼稚区室诱导CD8+T细胞应答。图7示出了在健康供体中，在两轮刺激之后，针对突变表位产生的两个CD8+T细胞应答的代表性流式图。而且，来自记忆区室的CD8+T细胞应答可以扩充到高数目。在图8A所示的代表性示例中，在多达三轮刺激之后，所有CD8+T细胞中约50％对免疫优势表位CMV pp65、EBV YVL、EBV BMLF1和Mart-1具有特异性。诱导的CD8+记忆应答在肽回忆测定中显示出多功能性(脱粒和细胞因子释放，图8B)。
实施例8-T细胞的流式细胞术分析
图5A描绘了使用方案2在图中所示条件下诱导的CD8+幼稚T细胞的ME-1应答的示例性流式细胞术分析。图5B描绘了在图中指示的条件下诱导的CD8+幼稚T细胞的ME-1应答的流式细胞术分析的实例。长诱导后，观察到12.6％的CD8+T细胞对ME-1具有特异性。
实施例9-诱导的T细胞的细胞毒性测定
使用细胞毒性测定来评估诱导的T细胞培养物是否可以杀死表达抗原的肿瘤细胞系。在该实施例中，测量了活性胱天蛋白酶3在存活和死亡的肿瘤细胞上的表达，以量化早期细胞死亡和死亡的肿瘤细胞。在图9中，诱导的CD8+记忆应答能够杀死表达抗原的肿瘤靶标。
实施例10-产生的CD8+T细胞的表型分析
为了分析表型表达，将每种培养物的1x104-1x106个T细胞在含有0.1-10％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS(FBS-PBS)中洗涤，并重悬于含有1:100稀释的荧光染料标记的抗体(CD45RA和CD62L)的FBS-PBS中。在冰上孵育后，将细胞洗涤并固定以进行流式细胞术分析。如果选择的CD8 T细胞培养物表达CD62L而不表达CD45RA，无论它们对各种肽的反应性如何，都可以表明选择的T细胞培养物属于CD8+记忆T细胞亚组。
实施例11-CD8+T细胞的细胞因子产生
可以分析CD8+T细胞培养物的细胞因子谱。首先用抗原肽脉冲的自体APC攻击T细胞培养物。细胞因子谱使用ELISA试剂盒(PharMingen，San Diego,Calif.)定量确定。将微量滴定板(96-孔，NUNC Maxisorp)在4℃下用0.2-4μg/孔的纯化小鼠捕获人细胞因子单克隆抗体(IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ)(PharMingen)包被过夜。将板洗涤并将非特异性结合位点用10％(w/v)的胎牛血清(FBS)饱和0.5-3小时，然后洗涤。将上清液和细胞因子标准液用PBS稀释，并一式两份加入孔中。将板在37℃下孵育1-3小时，然后用PBS-T洗涤。将匹配的生物素化检测抗体添加到每个孔中，并在室温下孵育1-3小时。洗涤后，加入抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶并孵育0.5-3小时。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB，Sigma)用作显色底物。使用ELISA酶标仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)在450nm处测量光密度，并通过Microplate计算机软件(Bio-Rad)使用双八点标准曲线对细胞因子浓度进行定量。
实施例12–方案1和方案2：概述
在该实施例中，下表提供了方案1和方案2刺激方案的结果概述。
表1.方案1和2的结果概述
Figure BDA0003463384270001251
TBD*＝待确定
实施例13-方案1和2参数测试
用于测试方案参数的示例实验可以是在患者样品中以小规模测试方案1。用于测试方案参数的另一个示例实验可以是表征先前批次中生成的T细胞产品，包括测试CD4+T细胞和CD8+T细胞的功能以及分选抗原特异性细胞并通过单细胞RNAseq进行表征。用于测试方案参数的实验的另一个示例可以是在DC制备期间测试聚-ICLC/aCD40L的添加并量化T细胞富集。用于测试方案参数的另一示例实验可以是测试诱导的CD8+幼稚T细胞应答的功能，包括在杀伤测定中评估抗原特异性细胞毒性，以更宽的流动组(flow panel)进行肽回忆测定以测量分化和耗竭，对部分命中确定敏感性(肽滴定)和特异性(WT对突变型，池解卷积)，并富集CD8+以消除抗原特异性CD4+T细胞的旁观者效应的可能性。用于测试方案参数的另一个示例实验可以是询问功能，确定部分命中的敏感性(肽滴定)和特异性(WT对突变型，池解卷积)，使用分化和耗竭流动组进行回忆测定以更好地了解表型。用于测试方案参数的另一个示例实验可以是通过单细胞RNAseq对抗原特异性T细胞(CD8+记忆，CD8+幼稚，CD4+幼稚)进行分类，包括比较不同诱导的表型，比较来自不同区室的诱导表型，检查动力学。
实施例14-消耗表达CD14和/或CD25的细胞的T细胞输入物改善了对CD4+和CD8+幼 稚T细胞的诱导。
以下表2显示了来自方案1T细胞制备方法的结果，表明CD14-/CD25-的消耗可以增加CD8+初始命中率并具有一致的CD4+命中率。
表2-CD14-/CD25-消耗结果
Figure BDA0003463384270001261
实施例15-使用方案1和方案2显著改善了CD8幼稚诱导。
以下表3A和3B显示了来自本文所述的方案1和方案2T细胞制备方法的结果。在测试的两个人类供体中，与使用表达CD14的细胞耗尽相比，使用表达CD25的细胞耗尽或表达CD25和CD14的细胞耗尽，CD8+幼稚诱导显著改善。使用FLT3L刺激，CD8+幼稚诱导也显著改善。
表3A-来自HD35的CD8+幼稚诱导结果
Figure BDA0003463384270001271
Figure BDA0003463384270001281
表3B-来自HD34的CD8+幼稚诱导结果
Figure BDA0003463384270001282
Figure BDA0003463384270001291
实施例16-UV介导的与pMHC特异性试剂的肽交换测定。
抗原特异性pMHC多聚体通过紫外线介导的HLA特异性单体的肽交换和随后的多聚化而生成。这些用于检测抗原特异性T细胞。
UV介导的条件配体的裂解可以是时间依赖性的。通过以下描述的设置，可以在1分钟后检测到肽的切割，并且在大约15分钟后可以基本完成。通常可以使用30至60分钟的孵育时间，以确保条件性配体与目标肽的最佳交换。蛋白质浓度可能会影响UV介导的裂解速率，因为硝基苯基部分和反应产物都吸收长波长的UV光。另外，路径长度可能会影响反应速度。可以通过在感兴趣的MHC配体存在下进行UV介导的裂解来挽救在UV暴露下形成的空的肽受体MHC分子。在大多数实验中，使用的肽相对于MHC为100倍摩尔过量。紫外线诱导的肽交换常规使用25μg/mL的紫外线敏感的I类MHC复合物进行。但是，肽交换反应可以使用浓度高达100-200μg/mL的MHC I类进行。
材料：
96孔板(目录号：651201聚丙烯微孔板96孔V尖形，Greiner Bio-one)
366nm紫外灯CAMAG UV Cabinet 3(目录号：022.9070，CAMAG)，装有长波紫外线UV灯，366nm，2x8W(目录号：022.9115，CAMAG)或Uvitec灯管，带2x15W，365nm黑色蓝光灯管(型号-LI215 BLB尺寸L xW x H 505x140x117mm)
带转子的微量滴定板离心机。
程序：
1.在96孔板中，如表4所示向每个孔中添加以下试剂：
表4
Figure BDA0003463384270001301
2.将96孔板置于紫外灯(366nm)下1小时，紫外灯与样品之间的距离约为5厘米。
3.以3,300g的转速旋转平板5分钟。将100μL上清液(将板保持一定角度以避免转移任何沉淀物)转移到新的96孔板中以用于下游应用。
实施例17-组装荧光染料缀合的pMHC多聚体
MHC I类复合物可与荧光团标记的链霉亲和素复合形成MHC I类四聚体，以用于T细胞分析。常用的荧光团包括别藻蓝蛋白和藻红蛋白，与这些缀合物的MHC多聚体的形成描述如下。然而，链霉亲和素包被的量子点或任何链霉亲和素偶联的荧光团也可以用于制备用于T细胞检测的MHC多聚体。
材料：
PE-链霉亲和素溶液1mg/mL(目录号：S866，Molecular Probes)或APC链霉亲和素溶液1mg/mL(目录号：S868，Molecular Probes)带有交换的I类MHC复合物的微量滴定板，每100孔中含25μg/mL的pMHC。这相当于每孔2.5μg或0.05nmol I类MHC。
程序：
1.在PBS中产生27μg/mL的链霉亲和素-PE或PBS中14.6μg/mL的链霉亲和素-APC的稀释液，为I类MHC的每个孔制备100μL。
2.通过以10分钟为间隔的四次连续添加25μL将链霉亲和素-PE或-APC添加到I类MHC中。
实施例18-MHC多聚体的组合编码
紫外线介导的MHC肽交换
1.在冰上解冻生物素化的p*MHC复合物的储备液。
2.将感兴趣的生物素化p*MHC复合物在PBS中稀释至200μg/mL。每个交换反应需要60μL的体积。为了使pMHC复合物缀合至Qdot585，每个交换反应需要80μL。
3.在PBS中将肽储备液稀释至400μM。每个肽至少准备70μL；对于用于使pMHC复合物与Qdot585缀合的肽，至少要制备90μl每个肽。
4.在带有V形底部的96孔聚丙烯微孔板中，每孔混合60μL所选等位基因的200μg/mL p*MHC和60μL 400μM肽溶液(最终浓度：100μg/mL p*MHC和200μM肽)。为了将pMHC复合物缀合至Qdot585，将80μL的200μg/mL p*MHC和80μL的400μM肽溶液混合。
5.在RT下将96孔微孔板暴露于紫外光(约366nm)1小时。到紫外灯的距离应为2-5cm。
6.在室温下将板以3,300g离心5分钟
7.如果包括暂停点，则重复步骤6，然后将2×50μL上清液转移到两个带有V形底部的新鲜96孔聚丙烯微孔板中，并置于冰上。为了使pMHC复合物缀合至Qdot585，转移2×70μL。注意不要转移底部沉淀物(通常是不可见的)，因为聚集物的转移可能会增加最终MHC多聚体染色的背景。
8.通过与荧光染料-链霉亲和素缀合物缀合，使pMHC单体多聚。差异缀合描述如下：用于与Qdot605-、625-、655-或705-链霉亲和素缀合的选项A；选项B与Qdot585-链霉亲和素缀合；选项C与PE-、APC-或PE-Cy7-链霉亲和素结合。
(A)与Qdot605-、625-、655-或705-链霉亲和素的缀合：(i)每50μLpMHC单体添加3.5μL Qdot-链霉亲和素缀合物(储备液浓度1μM)(终浓度为66nM)。
(B)与Qdot585-链霉亲和素的缀合：(i)每70μL pMHC单体添加4.9μL Qdot585-链霉亲和素缀合物(储备液浓度1μM)(至终浓度66nM)。(C)与PE-、APC-或PE-Cy7-链霉亲和素的缀合：(i)每50μL加入4.6μL PE-、APC-或PE-Cy7-链霉亲和素缀合物(储备液浓度200μg/mL)pMHC单体(至终浓度为16.8μg/mL)。
9.充分混合，在冰上静置30分钟。
10.添加D-生物素和NaN3至终浓度25μM D-生物素和0.02％(wt/vol)的NaN3。通过向每个孔中添加2.5μL 20倍储备液(500μM D-生物素和0.4％(wt/vol)NaN3)来进行操作；对于缀合至Qdot585的MHC多聚体，向每个孔中添加3.5μL。充分混合并在冰上孵育20分钟。
11.将50μl的含有25μM D-生物素和0.02％(wt/vol)的NaN3的PBS加入缀合至PE、APC或PE-Cy7的MHC多聚体(两倍稀释)。
12.混合不同的复合物。混合时，将Qdot585与所有其他有色复合物的比例为2:1。以1:1比例混合所有其他有色复合物。
使用MHC多聚体对T细胞的染色
13.将所有27种颜色组合的MHC多聚体混合，以获得一个即用型样品，并在4℃下以3,300g离心5分钟，然后转移上清液。每次T细胞染色总共需要54μl上清液(即混合物中存在的每个单独的pMHC复合物为2μL)。
14.解冻PBMC样品(或其他相关的T细胞样品)，并用RPMI洗涤两次。建议在解冻后用DNA酶处理以减少细胞凝集(例如，通过在含有0.025mg/mL Pulmozyme和2.5mM MgCl2的培养基中解冻细胞)。
15.将细胞重悬于含有2％(vol/vol)FBS(FACS缓冲液)的PBS中，然后将它们分配到96孔聚苯乙烯U形底微孔板中，在200μL FACS缓冲液中每孔最多3x106个细胞。
16.在室温下以490g的转速旋转平板5分钟。
17.通过将板倒置而丢弃缓冲液—细胞以沉淀形式留在孔的底部。
18.加入来自步骤13的54μL MHC多聚体并充分混合。
19.在37℃下孵育15分钟。
20.将板移至冰上，并从5×储备液中加入20μL抗体混合物。
21.加入4μL近红外死细胞染色剂的40倍稀释液并充分混合。
22.在冰上孵育30分钟。
23.在4℃下以490g的转速旋转平板5分钟。
24.颠倒培养皿，倒出上清液。
25.用200μL FACS缓冲液洗涤两次(在490g下于4℃离心5分钟两次，每次旋转后将板倒置以除去上清液)。
26.将沉淀物重悬于50-100μL FACS缓冲液中，并将其转移至1.4mL或5mL FACS管中。现在可以将样品准备在流式细胞仪上进行采集。
单色补偿对照
27.向11个FACS管中添加100μL FACS缓冲液和一滴阴性补偿珠(第1-11号)。
28.将一滴抗小鼠Ig-κ补偿珠添加到步骤27中的1-10管中，并将一滴ArC胺反应性珠粒加到新管中(12号)。
29.将5μL 1mg/mL抗CD8-生物素添加至试管1-8中并混合。
30.在冰上将试管1-8孵育20分钟。
31.用2mL FACS缓冲液洗涤试管1-8两次(在4℃下以490g离心5分钟)。
32.将1μL的近IR死细胞染色剂添加至试管12(来自步骤28)；混合并在黑暗中于室温孵育30分钟。
33.将链霉亲和素-荧光染料缀合物稀释十倍(除Qdot585以外)，将各5μL添加到试管1-7中，向试管8添加1μL的未稀释Qdot585-链霉亲和素，然后在黑暗中在冰上孵育20分钟。
34.将5μL FITC抗体(使用一种转储(dump)通道抗体)或5μL的Alexa Fluor 700抗CD8a抗体添加至试管9和10(来自步骤28)；在黑暗中在冰上孵育20分钟。
35.用2mL FACS缓冲液洗涤试管1-11两次，用2mL PBS洗涤试管12两次(在490g下于4℃离心5分钟)。
36.将所有试管重悬于150μL FACS缓冲液中。将一滴ArC阴性珠加入试管12并混合。补偿对照已准备好在流式细胞仪上进行采集。
门控策略
37.首先在淋巴细胞上，然后在单细胞(FSC-α、FSC-W)、活细胞、转储通道阴性细胞和CD8+细胞上进行门控操作。
38.绘制单独的门，以定义八个不同的MHC多聚体通道中的阳性事件。
39.反转八个MHC多聚体阳性门，以获得八个门，其为每个MHC多聚体通道选择CD8+和MHC多聚体阴性细胞。
40.将两个MHC多聚体阳性群体的门相交，将其他六个MHC多聚体群体中的每个群体的门相交。门的这种组合选择在两个且仅两个MHC多聚体通道中为阳性的CD8+细胞(即，如果一个细胞在一个或三个或更多MHC多聚体通道中为阳性，则将其选出)。这样的门的实例是PE+和APC+和PE-Cy7-和Qdot585-和Qdot605-和Qdot625-和Qdot655-和Qdot705-。
41.对MHC多聚体的所有28种可能的两种颜色组合进行这些相交的门(在步骤40中进行描述)。
42.加入步骤41中的所有28个门(例如，门1或门2或...或门28)。
43.与步骤39中的八个反向门相交(PE-和APC-和PE-Cy7-和Qdot585-和Qdot605-和Qdot625-和Qdot655-和Qdot705-)。
44.从步骤42和43连接两个门。
45.用所有可能的双色代码绘制28点图，显示在步骤44中为门控的事件。这些图将仅显示对于所有MHC多聚体均为阴性或对两个为阳性的CD8+细胞；所有背景事件都被排除。
46.还用所有可能的双色代码绘制28点图，显示所有CD8+细胞。这些图将很好地指示样品中的背景水平，也可用于揭示不当补偿。建议将这些“相加”图与门控图进行比较，以获取将响应与背景分离的经验。这对于低强度群体尤其重要。
实施例19–荧光细胞条形码化
细胞条形码可用于通过流式细胞仪进行多重表型和功能分析。可以对磷酸流进行轻微的修改以包括FCB标记。甲醛固定后，将样品重悬于含有指定浓度的Alexa Fluor或太平洋蓝琥珀酰亚胺酯的100％20-25℃甲醇(通常每106个细胞500μL)中，每个样品接受不同浓度的荧光染料。在某些情况下，可以将样品重悬在甲醇中，然后添加溶于DMSO(通常以1:50稀释)的FCB荧光团。可以这样做，以便事先进行FCB染色基质的制备和在DMSO中的保存，这是96孔板实验所必需的。在20-25℃标记15分钟后，将细胞用染色介质(含有0.5％BSA和0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0))洗涤两次。在4℃或更低温度下进行标记会产生非常低的标记强度，从而允许在-80℃下将样品存储在甲醇染色溶液中，而不会增加FCB染色水平。
差异标记的样品将合并到一个FACS管或孔中，如果所得体积大于100μL，则再次沉淀。合并的条形码化样品(通常为100μL)将用磷酸特异性和/或表面标记抗体染色，洗涤并通过流式细胞仪进行分析。可以在配备405nm、488nm和633nm激光器以及制造商的备用滤光片的BD LSR2流式细胞仪上进行流式细胞术，用610/20带通滤光片代替Cascade Yellow的405nm八边形带通滤光片量子点605。
实施例20-CD4+幼稚诱导
方案1和2使用PIN肽进行。评估了抗原特异性CD4+幼稚诱导。结果见以下表5。‘Y’表示观察到T细胞应答。
表5-来自供体1和2的CD4+幼稚诱导结果
Figure BDA0003463384270001351
Figure BDA0003463384270001361
表21-制备过程：DC衍生化
表6–用于DC衍生化的示例性方案
Figure BDA0003463384270001362
实施例22–T细胞诱导方案1
表7A–T细胞诱导#1
Figure BDA0003463384270001363
表7B-T细胞诱导#2
Figure BDA0003463384270001371
表7C-T细胞诱导#3
Figure BDA0003463384270001372
表7D-收获与冷冻保存
Figure BDA0003463384270001373
实施例23-T细胞诱导方案2
表8A-T细胞诱导#1
Figure BDA0003463384270001374
Figure BDA0003463384270001381
表8B-T细胞诱导#2
Figure BDA0003463384270001382
表8C-T细胞诱导#3
Figure BDA0003463384270001383
表9-收获与冷冻保存
Figure BDA0003463384270001384
实例24-使用多路化、多参数流式细胞术同时检测CD4+和CD8+新抗原特异性T细胞 应答并进行功能表征
新抗原是由癌细胞突变产生的，这些变异来自改变蛋白质编码基因序列的体细胞突变，目前正成为免疫治疗的有吸引力的靶标。它们在肿瘤细胞上的独特表达不同于健康组织上，并可能被免疫系统识别为外来抗原，增加免疫原性。开发了T细胞制备工艺以通过多轮离体T细胞刺激来提高记忆力和从头产生CD4+和CD8+T细胞对患者特异性新抗原的应答，从而产生新抗原反应性T细胞产品以供使用在过继细胞疗法中。刺激的T细胞产品的详细表征可用于测试这些过程利用的许多潜在变量。
为了探测T细胞的功能和/或特异性，开发了一种测定，以同时检测抗原特异性T细胞应答并表征其大小和功能。该测定采用以下步骤。首先使用T细胞-APC共培养物在抗原特异性T细胞中引发反应。任选地，采用使用荧光细胞条形码的样品多路化。为了鉴定抗原特异性CD8+T细胞并检查T细胞功能，使用FACS分析同时探测肽-MHC多聚体的染色和多参数细胞内和/或细胞表面细胞标志物的染色。简化测试的结果证明了其在研究由健康供体诱导的T细胞应答中的应用。在健康的供体中鉴定出针对肽的新抗原特异性T细胞应答。还比较了诱导的T细胞应答的大小、特异性和功能性。图25和图26描绘了用于同时分析T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的示例性方法。
简言之，将不同的T细胞样品用不同浓度的不同荧光染料条形码化(参见例如实施例19)。每个样品接受不同浓度的荧光染料或不同浓度的多种染料的组合。将样品重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后添加溶解在DMSO中的荧光团(通常以1:50的稀释度)至最大终浓度为5μM。在37℃下标记5分钟后，通过添加含蛋白质的培养基(例如含有10％合并的人AB型血清的RPMI培养基)猝灭过量的荧光染料。用如上所述抗原肽脉冲的自体APC攻击独特条形码化的T细胞培养物。
将差异标记的样品合并到一个FACS管或孔中，如果得到的体积大于100μL，则再次沉淀。将合并的条形码化的样品(通常为100μL)用包括LAMP-1的表面标志物抗体染色(参见，例如，实施例11)并与组装的荧光染料缀合的肽-MHC多聚体一起孵育(参见例如以上实施例17和18)。固定和透化后，将样品另外用靶向TNF-α和IFN-γ的抗体进行细胞内染色。
然后通过流式细胞术在流式细胞仪上同时分析合并的条形码化T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色。与分别分析T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的其他方法不同，本实施例中描述的T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的同时分析提供了关于既具有抗原特异性又具有增加的细胞标志物染色的T细胞百分比的信息。分析T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的其他方法单独确定抗原特异性样品的T细胞百分比，并单独确定细胞标志物染色增加的T细胞百分比，仅允许关联这些频率。在该实施例中描述的T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的同时分析不依赖于抗原特异性T细胞的频率与细胞标志物染色增加的T细胞的频率的相关性；相反，它提供了既具有抗原特异性又具有增加的细胞标志物染色的T细胞的频率。在该实施例中描述的T细胞样品的细胞标志物谱和MHC四聚体染色的同时分析允许在单个细胞水平上确定那些既具有抗原特异性又具有增加的细胞标志物染色的细胞。
为了评估给定诱导过程的成功性，使用了回忆应答测定，然后进行了多路化、多参数流式细胞术组分析。取自诱导培养物的样品用独特的双色荧光细胞条形码标记。将标记的细胞在负载抗原的DC或未负载的DC上孵育过夜，以刺激抗原特异性细胞中的功能应答。第二天，根据以下表10将独特标记的细胞合并，然后进行抗体和多聚体染色。
表10–测定靶标(标志物)、荧光染料和目的
Figure BDA0003463384270001401
Figure BDA0003463384270001411
确定了对多路化样品进行完全解卷积的能力，所述样品通过标记，单独获得或作为混合物获得(图27A)。独特标记的样品可以完全解析，而不与或几乎不与其他条形码产生交叉污染。通过多聚体染色对抗原特异性CD8+T细胞的检测通过样品多路化维持。分离含有约20％对CMV pp65、EBV BRLF1、EBV BMLF1和/或MART-1具有特异性的CD8+T细胞的诱导培养物样品，用九个独特的双色条形码标记，然后合并，以用靶向所有四种特异性的四聚体以相同的双色组合(亮紫色650[BV650]和藻红蛋白[PE])进行染色(图27B)。所有九个条形码产生可比较的四聚体染色模式和四聚体+细胞的检测频率。
还在回忆应答测定中分析了两种含有从头CD4+T细胞应答的诱导培养物的样品，其单独进行而没有条形码化或与无关样品混合(图28A和图28B)。从细胞中引发的功能数和应答幅度没有随样品条形码化显著改变。
对诱导的CD8+记忆应答的特异性和功能性的同时分析表明，在起始健康供体材料中，针对CMV pp65、MART-1和EBV BRLF1和BMLF1表位的CD8+记忆应答可以从0.23％的CD8+T细胞升高至>60％(图29A)。
通过在CD8+多聚体+细胞上预门控，选择性地探询抗原特异性T细胞的功能(图29B)。暴露于负载抗原的DC后，细胞表现出细胞毒性功能(CD 107a表面暴露)和IFNγ分泌。
还证实了在同一培养物中从头诱导的具有多种特异性的CD4+应答的检测和功能表征。利用抗原特异性功能来鉴定诱导的CD4+T细胞应答(图30A)。在所示的示例中，在针对10个HIV衍生抗原决定簇的四个复制培养物中进行了诱导，这些抗原决定簇是HIV阴性健康供体的初次靶标。在所有四个生物学重复中检测到抗原特异性应答。通过池解卷积选择检测到的应答中的三个用于进一步随访，以鉴定诱导应答的特异性(图30B)。在每个重复测试中均检测到多种应答，并且在每种情况下，相同的两个表位(HIV#5和HIV#7)诱导出最高的应答量级。不受任何理论的束缚，这可能反映了这些表位在该供体中的更高的免疫原性，这是由于II类MHC单倍型或在幼稚组库中靶向这些表位的T细胞的前体频率更高。在DC加载期间通过肽滴定确定对于三种选择的应答的对抗原的敏感性(图30C)。对HIV#5、HIV#6和HIV#4的应答分别表明EC50为0.45μM、0.43μM和9.1μM。
实施例25-T细胞制备方案3
材料：
AIM V培养基(Invitrogen)
人类FLT3L，临床前CellGemx#1415-050储备液50ngμL
TNF-α，临床前CellGenix#1406-050，储备液10ngμL
IL-1β，临床前CellGenix#1411-050，储备液10ng/uL
PGE1或Alprostadil–捷克共和国Cayman储备液0.5μg/μL
R10培养基-RPMI 1640谷氨酰胺+10％人血清+1％PenStrep
20/80培养基-18％AIM V+72％RPMI 1640glutamax+10％人血清+1％PenStrep
IL7储备液5ng L
IL1储备液5ng/μL
程序：
步骤1：在2mL AIM V培养基中，用FLT3L在24孔板的每个孔中接种500万个PBMC(或目标细胞)
步骤2：AIMV中的肽加载和成熟
1.将感兴趣的肽池(无肽条件除外)与各自孔中的PBMC(或感兴趣的细胞)混合。
2.孵育0.5至4小时。
3.孵育后，将成熟混合物(包括TNF-α、IL-1β、PGE1和IL-7)混合到每个孔中。
步骤3：将人血清以10％体积的最终浓度添加到每个孔中并混合。
步骤4：用补充了IL7+IL15的新鲜RPMI+10％HS培养基替换培养基。
步骤5：每1-6天孵育期间，用新鲜的补充IL7+IL15的20/80培养基替换培养基。
步骤6：在2ml AIM V培养基中，用FLT3L在新的6孔板的每个孔中接种500万个PBMC(或感兴趣的细胞)
步骤7：重新刺激的肽加载和成熟(新板)
1.将感兴趣的肽池(无肽条件除外)与各自孔中的PBMC(或感兴趣的细胞)混合
2.孵育1小时。
3.孵育后将成熟混合物混合到每个孔中
步骤8：重新刺激：
1.对第一刺激FLT3L培养物进行计数，并将500万个培养细胞添加到新的重新刺激板中。
2.使培养物体积达到5mL(AIM V)，并添加500μL人血清(10体积％)
步骤9：取出3ml培养基，并添加6ml补充有IL7+IL15的RPMI+10％HS培养基。
步骤10：用补充有IL7+IL15的新鲜20/80培养基替换75％的培养基。
步骤11：如果需要，重复重新刺激。
实施例26-使用T细胞制备方案3的实验数据
使用T细胞制备方案3制备T细胞，并分析刺激的T细胞。样品取自两名黑色素瘤患者。使用与实施例24中所述类似的测定分析T细胞。图34显示了pMHC多聚体图，该图量化了从两名黑素瘤患者中诱导的CD8+T细胞应答。如本文所用的，NEO-STIM是指T细胞制备方案。图35显示了在黑素瘤患者中诱导的记忆和从头CD8+ T细胞应答的多功能谱数据，如1、2、3或4种功能的组合所示。一种或多种功能是产生选自IFNγ、TNFα、CD107a和4-1BB的一种或多种因子。图36显示了在黑素瘤患者中诱导的针对突变和野生型肽的记忆和从头CD8+ T细胞应答的特异性。图37A和37B和37C显示了在黑素瘤患者中诱导的记忆和从头应答的细胞毒性谱，其通过CD8+CD107a+T细胞的频率定量(上图)。图37A和37B和37C的下图显示了通过这些T细胞应答杀死靶细胞，如通过aCAS3+肿瘤细胞的频率所量化的。图38A显示了在黑素瘤患者中新抗原特异性CD4+T细胞应答的鉴定。图38B显示了在图38中鉴定的这些CD4+T细胞应答的特异性。图38A为突变型和野生型肽。图38C显示了这些CD4+T细胞应答的多功能性谱，如1、2、3或4个功能的组合所示。一种或多种功能是产生选自IFNγ、TNFα、CD107a和4-1BB的一种或多种因子。
实施例27-使用T细胞制备方案1或2的实验数据
使用T细胞制备方案1或替代方案2制备T细胞。使用与实施例24中所述类似的测定法分析受刺激的T细胞。图39显示了在有或没有添加Epacadostat的情况下在两个健康供体(例如HD66和HD63)中诱导的记忆应答的功能，如1、2或3个功能的组合所显示(例如，一个或多个功能是产生一种或多种选自IFNγ、TNFα和CD107α的因子)。图40显示在添加或不添加Epacadostat的六次重复诱导中诱导的从头CD8+T细胞应答百分比(“命中率”，在四个健康供体中取平均)。图41A显示了用本文提供的T细胞制备方案诱导后，有或没有添加PD-1阻断抗体，来自供体HD55的抗原特异性细胞的绝对数。图41B显示在用本文提供的T细胞制备方案诱导后，有或没有添加PD-1阻断抗体，来自供体HD 67的抗原特异性细胞的绝对数。图42A显示在添加或不添加IL-12的情况下从头CD8+T细胞应答的pMHC+CD8+T细胞分数。图42B显示了在添加或不添加IL-12的情况下从头CD8+T细胞应答中CD8+T细胞的百分比。
实施例28：使用患者特异性新抗原诱导的免疫应答的深度表征
使用生物信息引擎预测患者特异性新抗原。在刺激方案中，将覆盖预测的新抗原的合成长肽用作免疫原，以评估免疫原性。刺激方案包括将这些新抗原编码肽供应至患者来源的APC，然后将其与患者来源的T细胞共培养以引发新的抗原特异性T细胞。
刺激方案中包含多轮刺激，以引发、激活和扩充记忆以及从头的T细胞应答。通过使用以下测定表征这些应答，分析了这些新抗原特异性T细胞的特异性、表型和功能：使用pMHC多聚体的组合编码分析用于检测多种新抗原特异性CD8+T细胞应答。使用多路化、多参数流式细胞术进行的回忆应答测定用于鉴定和验证CD4+T细胞应答。通过测量促炎细胞因子(包括IFN-γ和TNFa)的产生以及CD107a上调作为脱粒的标志物来评估CD8+和CD4+ T细胞应答的功能性。使用表达新抗原的肿瘤细胞系进行细胞毒性试验，以了解CD8+ T细胞应答识别和杀死针对天然加工并呈递的抗原的靶细胞的能力。通过T细胞上CD107a的细胞表面上调和表达新抗原的肿瘤细胞上活性胱天蛋白酶3的上调来测量细胞毒性。在这项研究中，黑色素瘤患者样品(NV6和NV10)是在IRB批准下获得的。
刺激方案成功扩充了先前存在的CD8+ T细胞应答，并诱导了从头CD8+ T细胞应答(表11)。
表11
Figure BDA0003463384270001451
使用来自黑素瘤患者NV10的PBMC，观察到先前存在的CD8+ T细胞应答从4.5％的CD8+ T细胞扩充到72.1％的CD8+ T细胞(SRSF1E>K)。此外，刺激方案可有效诱导两种针对患者特异性新抗原的从头CD8+ T细胞应答(ARAP1Y>H：6.5％的CD8+ T细胞，PKDREJG>R：13.4％的CD8+ T细胞；在刺激过程之前未检测到细胞(图34)。刺激方案使用来自另一位黑色素瘤患者NV6的PBMC成功诱导了针对先前描述的和新型模型新抗原的7种从头CD8+ T细胞应答，直到不同量级(ACTN4K>N CSNK1A1S>L DHX40neoORF 7，GLI3P>L，QARSR>W，FAM178BP>L和RPS26P>L，范围：0.2％的CD8+ T细胞，最高52％的CD8+ T细胞)。此外，针对患者特异性新抗原的CD8+记忆T细胞应答得到了扩充(AASDH neoORF，刺激后高达13％的CD8+ T细胞)。
对来自患者NV10的诱导CD8+ T细胞进行了更详细的表征。在用负载突变肽的DC再次攻击时，新抗原特异性CD8+ T细胞表现出一种、两种和/或所有三种功能(对于SRSF1E>K和ARAP1Y>H，分别具有16.9％和65.5％的功能性CD8+pMHC+T细胞(图35)。
当用不同浓度的新抗原肽再次攻击时，诱导的CD8+ T细胞对突变的新抗原肽有显著的应答，而对野生型肽没有显著的应答(图36)。
在患者NV 10中，使用采用负载突变新抗原的DC的回忆应答测定鉴定了CD4+ T细胞应答(图38A-38C)。鉴定出三种CD4+ T细胞应答(MKRN1S>L、CREBBPS>L和TPCN1K>E)是基于与负载突变型新抗原肽的DC的反应性。当用突变新抗原肽再次攻击时，这些CD4+ T细胞应答也显示出多功能谱。31.3％、34.5％和41.9％的CD4+ T细胞分别显示一种、两种和/或三种功能；MKRN1S>L、CREBBPS>L和TPCN1K>E应答。
还评估了来自患者NV10的诱导的CD8+应答的细胞毒性能力(图37A-37C)。共培养后，SRSF1E>K和ARAP1Y>H应答均显示CD8+ T细胞上的CD107a显著上调，而用突变体构建体转导的肿瘤细胞上的活性胱天蛋白酶3显著上调。
使用刺激方案，通过在患者材料中诱导多种新抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞应答，可以确定预测的患者特异性新抗原以及模型新抗原具有免疫原性。诱导多功能和突变体特异性CD8+和CD4+ T细胞应答的能力证明了预测高质量新抗原和产生有效T细胞应答的能力。在刺激过程结束时，存在多个富集的新抗原特异性T细胞群体(记忆和从头)，证明了产生新的T细胞应答并产生有效的癌症免疫疗法来治疗癌症患者的能力。
实施例29–细胞的选择性消耗的影响
在该实施例中，研究了从PBMC培养物中选择性消耗非必需细胞对细胞群体、离体细胞扩充速率和活化T细胞生成的影响。消耗研究的目的是通过富集必需的APC群体(通过消耗非必需PBMC)来增强CD8T细胞引发。
PBMC分离自供体，HD66、HD67、HD69；并在G-Rex 24孔板中建立细胞培养。在以下肽浓度的存在下培养细胞：0.4μM(0.4mM肽储备液)。肽池：测试了两组肽：高免疫原性和低免疫原性HIV3、ACTN4、CSNK1A1肽。另外，使用MART-1评估具有高前体频率的细胞的扩充，如同记忆T细胞应答的情况一样。PBMC首先按实验组所示经历消耗，然后用Flt3L刺激。这些组包括CD14/25消耗(基础Flt3L)；基础Flt3L+CD11b消耗(使用CD11b生物素AB)；基础Flt3L+CD11b/CD19消耗(使用CD11b生物素AB、CD19微珠)。
读出–在诱导后第16天进行以下测定：细胞的扩充倍数，多聚体分析。细胞计数被表示为绝对数或占总群体的百分比。图46-47显示了在进行所示消耗后第0天的所得细胞。图48显示CD11b和CD19细胞的消耗对扩充的变化倍数没有影响。图49A和图49B显示CD11b或CD11b和CD19的消耗实际上增加了由负载肽的DC引发的幼稚T细胞的命中率。当使用低或高免疫原性肽时没有观察到差异。CD11b和CD11b/CD19细胞的消耗显示在用负载抗原的APC第一次刺激后抗原特异性CD8+ T细胞的显著改善。如图50所示，对于MART-1肽，单次刺激后CD8+抗原特异性T细胞增加了两倍以上(左)。当用高和低免疫原性肽刺激细胞时发现类似的增加。随着多次诱导，增加被进一步放大(数据未示出)。总体而言，pDC和CD141+DC的增加频率与改善的T细胞诱导相关。
研究了通过从PBMC培养物中选择性消耗CD3+、CD19+、CD11b+、CD14+和CD25+细胞进一步富集抗原呈递细胞(APC)，对细胞群体、离体细胞扩充速率和活化T细胞的生成的影响。PBMC分离自供体，HD101、HD113、HD114；并且在G-Rex 24孔板中建立细胞培养。如下消耗三组细胞：5x 10^6个细胞消耗CD14/CD25(基础)；5x 10^6个细胞消耗CD14/CD25/CD11b/CD19(基础+CD11b/CD19)；5X 10^5个细胞消耗CD3/CD19/CD11b/CD25/CD14并与5X 10^6个基础+CD11b/CD25细胞混合，并且该组在描述本实施例的附图中被称为APC。如下根据细胞表面标志物鉴定各种细胞群体：通过检测CD141和Clec9A表达来鉴定CD141+DC；通过检测CDlc表达来鉴定CD1c+DC；通过CD303和CD123表达来鉴定类浆细胞DC(pDC)。如图51A-51C所示，pDC是富集组(APC)内最过度呈现的APC。第一次刺激期间的APC富集提高了命中率(抗原特异性CD8+ T细胞)(图51D和51E)。
实施例30.较早或较晚刺激的细胞对抗原响应性的贡献
为了研究较早或较晚添加的细胞群体对抗原响应性的贡献，在用负载抗原的APC刺激之前，用膜渗透性胺反应性染料(例如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯或TagIT VioletTM)标记细胞(包括T细胞)，并且通过染料的存在和稀释率记录抗原特异性T细胞的扩充。当应用于第二次刺激时，已经培养了14天的细胞群体用一种染料标记，而含有负载抗原的APC和T细胞的新制品的另一细胞群体用另一种染料标记，然后将两个细胞群体混合在一起进行重新刺激或扩充。通过每种染料的存在和稀释率记录这些群体中的每一个对总抗原特异性T细胞池的相对贡献(图52A)。使用该实验设计，注意到新制备的细胞群体在第21天未产生抗原特异性T细胞。注意到当新制备的APC在添加已经培养的细胞前4天或6天(分别为5天领先开始或7天领先开始)预加载抗原时，新制备的T细胞对抗原特异性部分有很大贡献，而提前1天(标准方案，图52B中所示的模式)则没有。同时，注意到当使用提前4天或6天预加载的APC进行重新刺激时，已经培养的T细胞的增殖率降低，导致与标准方案相比总体上较低的抗原特异性细胞数目(图52C)。
实施例31-使用编码新抗原肽的信使RNA诱导免疫细胞
在该实施例中，进行了比较用新抗原肽和编码新抗原肽的信使RNA诱导免疫细胞的研究。
材料：AIM V培养基(Invitrogen)；LS柱，Miltenyi Biotec#130-042-401，CD14MicroBeads，人，Miltenyi Biotec#130-050-201；CD25MicroBeads II，人，MiltenyiBiotec#130-092-983；MACS缓冲液：用autoMACS Finsing溶液(Miltenyi Biotec#130-091-22)1:20稀释的MACS BSA储备溶液(#130-091-376)；人FLT3L，临床前CellGenix#1415-050储备液50ng/μL；CD3微珠，人，Miltenyi Biotec#130-050-101；TNF-α，临床前CellGenix#1406-050储备液10ng/μL；IL-1β，临床前CellGenix#1411-050储备液10ng/μL；PGE1或Alprostadil–来自捷克共和国的Cayman储备液0.5μg/μL；AIMV培养基+2，5，10％人血清+1％PenStrep；IL7储备液5ng/μL；IL15储备液5ng/μL；24孔G-Rex板；IVT mRNA(1μg/μL)；RNAse zap；Lonza P3 Nucelofection试剂盒和缓冲液，带有100ul器皿。
程序：
第0天：PBMC的CD14和CD25消耗以及FLT3L处理
1.PBMC在AIM V培养基中解冻并以1000万个细胞/mL计数。
2.然后通过以300xg离心5分钟使细胞沉淀，并在含有benzonase(1uL/mL)的温培养基中重悬1小时。在benzonase处理后，对细胞进行计数。
3.将MACS LS柱用3mL冷MACS缓冲液洗涤3次。
4.然后将PBMC以300xg离心5分钟，并在50mL试管中每107个细胞重悬于60uL MACS缓冲液中
5.每107个细胞将20ul CD25II微珠和20uL CD14微珠添加到细胞加MAC缓冲液中，并在4度冰箱或冰上孵育15分钟
6.孵育后，通过添加冷MACS缓冲液使细胞总体积达到50mL，并将细胞以300xg离心10分钟。然后倒出上清液，每2x108个细胞将细胞重悬浮于500μL中。
7.使细胞通过连接到Miltenyi MidiMACS柱的LS柱。然后用3mL MACS缓冲液洗柱3次。
8.对通过磁体进入收集管的细胞进行计数并旋转。然后对细胞进行计数，将500万个细胞置于2mL含50ng/mL FLT3L的AIM V中，并接种到24孔板中。
第1天：FLT3L处理的PBMC的核转染
1.将2ml AIM V培养基置于24孔GREX板的孔中。将板与15mL锥形管中的单独5mL培养基一起放入培养箱中以达到平衡。
2.使用细胞提升器，从孔中收获用FLT3L刺激过夜的细胞
3.将所有细胞收集在50mL锥形管中，并用额外1mL冷培养基洗涤孔。然后将细胞以300xg旋转7分钟
4.按照制造商的方案，对FLT3L刺激的PBMC进行CD3分离。将留在磁体上的CD3分离的细胞从柱中排出，计数，并接种到平衡的24孔板的适当孔中，然后放入培养箱中。
5.将从Miltenyi珠分离中作为流过物收集的剩余细胞离心(300xg持续7分钟)，并将沉淀物置于冰上。
6.将1μg-10μg适当的RNA添加到每个AMAXA nucleocuvette容器中并置于冰上(体积保持小于10μL；如果需要，用无RNA酶的水稀释RNA)。
7.将细胞重悬于P3缓冲液中，每个器皿每百万个细胞使用100ul P3缓冲液
8.将100ul P3缓冲液加细胞与RNA在nucleocuvette中混合，并按照制造商的方案酌情使用CB150、DU100、EA100、EU100或CU110方案进行核转染。
9.然后将器皿在冰上孵育10分钟，孵育后，加入100ul预温的培养基。
10.然后将细胞接种在24孔板的适当孔中，并置于培养箱中。
第2天：细胞成熟和人血清添加
1.在核转染后2-3小时加入含有TNF-α、IL-1β、PGE1、IL-7的成熟混合物。然后将板放回培养箱中。8-12小时后，向每孔中加入人血清，使人血清达到孔体积的10％。然后将板放入培养箱中进行培养。
第5、8、10和12天：培养基更换与IL-7和IL-15进料
1.根据培养物生长确定的需要，将含有10％人血清并补充有5ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15的AIMV添加到培养物中。
第12-14天：重复第0天至第2天方案，以重新刺激培养的T细胞
第14天：培养的T细胞的重新刺激
1.收获T细胞培养物，计数，并以1:1的诱导培养物与核转染PBMC的比例用新核转染的培养物重新接种。将人血清添加到培养物中，使人血清的培养体积为AIMV中的10％。
第16和19天：培养基更换与IL-7和IL-15进料
1.根据培养物生长确定的需要，将含有10％人血清并补充有5ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15的AIMV添加到培养物中。
第19-21天：重复第0天至第2天方案，以重新刺激培养的T细胞
第21天：培养的T细胞的重新刺激
1.收获T细胞培养物，计数，并以1:1的诱导培养物与核转染PBMC的比例用新核转染的培养物重新接种。将人血清添加到培养物中，使人血清的培养体积为AIMV中的10％。将任何额外的细胞冷冻保存以供额外分析。
第23天和第26天：培养基更换与IL-7和IL-15进料
1.根据培养物生长确定的需要，将含有10％人血清并补充有5ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15的AIMV添加到培养物中。
第28天：诱导的T细胞的收获
2.收获T细胞培养物，计数，冷冻以供进一步分析。
结果：图53显示了来自上述研究的示例性数据。在研究结束时评价使用新抗原肽(优势肽)或预先鉴定的新抗原肽或编码所述肽的mRNA或编码无关mRNA(GFP)的mRNA刺激细胞导致的扩充倍数。mRNA诱导的细胞显示出令人惊讶的变化倍数增加。值得注意的是，表达GFP的mRNA组只有一个样品，因此将进行进一步的实验以验证该数据。尽管如此，该趋势显示出mRNA诱导的细胞的变化倍数显著增加。
图54显示了来自研究的示例性数据，在该研究中使用了优势肽(病毒肽的混合物)的选择。Irr RNA＝无关RNA。在该实验中，在用mRNA诱导之前，在一些样品中去除了CD3+细胞(在图中表示为-CD3)。比较DOM-RNA和DOM RNA-CD3样品，其中细胞用相同的mRNA诱导，只有CD3细胞首先从表示为DOM RNA-CD3的组中去除，观察到CD3的存在与否并没有导致诱导曲线的巨大差异。一般而言，用编码新抗原肽的mRNA刺激导致抗原特异性T细胞的高水平诱导，如多聚体阳性细胞所示。
图55显示了示例性数据，其中在刺激和扩充结束时获得的CD8+ T细胞通过流式细胞术评价抗原特异性记忆T细胞应答。由病毒肽诱导的实验组中的CD8+ T细胞示于图54上图(EBV BMLF肽，左；编码EBV BMLF肽的mRNA，右)，其显示出相似的特异性谱，大约46％的CD8+T细胞对多聚体具有特异性。图55下图(预先鉴定的ME-1肽，左；编码该ME-1肽的mRNA，右)显示出更高的mRNA对T细胞的诱导。该研究表明，在低免疫原性抗原的情况下，使用mRNA进行诱导可能更有益。
实施例32-增加T细胞引发效率和抗原特异性T细胞产量的方法
在该实施例中，用编码抗原编码序列的mRNA将PBMC直接电穿孔到PBMC群体中，以提高T细胞引发的效率和抗原特异性T细胞的产量。该过程用图56A和56B中的简化工作流程表示。基于受试者的基因组或外显子组测序结果和受试者特异性新抗原的鉴定，还可以从可靠的MHC-肽结合预测器平台开发针对特定受试者的个性化抗原(例如，新抗原)。在国际申请PCT/US2018/017849和PCT/US2019/068084中至少部分地公开了可靠的MHC-肽结合预测器平台，在此通过引用完全并入。在确定受试者的HLA组库(repertoire)后，在预测器中运行对癌症类型具有特异性的潜在抗原表位，并鉴定出排名前列的预测结合物。生成一种或多种RNA构建体。每种RNA构建体包含编码多种抗原的核酸，所述抗原包含鉴定的表位。通过电穿孔或核转染将mRNA引入PBMC中。PBMC表达RNA编码的抗原肽并将其呈递给邻近的T细胞，例如，在抗原呈递细胞与T细胞共培养时，例如在PBMC样品中(图56A)。
对于肽和mRNA刺激的示例性平行比较，将PBMC样品消耗CD14和CD25表达细胞，并使其通过如图56B所示的基本工作流程。
用于递送编码多个免疫原性表位的多核苷酸的RNA构建体设计，以供在PBMC上表 达以进行抗原呈递
示例性的RNA构建体显示在图57A中。RNA构建体包含新抗原串，其中连接编码多个抗原表位的多个mRNA序列以生成5’–3’多联体。至少一种由mRNA编码的抗原是新抗原。该mRNA包含5’-帽、3’聚A尾和编码串联的抗原串的多核苷酸序列，可操作地连接至启动子序列，在这种情况下以T7启动子为例。在加载PBMC中使用的构建体在编码新抗原串的序列上有很大不同，因为它因具体情况而异。该构建体的新抗原串部分的详细视图在图57B中描绘。切割序列如QLGL和K被仔细优化并放置在串联的新抗原串内编码一个或多个抗原的序列之间。单条mRNA链中的特定序列以及编码抗原的序列和切割序列的排列经过单独优化，以获得PBMC的出色表位呈递，进而使抗原响应性T细胞的产量最大化。示例性抗原或新抗原序列获自HIV-3表位、CSNK1A1表位、mCDK4表位、mME1表位和Gli3表位。切割促进序列的设计和放置与某些表位编码序列仔细地并列，确保编码的表位不会在转染mRNA时无意中在表位序列内自然切割，从而每个表位都被呈现以由PBMC表达并呈递。
5’-帽和聚A元件
在mRNA中包含和不包含5’-帽的情况下进行实验。PBMC用带有5’帽(Cap1或Cap0)的mRNA进行转染。注意到CAP1结构对于有效的mRNA递送和表达至关重要。图58A显示在5’-UTR区引入腺苷以帮助共转录引入Cap1结构(CleanCap)。如图58B-58C所示，就降低的细胞毒性(图58B)和mRNA编码的GFP的更高表达(图58C)而言，Cap1引入具有比Cap0更大的优势。优化了聚A尾的长度。约120个核苷酸的聚A尾被认为对mRNA表达有效(数据未示出)。
mRNA内的核苷酸修饰和对T细胞诱导的影响：
通过替换胞苷(C)或尿苷(U)残基进一步修饰mRNA，以增加mRNA的稳定性和抗降解性。在该实施例中，选择性耗尽CD3、CD14和CD25表达细胞的PBMC用GFP mRNA进行核转染，其中所有天然尿苷三磷酸、所有胞嘧啶三磷酸或部分量的两种核苷被修饰，并且在不同时间点跟踪GFP表达。在24小时时进行流式细胞术(中行和底行)。在72小时时，使用Inucyte测量GFP阳性活细胞(顶行)。尿苷残基被修饰为假尿苷，胞苷被修饰为5-甲基胞苷，不同实验组的修饰百分比在表13中示出。
表13-mRNA中的尿苷和胞苷修饰
样品 置换％(U/C)
部分UTP 30/0
全部UTP 100/0
部分UTP/部分CTP 30/30
全部UTP/全部CTP 100/100
全部UTP/部分CTP 100/30
标准 0/0
图59A-59C所示的数据表明，尿苷和胞苷被假尿苷和5-甲基胞苷部分和全部置换有助于更好的翻译，部分UTP置换产生了更多数目的新抗原特异性细胞(图58B)。
当用编码肽的mRNA刺激APC时的高CD8命中率：
以串联的新抗原串的形式构建短聚体(9-10个氨基酸)或长聚体(25个氨基酸)，如图60A中的图形所示。用上述多抗原编码mRNA构建体进行核转染的PBMC用于刺激T细胞，并与包含相同表位的肽进行并排比较。短和长RNA序列产生类似的多聚体响应性CD8+ T细胞(表14)。值得注意的是，使用编码长聚体(和短聚体)的mRNA观察到强大的CD8应答。
表14-肽和RNA的长和短聚体介导的激活的比较
Figure BDA0003463384270001551
如图60B所示，Gli3表位被肽以及mRNA很好地呈现和呈递，然而，mRNA编码的负载Gli3短聚体表位的PBMC导致更多的Gli3特异性CD8+ T细胞(如通过多聚体测定所检测的)。多聚体测定的代表性流式细胞术结果显示在图60C中。相比之下，本文使用的HIV-3或CDK4表位不能被包含长或短聚体序列的mRNA链很好地呈现。短聚体肽序列产生更高比例的CDK4-特异性CD8+ T细胞；肽长聚体产生HIV-3特异性CD8+ T细胞，编码它们的mRNA序列不产生各自的抗原特异性CD8+ T细胞。
诱导PBMC导致多聚体阳性CD8+ T细胞增加
在该实验中，对PBMC进行不同的处理以消耗某些群体，并研究它们的扩充和多聚体特异性。通过用RNA构建体对以下三组PBMC制品进行核转染来测试多聚体特异性T细胞的产量：(i)CD25耗尽的PBMC，(ii)CD14和CD25耗尽的PBMC，(iii)冷冻的CD14和CD25耗尽的PBMC。在制品(i)中，T细胞在核转染过程中没有像制品(ii)和(iii)那样与APC分离。这些与一组负载有肽的PBMC进行了比较。所有细胞在电穿孔前都用FLT3L处理。测试了各种mRNA构建体，图61A中显示了一个代表。总的来说，耗尽CD25的负载RNA的PBMC表现出优异的多聚体特异性CD8+ T细胞，如图161B所示。负载mRNA的CD25耗尽的PBMC优于类似地负载有RNA的新鲜或冷冻的CD14和CD25耗尽的细胞，并且所有负载RNA的PBMC在生成对多聚体有响应性的CD8+ T细胞方面都有优势。在RNA加载步骤之前较少处理PBMC可能是有利的。PBMC群体中多种细胞组分的消耗需要使细胞群体经受多种抗体、洗涤步骤和回收步骤，这相当于对细胞的处理压力。
负载mRNA的PBMC在抗原呈现方面显示出更大的多样性，如图61B和下面的表15A和表15B所示。CD25耗尽的PBMC具有可检测的Gli3特异性CD8+ T细胞和ME1特异性CD8+ T细胞。ME1特异性CD8+ T细胞在所有其他组中都可以忽略不计。图61C显示了表示Gli3特异性细胞的代表性流式细胞术数据。
表15A–供体1
Figure BDA0003463384270001571
表15B–供体2
Figure BDA0003463384270001572
用FLT3L处理过夜的PBMC和CD25耗尽的PBMC用短聚体或较长的RNA构建体进行电穿孔，并在两次刺激后第26天研究抗原特异性(图61D)以及扩充倍数(图61D)。这些数据说明，所编码的表位的长度对于实现稳健的CD8诱导并不重要，这与使用肽长聚体和短聚体刺激的情况下的观察结果形成对比。
不同成熟混合物的效果
研究了几种细胞因子和生长因子的混合物，其用于包含在T细胞培养基中以扩充PBMC刺激的T细胞。培养基中的组分统称为T细胞成熟混合物。在一组示例性实验中，对来自两个供体的PBMC如前所述用mRNA构建体进行核转染，并在来自每个供体细胞的样品组中测试了用于T细胞扩充的不同成熟混合物。测试的各种细胞因子混合物在以下表15C中列出。其他待测试的细胞因子混合物包括IFN-γLPS、聚I和聚C以及CD40；以及TLR-7/8和LPS。
表15C.在成熟混合物中测试的细胞因子和生长因子混合物。
组 成熟混合物
1 IFN-γ，LPS
2 TNF-α，IL-1β，IL-6，PGE-2[TIIP(IL6)]
3 TNF-α，IL-1β，IL-7，PGE-2[TIIP(IL7)]
结果示于图62B-62D中。LPS+IFN-γ的添加与第26天更高的多聚体特异性细胞相关。还测试了每个表位是否随时间由PBMC表达，或者一个或多个的表达是否受到损害。
CD25耗尽的PBMC细胞用RNA进行电穿孔(图60C中所示)并培养24小时。在所示的时间收获细胞，沉淀，并快速冷冻。对HLA-A02:01-肽复合物进行免疫沉淀，然后将肽洗脱并通过LC-MS/MS进行分析。从电穿孔的细胞中洗脱的肽(轻)与重标记的标准肽(重)进行比较，以进行阳性鉴定。(图63A)。图63B显示，肽Gli3、HIV3、mACTN4、mCDK4和mME1中的每一种都容易地表达为显性表位。
除了多聚体测定之外，还评估了这些扩充的T细胞的功能性。通过该方法生成的CD8 T细胞对特定表位具有免疫响应性，并以所示的不同剂量释放TNF-α和/或IFN-γ或CD107a(图64A-64B)。与上述数据一致，与生成较少特异性T细胞的肽相比，高免疫原性肽如Gli3的细胞因子应答更高。图65示出了为生成最佳产品而考虑的标准。
实施例33-T细胞治疗剂的制备方案
T细胞治疗产品在下面总结的多步骤过程中制备(图66)。制备过程包括以下步骤：(A)肿瘤活检：进行肿瘤活检以提供用于DNA和核糖核酸(RNA)测序的组织。来自患者的外周血样品用作“正常”组织对照。(B)测序和生物信息学：使用患者肿瘤和正常样品的全外显子组DNA测序和RNA测序以及肿瘤的RNA测序来鉴定并验证突变。对免疫原性表位进行预测并确定优先顺序，并用来设计随后将被制备的肽。生物信息学过程利用了可公开获得的和专有的软件组件的组合。图66示出了从样品收集开始到患者中突变鉴定再到以逐步方式生成肽的功能序列。(C)选定的合成肽的制备：制备两组肽，每组最多30-35种肽。第1组是8-11个氨基酸(主要是9-10个氨基酸)，以通过MHC I类与抗原呈递细胞(APC)的直接结合来特异性地针对CD8+细胞的生成，而第2组是大约25个氨基酸，以特异性地针对CD4+细胞在被APC内化和重新呈递后的诱导。(D)细胞分离：进行血液成分分离以提供患者APC和T细胞作为T细胞治疗剂的起始材料。(E)抗原呈递细胞的分离：从血液成分分离起始材料中分离抗原自体CD14+树突细胞(抗原呈递细胞)。这些树突细胞随后加载上述新抗原肽。(F)T细胞扩充：从血液成分分离产品中分离的T细胞与负载肽的树突细胞共同孵育。对患者的新抗原特异性T细胞进行诱导、刺激和扩充。产生的细胞产品能够直接或间接识别并破坏肿瘤细胞，在淋巴消耗化疗后重新输注到患者体内。
不希望受理论的束缚，T细胞治疗剂的作用模式基于用识别患者自身新抗原特异性表位的自体CD3+ T细胞治疗患者。一旦施用于患者，抗原特异性T细胞就预期在体内扩充，并通过诱导凋亡的配体或裂解颗粒的释放来消除表达所述抗原的肿瘤细胞，从而导致患者肿瘤消退和无进展存活。
起始材料：患者自身的树突细胞和T细胞通过血液成分分离获得(血液成分分离产品)。血液成分分离根据最佳实践在当地授权的标准方案下在诊所进行。表16显示了患者血液成分分离产品的示例性接受标准。
表16-患者血液成分分离产品的接受标准
Figure BDA0003463384270001601
使用生物信息学过程导致选择患者特异性肽，随后制备这些肽并用于制备T细胞产品。生物信息学软件由申请人许可的可商业获得和可公开获得的软件以及专有算法的组合组成，这些软件和算法串联使用以鉴定突变并选择用于制备肽的序列。生物信息学过程从来自标准测序技术的数据开始。首先，需要软件算法来鉴定并选择患者特定的突变。其次，使用标准方法对所有候选物进行肽-MHC结合的预测。组合这些成熟的技术允许对用于T细胞刺激的肽进行排名和选择。所有软件都经过评价，以证明适合预期用途，以支持1期临床试验。专有算法经测试和验证符合规范，并且如预期的那样始终获得所得的表位序列选择。
关键原材料：制备合成新抗原肽以提供两组肽，每组最多30-35种肽。根据从生物信息学过程预测的患者特异性新抗原序列，第1组是8到11聚体(用于诱导CD8+新抗原特异性T细胞)，第2组是大约25聚体(用于诱导CD4+新抗原特异性T细胞)。
合成肽不是递送给患者的药物产品的一部分，因此不构成起始材料。它们作为纯度至少为90％的纯化产品获得并使用。这些肽在单核细胞衍生的DC成熟之前添加，随后将其添加到患者的T细胞中，以诱导、刺激并扩充能够识别并直接或间接消除患者肿瘤细胞的新抗原特异性T细胞。肽非常可能通过降解(在37℃的水性条件下长时间孵育)、细胞洗涤和稀释制备单元操作而被清除，并且不会作为药物产品发布的一部分进行测试。
根据肽在MHC I类和II类等位基因上的呈递，合成这2组肽，以帮助确保CD8+和CD4+细胞均得到刺激。
非临床开发：迄今为止的体外药理学研究的结果表明：在来自健康供体的细胞中，新抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞可以从幼稚T细胞区室中诱导出来——从而可能扩大可以识别并消除目的肿瘤的T细胞的组库。可以进一步扩充预先存在的CD8+记忆T细胞应答。这已在T细胞对常见病毒表位的应答中得到证明，预计其行为方式与新抗原特异性记忆T细胞应答相同。通过刺激后多种炎性细胞因子的分泌而测量的多种T细胞效应子功能，即新抗原和病毒特异性T细胞的多功能性，已经得到证明，这被认为与临床有效的免疫应答有关。来自多个小组的研究表明，具有效应记忆和中央记忆表型的T细胞是过继细胞疗法的最佳群体。这些群体已被证明在转移后持续存在，并且还具有增殖和维持细胞毒性功能的能力。始终是，T细胞治疗产品中超过75％的新抗原诱导的T细胞在培养约4周后具有效应记忆表型(CD45RA-/CD62L-)。
交叉反应性评价表明，来自健康供体的新抗原特异性CD4+ T细胞是从幼稚区室诱导的，当受到新抗原肽池及其野生型对应物的滴定攻击时，对突变体有明显反应，但对相应的天然肽没有反应。这些发现表明，诱导的T细胞产品对突变的靶标具有高度特异性。计划进行进一步的研究，包括使用来自荷瘤患者供体的细胞以及基于杀死表达目的新抗原的荷瘤患者供体的肿瘤细胞系(卵巢癌和非小细胞癌)的概念验证。
从树突细胞培养物的衍生开始到完成药物产品的制备，该制备过程是连续的。因此，考虑到表17中所示的产品发布测试方案，原料药是刚好在装入输液袋之前重悬于冷冻保存介质中的细胞。药物产品是在其最终容器和密闭系统中配制的原料药。
原料药是重悬在冷冻保存介质中的T细胞治疗性自体CD3+ T细胞。
药物产品是重悬在冷冻保存介质中并装入最后的袋中以供输注的T细胞治疗性自体CD3+ T细胞。
发布测试
外观检查
通过目视检查NEO-PTC-01药物产品输液袋进行外观检查。
CD3+ T细胞身份和纯度
使用流式细胞术分析确定NEO-PTC-01的身份和纯度。多色流式细胞术能够分析异质细胞产品，并提供基于每个细胞的多参数信息。用于NEO-PTC-01测试的流式细胞术方法在用于分析的标志物组中包含四种标志物；CD3、CD14、CD25和活/死。该分析如下进行：解冻NEO-PTC-01的QC冷冻管。将细胞加入96孔板中，并用抗CD3、抗CD14、抗CD25和活死染色剂染色。CD3是T细胞的标志物。CD14和CD25被包括在用于过程监测的标志物组中。该分析报告的结果是％活CD3+细胞。
活力
NEO-PTC-01的活力测试根据EP 2.7.29使用台盼蓝排除试验进行。将NEO-PTC-01QC冷冻管解冻，并以1:1的比例与台盼蓝混合。使用以下等式确定活力百分比：
((活细胞)/(总细胞计数))x100＝活力百分比。
细胞计数
使用NEO-PTC-01的QC冷冻管进行最终细胞计数。根据EP 2.7.29使用血细胞计数器进行细胞计数。根据计数的细胞数、样品稀释因数和用于分析的样品体积确定细胞浓度。活细胞计数用于确定用于患者的细胞剂量。
内毒素
使用NEO-PTC-01的QC冷冻管，使用Endosafe-Portable Test System(PTS)系统(Charles River)进行内毒素检测。Endosafe-PTS系统是一种分光光度计，其测量与样品中的内毒素浓度直接相关的颜色强度。颜色是通过样品与显色的鲎变形细胞溶解物(LAL)的反应而显现的(动力学显色试验方法)。Endosafe-PTS系统符合EP 2.6.14的所有要求。该系统使用FDA许可的一次性药筒。该分析中使用了加标回收(Spike recovery)对照来确认样品基质中不存在抑制/增强。
支原体
NEO-PTC-01的支原体检测使用核酸扩增(NAT)来进行。在该方法中，将含有NEO-PTC-01细胞的最终收获样品接种到两种类型的肉汤培养基中。适当的阳性(掺加50个菌落形成单位(CFU)的支原体)和阴性对照(掺加生理盐水的肉汤)都包括在该分析中。接种的样品在35-37℃下孵育96±4小时。在孵育期结束时，从每个样品中提取DNA。DNA在qPCR反应中用作模板，使用SYBR绿色作为荧光染料。该检测方法符合使用EP 2.6.7中描述的NAT技术进行的支原体检测。该分析中使用加标回收对照来确认样品基质不会干扰该检测方法检测支原体污染的能力。
无菌性
NEO-PTC-01的无菌检测使用BacT/Alert无菌性系统(BioMerieux)来进行。BacT/Alert系统是一种自动化的基于生长的系统，它利用微生物本身的新陈代谢来确定无菌性污染。微生物污染物代谢BacT/Alert瓶中所含的生长培养基，并产生CO2作为副产物。每个小瓶包含比色传感器。当传感器吸收微生物产生的CO2时，它会产生不可逆的颜色变化。一旦达到检测阈值，仪器就会将测试小瓶标记为阳性。在孵育期内每10分钟自动读取一次读数。BacT/Alert系统用于过程中(第14天上清液，每个单独的容器)和最终配制的NEO-PTC-01。NEO-PTC-01最终产品的无菌性检测按照EP 2.6.27和EP 2.6.1进行，直到BacT/Alert系统的验证完成。用于NEO-PTC-01检测的样品体积大于等于总产品体积的1％，分为两种培养基类型(厌氧和需氧)。BacT/Alert系统使用产品特定的矩阵NEO-PTC-01检测进行验证。第3.2.P.5.3节提供了更多详细信息。该数据将用来支持<14天的无菌性检测方法。
用来评价NEO-PTC-01中的细胞类型的表征测试流式细胞术
已经开发了流式细胞术组来评价NEO-PTC-01中的CD3+ T细胞亚群和非CD3+细胞类型(包括髓系细胞、B细胞和NK细胞)。另外，使用标志物来定义产品的分化状态。标记物包括CD3、CD4、CD8、Vγ9、CD56、CD14、CD19、CD11c、CD11b、CD62L、CD45RA。NEO-PTC-01中CD4+和CD8+亚群的百分比被报告为活CD3+阳性细胞的百分比。
NEO-PTC-01中残留的IL-7和IL-15的评价
在一些实施方案中，NEO-PTC-01中残留的IL-7和IL-15的水平可以使用夹心免疫测定与电化学发光检测分析试剂盒(MesoScale Discovery)来确定。
使用pMHC多聚体的组合编码分析
使用肽-MHC(pMHC)多聚体的组合编码分析用来确定新抗原特异性CD8+ T细胞应答的数目和幅度。T细胞通过将T细胞受体(TCR)与靶细胞表面上表达的肽MHC复合物结合来识别其靶标。通过重组产生pMHC复合物并将它们与荧光团偶联，它们可以用作试剂，以通过流式细胞术检测抗原特异性T细胞。为每种用于NEOPTC-01制备的患者特异性短肽生成pMHC多聚体。这允许对新抗原特异性CD8+ T细胞的总分数进行计算，并鉴定被NEO-PTC-01识别的表位。为了进行该分析，将NEO-PTC-01解冻，洗涤，并用pMHC多聚体和一组表面标志物(包括CD8、CD4、CD14、CD16和CD19)染色。CD4-/CD14-/CD16-/CD19-、CD8+、pMHC+ T细胞的分数使用流式细胞术来定量。没有pMHC多聚体试剂可用于确定CD4+ T细胞应答。因此，抗原回忆测定用于该分析。
抗原回忆测定
流式细胞术与24小时回忆测定相结合，用来评估NEO-PTC-01中新抗原特异性CD4+T细胞应答的数目和幅度，以及诱导的CD4+和CD8+ T细胞的多功能性谱。NEO-PTC-01与负载或未负载患者特异性肽的树突细胞共培养。24小时后，使用两种测定输出来表征细胞产品：·使用流式细胞术鉴定新抗原特异性CD4+ T细胞群体，被定义为与阴性对照相比，在靶抗原的存在下，CD4+ T细胞上IFNγ和/或TNFα的表达增加。·使用流式细胞术评估新抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的多功能谱。通过与阴性对照相比，在靶抗原的存在下，IFNγ、TNFα和/或CD107a的表达增加来定义多功能谱。在CD8+反应性的背景下，新抗原特异性细胞在CD8+pMHC+ T细胞上进行预门控，然后评估多功能性。
自体肿瘤的识别
在暴露于自体肿瘤细胞时检测到功能性T细胞被用来确定存在抗原特异性T细胞，并且其对肿瘤细胞表面上呈递的抗原水平敏感。该测定使用来源于患者的自体肿瘤消化物。NEO-PTC-01与自体肿瘤细胞共培养4小时。与阴性对照(单独的NEOPTC-01)相比，在靶抗原的存在下，IFNγ、TNFα和/或CD107a的表达增加允许在NEO-PTC-01中鉴定出能够识别自体肿瘤的T细胞。
细胞毒性测定
使用负载肽的或稳定转导的靶细胞进行的细胞毒性测定表明，抗原特异性T细胞能够在抗原识别后杀死肿瘤细胞。该测定使用黑素瘤肿瘤细胞系A375，该细胞系可以被工程改造为稳定表达目的抗原以及相关的人类白细胞抗原(HLA)等位基因。NEO-PTC-01与A375肿瘤细胞共培养6小时，然后通过CD8+ T细胞上CD107a的脱粒和肿瘤细胞上活性胱天蛋白酶3(早期凋亡的标志物)的上调来测量细胞毒性。
表17显示了示例性发布测试和规范。表18显示了产品的示例性表征。
表17–发布测试和规范
Figure BDA0003463384270001651
Figure BDA0003463384270001661
为了降低将污染引入已灌装的药物产品输液袋中的风险，从原料药制备过程步骤中取得发布测试样品(重悬在最终制剂中的CD3+ T细胞)。这种方法的一个例外是用于支原体检测的样品，这将在收获T细胞培养物时取得。这是细胞在培养中时间最长但在细胞洗涤之前的制备步骤。因此，就检测到污染的风险而言，该制备阶段代表了最坏的情况。
表18–表征试验
Figure BDA0003463384270001662
Figure BDA0003463384270001671
Figure BDA0003463384270001681
表19-T细胞治疗性药物产品稳定性测试间隔和测试
时间点 测定
T初始 细胞计数，活力，身份，效力，无菌性，内毒素，支原体
T1 M 细胞计数，活力，身份，效力，无菌性，内毒素
T3 M 细胞计数，活力，身份，效力
T6 M 细胞计数，活力，身份，效力，无菌性，内毒素
实施例34-在卵巢癌患者中使用T细胞疗法(上文公开的T细胞治疗剂)的方案
该实施例描述了一项提出的在对铂敏感的高分级浆液性卵巢癌患者中对新抗原激活的T细胞疗法(以下称为“T细胞治疗”)的开放标签、单臂、I期研究。
主要目标：评价T细胞治疗剂单次输注在患有铂敏感性疾病且经历无症状复发的转移性卵巢癌患者中的安全性。次要目标：(i)根据实体瘤反应标准(RECIST)v1.1，通过无进展生存期评估确定抗肿瘤活性。(ii)通过无化疗间隔、至第一次后续治疗的时间和总生存期评估确定抗肿瘤活性。探索性目标包括：(i)通过在T细胞治疗剂治疗之前、期间和之后评价细胞免疫应答(包括外周血和肿瘤活检中的抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞应答)来表征免疫原性。(ii)表征输注细胞的克隆扩充、持久性和表型。(iii)将患者反应与探索性生物标志物如PD-L1表达、体细胞突变负荷和新抗原负荷相关联。
研究设计：剂量评价：
T细胞疗法是一种自体个性化、新抗原特异性过继T细胞疗法，将施用于接受不超过一种先前铂类疗法治疗的对铂敏感的高分级浆液性卵巢癌患者。在至少相隔一周的两次测量中记录到至少是基线水平两倍的CA 125升高后，将招募患者。15名患者计划完成治疗。该研究以剂量递增的形式进行，最大剂量为1x1011个CD3+细胞。没有定义最小剂量。由于产品的个性化性质，细胞剂量可能因患者而异。1x1011个CD3+细胞的最大剂量基于类似产品，如TIL疗法。在现有的TIL疗法研究中，患者接受了宽范围的细胞剂量，细胞剂量与临床益处之间没有任何明确的关联。预计输注的细胞会因患者而异地扩大。由于没有证据表明这种扩大与患者体重或体表面积有关，因此采用了平面固定(flat-fixed)剂量递增方案。
治疗：
在发布T细胞治疗剂以供患者施用时，他们接受重复的放射学评估并开始使用环磷酰胺30mg/kg/d为期2天(第-5和-4天)和氟达拉滨25mg/m2/d为期3天(第-3、-2和-1天)的预治疗方案。在第0天，T细胞治疗剂作为单次静脉内输注施用。在前三名患者中评估1x1010个CD3+细胞的初始剂量。以该剂量水平向患者的输注至少错开2周以评估毒性。如果该剂量水平的输注耐受良好，则第二个剂量水平(3名患者)接受1x1011个CD3+ T细胞。在该较高剂量下的细胞输注也至少错开2周以评估毒性。如果三名患者对1x1011个细胞的输注耐受良好，则所有后续患者都接受最多1x1011个细胞。所有治疗都在住院环境中进行。以每名患者为基础制备T细胞治疗剂，预计制备的细胞数存在异质性。如果制备的剂量在剂量水平1中高于1x1010个CD3+，或在剂量水平2中高于1x1011个CD3+细胞，则仅给出代表目标剂量水平的制备剂量的一部分。如果制备的剂量低于这些目标剂量水平，则给予该剂量，但患者不被视为DLT可评价的，并且为了3+3设计的目的而被替换。最大耐受剂量(MTD)定义：具有可接受的副作用的输注细胞的最高剂量。
表20–剂量群组
Figure BDA0003463384270001701
剂量范围：
没有定义最小剂量。由于产品的个性化性质，细胞剂量可能因患者而异。1x1011个CD3+细胞的最大剂量基于类似产品，如TIL疗法。在现有的TIL疗法研究中，患者接受了宽范围的细胞剂量，细胞剂量与临床益处之间没有任何明确的关联。预计输注的细胞会因患者而异地扩大。由于没有证据表明这种扩大与患者体重或体表面积有关，因此采用了平面固定(flat-fixed)剂量递增方案。在前三名患者中评估1x1010个CD3+细胞。如果以该剂量输注耐受良好，则后续患者接受最多1x1011个CD3+细胞。
剂量限制毒性(DLT)：
剂量限制性毒性的定义如下：细胞输注后24小时内发生3级或更高的毒性(与细胞输注有关)。在服用两剂1000mg口服(PO)对乙酰氨基酚或两剂2mg口服(PO)氯马斯汀的情况下，毒性不得在8小时内逆转至小于或等于2级。3级自身免疫。毒性不得在10天内消退或逆转至小于或等于2级自身免疫毒性。任何4级自身免疫毒性。任何3级或更高的非血液学毒性
由于淋巴消耗化疗方案或支持性药物施用引起的预期毒性不被视为DLT。
细胞因子释放综合征(CRS)定义和治疗：
细胞因子释放综合征是一种严重的免疫系统毒性，已在嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和双特异性T细胞参与抗体中观察到。这些疗法的特征在于超生理性T细胞激活，这导致了令人印象深刻的临床疗效，同时也引起显著和偶尔严重的CRS毒性。CRS是一系列炎性症状，由与T细胞参与和增殖相关的细胞因子升高引起。虽然在大多数情况下，这些症状包括轻度发热和肌痛，但它们也可能表现为严重的炎性综合征，伴有血管渗漏、低血压、肺水肿和凝血功能障碍。
尽管任何免疫激活疗法都存在CRS风险，但申请人认为T细胞治疗剂的CRS风险极低。T细胞治疗性细胞产品未经遗传修饰，且T细胞未经刺激、激活或改造为在超生理水平下发挥作用。值得注意的是，TIL疗法未观察到CRS。
根据来自CAR-T细胞临床研究的CRS经验，申请人在T细胞输注后监测CRS，并在T细胞输注后每天测量外周血C反应蛋白、铁蛋白和IL-6。用白介素6受体阻断抗体托珠单抗治疗已经实现了严重细胞因子释放综合征的快速逆转，托珠单抗被纳入本研究中严重CRS的处置中。
安全性审查委员会(SRC)
SRC酌情由现场研究者、资助者医疗监督员、资助者研发主管和特别成员组成。持续进行仔细评估，以确定细胞输注的毒性、免疫学效果和抗肿瘤功效。
研究阶段：
(1)CA 125的预筛查。铂类敏感患者(定义为对一线铂类化疗的临床反应大于或等于6个月)每三个月接受一次CA 125检测。基线CA 125水平被定义为在完成一线铂类化疗后的前六个月内记录到的最低值。
无症状CA 125升高的筛查。当检测到至少是基线水平两倍的CA 125升高时，患者接受CT扫描以确定疾病负担的程度；所有扫描都在本地进行审查，并在需要时进行中央审查。至少一个部位有可测量病变的患者接受筛查以确定资格。筛查程序包括完整的病史，包括既往癌症治疗和相关手术、同步用药、完整的体格检查、东部肿瘤合作组(ECOG)体力状态(PS)、生命体征、12导联心电图(ECG)和临床实验室评估(血液学、化学、尿液分析、妊娠试验、甲状腺检验)。
治疗前包括活检和血液成分分离。符合上述筛查标准的患者被纳入试验中。入组后，患者在筛查后的14天内进行肿瘤活检或手术切除，以获得用于测序和个性化突变分析的组织。肿瘤活检必须是福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)，并且根据病理学评估至少含有30％的肿瘤细胞性。平行地获取外周血样品作为“正常”组织对照以及用于人类白细胞抗原(HFA)I类和II类分型。从肿瘤和正常组织中获得DNA，并提交进行全外显子组测序，以鉴定患者独特的突变情况。平行地对肿瘤RNA进行测序，以表征基因表达。剩余的肿瘤组织也提交进行肿瘤标志物和免疫细胞标志物的免疫组化分析。在治疗前期间，患者还接受至少6倍血容量的血液成分分离。从血液成分分离中分离的T细胞和抗原呈递细胞用于生成T细胞治疗性药物产品。
T细胞治疗剂产生。T细胞治疗剂的产生在肿瘤活检和血液成分分离后的12-16周内进行。该产品是自体个性化的、新抗原特异性的过继T细胞治疗剂，由CD3+ T细胞组成，这些细胞已用负载有来自每个单独患者肿瘤的新抗原肽的自体抗原呈递细胞进行离体扩充。所述新抗原肽对患者的肿瘤细胞是特异的，对患者也是独特的，因为它们是基于对每个患者肿瘤中突变的序列分析而设计的。
治疗
在患者的T细胞产品发布时，他们接受重复的放射学评估并开始使用环磷酰胺30mg/kg/d为期2天(第-5和-4天)和氟达拉滨25mg/m2/d为期3天(第-3、-2和-1天)的预治疗方案。在第0天，T细胞治疗剂作为静脉内输注施用。在前三名患者中评估1x1010个CD3+细胞的初始目标剂量。对于接受1x1010个细胞的前三名患者，患者至少错开2周以评估毒性。如果该剂量水平的输注耐受良好，则第二个剂量水平的患者接受1x1011个CD3+ T细胞。对于接受1x1011个细胞的前三名患者，在该较高剂量下的细胞输注至少错开2周以评估毒性。如果三名患者对1x1011个细胞的输注耐受良好，则所有后续患者都在第0天接受最多1x1011个细胞的单次T细胞治疗剂输注。所有治疗都在住院环境中进行。以每名患者为基础制备T细胞治疗剂，预计剂量存在异质性。如果制备的剂量在剂量群组1中高于1x1010个CD3+，或在剂量群组2中高于1x1011个CD3+细胞，则仅给出代表目标剂量水平的制备剂量的一部分。如果制备的剂量低于这些目标剂量水平，则可以给予该剂量，但患者不被视为DLT可评价的，并且为了3+3设计的目的而被替换。从第1天开始，以5mcg/kg/天(不超过300mcg/天)的剂量皮下施用非格司亭。非格司亭给药每天继续，直到嗜中性粒细胞计数>1.0x109/L X 3天或>5.0x109/L。如果在12-16周的生产阶段，患者出现需要立即治疗的症状进展，他们可以继续研究，如果临床上合适，则在第二次复发时接受T细胞治疗，如CA 125高于基线2倍的升高所记录的那样。
随访
本研究的主要治疗阶段是第1周至第52周。在主要治疗阶段进行的安全性评估包括不良事件(AE)收集、针对症状的身体检查、生命体征测量、ECOG PS和安全性实验室评估。用于评价对治疗的反应的放射学评估在第12、24和48周进行。非格司亭给药后大约4-6周，患者接受全面的肿瘤评估以及毒性和免疫学参数的评估。在进行该方案时，患者不接受其他实验性药物。用于全面免疫监测的外周血单核细胞(PBMC)在T细胞治疗输注后的4小时、4天、14天、1个月和此后每月的时间点从80-120cc外周血抽血中获得。除了治疗前的活检外，还必须在第20周与第24周之间和/或在疾病进展时进行针芯活检或手术活检。
实施例35–用于转移性黑素瘤的过继细胞治疗的自体新抗原特异性T细胞产品的 开发
可放大的工艺工程化、T细胞制备和质量控制
在该实施例中，显示了使用对转移性黑素瘤患者的白细胞分离术的多个成功工艺工程化运行的结果。NEO-STIM是一种专有的离体诱导过程，生成新抗原特异性T细胞产品(NEO-PTC-01)，其中含有针对来自每个单独患者肿瘤的多种新抗原的高度特异性T细胞应答；这些T细胞应答是多功能的，并且可以识别自体肿瘤。临床试验计划使用此处描述的过程开始。NEO-PTC-01的临床程序的通用工作流程在图1A和67中以图形方式呈现。该程序的设想优势在图67中进行了概述。
描述了诱导过程NEO-STIMTM，它引发、激活并扩充多种新抗原特异性T细胞应答。药物产品NEO-PTC-01的特性——特异性、功能性和表型——有望带来临床益处并克服其他细胞疗法面临的挑战，包括但不限于降低抗原逃逸的风险，降低脱靶毒性的风险，选择最佳的T细胞表型来驱动持久性和肿瘤细胞杀伤，涵盖整个实体瘤的广阔临床机会，以及利用生成预期毒性有限的非工程化细胞产品的优势。产生了新抗原特异性T细胞产品(NEO-PTC-01)，其含有针对来自每个单独患者肿瘤的多种新抗原的高度特异性T细胞应答；这些T细胞应答是多功能的，并且可以识别自体肿瘤。
荷兰癌症研究所的生物治疗单位(Biotherapeutics Unit of NetherlandsCancer Institute)——Antoni van Leeuwenhoek(NKI-AVL)使用来自健康供体的PBMC和在IRB批准下获得的3个黑素瘤患者样品进行了四次工艺工程化运行(表22)。
对于黑素瘤患者，使用T细胞表位预测程序预测患者特异性新抗原。对于HD108，使用先前鉴定的仅限于供体HLA等位基因的新抗原和模型抗原来执行NEO-STIM。生成长度为8至25个氨基酸的合成肽。NEO-STIM用来引发、激活并扩充记忆和从头T细胞应答，每个容器使用多达50x106个PBMC。
这些新抗原特异性T细胞的特异性、表型和功能性通过使用以下测定表征这些应答来分析：
■使用pMHC多聚体的组合编码分析。
■详细的流式细胞术表征。标志物包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD45RA和CD62L。
■使用多重化、多参数流式细胞术的回忆应答测定，以a)鉴定并验证CD4+T细胞应答，b)评估CD8+和CD4+T细胞应答的多功能性，以及c)评估识别自体肿瘤的能力。测量了促炎细胞因子IFN-γ和TNFα，以及作为脱粒标志物的CD107a的上调。
■使用表达新抗原的肿瘤细胞系的细胞毒性试验，以了解新抗原特异性CD8+T细胞应答响应于天然加工并呈递的或外源负载的抗原识别并杀死靶细胞的能力。
结果
为NEO-PTC-01(过继T细胞治疗产品)的制备提供信息的临床前开发活动成功地使用对健康供体和3名转移性黑素瘤患者的白细胞分离术进行了4次工艺工程化运行。
对于所有4次工艺工程化运行，生成的最终药物产品符合发布规范(表21)。
表21–符合接受标准的药物产品的结果
Figure BDA0003463384270001751
大多数最终药物产品由CD3+T细胞组成(范围：67.4％至90％)。B细胞、NK细胞和APC构成非CD3+部分(图68)。
从PBMC诱导19种CD8+和25种CD4+T细胞应答(对于CD8+和CD4+T细胞，每名患者的范围分别为4-5和4-7，表22，图69A-69C)。在来自黑素瘤患者的PBMC中诱导的所有T细胞应答都被假定为从头T细胞应答；在未经操作的起始材料中没有检测到预先存在的应答。来自健康供体的PBMC也是如此；然而，已确定的应答之一是针对MARTI，已知其在外周血中具有高前体频率。因此，该过程成功地诱导了来自幼稚区室的T细胞应答。另外，在健康供体中，已知具有高前体频率的T细胞应答得到扩充，这类似于记忆T细胞应答的扩充。
表22-工程化运行的诱导的设计
Figure BDA0003463384270001761
进行了进一步的表征以评估NEO-STIM诱导的CD8+和CD4+T细胞的多功能性谱和分化状态。在用突变的负载肽的DC再次攻击后，新抗原特异性T细胞表现出1、2和/或3种功能(CD8+和CD4+T细胞应答的多功能性谱的实例分别显示在图69C和图70下图中)。图70上图展示了代表性数据，其表明在代表性诱导应答中表达IFN-γ和/或TNF-α的CD4+细胞的分数。右上图描绘了指示IFN-γ+CD4+T细胞的示例性流式细胞图的代表性数据。另外，还评估了药物产品的分化状态。大多数NEO-STIM诱导的T细胞具有效应记忆和中央记忆表型(图71)。
NEO-STIM诱导的T细胞应答显示对突变表位是高度特异性的。评估诱导的CD8+和CD4+T细胞应答的特异性，并将其分配到2个类别(图72)：(i)突变体反应性和(ii)野生型交叉反应性。突变反应性类别是(a)突变体特异性，其显示针对突变型而非野生型表位的IFN-γ和/或TNFα显著增加；和/或(b)突变体选择性，其显示针对突变型和野生型表位的IFN-γ和/或TNFα显著增加。然而，与野生型表位相比，针对突变型表位的信号明显更高。野生型交叉反应类别显示针对突变型和野生型表位的IFN-γ和/或TNFα显著增加。这2个信号之间没有显著差异。总之，对于CD4+区室，在两个类别中都检测到了T细胞应答；85％的CD4+T细胞为突变体反应性，而15％对野生型表位有交叉反应性。对于CD8+T细胞区室，100％的所有T细胞都是突变体反应性的(表23)。
表23-所有检验的应答的总结，使用Tukey检验指定显著性，P<0.05
Figure BDA0003463384270001771
最后，对于鉴定的T细胞应答的亚组，评估了NEO-STIM诱导的T细胞的细胞毒性能力。为试运行和ENG-01生成转导的肿瘤细胞系，其表达供体特异性HLA等位基因以及研究的突变。对于ENG-02，使用表达供体特异性HLA等位基因的负载肽的肿瘤细胞(图73)：
i.针对RELG>R(试运行)和LRBAS>L(ENG-01)的CD8+T细胞应答显示在共培养后，CD8+T细胞上的CD107a以及用突变构建体转导的肿瘤细胞上的活性胱天蛋白酶3的显著上调。
ii.针对TENM3S>L和ITPR3E>K(ENG-02)的CD8+T细胞应答显示在与负载肽的肿瘤靶标共培养后，肿瘤细胞上活性胱天蛋白酶3的显著上调，以及在TENM3S>L的情况下，CD8+T细胞上的CD107a上调。
重要的是，将从ENG-01和ENG-02产生的T细胞与可获得的自体肿瘤消化物共培养证明，基于新抗原特异性T细胞上IFN-γ+和CD107a的上调，诱导的T细胞能够直接识别自体肿瘤细胞(图74)。
使用该示例性诱导过程，可以以治疗规模从黑素瘤患者的PBMC可重复地产生有效的T细胞产品。该诱导过程诱导多种CD8+和CD4+ T细胞应答。诱导的T细胞应答是突变型反应性的，显示出多功能谱，并具有中央和效应记忆表型。诱导的T细胞应答具有细胞毒能力，表现为识别表达抗原的肿瘤细胞系后细胞毒功能的上调。重要的是，诱导的T细胞培养物可以直接识别自体肿瘤。
临床应用
规模化制备的T细胞的示例性临床应用可以是本申请中公开的任何临床应用，包括但不限于黑素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌的治疗。
在开始临床试验的程序中的另一个应用总结在图75中。在这个应用中，患者被包括在两个群组中。群组A：对于抗PD1治疗为难治性且接受抗CTLA-4疗法的患者。这些患者接受两剂上述药物产品。(i)少数患者接受10^8-10^9个细胞的单一疗法，少数患者接受>10^9-10^10个细胞。群组B：包括在有或没有抗CTLA4的情况下使用抗PD1在3个月时稳定或无症状进展的患者(剂量在群组A中确定)。
实施例36：NEO-PTC-01在晚期或转移性黑素瘤患者中的开放标签I期研究
本研究将研究NEO-PTC-01——用于过继细胞疗法的自体个性化T细胞产品，该产品离体制备，并靶向在肿瘤和肿瘤微环境中展示的新抗原。新抗原是在患者主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类等位基因背景下呈递的DNA突变衍生的肿瘤特异性抗原。靶向新抗原利用个性化的方法，并提供定制每个细胞产品的组成，从而为每个患者生成个性化T细胞产品的机会。来自该产品的细胞预计来自中央或效应记忆表型，能够执行多种功能(预期的作用机制包括细胞因子的产生和识别靶细胞后的脱粒)，并且预计与野生型表位相比是高度突变体特异性的。增加这种新抗原特异性过继T细胞疗法与检查点抑制剂SOC疗法相比可提供显著的临床益处，包括更持久的抗肿瘤应答、症状控制以及延长无肿瘤进展的时间。
研究目的
本研究的主要目的是评价NEO-PTC-01在不可切除或转移性黑素瘤患者中的安全性并确定其最高耐受剂量。本研究的次要目的是1)基于实体瘤反应标准(RECIST)v1.1(Eisenhauer，2009)，通过无进展生存期评估确定抗肿瘤活性，以及2)通过总体反应率(ORR)、反应持续时间(DOR)和临床受益率(CBR)评估确定抗肿瘤活性。
研究设计
研究NTC-001是关于NEO-PTC-01在不可切除或转移性黑素瘤患者中的安全性和活性的1期研究。该研究分两部分进行，部分1(剂量发现)和部分2(剂量扩展)。该研究的剂量发现部分以≥1x10^8至≤1x10^9个细胞的剂量启动NEO-PTC-01治疗，并根据3+3剂量递增设计继续进行。剂量扩展部分2在扩大的患者群组中测试最高可耐受的部分1剂量，以进一步定义安全性和耐受性。
研究人群
年龄为18-75岁的成年男性和女性，患有不可切除或转移性黑素瘤，在接受PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂治疗(部分1)时有进展。
干预
研究部分1中的患者以≥1x10^8至≤1x10^9个细胞的剂量开始接受NEO-PTC-01。研究部分2(扩大群组)中的患者以来自部分1的最高耐受剂量接受NEO-PTC-01。
主要研究参数/研究结果
主要研究参数是基于不良事件(AE)、严重不良事件(SAE)的发生率以及安全性实验室值、体格检查和生命体征的变化来评估NEO-PTC-01治疗的安全性。根据系列放射照相评估(计算机断层扫描[CT]或磁共振成像[MRI])评估对治疗的临床反应，以确定对治疗的反应和疾病进展(RECIST v1.1)。
次要研究参数/研究结果
根据系列放射照相评估(计算机断层扫描[CT]或磁共振成像[MRI])评估对治疗的临床反应，以确定对治疗的反应和疾病进展(RECIST v1.1)。确定总反应率(ORR)，其被定义为达到CR或部分反应(PR)的患者比例。PFS，被定义为从NEO-PTC-01首次给药日期到首次记录到疾病进展(PD)或死亡的日期的时间。DOR，被定义为从首次记录到确认反应的日期到首次记录到PD的日期的时间。临床受益率(CBR)，被定义为根据RECIST达到CR、PR或SD的患者比例。至首次后续治疗的时间，被定义为从首次给药日期到第一次后续治疗的开始日期的时间。与参与、益处和群体相关性相关的负担和风险的性质和程度。
NTC-001是关于NEO-PTC-01在不可切除或转移性黑素瘤患者中的剂量发现和安全性的首次人体(FIH)研究。该研究的剂量发现部分是根据3+3剂量递增设计构建的，在安全性评价的初始阶段限制研究药物的暴露。作为额外的安全预防措施，在剂量群组中，前3名患者的加入最少错开2周间隔。主要风险范围包括淋巴消耗期间的感染、细胞因子释放综合征(CRS)的可能性以及肿瘤外、靶外毒性。其他潜在风险是与其他研究特定程序(包括肿瘤活检和白细胞分离术)相关的风险。在淋巴消耗、T细胞产品输注和嗜中性粒细胞恢复的初始治疗阶段，患者住院接受住院监测。此后，每周一次的临床检查和实验室监测在出院后的第1-4周在门诊进行，然后在剩余的研究中每6周进行一次访视。安全干预措施包括在环磷酰胺+氟达拉滨淋巴消耗方案后使用非格司亭生长因子支持，以及细胞因子释放综合征(CRS)监测和处置。先前基于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的疗法的研究可能是最相关的比较疗法。在设计本研究的起始剂量和剂量范围时考虑这些研究。较低的起始剂量作为患者中初始NEO-PTC-01测试的核心安全考虑因素而实施。来自肿瘤活检的评估对于本研究的基本原理和设计至关重要。在可行的情况下，研究设计允许使用存档样品作为基线肿瘤样本。在这项首次人体研究中，需要输注后肿瘤活检和白细胞分离样品来评价安全性和药效学效应，包括与毒性和疗效的相关性。这些程序根据方案或机构标准在医院监控的环境中执行。这些风险相对于在不可切除或转移性黑素瘤患者中的潜在NEO-PTC-01临床益处以及疾病进展或对先前治疗的非最佳反应(部分2)来考虑。NEO-PTC-01代表了一种新颖的个性化治疗方法；增加新抗原特异性自体T细胞疗法与检查点抑制剂方案相比可提供显著的临床益处。
主要纳入标准
1.愿意并能够提供书面知情同意书的成年(18至75岁)男性和女性。
2.组织学证实有不可切除的或转移性黑素瘤。
3.部分1：
a.先前曾接受过PD-1/PD-L1抑制剂(作为单一药物或联合用药)和含有CTLA-4抑制剂的方案(单一药物或联合用药)。
b.对于最后一次治疗方案记录到病情进展。
4.部分2：
a.曾接受/正在接受PD-1/PD-L1抑制剂(作为单一药物或与CTLA-4联合)至少3个月。
b.根据RECIST 1.1已记录到病情稳定或在最近的影像学评估中记录到无临床症状的疾病进展，必须在入组3个月内发生。
c.在医学上适合继续PD-1/PD-L1抑制剂治疗。
d.研究者认为添加基于T细胞的疗法将会有益。
5.对于BRAF突变患者：患者先前必须也接受过靶向疗法(B-raf抑制剂或B-raf/MEK联合疗法)。
6.患者必须在临床上无症状并且预计不会出现需要抗肿瘤治疗的症状至少16周。
7.根据RECIST v1.1至少有一个可测量的病变部位。
8.必须至少有一个病变部位可以进行肿瘤组织活检。对于治疗前活检，如果活检是在入组6个月内进行的，则可以使用存档样本。
9.ECOG体力状态为0或1
10.从与先前治疗相关的所有毒性恢复到可接受的基线状态(实验室毒性见以下纳入限制)或美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(NCI CTCAE)5.0版，0或1级，不被视为安全风险的毒性(例如，脱发)除外。
11.筛查实验室值必须符合以下标准，并应在研究治疗前28天内获得：
a.白细胞(WBC)计数≥3x 10^3/μL
b.嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)≥1.5x 10^3/μL
c.血小板计数≥100x 10^3/μL
d.血红蛋白>9g/dL或6mmol/L
e.根据Cockcroft-Gault，血清肌酐≤1.5x正常值上限(ULN)或肌酐清除率(CrCl)≥50mL/min
f.天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)≤3x ULN
g.总胆红素≤1.5x ULN(Gilbert综合征患者除外，在这种情况下，总胆红素<3.0mg/dL是可接受的)
h.国际标准化比率(IN R)、凝血酶原时间(PT)或活化部分凝血活酶时间(aPTT)≤1.5x ULN，除非患者正在接受抗凝治疗，只要PT或aPTT在抗凝剂的预期使用的治疗范围内即可
主要排除标准
1.年龄超过75岁。
2.接受过三种以上针对转移性疾病的既往疗法。
3.有活动性自身免疫病或自身免疫病史(已知或疑似)。白癜风、I型糖尿病、仅需要激素替代的自身免疫性状况导致的残留甲状腺功能减退症、不需要全身治疗的银屑病或在没有外部触发的情况下预计不会复发的状况允许有例外。
4.有已知活动性中枢神经系统(CNS)转移和/或癌性脑膜炎。先前接受过脑转移治疗的患者可以参加，前提是病情稳定，没有新的或扩大的脑转移的证据，并且在入组前至少7天没有使用类固醇。这一例外不包括癌性脑膜炎，无论临床稳定性如何，都将其排除在外。
5.需要静脉内抗微生物治疗的活动性全身感染，凝血障碍或心血管、呼吸或免疫系统的其他活动性主要医学疾病，如正应力铊或类似检验所证明的，心肌梗死，有临床意义的心律失常，如未得到控制的心房颤动、室性心动过速，或者二度或三度心脏传导阻滞，以及阻塞性或限制性肺病。
6.有需要在NEO-PTC-01输注前14天内使用皮质类固醇(>10mg每日泼尼松当量)或其他免疫抑制药物进行全身治疗的状况。在没有活动性自身免疫性疾病的情况下，允许吸入或局部使用类固醇和肾上腺替代剂量(每天5-10mg泼尼松当量)。
7.已知的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、活动性慢性乙型或丙型肝炎和/或与癌症无关的危及生命的疾病，研究者认为这些疾病可能会干扰参与本研究。
8.有任何潜在的医疗状况、精神状况或社会状况，研究者认为这些状况会干扰参与本研究。
9.有计划的大手术，预计会干扰研究参与或混淆分析研究数据的能力。
10.从筛查访视开始到试验(E01")访视结束后120天，在计划的试验持续时间内妊娠或哺乳，或预期怀孕或生育孩子。哺乳妇女被排除在本研究之外，因为在哺乳婴儿中存在继发于本研究中将要施用于母亲的治疗的未知但潜在的AE风险。
11.有除黑素瘤以外的另一种侵袭性恶性肿瘤史，但以下情况除外：a.患者至少已无病2年，并且研究者认为该恶性肿瘤复发的风险较低。b.患者未接受针对乳腺原位癌、口腔癌或宫颈癌、皮肤基底细胞癌或鳞状细胞癌的全身化疗
剂量递增部分1的患者在标准方案后出现疾病进展，标准治疗没有延迟或偏离。对于部分2患者，NEO-PTC-01与持续CPI疗法一起给予。

Claims (64)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括：
(a)从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；
(b)在以下物质的存在下，将来自步骤(a)的APC和T细胞第一群体孵育第一时间段：
(i)FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和
(ii)(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；
从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；
(c)扩充来自步骤(b)的经刺激的T细胞，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)来自步骤(b)(ii)的所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白；以及
(d)将来自(c)的经扩充的细胞群体施用于所述人类受试者，其中来自步骤(c)的经扩充的细胞群体包含1x108至1x1011个总细胞。
2.一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括权利要求1的步骤(a)至(c)；以及
(d)向所述人类受试者施用包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述人类受试者：
(i)患有不可切除的黑素瘤，
(ii)先前曾接受过PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂和包含CTLA-4抑制剂的方案并且有疾病进展，或者
(iii)曾接受过或目前正在接受PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂至少3个月，并且病情稳定或疾病有无症状进展。
3.一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括权利要求1的步骤(a)；以及
(b)在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：
(i)FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和
(ii)编码包含至少两个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列的多肽的mRNA；从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；以及
根据权利要求1的步骤(c)进行扩充。
4.一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的改进的离体方法，该方法包括：
(a)直接从来自人类受试者的经洗涤和/或冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)样品中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞；
从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的PBMC群体；
(b)根据权利要求1的步骤(b)进行孵育；
从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；以及
(c)根据权利要求1的步骤(c)进行扩充。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中(b)包括将编码所述多肽的多核苷酸或mRNA引入来自步骤(a)的APC和T细胞第一群体的APC中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中引入包括电穿孔或核转染。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在不将来自步骤(a)的APC和T细胞第一群体的T细胞与APC分离的情况下进行所述电穿孔或核转染。
8.根据权利要求1和3-7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述人类受试者施用包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体。
9.根据权利要求1、2和4-8中任一项所述的方法，其中孵育包括在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：(i)FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和(ii)编码包含至少两个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列的多肽的mRNA。
10.根据权利要求3或9所述的方法，其中所述mRNA包含5’帽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述5’帽是CAP-1。
12.根据权利要求3或9所述的方法，其中所述mRNA包含3’聚A尾。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚A尾的长度为120至135个核苷酸。
14.根据权利要求3和9-13中任一项所述的方法，其中所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的第一肿瘤抗原表位序列通过接头序列连接至所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的第二肿瘤抗原表位序列。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述5’帽通过接头序列可操作地连接至所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列中的肿瘤抗原表位序列。
16.根据权利要求3和9-14中任一项所述的方法，其中所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列被表达为单条多肽链。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中孵育包括在LPS和IFNγ的存在下孵育所述包含APC和T细胞第一群体的CD14和/或CD25耗尽的免疫细胞群体。
18.根据权利要求3和9-17中任一项所述的方法，其中所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的长度各自为8至12个氨基酸。
19.根据权利要求3和9-17中任一项所述的方法，其中所述至少两个不同肿瘤抗原表位序列的长度各自为15至25个氨基酸。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的不同肿瘤抗原表位序列。
21.根据权利要求2-20中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体包含1x108至1x1011个总细胞。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述人类受试者患有不可切除的黑素瘤。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述人类受试者先前接受过PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂和包含CTLA-4抑制剂的方案，并且有疾病进展。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述人类受试者曾接受过或目前正在接受PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂至少3个月，并且病情稳定或疾病有无症状进展。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD3+细胞的百分比为总细胞群体的至少40％、至少50％或至少60％。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少10％。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少5％。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中IFNγ+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少15％。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+和IFNγ+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少2％。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+和CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少0.5％。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中IFNγ+和CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少5％。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中TNFα+和IFNγ+和CD107a+细胞的百分比为所述肿瘤抗原特异性T细胞群体的至少0.1％。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为幼稚T细胞(CD62L+和CD45RA+)的CD4+T细胞的百分比至多为15％。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应记忆T细胞(CD62L-和CD45RA-)的CD4+T细胞的百分比至少为60％。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应T细胞(CD62L-和CD45RA+)的CD4+T细胞的百分比至多为5％。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为中央记忆T细胞(CD62L+和CD45RA-)的CD4+T细胞的百分比至少为10％。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为幼稚T细胞(CD62L+和CD45RA+)的CD8+T细胞的百分比至多为25％。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应记忆T细胞(CD62L-和CD45RA-)的CD8+T细胞的百分比至少为60％。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为效应T细胞(CD62L-和CD45RA+)的CD8+T细胞的百分比至多为10％。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中作为中央记忆T细胞(CD62L+和CD45RA-)的CD8+T细胞的百分比至少为15％。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体产生细胞因子，并在识别靶细胞后引起脱粒。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述人类受试者对于抗检查点抑制剂疗法是难治性的。
43.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述人类受试者的年龄为18至75岁。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述人类受试者在BRAF基因中具有突变，并且先前曾接受过B-raf抑制剂或B-raf/MEK联合疗法。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中消耗包括从来自人类受试者的外周血单核细胞(PBMC)样品中消耗CD14+细胞和CD25+细胞，该样品尚未经历单核细胞成熟为成熟树突细胞(DC)的步骤。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中消耗进一步包括从来自人类受试者的外周血单核细胞(PBMC)样品中消耗CD11b+细胞，该样品尚未经历单核细胞成熟为成熟树突细胞(DC)的步骤。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)在少于28天内进行。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD8+肿瘤抗原特异性T细胞占CD8+T细胞总数的比例至少是所述生物样品中CD8+肿瘤抗原特异性T细胞占CD8+T细胞总数的比例的两倍。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中CD4+肿瘤抗原特异性T细胞占CD4+T细胞总数的比例至少是所述生物样品中CD4+肿瘤抗原特异性T细胞占CD4+T细胞总数的比例的两倍。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中至少0.1％的CD8+T细胞是来源于幼稚CD8+T细胞的CD8+肿瘤抗原特异性T细胞。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中在包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体中至少0.1％的CD4+T细胞是来源于幼稚CD4+T细胞的CD4+肿瘤抗原特异性T细胞。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中扩充包括(A)使所述包含经刺激的T细胞的细胞群体与第二成熟APC群体接触，其中所述第二成熟APC群体(i)已经与FLT3L一起孵育，并且(ii)呈递至少一个肿瘤抗原表位序列；以及(B)将所述包含经刺激的T细胞的细胞群体扩充第二时间段，从而形成经扩充的T细胞群体。
53.根据权利要求52所述的方法，其中在使所述包含经刺激的T细胞的细胞群体与第二成熟APC群体接触之前，所述第二成熟APC群体已与FLT3L一起孵育至少1天。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述生物样品是外周血样品、白细胞分离样品或血液成分分离样品。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括收获所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，冷冻保存所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，或制备含有所述包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体的药物组合物。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中孵育包括在FLT3L和编码所述多肽的RNA的存在下孵育所述包含APC和T细胞第一群体的CD14/CD25耗尽的免疫细胞群体第一时间段。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述患有癌症的人类受试者是从中获得所述生物样品的人类受试者。
58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述多肽的长度为8至50个氨基酸。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述多肽包含至少两个肿瘤抗原表位序列，每个序列由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中从包含APC和T细胞第一群体的免疫细胞群体中消耗CD14+细胞和/或CD25+细胞包括使所述包含APC和T细胞第一群体的免疫细胞群体与CD14结合剂和/或CD25结合剂接触。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中消耗进一步包括从所述包含APC和T细胞第一群体的免疫细胞群体中消耗CD19+细胞。
62.一种用于制备肿瘤抗原特异性T细胞的离体方法，该方法包括：
(a)从包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞的免疫细胞群体中消耗CD11b+细胞，从而形成包含APC和T细胞第一群体的CD11b耗尽的免疫细胞群体，其中所述免疫细胞群体来自人类受试者的生物样品；
(b)在以下物质的存在下，将所述包含APC和T细胞第一群体的CD11b耗尽的免疫细胞群体孵育第一时间段：
(i)FMS样酪氨酸激酶3受体配体(FLT3L)，和
(ii)(A)包含至少一个由患有癌症的人类受试者的癌细胞表达的肿瘤抗原表位序列的多肽，或(B)编码该多肽的多核苷酸；
从而形成包含经刺激的T细胞的细胞群体；以及
(c)扩充所述包含经刺激的T细胞的细胞群体，从而形成包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体，其中所述肿瘤抗原特异性T细胞包含对包含以下成分的复合物具有特异性的T细胞：(i)所述至少一个肿瘤抗原表位序列，和(ii)由(b)(ii)的人类受试者的癌细胞或APC表达的MHC蛋白。
63.根据权利要求62所述的方法，其进一步包括在步骤(a)中从免疫细胞群体中消耗CD14和CD25细胞，从而形成CD11b/CD14/CD25耗尽的免疫细胞群体。
64.一种药物组合物，其包含通过权利要求1-62中任一项产生的包含肿瘤抗原特异性T细胞的经扩充的细胞群体；以及药学上可接受的载体。
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