CN114072505A - 核酸mazzocchio及其制造和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了涉及核酸纳米结构的组合物和方法，该核酸纳米结构可以封装货物以用于例如治疗、诊断和分析应用。所述纳米结构可以具有多个相互连接的子单元，这些子单元被配置为使得所述纳米结构具有包含闭合三维空腔的连续圆环样结构。优选地，所述纳米结构是核酸mazzocchio。所述子单元通过具有确定长度的接头连接以将纳米结构限制为连续的圆环样形状。闭合的三维空腔具有限定的尺寸以封装任何感兴趣的货物。货物也可以放置在纳米结构中心的开孔中。所述货物可以是范围广泛的化合物，包括例如化学药物、小分子、治疗剂、靶向剂、酶、染料和荧光分子。因此，公开的纳米结构适合于递送一种或多种治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂或预防剂。

Description

核酸MAZZOCCHIO及其制造和使用方法
发明领域
本发明通常属于核酸纳米结构领域，特别是在基于mazzocchio的核酸纳米结构领域，以递送用于治疗、诊断和分析应用的货物。
发明背景
DNA是众所周知的存储和传输遗传信息的生物材料。然而，对其分子结构和特性的理解使得DNA纳米技术的全新领域得以发展，将DNA分子从其生物环境中分离出来，并利用其信息来组装结构基序并使它们连接在一起。DNA纳米技术使得可以使用DNA作为砖块以制造用于生物医学的物件，包括合成生物学、诊断学和治疗学应用。DNA吸引纳米科学家的原因有很多，包括：首先，DNA是一种天然纳米级材料；其次，已经有大量研究DNA的技术；第三，可以在自组装过程中利用DNA携带信息的能力。
DNA纳米技术使用双链DNA中的基本Watson-Crick碱基配对原理以制造用于各种目的的从DNA砖块至DNA折纸的各种物体(Seeman,NC.,et al.,Nature ReviewsMaterials,3,17068(2017))。所述领域始于围绕使用Holliday连接构建框架以帮助蛋白质结晶的想法(Seeman,NC,J.Theor.Biol.,99(2):237-47(1982))，并迅速推动了DNA纳米技术在生物医学应用的发展，例如用于药物递送(Douglas,SM.,et al,Science,335(6060):831-4(2012))和小干扰RNA(siRNA)递送至细胞和动物中(Jiang,D.,et al.,ACSAppl.Mater.Interfaces,8(7):4378-84(2016)；Lee,H.,et al.,Nat.Nanotechnol.,7(6):389-93(2012))。
DNA纳米结构的合理设计有两种通用方法(Wang,D.,et al.,Nat.Protoc.,13(10):2312-2329(2018))。一种方法是使用基于瓦片的方法，使用少量寡核苷酸，这些寡核苷酸彼此碱基配对以产生重复模块单元。DNA四面体是经典的简单DNA纳米结构，其可以通过四个寡核苷酸的退火简单合成，如Goodman,RP,et al.,Chem.Commun.(Camb),12:1372-3(2004)所证实。DNA四面体的有限尺寸一直存在挑战，因此已经开发了双束DNA四面体。已经通过自组装开发了更复杂的DNA多面体，包括十二面体和巴基球(Buckyball)(He,Y.etal.,Nature,452(184):198-201(2008))。第二种方法是折纸方法，其中通过导入通常数百个短的订书钉链(staple strand)寡核苷酸，将长的单链噬菌体DNA折叠成特定形状。订书钉链包含与支架互补的序列的区段或区域，将序列空间中相距甚远的序列带至欧几里得(Euclidian)空间中的附近位置。这些相互作用和几何结构在盐存在下通过特定的Watson-Crick碱基配对而稳定，所述盐使用固定的Holliday连接以限制空间中相邻的双链体。
这两种方法具有不同的优点和缺点。基于瓦片的方法往往导致更简单的结构，在规模和复杂性方面可能会受到限制，尤其是在整合至动态单元中时。基于折纸的方法可以产生令人印象深刻且复杂的纳米结构，例如George Church的纳米机器人递送(Douglas,SM.,et al,Science,335(6060):831-4(2012))，但需要数百个寡核苷酸订书钉链可能会限制其在治疗或诊断中的实际应用。使用数百个单链DNA的合成是一个主要缺点，约束了用于递送目的的DNA折纸的商业化和临床批准(例如US20070117109A1、US20180016569A1和WO2018165465A1)。此外，这两种方法均存在保护货物递送的挑战。各种研究表明，纳米粒子穿过细胞膜的最佳直径约为50-100nm(Arnida,et al.,J.Appl.Toxicol.,30(3):212-7(2020)；Chithrani,BD.,et al.,Nano.Lett,6(4)662-8(2006)；Huang,K.,et al.,ACSNano.,6(5):4483-93(2012)；Xu,A.,et al.,Int.J.Nanomedicine,7:3547-54(2012))。即使对于简单的纳米结构(见例如CN107397960A和WO2018017806A1)，其也被限于递送一些类型的货物例如siRNA和小分子，因为其不能像DNA折纸那样能保护多种分子。
因此，本领域需要组合DNA折纸封装和较小DNA纳米结构进行药物递送的简便性的益处的纳米结构。
因此，本发明的一个目的是提供对于生物医学应用(例如临床药物递送)而言经济和/或实用的核酸纳米结构。
本发明的另一个目的是提供具有改进的稳定性和/或降低的内在毒性的核酸纳米结构。
本发明的另一个目的是提供细胞内和/或组织内递送的最佳尺寸的核酸纳米结构。
本发明的另一个目的是提供包含可以靶向和递送货物的核酸纳米结构的组合物，及其在治疗、诊断和分析应用中的使用方法。
对于本说明书中包括的文件、行为、材料、装置、文章等的任何讨论不被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者是与本发明公开相关领域中普通常识，因为其存在于本申请的每个权利要求的优先权日之前。
在整个说明书中，单词“包含”或其变化用语将被理解为是指包含所陈述的元件、整数或步骤，或一组元件、整数或步骤，但不排除任何其它元件、整数或步骤，或一组元件、整数或步骤。
发明简述
本发明公开了涉及核酸纳米结构的组合物和方法，所述纳米核酸结构可以封装货物以用于治疗、诊断和分析应用。在一些形式中，所述纳米结构可以具有连续的圆环样形状。在一些形式中，所述圆环样形状是mazzocchio。在一些形式中，所述纳米结构可以由多个子单元组成，每个子单元具有界定的多边形形状，其中子单元通过接头连接以形成具有连续圆环样形状的结构。在一些形式中，所述纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构(supramolecular corkscrew)。在一些形式中，所述纳米结构可以具有一个或多个界定尺寸的三维空腔，所述三维空腔用于封装货物。在一些形式中，所述货物可以是范围广泛的化合物，包括化学药物、治疗剂、靶向组分、酶、染料和荧光分子。在一些形式中，所述纳米结构可用于递送一种或多种治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂或预防剂。
特别地，本发明公开了包括含有多个子单元的核酸纳米结构的组合物，其中所述纳米结构具有含有闭合三维空腔的连续圆环样结构。每个子单元可包含核心域和连接域，其中核心域可以界定具有包围开放区域的多个边的多边形，其中所述边和开放区域界定子单元的平面。每个子单元的第一边可以与另一子单元的第一边共平面，每个子单元可以位于另外两个子单元之间，并与另外两个子单元连接，其中连接的子单元的平面彼此面对，从而形成子单元的堆叠。连接的子单元的平面基本上垂直于所述子单元的第一边的平面，并且在与子单元的第一边的平面水平的方向上相对于连接于给定子单元的子单元倾斜。连接的子单元的平面之间的倾斜可以在子单元的堆叠中产生弯曲，使得连接的子单元形成连续的圆环样结构，所述连续圆环样结构具有由堆叠子单元的开放区域界定的闭合三维空腔。每个子单元的连接域可以包含一个或多个接头，并且子单元之间可通过接头连接。每个接头可具有配置成在连接的子单元的平面之间产生倾斜的长度，从而产生所述纳米结构的连续圆环样结构。纳米结构中的子单元和接头可形成延伸的超分子螺旋样结构。
每个子单元的多边形可以是任何形状。例如，在一些形式中，每个子单元的多边形可以是六边形、八边形、五边形、七边形、四边形或三角形。在一些形式中，所述纳米结构可以具有50至100nm的内部直径、外部直径或两者，包括端值。在一些形式中，所述纳米结构可以包含8至40个子单元，包括端值，优选16或32个子单元。在一些形式中，每个子单元包含6至20个单链核酸链。在优选形式中，每个子单元包含12个单核酸链。
在一些形式中，子单元的核心域包含一个支架核酸链和n-1个订书钉核酸链，其中n是子单元多边形中的边数。每个订书钉链可包括侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，并且每个订书钉链的中心区可以与支架链结合以形成双链体区。在优选的形式中，所述订书钉链的中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
在特定形式中，每个子单元的多边形可以是六边形或八边形。优选地，每个子单元的多边形是六边形。
在特定形式中，核心域可包含一个支架核酸链(链1)和五个订书钉核酸链(链2-6)，其中每个订书钉链包括侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，并且其中每个订书钉链的中心区与支架链结合以形成双链体区。优选地，订书钉链的中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
在一些形式中，每对彼此相邻的双链体区被配置为形成双面角，其中每个双面角近似于多边形顶点的角。优选地，所述双面角可以是120°。
在一些形式中，每个突出区可以与侧翼双链体区成约90°的双面角。订书钉链的5’突出区可各自单独包含8-16个核苷酸，包括端值，3’突出区可各自单独包含8-16个核苷酸，包括端值，或两者。
在一些形式中，胸苷残基可存在于一个或多个双链体区域之间。在一些形式中，胸苷残基可以存在于每个双链体区域之间。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对，并且一个或多个双链体区域之间可以存在胸苷残基。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对，并且每个双链体区域之间可以存在胸苷残基。双链体区域之间存在的一些或全部胸苷残基可以是未配对的。在一些形式中，一个或多个双链体区域之间可以存在未配对的胸苷残基。在一些形式中，未配对的胸苷残基可存在于每个双链体区域之间。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对，并且未配对的胸苷残基可以存在于一个或多个双链体区域之间。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对，并且未配对的胸苷残基可以存在于每个双链体区域之间。在一些形式中，未配对的胸苷残基可存在于中心区和一个或两个突出区之间的核心域的一个或多个链上。在一些形式中，未配对的胸苷残基可以存在于中心区和一个或两个突出区之间的核心域的每个链上。
在一些形式中，连接域可包含与核心域的一个或多个突出区互补的n个单链核酸接头。在优选的形式中，连接域可包含与核心域的一个或多个突出区互补的六个单链核酸接头(链7-12)。在一些形式中，连接域的一个或多个接头与核心域的突出区之间的互补程度在16至32个碱基对的范围内，包括端值。
在本发明公开的纳米结构中，核酸、核酸链和接头可以是DNA。在一些形式中，所有链和接头在序列上均是独特的。
在一些形式中，本发明公开的纳米结构可进一步包含治疗剂、毒性剂、靶向剂、成像剂、诊断剂或预防剂，或其组合。在一些形式中，本发明公开的纳米结构可进一步包含成像剂，包括但不限于金纳米粒子。在一些形式中，本发明公开的纳米结构可以进一步包含靶向剂，包括但不限于适体。在一些形式中，本发明公开的纳米结构可进一步包含如DNA、RNA、PNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、小分子或染料等分子。在一些形式中，所述剂或分子可以共价或非共价结合于纳米结构。在一些形式中，所述剂或分子可以封装在纳米结构内。
本发明还提供了制造和使用本发明公开的纳米结构的方法。例如，本发明公开了制造任何本发明公开的纳米结构的方法，其通过对构成纳米结构的支架链、订书钉链和接头的混合物施加温度转变，使得所述链和接头退火。在一些形式中，纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。在一些形式中，所述链和接头以约等摩尔浓度存在。在一些形式中，所述温度转变可发生在16小时的时间段内。在一些形式中，所述温度转变可涉及从90℃至20℃的温度变化。进一步公开了通过向对象施用本文提供的任何纳米结构而将治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂、预防剂或其组合递送至对象的方法。
本发明公开的方法和组合物的其它优点将部分在随后的描述中阐述，以及部分从描述中理解，或者可以通过实施本发明公开的方法和组合物而学习。本发明公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前述一般描述和以下详细描述均仅是示例性和说明性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。
附图简述
并入并构成本说明书一部分的附图示例了本发明公开的方法和组合物的一些实施方案，并且与描述一起用于解释公开的方法和组合物的原理。
图1A是由Leonardo da Vinci最初描绘的mazzocchio的示意图。Da Vinci的mazzocchio是包含八边形子单元的32个子单元结构。图1B是示出受da Vinci原创启发但包含16个六边形子单元的简化的核酸mazzocchio示意图。图1C-1D示出包含在图1B的mazzocchio中的示例DNA六边形子单元的设计。图1C是示出每个子单元由12个单链DNA链组成的示意图，其中6个链形成核心域(1个支架链(黑色)和5个订书钉链(各种灰色))，以及6个接头链形成连接域(灰色链)。每个转折点(灰点)包含一个未配对(即单链)胸苷残基。双链体区域以及每个链的5’突出区和/或3’突出区是显而易见的。图1D是示出图1C的16个六边形子单元如何组装成简化的核酸mazzocchio纳米结构的图片。
图2是示出与纳米结构浓度成函数的来自DNA四面体和DNA mazzocchio纳米结构的多柔比星荧光定量的图。
发明详述
本发明公开的方法和组合物可以通过参考以下具体实施方案的详细描述和其中包括的实施例以及附图及其之前和之后的描述而更容易理解。
已经发现，核酸纳米结构可以被配置成圆环样结构，例如mazzocchio，以用于在如治疗、诊断和分析等应用中封装和/或呈递货物。本发明公开的纳米结构是受Da Vinci的15世纪几何研究启发的多边形超环面圆环(Brecher,K.(2012).The Mazzocchio inPerspective.Paper presented at the Proceedings of Bridges 2012:Mathematics,Music,Art,Architecture,Culture)。mazzocchio具有重复的瓦片子单元，每个子单元由有限数量的单链寡核苷酸组成，从而组装成具有限定尺寸和三维空腔的物体。纳米结构的尺寸可以由每个重复单元的长度配置，并配置为包含特定数量的货物。货物可以是广泛范围的分子，包括但不限于生物制剂、化学药物、酶和荧光分子。基于mazzocchio的纳米结构可以用细胞表面表位如适体的靶向分子装饰，以提高递送的特异性。
与当前的核酸纳米结构方法相比，本发明公开的基于mazzocchio的纳米结构的生产成本更低。例如，DNA折纸纳米结构通常使用数百个单链DNA，因此成本可能成为现实世界临床应用的一个问题。相比之下，基于mazzocchio的纳米结构通常可以使用少于20个寡核苷酸，因此更实用且更具成本效益，但仍然可以制造复杂的三维结构来封装货物。
此外，本发明公开的基于mazzocchio的纳米结构与先前的药物递送方法相比在制造的容易性、稳定性和生物相容性方面具有多种优势。例如，基于mazzocchio的纳米结构可以由仅6至12个单链DNA序列制成，并且可以根据货物的尺寸和数量进行定制。纳米结构的合成也是一个简单的过程。通常，这涉及混合等量的单链寡核苷酸，以及在没有任何复杂化学反应的情况下加热和冷却。
如实施例中所示，成功地制造了具有约50至60nm直径的十六个子单元的六边形DNA mazzocchio纳米结构。这个尺寸在已知最有效的纳米粒子穿透细胞膜以进行药物递送的范围内。基于mazzocchio的纳米结构组合了DNA折纸封装与较小DNA纳米结构递送药物的简单性的益处。这立即开创了广泛的应用领域。由于基于mazzocchio的纳米结构可具有限定尺寸的空腔，该空腔可接近但仍不受环境影响，因此基于mazzocchio的纳米结构可以封装任何货物，包括但不限于药物、成像试剂、分析试剂或诊断分子(例如在组装过程中封装)并可以将其递送至靶细胞或组织。还考虑了其它非细胞生物医学应用。
因此，本发明公开了涉及核酸纳米结构的组合物和方法，该核酸纳米结构可以封装货物用于治疗、诊断和分析应用。所述纳米结构可以具有连续的圆环样形状，例如mazzocchio，并且可以由具有界定的多边形形状的多个子单元组成，其中子单元通过接头连接以形成所述结构。所述纳米结构可以具有一个或多个限定尺寸的三维空腔，其封装货物，包括但不限于化学药物、治疗剂、靶向组分、酶、染料和荧光分子。所述纳米结构可用于递送一种或多种治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂或预防剂。
特别地，本发明公开了包括含有多个子单元的核酸纳米结构的组合物，其中纳米结构具有含有闭合三维空腔的连续圆环样结构。每个子单元可包含核心域和连接域，其中核心域可界定具有包围开放区域的多个边的多边形，其中所述边和开放区域界定子单元的平面。每个子单元的第一边可以与另一个子单元的第一边共平面，每个子单元可以位于另外两个子单元之间并与两位两个子单元连接，其中连接的子单元的平面彼此面对以形成子单元的堆叠。连接的子单元的平面可以基本上垂直于子单元的第一边的平面，并且在与子单元的第一边的平面水平方向上相对于连接于给定子单元的子单元倾斜。连接的子单元平面之间的倾斜可以在子单元的堆叠中产生弯曲，使得连接的子单元形成具有由堆叠的子单元的开放区域界定的闭合三维空腔的连续圆环样结构。每个子单元的连接域可以包含一个或多个接头，子单元之间可以通过接头连接。每个接头可具有配置成在连接的子单元平面之间产生倾斜的长度，从而产生纳米结构的连续圆环样结构。纳米结构中的子单元和接头可以形成延伸的超分子螺旋形结构。
每个子单元的多边形可以是任何形状。例如，在一些形式中，每个子单元的多边形可以是六边形、八边形、五边形、七边形、九边形、十边形、四边形(例如正方形、长方形)或三角形。在一些形式中，所述纳米结构可以具有50至100nm的内部直径、外部直径或两者，包括端值。在一些形式中，纳米结构可包含数百个子单元(例如约100、约200、约300、约400、约500或更多个)。在一些形式中，优选纳米结构包含较少数量的子单元，例如少于50个子单元。在优选的形式中，纳米结构可以包含8至40个子单元，包括端值，优选16或32个子单元。在一些形式中，每个子单元包含6至20个单链核酸链。在优选形式中，每个子单元包含12个单核酸链。
在一些形式中，子单元的核心域包含一个支架核酸链和n-1个订书钉短核酸链，其中n是子单元多边形中的边数。每个订书钉链可以包括侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，每个订书钉链的中心区可以与支架链结合形成双链体区域。在优选的形式中，订书钉链的中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
在特定形式中，每个子单元的多边形可以是六边形或八边形。优选地，每个子单元的多边形是六边形。
在特定形式中，核心域可包含一个支架核酸链(链1)和五个订书钉核酸链(链2-6)，其中每个订书钉链包括侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，并且其中每个订书钉链的中心区与支架链结合以形成双链体区域。优选地，订书钉链的中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。在一些形式中，每对彼此相邻的双链体区域被配置为形成双面角，其中每个双面角近似为多边形顶点的角。优选地，双面角可以是120°。
在一些形式中，每个突出区可以与侧翼双链体区域成大约90°的双面角。订书钉链的5’突出区可各自单独包含8至16个核苷酸，包括端值，3’突出区可各自单独包含8至16个核苷酸，包括端值；或两者。
在一些形式中，胸苷残基可存在于一个或多个双链体区域之间。在一些形式中，每个双链体区域之间可以存在胸苷残基。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对并且一个或多个双链体区域之间可以存在胸苷残基。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对并且每个双链体区域之间可以存在胸苷残基。双链体区域之间存在的一些或全部胸苷残基可以是未配对的(即单链)。在一些形式中，一个或多个双链体区域之间可以存在未配对的胸苷残基。在一些形式中，未配对的胸苷残基可存在于每个双链体区域之间。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对并且未配对的胸苷残基可以存在于一个或多个双链体区域之间。在一些形式中，子单元的每个双链体区域可以包含20个碱基对并且未配对的胸苷残基可以存在于每个双链体区域之间。在一些形式中，未配对的胸苷残基可存在于中心区与一个或两个突出区之间的核心域的一个或多个链上。在一些形式中，未配对的胸苷残基可以存在于中心区与和一个或两个突出区之间的核心域的每个链上。
在一些形式中，未配对的胸苷残基位于一对或多对相邻双链体区域之间(例如在突出区和双链体区域的交叉处；见图1C)。突出区和双链体区域的交叉点可以称为子单元的转折点。在一些形式中，未配对的胸苷残基位于每对相邻双链体区域之间(即在每个转折点)。在一些形式中，连接域可包含与核心域的一个或多个突出区互补的n个单链核酸接头。在优选的形式中，连接域可以包含与核心域的一个或多个突出区互补的六个单链核酸接头(链7-12)。在一些形式中，连接域的一个或多个接头与核心域的突出区之间的互补程度在16至32个碱基对的范围内，包括端值。
在本发明公开的纳米结构中，支架链、订书钉链和接头链的长度可根据包括纳米结构的期望形状和尺寸在内的多个变量而变化。例如，在一些形式中，mazzocchio纳米结构的最佳直径(例如内部直径、外部直径或两者)为约50至100nm。在这种形式中，支架链、订书钉链和接头链的长度可以被配置成彼此成比例，从而获得这种最佳直径的mazzocchio纳米结构。例如，支架链可以包括约70至560个核苷酸，包括端值；订书钉链可包括约13至219个核苷酸，包括端值；接头链可包括约2至58个核苷酸，包括端值。
在本发明公开的纳米结构中，所述核酸、核酸链和接头可以是DNA。在一些形式中，所有链和接头在序列上均是独特的。
在一些形式中，本发明公开的纳米结构还可包含治疗剂、毒性剂、靶向剂、成像剂、诊断剂或预防剂，或其组合。在一些形式中，本发明公开的纳米结构还可包含成像剂，包括但不限于金纳米粒子。在一些形式中，本发明公开的纳米结构可以进一步包含靶向剂，包括但不限于适体。在一些形式中，本发明公开的纳米结构可以进一步包含如DNA、RNA、PNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、小分子或染料等分子。在一些形式中，所述剂或分子可以共价或非共价结合于纳米结构。在一些形式中，所述剂或分子可以封装在纳米结构内。
本发明还提供了制造和使用所述纳米结构的方法。例如，本发明公开了通过对构成纳米结构的支架链、订书钉链和接头的混合物施加温度转变，使所述链和接头退火以制造任何公开的纳米结构的方法。在一些形式中，纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。在一些形式中，所述链和接头以大约相等的摩尔浓度存在。在一些形式中，温度转变可发生在16小时的时间段内。在一些形式中，温度转变可涉及从90℃至20℃的温度变化。进一步公开了通过向对象施用本文提供的任何纳米结构以将治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂、预防剂或其组合递送至对象的方法。
本发明公开的方法和组合物的其它优点将部分在随后的描述中阐述，及部分从描述中理解，或者可以通过实施本发明公开的方法和组合物来学习。本发明公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前述一般描述和以下详细描述均仅是示例性和说明性的，而不是对所要求保护的本发明的限制。
应当理解，除非另有说明，否则本发明公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，并且因此可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。
材料
本发明公开了可用于本发明公开的方法和组合物、可用于与本发明公开的方法和组合物联合使用、可用于制备本发明公开的方法和组合物或者是本发明公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。这些和其它材料在本文中被公开，并且应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等被公开时，虽然这些化合物的每个不同个体和集体组合和排列的具体参考可能没有被明确公开，但每一个均在本文中被具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了纳米结构，并且讨论了可以对包括纳米结构在内的许多组件进行的众多修改，除非特别指明是相反的，则特别涵盖纳米结构的每一种组合和排列以及可能的修改。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及一个组合分子示例A-D，则即使没有单独列举每一项，但每项均是单独和共同涵盖的。因此，在这个实例中，每个组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F均被特别涵盖并且应该被认为是从A、B和C、D、E及F以及示例组合A-D的公开内容中公开的。同样，这些项的任何子集或组合也被特别涵盖和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组被特别涵盖且应被视为从A、B和C、D、E及F以及示例组合A-D的公开内容中公开。此外，如上涵盖和公开的每种材料、组合物、组分等也可以特别地和独立地包括在这种材料的任何组、亚组、列表、组件中或排除在外。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各个其它步骤，则应理解这些其它步骤中的每一步均可以用所公开方法的任何特定实施方案或实施方案组合来执行，并且每个这种组合是特别涵盖的且应该是视为公开的。
A.定义
术语“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，旨在包括但不限于核苷酸的聚合形式，其可具有各种长度的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，或其类似物或修饰的核苷酸，包括但不限于锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代核酸。寡核苷酸通常由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，术语“寡核苷酸序列”是以字母表示的多核苷酸分子；或者，该术语可应用于多核苷酸分子自身。这种字母表示可以输入至具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性搜索。寡核苷酸可任选包括一种或多个非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。在一些情况中，核苷酸序列是使用International Union ofPure and Applied Chemistry(IUPAC)或其小组推荐的字符表示提供的。本文使用的IUPAC核苷酸代码包括：A＝腺嘌呤，C＝胞嘧啶，G＝鸟嘌呤，T＝胸腺嘧啶，U＝尿嘧啶，R＝A或G，Y＝C或T，S＝G或C，W＝A或T，K＝G或T，M＝A或C，B＝C或G或T，D＝A或G或T，H＝A或C或T，V＝A或C或G，N＝任何碱基，“.”或“-”＝缺口。在一些形式中，对于腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷，字符集分别是(A、C、G、T、U)。在一些形式中，字符集是(A、C、G、T、U、I、X、Ψ、R、Y、N)分别表示腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷、尿苷、肌苷、尿苷、黄苷、假尿苷。
术语“核酸纳米结构”或“纳米结构”可互换使用，并且如本文所用，是指具有期望形状和尺寸的核酸物体，其通过经由接头链互连的多个多边形子单元的组装或聚合而形成。每个子单元可以使用多个短的单链核酸(订书钉链)(例如DNA)形成，以指导较长的单链多核苷酸(支架链)折叠成期望形状。通常，在纳米结构的每个子单元中，单链核酸序列贯穿整个子单元。纳米结构子单元任选包括与支架序列杂交并产生多边形结构的寡核苷酸订书钉链。当子单元不包括订书钉链时，支架序列与其自身杂交以产生具有期望的多边形形状的子单元。通常，纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。应当理解，在本文的组合物、方法和系统以DNA(例如DNA mazzocchio)示例的情况下，其它核酸分子可以被替代。核酸纳米结构可由脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或其类似物或修饰的核苷酸组成，包括但不限于锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代核酸。
术语“支架链”、“支架序列”或“支架核酸链”可互换使用，是指折叠成约10nm至1微米或更大级别的期望形状的单链多核苷酸。在一些形式中，支架序列通过与小核酸“订书钉链”杂交而折叠成特定几何形状的子单元。或者，可以将单链核酸支架设计成在没有辅助链的情况下折叠，例如使用平行或平行交叉基序。支架链可由脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或其类似物或修饰的核苷酸组成，包括但不限于锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代核酸。术语“订书钉链”、“订书钉核酸链”或“辅助链”可互换使用。“订书钉链”或“辅助链”是指寡核苷酸，其用作胶水以将支架核酸链保持在其限定的几何形状和/或将纳米结构保持在其三维几何形状。可以在5’末端或3’末端向订书钉链加入额外的核苷酸，这些核苷酸被称为“订书钉链突出区”。
“突出”和“突出区”可互换使用，是指未结合的或未设计为结合另一寡核苷酸的寡核苷酸区段。因此，突出不限于订书钉链，也可以包括在支架链中。5’末端的突出被称为“5’突出区”，3’末端的突出被称为“3’突出区”。突出区可以被功能化以具有期望的性质，例如与靶核酸序列杂交的特定序列或靶向元件。在一些情况下，突出区可以被生物素化(例如在链霉亲和素包被的珠上捕获纳米结构)。在一些情况下，突出区也可以用化学部分进行修饰。非限制性实例包括点击化学基团(例如叠氮化物基团、炔基、DIBO/DBCO)、胺基团和硫醇基团。在一些情况下，突出区包含设计成与其它核酸序列例如其它核酸纳米结构突出区上的那些序列杂交的序列。在其它情况下，突出区包含一个或多个与分子缀合的位点。例如，突出区可以与蛋白质或非蛋白质分子缀合，例如以实现核酸纳米结构的亲和性结合。与突出区标签缀合的示例蛋白质包括生物素和抗体，或抗体的抗原结合片段。在一些情况下，寡核苷酸内部的一些碱基可以使用碱基类似物(例如2个氨基嘌呤、锁核酸，例如用连接2’氧和4’碳的额外桥键修饰的那些核酸)修饰，以作为接头以连接功能部分(例如脂质、蛋白质)。或者，可以使用DNA结合蛋白或引导RNA将二级分子附着于DNA支架上。
如本文所用，“互补程度”是指杂交在一起的任何两个核酸链之间互补的残基数量。
在纳米结构的结构配置的描述中使用的“连续”是指没有限定的开始和/或结束的特性。也就是说，纳米结构是一个闭合的、未破损的或不间断的整体。这可以在本发明公开的DNA mazzocchio纳米结构的描述中很容易地可视化，这些结构是圆环状，具有闭合的3D环(见图1A-1B)。
如本文在由纳米结构形成的三维空腔的描述中使用的“闭合”是指在子单元与其组分(例如核心域和连接域)之间的规则间距中不存在间隙、开口或不连续性。可以理解的是，子单元及其连接在子单元及其连接之间留下了开放空间，这对于带来灵感的mazzocchio也是如此(图1A)。这种开放空间不是子单元与其组件之间的规则间距中的间隙、开口或不连续性，因为这些是规则间距。因此，正是由于没有额外的间隙、开口或不连续性，才使得所述三维空间如本文所定义的那样闭合。
如本文所用，“多边形直径”是指由纳米结构内子单元的核心域界定的多边形的直径。例如，这可以是由包含在纳米结构中的堆叠子单元的开放区域界定的三维空腔的直径。例如，参见图1B的13.86nm线。确定给定多边形直径的方法是本领域已知的。
如本文所用的与纳米结构相关的“圆环样结构”和“超环面结构”是指纳米结构的形状，其中纳米结构通常对应于圆环面形状。圆环面是一个旋转的表面，中间有一个孔，其类似甜甜圈，形成一个实体。旋转的轴穿过孔，因此不与表面相交。例如，当一个长方形围绕平行于其边之一的轴旋转时，产生一个空心长方形截面环。如本发明公开的，由子单元形成的多边形界定了纳米结构的截面和形成圆环样结构的旋转图。多边形(旋转图)可以是各种多边形中的任意一种，如六边形、八边形、五边形、七边形、九边形、十边形、四边形(如正方形、长方形)、三角形等。如果旋转图是圆形，则物体称为圆环体。
如本文所用的与纳米结构相关的“内部直径”是指穿经圆环样结构中间的孔(这个孔类似于甜甜圈的孔)的中心及其端点位于圆环样结构的中心孔的最内边的任何直线段的长度。例如，参见图1B的37.06nm线。
如本文所用的与纳米结构相关的“外部直径”是指穿经圆环样结构中间的孔(这个孔类似于甜甜圈的孔)的中心及其端点位于圆环样结构的最外边/侧面的任何直线段的长度。
如本文所用的与纳米结构相关的“闭合直径”是指穿经圆环样结构中间的孔的中心及其端点位于圆环样结构相对边空腔的中心的任何直线段的长度。例如，参见图1B的50.92nm线。
如本文所用，术语“超分子螺旋形结构”是指具有螺旋形结构特性的超分子螺旋，例如由两个核酸链形成的双螺旋中的螺旋形结构。超分子螺旋形结构是一种超分子组装形式，其中多个分子组装在一起形成结构。因此，在本发明公开的核酸纳米结构的描述中，超分子螺旋形结构是以螺旋形结构螺旋与子单元和接头杂交的多个核酸分子的组装，从而形成延伸的超分子螺旋形结构。螺旋形结构的优选形式由在各个子单元中连接域的接头之间形成的双螺旋呈现。
如本文所用，术语“剂”广泛用于是指物理、化学或生物学材料，其通常赋予由纳米结构运载、呈现和/或递送的货物以生物学有用的功能。剂可以是任何天然或非天然材料，包括但不限于生物学材料，例如细胞、噬菌体或其它病毒；有机化学物质，如小分子；纳米粒子，放射性核素；核酸分子或寡核苷酸；脂质；糖类或多糖类；多肽；或肽。剂可以具有任何目的，例如但不限于成像或检测、治疗用途、诊断用途、毒性用途或其组合。例如，剂可以影响靶标，例如具有治疗作用的剂，或者可以促进靶标的检测、可视化或成像，例如荧光分子或放射性核素。
术语“靶向剂”或“靶向分子”是指可将纳米结构导向选择的细胞或组织类型上的受体位点的物质，其可用作附着分子或用于偶联或附着另一分子。术语“导向”是指使分子优先附着于选择的细胞或组织类型。这可用于引导细胞材料、分子或药物，如下所述。
如本文所用，术语“小分子”通常是指分子量小于约2,000g/mol、小于约1,500g/mol、小于约1,000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol的有机分子。小分子是非多聚的和/或非低聚的分子。
如本文所用，术语“肽”是指通过化学结合在一起的氨基酸组成的一类化合物。通常，氨基酸通过酰胺键(CONH)以化学方式结合在一起；然而，氨基酸可以通过本领域已知的其它化学键结合在一起。例如，氨基酸可以通过胺键结合。本文使用的肽包括氨基酸的寡聚物和小肽和大肽，包括多肽。
B.组合物
1.核酸纳米结构
本发明公开了任选包含一种或多种货物的核酸纳米结构。通常，本发明公开的核酸纳米结构主要由核酸分子组装而成。通常，本发明公开的核酸纳米结构通过核酸杂交而组装、结构化和/或保持在一起。在一些形式中，本发明公开的核酸纳米结构至少部分通过嘧啶二聚体而组装、结构化和/或保持在一起。
形成纳米结构的核酸可以是任何形式的核酸，包括例如DNA、RNA、DNA和RNA的混合物，包括或组成为修饰的核苷酸和/或修饰的核酸的核酸，例如肽核酸(PNA)。核酸可以是单链或双链的，或包含双链或单链序列的一部分。核酸可以是DNA(例如基因组和cDNA)、RNA、或杂交体，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意组合，以及碱基的任意组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。这种核酸包括核苷酸和核苷及核苷酸类似物，以及修饰的核苷，例如氨基修饰的核苷。此外，“核苷”包括非天然存在的类似物。可以根据需要选择用于核酸组装的核酸分子的组合物以赋予特定的性质/优势，例如稳定性、生物相容性、货物的封装和/或释放等。
本发明公开的核酸纳米结构是任意几何形状的结构。在优选的形式中，所述核酸纳米结构可以是三维形状。在一些形式中，所述核酸纳米结构具有圆环样形状。在一些形式中，所述核酸纳米结构具有mazzocchio形状。
已知小于30nm或大于200nm的纳米粒子往往比尺寸在30nm和200nm之间的纳米粒子更快地从血浆循环中清除。因此，对于涉及将本发明公开的纳米结构施用于对象的应用，优选(尽管不是必需的)纳米结构具有这个范围内(即30-200nm，包括端值)的尺寸(例如多边形直径、内部直径、外部直径、闭合直径或组合)，优选在50-100nm，包括端值。例如，纳米结构的尺寸可以为30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm和200nm，但不限于此。本领域技术人员将立即认识到这个范围内的所有尺寸均被涵盖，以及符合这个范围内的所有尺寸并未在本文中具体列出，仅是为了节省篇幅。此外，应当理解，由符合这个范围内的所有尺寸点限定的所有范围均涵盖在内，每个范围在本文中并未具体列出，仅是为了节省本文件中的篇幅和/或避免公开为本领域技术人员立即显而易见的内容。
i.设计和制造
如上所述，通常有两种方法可以制造不同类型的核酸纳米结构：(1)基于瓦片的方法，和(2)支架式DNA折纸法。基于瓦片的方法通常使用少量寡核苷酸，这些寡核苷酸彼此碱基配对以产生重复的模块单元。折纸方法通常涉及使用许多小的“订书钉链”作为胶水将称为“支架链”的长单链多核苷酸折叠成期望的形状或结构，从而适当地固定支架。DNA折纸是DNA的纳米级折叠，以在纳米级产生任意二维和三维形状。通过设计碱基序列，互补碱基对之间相互作用的特异性使DNA成为有用的构建材料。
本发明公开的方法和组合物利用来自两种方法的元素。例如，公开了包括含有多个子单元的核酸纳米结构的组合物，其中纳米结构具有含有闭合三维空腔的连续圆环样结构(例如基于mazzocchio的DNA纳米结构或DNA mazzocchio)。通常，多个子单元包含类似于基于瓦片的方法的重复模块单元的多个相同的子单元。每个子单元包含核心域和连接域。在一些形式中，核心域可包含支架核酸链和与支架链杂交的订书钉核酸链，以将支架链折叠成类似于折纸方法的特定模式。纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。
已知许多设计和方法可用于制造不同类型的核酸纳米结构，例如基于DNA瓦片的结构和支架式DNA折纸结构。许多这些方法和设计可以与本发明公开的核酸纳米结构一起使用并适应于本发明公开的核酸纳米结构。
示例的方法包括在如下文章中描述的那些方法：Benson E et al(Benson E etal.,Nature 523,441-444(2015))，Rothemund PW et al(Rothemund PW et al.,Nature.440,297–302(2006))，Douglas SM et al.,(Douglas SM et al.,Nature459,414-418(2009))，Ke Y et al(Ke Y et al.,Science 338:1177(2012))，Zhang F et al(ZhangF et al.,Nat.Nanotechnol.10,779–784(2015))，Dietz H et al(Dietz H et al.,Science,325,725-730(2009))，Liu et al(Liu et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,50,pp.264-267(2011))，Zhao et al(Zhao et al.,Nano Lett.,11,pp.2997-3002(2011))，Woo et al(Woo et al.,Nat.Chem.3,pp.620-627(2011))及Torring et al(Torring et al.,Chem.Soc.Rev.40,pp.5636-5646(2011))，这些文章通过引用以其全部内容并入本文。
自上而下设计任意几何形状的核酸纳米结构的示例方法在Venzianoet al,Science,352(6293),2016中描述，所述文章通过引用以其全部内容并入本文。
在一些形式中，纳米结构的序列是人工设计的，或使用替代的计算序列设计程序设计。可以并入制造和使用NMO方法中的示例设计策略包括基于单链瓦片的DNA折纸法(KeY,et al.,Science 2012)；砖状DNA折纸，例如包括带有辅助链的单链支架(Rothemund,etal.,and Douglas,et al.)；以及在PX折纸中自身折叠的纯单链DNA，例如使用平行交叉折叠。
备选的纳米结构包括砖块、带孔或腔的砖块，使用在方形或蜂窝格子上包装的DNA双链体进行组装(Douglas et al.,Nature 459,414-418(2009)；Ke Yet al.,Science338:1177(2012))。或者可以使用其中纳米结构通过单个长支架链自身折叠而形成的平行交叉(PX)折纸法，条件是诱饵序列仍然以位点特异性方式包含在内。
当支架式核酸折纸法用于设计和制造本发明公开的纳米结构和/或其子单元时，这通常涉及构建近似期望的形状/几何结构的核酸结构的几何模型。这个形状从上至下由偶数个平行双螺旋填充，理想化是圆柱体。所述螺旋被切割以适应连续成对的形状，并且长度限制为整数圈。为了将螺旋固定在一起，并入了周期交叉阵列；这些交叉指定了沿着一个螺旋运行的链切换至相邻螺旋并在那里继续的位置。所得模型近似为在x轴方向是一圈(例如3.6nm)及在y轴方向大概两个螺旋宽度(例如4nm)内的形状。这种结构中的DNA格子平行螺旋不是密堆积的，可能是由于静电排斥所致。因此，精确的y分辨率取决于螺旋之间的间隙。反过来，间隙似乎取决于交叉的间距。
在DNA折纸方法中，产生形状的基本技术包括使用许多小的“辅助链”作为胶水将在本文称为“支架链”的长单链多核苷酸折叠成期望形状或结构，从而适当地固定支架。辅助链的数量将取决于支架链的尺寸和所述形状或结构的复杂性。例如，对于相对较短的支架链(例如长度大约为150至1500个碱基)和/或简单的结构，辅助链的数量可以很小(例如大约4至40个，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个)。对于较长的支架链(例如大于1500个碱基)和/或较复杂的结构，辅助链的数量可以是数百至数千。在一些实施例中，辅助链的数量可为约300至600个，包括300、400、500或600个。在一些形式中，每个订书钉链/辅助链可具有约20至60个碱基对的长度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碱基对。
本公开提供了从多核苷酸产生任何期望形状或结构的方法。一旦产生了所述形状或结构，可以将任何期望的模式或配体加入所述形状或结构中。例如，可以产生三角形结构。在另一个实施例中，可以产生长方形。在一些实施例中，所述形状或结构的分辨率在一个方向上约为6纳米，在另一个方向上约为3纳米。例如，使用辅助链/订书钉链上的内部标记，分辨率可以降低至大约3nm。预期本公开涵盖本领域技术人员基于研究本发明公开而认为合适的其它形状或几何结构。在产生期望的结构后，可以加入其它的模式、材料或结构。
一些因素有助于支架核酸折纸成功应用于本发明公开的设计和制造。这些因素包括但不限于(1)链侵入，(2)订书钉链的过量，(3)协同效应和(4)有意不依赖订书钉链之间的结合的设计。简而言之，链侵入允许过量的全长订书钉链的正确结合以取代不需要的二级结构、不正确的订书钉链或严重截短的订书钉链。此外，每次正确加入订书钉链可以组构支架，以便随后结合相邻的订书钉链，并排除大量不需要的二级结构。最后，由于订书钉链并非旨在相互结合，因此其相对浓度无关紧要。
本发明还公开了将支架链、订书钉链和接头链组装成具有期望形状和尺寸的相应核酸纳米结构的方法。在一些形式中，组装部分通过订书钉链与支架序列的杂交进行。在一些形式中，核酸纳米结构的子单元的核心域仅包括单链DNA寡核苷酸。在一些形式中，核酸纳米结构的子单元的核心域包括自身折叠的单链DNA分子。因此，在一些形式中，纳米结构通过DNA折纸退火反应组装。通常，纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。
通常，可以根据订书钉链和/或支架序列的特定参数进行退火。例如，在适当的反应体积中以适当的量混合订书钉寡核苷酸。在优选的形式中，订书钉链混合物以有效使纳米结构的产量和正确组装最大化的量加入。例如，在一些形式中，订书钉链以超过支架链的摩尔量加入。在一些形式中，订书钉链以与支架链相等的摩尔量加入。在特定形式中，本发明公开的纳米结构可以通过对构成纳米结构的支架链、订书钉链和接头的混合物施加温度转变来制备，使得所述链和接头以适当的方式退火。在一些形式中，温度转变可发生在1至48小时的时间段内，包括端点，例如16小时。在一些形式中，温度转变可涉及从90℃至20℃的温度变化。
在一些情况下，本发明公开的制造纳米结构的方法可涉及以例如基于期望的用途针对子单元而设计的靶标开始。纳米结构子单元可以使用四步工艺流程生产。首先，使用一个或多个计算设备设计制作纳米结构的核酸的单体的主要线性序列。使用已知的单体化学和物理性质(例如，“正常”A:T和G:C核苷酸碱基配对)，计算设备确定每个核酸链的适当序列，由此其共同的相互作用产生与特定设计的形状和尺寸相匹配的子单元和/或纳米结构。接下来，使用已知技术单独制造聚合物，例如体外化学或生化合成法(例如核酸的聚合酶链反应合成；体外转录/翻译)或体内生物合成法(例如核酸和/或多肽的重组表达)。接下来，使核酸链形成分子内和/或分子间键以产生具有期望尺寸和形状的子单元。在形成步骤中，可以使每个核酸链独立于其它核酸链折叠，可以允许一些核酸链在相同环境中一起折叠，或者可以组合所有核酸链并使其在相同环境中一起折叠。优选地，所有的核酸链被组合、变性，然后使其一起折叠，在所有子单元之间产生预定的分子间和分子内键合。最后，在使子单元与合适伙伴特异性受控结合以形成纳米结构的条件下组合多个子单元。应当理解，子单元可以具有相同的一般结构或不同的结构。优选地，单个纳米结构的所有子单元具有相同的结构(例如形状、尺寸)和/或是相同的(例如在相同构型中由相同核酸链组成)。
在一个示例形式中，公开了由一个或多个核酸链制造的核酸纳米结构，每个核酸链具有与纳米结构的其它核酸链(如果存在)的序列一起工程化的主要核苷酸序列。对核酸链的集合进行工程化，使得在允许核酸链自身退火或与如果存在的其它核酸链退火的条件下组合时，其形成特定结构子单元的多个相同拷贝，其有限尺寸和形状通过设计预先确定。在产生子单元的情况下，这些然后可以组合以形成纳米结构的多个相同的核心子单元(例如子单元的堆叠)，其有限尺寸和形状通过设计预先确定。
在另一个示例形式中，可以通过设计和合成DNA链来制造16个子单元(每个子单元包含例如12个单链DNA寡核苷酸)的DNA mazzocchio纳米结构。DNA可以通过例如标准脱盐进行纯化。纯化后的DNA寡核苷酸可以首先稀释为储液(例如，100μM在无核酸酶水中)。可以将等量的每种寡核苷酸在缓冲液中混合(例如在20mM Tris、2mM EDTA和12.5mM醋酸镁中)，以达到每种寡核苷酸最终浓度为7.5μM。然后可以将混合物置于热循环仪中进行缓慢退火过程，包括在例如90℃温育5分钟，然后以例如-0.1℃/分钟的速率从90℃缓慢冷却至20℃。可以通过凝胶电泳和透射电子显微镜评估DNA mazzocchio的正确尺寸。可以通过透射电子显微镜评估DNA mazzocchio的正确形状。
所得纳米结构可以通过本领域已知的可用于核酸纳米结构的标准技术鉴定。这些方法包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳(可用于确定链的正确相互作用及检查最终纳米结构的尺寸)、动态光散射(可用于确定直径和纯度)，以及显微镜检技术，如电子显微镜、原子力显微镜(AFM)和随机光学重建显微镜(STORM)。稳定性可以在培养条件下进行评估，包括富含核酸酶的血清和弱阳离子溶液。
子单元
本发明公开的纳米结构通常由多个核酸链制成，所述多个核酸链通常但非必须形成多个子单元，这些子单元最终组合产生最终的核心结构。例如，在一些形式中，纳米结构可以由多个子单元组成，每个子单元均具有限定的多边形形状，其中子单元通过接头连接以形成具有连续圆环样形状的结构。在一些形式中，纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。每个子单元的多边形可以是任何形状。例如，每个子单元的多边形可以是六边形、八边形、五边形、七边形、九边形、十边形、四边形(例如正方形、长方形)或三角形。优选地，每个子单元的多边形是六边形或八边形。
在示例形式中，多个DNA链被设计成彼此结合，使得它们通过正常碱基配对以特别限定的方式相互作用以形成预定的形状，例如具有固定连接点/顶点的六边形。每个子单元可以有多个5’和/或3’突出区，其可以作为其它子单元的结合点。每个突出区均具有被设计为仅与指定子单元的另一个突出区相互作用(例如杂交)的序列。以这种方式，子单元的结合完全受到控制，并且可以通过选择构成纳米结构的DNA链的各种序列来设计纳米结构的整体结构。
纳米结构可以包含多个子单元。例如，纳米结构可包含数百个子单元(例如，约100、约200、约300、约400、约500或更多个)。在一些形式中，优选纳米结构包含较少数量的子单元，例如少于50个子单元。优选地，本发明公开的纳米结构可以包含8-40个子单元，包括端值(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个子单元)。优选地，本发明公开的纳米结构包含16或32个子单元。每个子单元可包含6-20个(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)个单链核酸链(例如DNA链)。优选地，每个子单元包含12个单核酸链。
在特定的形式中，每个子单元可以包含核心域和连接域，其中核心域可界定具有包围开放区域的多个边的多边形，其中所述边和开放区域界定了子单元的平面。每个子单元的第一边可以与其它子单元的第一边共平面，并且每个子单元可以在另外两个子单元之间并与另外两个子单元连接，连接的子单元的平面彼此面对以形成子单元的堆叠。以此类推，典型的多米诺骨牌堆叠具有彼此面对的多米诺骨牌的最大长方形面。连接的子单元的平面可以基本上垂直于子单元第一边的平面，并且在与子单元第一边的平面水平方向上相对于连接于给定子单元的子单元倾斜。基本上垂直是指垂直方向在垂直10°以内，优选垂直5°以内，更优选垂直3°以内，最优选垂直1°以内。连接的子单元的平面之间的倾斜可以在子单元的堆叠中产生弯曲，使得连接的子单元形成具有由堆叠的子单元的开放区域界定的闭合三维空腔的连续圆环样结构。
在一些形式中，子单元分别相对于彼此以及相对于第一边的平面的倾斜度和垂直度可以改变。例如，通过围绕闭合圆环样形状所需的平均倾斜度增加或减少而改变子单元的倾斜度，可以产生波浪形或有角度的表面(波浪形主要位于纳米结构的顶部和底部表面)。类似地，通过围绕完全垂直度增加或减少而改变子单元的垂直度，可以产生波浪形或有角度的表面(波浪形主要位于纳米结构的外表面和内表面)。这两种变化的组合可以产生更多改变和/或更复杂的表面。
支架链
在一些形式中，本发明公开的核酸纳米结构包含多个子单元，其中每个子单元可包含核心域和连接域。通常，子单元的核心域包含一个支架核酸链，尽管对于一些设计可以使用多于一个支架链。
在一些形式中，用于产生本公开纳米结构的子单元的形状的基本技术包括使用许多小的“辅助链”作为胶水将在本文称为“支架链”的长单链多核苷酸折叠成期望的形状或结构，从而适当固定支架。辅助链的数量将取决于支架链的尺寸和形状或结构的复杂性。订书钉链将支架链固定成特定模式。订书钉链的选择决定了所述模式。
可以将支架链想象成一根长绳。为了制作形状或结构，支架链以光栅模式反复折叠，以限定形状或结构。所得支架链行经路径有些像迷宫中的路径；其通常不会与自身交叉。支架链的每个折叠的长度是半圈(约5或6个核苷酸)多核苷酸(例如DNA)的倍数。每个折叠发生在正在建立的形状或结构中的特定行上。如果折叠是偶数个半圈，则支架在形状/结构上反转方向；如果折叠是奇数个半圈，则支架在形状/结构中沿相同方向继续。这些规则对于平面2D结构是典型的，例如多边形结构。对于3D结构，螺旋的长度可以不同。例如，为了建立排列在直线3D网格上的支架栅格，支架的长度可以是四分之一(1/4)圈的倍数。类似地，为了在六边形排列的3D网格上建立支架栅格，支架的长度可以是三分之一(1/3)圈的倍数。“排列在X型3D网格上”是指在纳米结构的横截面中螺旋中心的位置，其被视为与平行螺旋组垂直，是可以与X型2D网格对齐的2D模式。
当支架链被折叠成某形状或结构时，支架的某些截面靠近在一起，如果支架链完全伸展，这些截面则相距较远。在一些形式中，当使用计算机程序时，对于支架链的每个短截面(例如8个碱基)，所述程序确定支架的哪个其它截面应该在完成的形状或结构附近。然后可以使用计算机程序设计辅助链，以将靠近或并列的截面连接在一起。设想支架的一个截面“A”链，其靠近支架的另一截面“B”链(链“A”和“B”可以是不同支架链的相同链)。所述程序设计辅助链，以便辅助链的一半与“A”结合，辅助链的另一半与“B”结合，当辅助链同时结合“A”和“B”时，辅助链将所述链连接在一起。
鉴于支架的折叠路径形成期望的形状或结构，选择合适的辅助链将其固定在一起。对于复杂的形状，通常使用计算机程序选择辅助链。辅助链被设计为将支架链的两个或多个小截面或结构域保持在一起。
支架链的长度可以根据其被折叠成的多边形的期望尺寸和形状而变化。通常，支架链包括10至1000个核苷酸，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在特定形式中，支架链包括约70至560个核苷酸，包括端值。例如，支架链可包括约70-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500或500-560个核苷酸，包括端值。
支架链可以来自任何天然或人工来源。在一些形式中，支架链源自噬菌体基因组。在一些形式中，支架链源自M13病毒基因组的一个区段。在一些形式中，支架链源自M13mp18单链DNA。可用于折叠DNA纳米结构子单元的其它单链环状DNA包括但不限于p7308、p7560、p7704、p8064、p8634和pEGFP。在一些形式中，支架链可包含任意序列和/或可通过基于本领域标准方法(例如固相合成、PCR组装)的化学合成方法产生。参见例如Hughes RA.,et al.,Cold Spring Harb.Perspect.Biol.9(1).pii:a023812(2017)。
订书钉链
在一些形式中，本发明公开的纳米结构使用核酸的短“订书钉”链或“辅助链”将多核苷酸链固定成特定模式。订书钉链的选择决定了所述模式。在一种形式中，可以使用软件程序鉴别形成给定设计需要的订书钉链。
通常，当使用订书钉链时，订书钉链的数量将取决于支架链的尺寸和所述形状或结构的复杂性。例如，对于相对较短的支架链(例如长度约50至1,500个碱基)和/或简单结构，订书钉链的数量可以较小(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或更多个)。对于较长的支架链(例如大于1,500个碱基)和/或较复杂的结构，订书钉链的数量可以是数百至数千(例如50、100、300、600、1,000或更多个辅助链)。
通常，订书钉链包括10至600个核苷酸，例如14-600个核苷酸。在特定形式中，订书钉链包括约13-219个核苷酸，包括端值。例如，在一些形式中，一个或多个订书钉链可包括约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500、550或600个核苷酸。在一些形式中，每个订书钉链包括中心区，其侧接3’突出区、5’突出区或两者。优选地，订书钉链的中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。每个订书钉链的中心区可以与支架链结合以形成双链体区域。订书钉链的5’突出区可各自单独地包含任意数量的核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)，订书钉链的3’突出区可各自单独包含任意数量的核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多)，或两者。在优选的形式中，订书钉链的5’突出区可各自单独包含8-16个核苷酸，包括端值；3’突出区可各自单独包含8-16个核苷酸，包括端值；或两者。可以理解，在任何给定链上，5’突出区和3’突出区可以包含相同或不同数量的核苷酸。
订书钉链通常在折叠缓冲液中提供。订书钉链通常但非必须以等摩尔量与适当的盐和洗涤剂组合加入单链支架序列中。
接头链
给定纳米结构中的每个子单元可以包含核心域和连接域。每个子单元的连接域可以包含一个或多个接头(也称为接头链)，子单元之间的连接可以通过接头进行。这种连接可涉及接头与核心域的支架链和/或订书钉链上的突出区之间的基于核酸的杂交。
子单元连接域包含的接头的的数量可以变化。连接域可以包含例如但不限于3-20个接头，包括端值。在一些形式中，接头的数量可以取决于由核心域的子单元限定的特定多边形。例如，在一些形式中，对于六边形子单元，连接域可具有六个接头，对于八角形子单元可具有八个接头，对于十边形子单元可具有十个接头。在一些形式中，子单元的连接域包含n个接头链，其中n是子单元多边形中的边数或子单元多边形中的顶点数。
每个接头可具有配置成在连接的子单元平面之间产生倾斜的长度，从而产生纳米结构的连续圆环样结构。每个接头的长度以及该接头在子单元中的位置决定了接头连接其子单元的位置与其互补接头连接其子单元的位置之间的间距。由于每个接头长度可以通过设计而改变，因此可以设计和选择子单元的倾斜、间距和垂直度以限定和建立纳米结构的整体结构和形状。这种设计部分是指接头的构型。因此，在任何给定的子单元中，一个或多个接头链可以具有相同或不同的长度。通常，接头链包括2至600个核苷酸，包括端值。例如，接头链可以包括2-20、15-50、40-100、80-300、200-600个核苷酸，包括端值。在特定形式中，接头链包括约2-60(例如2-58)个核苷酸，包括端值。在给定的子单元内，所有的接头在序列上可以是独特的。
通常，接头与核心域的一个或多个突出区互补。通常，各个链的杂交和其中的互补性基于Watson-Crick碱基配对。连接域的一个或多个接头与核心域的突出区之间的互补程度(互补残基的数量)可以是16-32个碱基对，包括端值。纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。
基于杂交，接头和突出区可以是完全、基本上或部分双链的。对于完全的或基本上的双链体，接头的长度将与其互补的突出区相同或几乎相同。这是优选的设计。对于部分双链体，接头的长度可以长于或短于其互补的突出区。或者，接头可具有与其相应突出区不互补的一些序列(以及与突出区互补的序列)。通过这些方式，接头的长度可以影响或决定突出区的长度。应当理解，在接头及其相应突出区仅部分互补的情况下，在设计子单元之间的间距和接头长度时应考虑接头和突出区的有效长度。
例如，特别是当子单元限定六边形时，核心域可以包含6个核酸链(链1-6)，连接域可以包含与核心域的一个或多个突出区互补的6个单链核酸接头(链7-12)。在这种形式中，连接域的链8可以排列为与第一子单元的链1的5’突出区和来自另一子单元的链1的3’突出区互补。链8与链1的5’和3’突出区之间的互补程度可以是28个碱基对(即链8是完全互补的)。连接域的链9可以排列为与核心域的链2的5’突出区和链3的3’突出区互补，互补程度可以是20个碱基对。连接域的链10可以排列为与核心域的链3的5’突出区和链4的3’突出区互补，互补程度可以是16个碱基对。连接域的链11可以排列为与核心域的链4的5’突出区和链5的3’突出区互补，互补程度可以是20个碱基对。连接域的链12可以排列为与核心域的链5的5’突出区和链6的3’突出区互补，互补程度可以是28个碱基对。连接域的链7可以排列为与核心域的链6的5’突出区和链2的3’突出区互补，互补程度可以为32个碱基对。
形状和尺寸
本发明公开的核酸纳米结构可以包含多个子单元，其中纳米结构具有含有闭合三维空腔的连续圆环样结构。每个子单元可以包含核心域和连接域，其中核心域可以限定为具有包围开放区域的多个边的多边形。核酸纳米结构的子单元的核心域可以具有任意的几何形状和尺寸。本文预期了几种几何变体以构建核酸纳米结构。在一些形式中，每个子单元的多边形可以是六边形、八边形、五边形、七边形、九边形、十边形、四边形(例如正方形、长方形)或三角形。在优选形式中，核心域可以限定为六边形或八边形。任何用于操作、分类或塑形核酸的方法均可用于产生所述纳米结构子单元。通常，所述方法包括“塑形”或以其它方式改变核酸构象的方法，例如DNA折纸方法。
应当理解，通常子单元的核心域包含一个支架核酸链和n-1个订书钉核酸链，其中n是子单元多边形中的边数。例如，具有八边形形状的子单元将包含具有一个支架链和七个订书钉链的核心域。
本发明公开的纳米结构可以具有连续的圆环样结构，其具有包含在其中的由堆叠子单元的开放区域界定的闭合三维空腔。因此，空腔的尺寸由子单元的边包围的开放区域界定。开放区域可以是任何期望的尺寸。在一些形式中，开放区域可以是适应任何感兴趣货物的封装的任何尺寸。在一些形式中，开放区域的尺寸在约30-2165nm2的范围内，包括端值。这个尺寸(30-2165nm2)对于具有六边形子单元的mazzocchio纳米结构可以是特别理想的。
在特定形式中，基于mazzocchio的纳米结构可具有约157-314nm的周长，包括端值。
在一些形式中，开放区域的边尺寸小于100nm，优选小于50nm，更优选小于20nm，最优选小于15nm。在一些形式中，纳米结构的子单元包含具有一个或多个边的多边形，其边的尺寸为5-200nm，例如5、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nm。在一些形式中，多边形的每个边的尺寸是5-200nm，例如5、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nm。
在一些形式中，多边形直径可以是5-200nm，例如5、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nm。优选地，多边形直径是50-100nm。在一些形式中，多边形直径小于100nm，优选小于50nm，更优选小于20nm，最优选小于15nm。
纳米结构的闭合3D空腔是中空的开放空间，其在圆环样环内闭合，可以包含感兴趣的货物。该空腔的尺寸通常小于整个纳米结构的尺寸。在一些情况下，本发明公开的纳米结构将感兴趣的货物封装在圆环样环的空腔内。具有任何目的或功能的任何化合物均可以作为货物封装在空腔内。示例的货物包括但不限于小分子、脂质、蛋白质、酶、抗体、蛋白质复合物、磷脂、核酸及其组合。
ii.核苷酸修饰
在一些形式中，纳米结构的核苷酸序列被修饰。例如，在一些形式中，订书钉链的一个或多个核苷酸被修饰，或者支架链的一个或多个核苷酸被修饰，或者接头链的一个或多个核苷酸被修饰，或其组合。
当修饰的核苷酸掺入核酸支架链、接头链和/或订书钉链时，修饰的核苷酸可以以用于制备核酸的总核苷酸的百分比或比例掺入。在一些形式中，修饰的核苷酸占序列中核苷酸总数的0.1％或大于0.1％，直至或接近存在的总核苷酸的100％。例如，修饰核苷酸的相对量可以在0.1％和100％之间，包括端值，例如占总数的0.1％-0.5％、1％-2％、1％-5％、1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％或50％以上，直至并包括100％，如占总数的60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些形式中，核酸序列包括单个修饰的核苷酸，或两个或三个修饰的核苷酸。
在一些形式中，核酸纳米结构在通过设计过程确定的精确位置以特定数量或比例包含修饰的核苷酸。因此，在一些形式中，核酸纳米结构可以在所述结构内的特定位置包括限定数量或百分比的修饰的核苷酸。在一些形式中，核酸纳米结构包括不止一种类型的修饰的核酸。
非天然存在的核酸可以包括例如天然和非天然存在的核苷酸的混合物。非天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物可以在核糖、磷酸酯和/或碱基部分进行修饰。在一些形式中，核酸可包含核糖核苷酸和非核糖核苷酸。在一些这种形式中，核酸可包含一个或多个核糖核苷酸和一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些形式中，核酸可包含一个或多个非天然存在的核苷酸或核苷酸类似物，例如具有硫代磷酸酯键、硼磷酸酯键的核苷酸，在核糖环的2’和4’碳之间包含亚甲基桥键的锁核酸(LNA)核苷酸，肽核酸(PNA)，桥接核酸(BNA)或吗啉代核酸。修饰的核苷酸的其它实例包括2’-O-甲基类似物、2’-脱氧类似物、-2硫尿苷类似物、N6-甲基腺苷类似物或2’-氟类似物。修饰的核苷酸的其它实例包括在2’位置的化学组分链接，包括但不限于肽、核定位序列(NLS)、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、聚乙二醇(PEG)、三甘醇或四甘醇(TEG)。修饰的碱基的进一步实例包括但不限于在一个或多个末端核苷酸修饰的2-氨基嘌呤、5-溴尿苷、假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(me1Ψ)、5-甲氧基尿苷(5moU)、肌苷、7-甲基鸟苷。核酸化学修饰的实例包括但不限于掺入2’-O-甲基(M)、2’-O-甲基-3’-硫代磷酸酯(MS)、硫代磷酸酯(PS)、S-约束的乙基(cEt)、2’-O-甲基-3’-thioPACE(MSP)或2’-O-甲基-3’-膦酰基乙酸酯(MP)。与未修饰的核酸相比，这种化学修饰的核酸可包含增加的稳定性。
可包含在纳米结构内的修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、S2T、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基喹啉、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基喹啉、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、和(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤。核酸分子也可以在碱基部分(例如，通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子和/或在通常与互补核苷酸不能形成氢键的一个或多个原子)、糖部分或磷酸主链进行修饰。核酸分子还可以包含胺修饰的基团，例如氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)以允许胺反应部分的共价连接，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。
在一些形式中，支架链、订书钉链和/或接头链的DNA核苷酸上的硫代磷酸酯修饰的主链用于改良纳米结构的稳定性(例如，抵抗外切核酸酶的降解)。例如，在一些形式中，核酸纳米结构包括保护所述结构的一个或多个区域免于体内酶降解或破坏的修饰的核酸。以此方式，修饰可增强在体内对纳米结构的一个或多个部分的酶促降解的保护，例如以增强或改变给定结构的体内半衰期。
锁核酸(LNA)是一个构象锁定的核苷酸类似物家族，除其它益处外，其对DNA和RNA寡核苷酸具有真正前所未有的亲和性和非常高的核酸酶抗性(Wahlestedt C,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,975633–5638(2000)；Braasch,DA,et al.,Chem.Biol.81–7(2001)；Kurreck J,et al.,Nucleic Acids Res.301911–1918(2002))。在一些形式中，纳米结构包含合成的RNA样高亲和性核苷酸类似物锁核酸。在一些形式中，支架链、订书钉链和/或接头链是合成的锁核酸。
肽核酸(PNA)是一种核酸类似物，其中天然核酸的糖磷酸主链已被通常由N-(2-氨基-乙基)-甘氨酸单元形成的合成肽主链取代，导致非手性和不带电荷的模拟物(Nielsen,et al.,Science 254,1497-1500(1991))。其具有化学稳定性和水解(酶促)裂解抗性。在一些形式中，纳米结构包含PNA。在一些形式中，支架链、订书钉链和/或接头链是PNA。
在一些形式中，PNA、DNA和/或LNA的组合用于纳米结构的核酸。例如，在一些形式中，PNA、DNA和/或LNA的组合用于订书钉链、接头链、支架链和/或纳米结构的任何核酸组分。
在一些形式中，核酸可以包括吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸通常由两个以上的吗啉代单体组成，这些单体含有嘌呤或嘧啶碱基配对部分，通过碱基特异性氢键有效结合多核苷酸中的碱基，通过含磷键连接在一起，长度为1至3个原子，将一个单体的吗啉代氮连接到相邻单体的5’环外碳。嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。吗啉代寡聚体的合成、结构和结合特性在美国专利号5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063和5,506,337详细说明。
本领域技术人员将认识到本发明公开的纳米结构可包含所述修饰或未修饰的核酸的各种组合。例如，本发明公开的纳米结构可以包含DNA、RNA、LNA、PNA或其组合。因此，应当理解，本发明公开的组合物和方法中使用的核酸在性质上可以是同质的或异质的。例如，核酸在本质上可以是完全的DNA，或者其可以包括DNA和非DNA(例如LNA)单体或序列。
C.货物
本发明公开的核酸纳米结构可用于携带、呈递和/或递送货物。纳米结构适合作为包括治疗剂、预防剂和/或诊断剂在内的货物的递送载体。纳米结构可以包含一种或多种类型的货物。货物可以与纳米结构共价或非共价结合。货物可以封装在纳米结构内。应当理解，本发明公开的圆环样纳米结构(例如DNA mazzocchio)包含两种不同的空间：(1)“甜甜圈”中心的孔和(2)在连续的圆环样结构的管内的闭合空腔。因此，货物可以装载在任一或这两种空间中。
由于纳米结构是基于核酸的，因此DNA纳米结构是完全生物学相容的，在宿主中引起最小的免疫反应。任何期望的几何结构的DNA纳米结构的设计进一步允许对DNA结构进行操作以适应于单个药物、剂量、靶位点和期望的降解率等。
任何货物均可以通过各种非共价或共价相互作用直接或间接掺入核酸纳米结构中。用于附着的一些示例的非共价相互作用包括嵌入、生物素-链霉亲和素相互作用、化学接头(例如使用点击化学基团)和互补核苷酸序列之间的杂交(即碱基配对)。在一些形式中，将货物掺入或装载至纳米结构中可涉及键的形成，例如共价键(例如碳-碳、碳-氧、氧-硅、硫-硫、磷-氮、碳-氮、金属-氧或其它共价键)、离子键、氢键(例如在羟基、胺、羧基、硫醇和/或类似官能团之间)、配位键(例如金属离子与单原子螯合配体或多原子螯合配体之间的络合或螯合)等。货物掺入也可以涉及疏水相互作用或范德华相互作用。在一些形式中，将货物掺入或装载至纳米结构中可涉及马来酰亚胺硫醇偶联。
纳米结构可以包括一个或多个将货物连接于纳米结构的连接/适体部分。连接/适体部分的非限制性实例包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素和任何其它合适的交联分子。纳米结构可以使用任何合适的化学修饰进行功能化，以允许掺入货物。一个实例是无铜点击化学，其可用于使纳米结构功能化以结合任何货物，包括接头、肽、抗体和荧光或放射性标记的报告分子。
在一些形式中，待递送的剂被简单捕获在纳米结构内，例如在“甜甜圈”中心的孔内。在这些情况下，纳米结构的孔径是重要的考虑因素，即其足够小，以便捕获的货物不会漏出。在一些形式中，DNA mazzocchio被组装成片状，以允许在纳米结构完成之前捕获货物。
在一些形式中，两种或更多种货物可以被物理地包埋、封装和/或非共价结合于纳米结构。一种剂可以增强另一种封装剂的功效。本领域技术人员将意识到在某一类别(例如诊断剂)内描述的剂、分子、化学部分或化合物不限于该类别。除非另有说明，否则剂、分子、化学部分或化合物可提供多种功能，因此可用作不止一种类型的货物。例如，相同的分子可以是诊断剂、成像剂、治疗剂、预防剂或毒性剂。
在另一种形式中，纳米结构组合物包括剂的混合物(例如蛋白质混合物)以连续递送至需要其的组织或细胞。
用于本公开纳米结构的货物可以是期望由本发明公开的核酸纳米结构携带、呈递和/或递送的任何分子、材料和组合物。本发明公开的货物可以以任何合适的方式组合、连接和/或偶联。例如，剂及其它分子可以直接或间接共价或非共价结合，具有或没有接头部分。在一些形式中，货物可以包括治疗剂、预防剂、毒性剂、诊断剂或其它剂。用作货物的示例性剂包括蛋白质、肽、碳水化合物、核酸分子、聚合物、小分子及其组合。在一些形式中，货物可以包括肽药物、染料、抗体或抗体的抗原结合片段。用作货物的治疗剂可包括抗癌药、抗炎药或抑制待治疗的疾病或病症的更具体的药物。用作货物的遗传治疗剂可包括反义DNA和RNA以及编码蛋白质、mRNA、miRNA、piRNA和siRNA的DNA。
在特定形式中，本发明公开的纳米结构包含治疗剂、毒性剂、靶向剂、成像剂、诊断剂或预防剂或其组合。在特定形式中，纳米结构包含成像剂，包括但不限于金纳米粒子。在特定形式中，本发明公开的纳米结构可以包含靶向剂，包括但不限于适体。在特定形式中，本发明公开的纳米结构包含如DNA、RNA、PNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、小分子或染料等分子。所述剂或分子可以共价或非共价结合于纳米结构。在一些形式中，所述剂或分子可以封装在纳米结构内。
1.靶向剂
在一些形式中，纳米结构包含一种或多种靶向剂(在本文中也称为靶向分子)，其相对于其它类型的细胞、组织、器官或体内微环境可以将核酸纳米结构特异性靶向一种或多种类型的细胞、组织、器官或微环境，或介导与蛋白质、脂质、多糖、核酸等的特异性结合。在一些形式中，靶向剂可以将核酸纳米结构特异性靶向一个或多个亚细胞区室。
示例的靶向剂包括蛋白质、肽、核酸、脂质、糖类或多糖，其结合与器官、组织、细胞或细胞外基质或特定类型的肿瘤或感染的细胞相关的一个或多个靶标。可以通过选择具有适当亲和性和特异性的靶向分子来调节核酸纳米结构的靶向特异性程度。例如，抗体或其抗原结合片段是非常特异性的。
通常，靶向剂利用特异于生物功能类细胞例如抗原呈递细胞的表面标志物。例如，树突状细胞表达许多可介导内吞作用的细胞表面受体。在一些形式中，为了靶向目的，突出区序列包括与感兴趣的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一些形式中，本发明公开的纳米结构可以通过凝集素介导的内吞作用靶向。
可以例如通过将生物素酰化的核苷酸掺入订书钉链中以在订书钉链上导入额外的官能团。因此，通过生物素-链霉亲和素相互作用导入任何链霉亲和素包被的靶向分子。在其它形式中，包括非天然存在的核苷酸用于进一步修饰的期望官能团。示例的官能团包括靶向剂、免疫调节元件、化学基团、生物大分子及其组合。
在一些形式中，靶向分子可以是抗体或其片段、特定受体的配体、或与待靶向细胞表面特异性结合的其它蛋白质。其它非限制性示例分子包括肽、亲和性配体、细胞穿透分子、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子。
亚细胞靶向分子的实例在如下美国专利申请公开中描述：2009031733，20090258926，20090176660，20080311136，20070287680，20070157328，20070111270，20070111251，20060257942，20060154340，20060014712，20050281805，20050233356，20040005309，20030082176和20010021500，这些专利申请通过引用以其全部内容，特别是其关于亚细胞靶向分子和基序的描述并入本文。核靶向分子的实例在如下美国专利申请公开中描述：10100143454，20100099627，20090305329，20090176710，20090087899，20070231862，20070212332，20060242725，20060233807，20060147922，20060070133，20060051315，20050147993，20050071088，20030166601，20030125283，20030083261，20030003100，20020068272和20020055174，这些专利申请通过引用以其全部内容，特别是其关于核靶向分子和基序的描述并入本文。
i抗体
在一些形式中，核酸纳米结构被修饰以包括一种或多种抗体。通过直接与细胞表面的一个或多个表位、其它配体或辅助分子结合而发挥作用的抗体可以直接或间接偶联于纳米结构。在一些形式中，抗体或其抗原结合片段对特定细胞类型表面的受体具有亲和性，例如在巨噬细胞、树突细胞或上皮内衬细胞表面表达的受体。在一些形式中，抗体在细胞表面结合一种或多种靶受体，从而能够增强或以其它方式介导抗体结合的纳米结构的细胞摄取，或抗体结合的纳米结构的细胞内易位，或两者。
任何特异性抗体均可用于修饰核酸纳米结构。例如，抗体可以包括与靶细胞上的表位结合的抗原结合位点。抗体与“靶”细胞的结合可以通过一种或多种不同的机制增强或诱导靶细胞蛋白对结合的核酸纳米结构的摄取。
在一些形式中，抗体或抗原结合片段与表位特异性结合。表位可以是线性表位。表位可以特异于一种细胞类型或可以由多种不同的细胞类型表达。抗体或其抗原结合片段可以结合包括靶细胞表面的3D表面特征、形状或三级结构的构象表位。
在一些形式中，与靶细胞上的表位特异性结合的抗体或抗原结合片段仅在蛋白质表位未被配体或小分子结合时才能结合。
各种类型的抗体和抗体片段可用于修饰核酸纳米结构，包括任何类别的完整免疫球蛋白、其片段和至少包含抗体的抗原结合可变域的合成蛋白质。抗体可以是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。抗体可以是抗原结合片段的形式，包括Fab片段、F(ab')2片段、单链可变区等。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体(mAb)。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要其特异性结合靶抗原和/或表现出期望的生物学特性活性即可(美国专利号4,816,567；及Morrison,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。还可以通过重组方式修饰抗体，例如通过氨基酸的缺失、添加或取代，以增加抗体在介导期望功能方面的功效。取代可以是保守取代。例如，抗体恒定区中的至少一个氨基酸可以被不同的残基取代(见例如美国专利号5,624,821；美国专利号6,194,551；WO 9958572；及Angal,et al.,Mol.Immunol.30:105-08(1993))。在一些情况下，进行改变以减少不需要的活性，例如补体依赖性细胞毒性。抗体可以是对至少两种不同抗原表位具有结合特异性的双特异性抗体。在一些形式中，表位来自相同抗原。在一些形式中，表位来自两种不同抗原。双特异性抗体可包括双特异性抗体片段(参见例如Hollinger,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6444-48(1993)；Gruber,et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))。
可以通过本领域已知的任何方式产生将核酸纳米结构靶向特定表位的抗体。用于抗体产生和生产的示例描述方式包括Delves,Antibody Production:EssentialTechniques(Wiley,1997)；Shephard,et al.,Monoclonal Antibodies(OxfordUniversity Press,2000)、Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(Academic Press,1993)；及Current Protocols in Immunology(John Wiley&Sons,mostrecent edition)。完整Ig分子的片段可以使用本领域熟知的方法产生，包括酶消化和重组方式。
ii.适体
在一些形式中，本文所述的纳米结构与基于核酸的适体缀合或掺入，这有助于其优先靶向一种或多种类型的细胞、组织、器官或微环境。在一些形式中，适体可以增强纳米结构在细胞中内在化(例如如果适体与细胞表面标志物结合)。
适体是短的单链DNA或RNA寡核苷酸(6～26kDa)，其折叠成明确定义的3D结构，以高亲和性和特异性识别包括跨膜蛋白、糖和核酸在内的各种生物分子(Yu B,et al.,MolMembr Biol.,27(7):286-98(2010))。原始适体库(尚未针对靶加以选择)的高序列和构象多样性使得发现靶结合适体的可能性很大。适体优选以特定方式与靶分子相互作用。通常适体是长度为15-50个碱基的小核酸，其折叠成特定的二级和三级结构，例如茎环或G-四分体(G-quartet)。适体可以结合小分子，如ATP和茶碱，也可以结合大分子，如逆转录酶和凝血酶。适体可与靶分子非常紧密地结合，Kd小于10-12M。优选适体以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。适体可以以非常高的特异性结合靶分子。例如，已分离出的适体与仅在分子的一个位置不同的另一分子相比与靶分子之间的结合亲和力差异大于10,000倍。优选适体与靶分子的Kd比与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。当对例如多肽等分子进行比较时，优选背景分子是不同的多肽。
在一些形式中，适体特异性结合表面或跨膜蛋白，例如整联蛋白αvβ3、VEGF受体、EGF受体、HER2、HER3、MUC1、PSMA和受体酪氨酸激酶RET。适体可包含修饰或未修饰的DNA或RNA。在一些形式中，适体是核酸酶抗性的。在一些形式中，适体是2’修饰的RNA适体(例如，2’-氟和2’-O-甲基)。最近已用于靶向组装的预期用于本公开组合物和方法中的适体的非限制性实例在Friedman AD,et al.,Curr Pharm Des.,19(35):6315-29(2013)(见表7)中提供。在一些形式中，一种或多种以下适体在提供的纳米结构上可用作靶向剂：Sgc8c PTK7适体、S2.2 MUC-1适体和AS1411核仁蛋白适体。
在一些形式中，适体可以直接附加于整合在支架中的序列之一的末端(例如子单元中任何链如接头链的3’或5’末端)，使得其可以从表面升起。例如，在特定形式中，适体(例如单链DNA适体)可以附加于DNA纳米结构(例如DNA mazzocchio)中一个或多个六边形子单元的第7链的3’末端。在这种形式中，适体将展示在纳米结构的外表面上。在纳米结构的其它形式中，适体可以附加于类似链的类似末端，由此适体可以从表面升起。预期这种设计使适体对细胞环境更加稳健，尽管适体可以在某种程度上相对于其靶标隐藏起来。在一些形式中，可以将衔接子序列附加于适体上，然后可以使用一段碱基配对序列将适体附加于纳米结构上。预期在这个设计中，适体可更多地暴露于其靶标，但对环境中的核酸酶的稳健性较低。
iii.凝集素
可以共价附着于核酸纳米结构以使其特异性靶向粘蛋白和粘膜细胞层的凝集素包括分离自如下物种的凝集素：相思子(Abrus precatroius)，双孢菇(Agaricusbisporus)，澳洲鳗鲡(Anguilla)，花生(Arachis hypogaea)，西非单叶豆(Pandeiraeasimplicifolia)，红花羊蹄甲(Bauhinia purpurea)，Caragan arobrescens，鹰嘴豆(Cicerarietinum)，刺松藻(Codium fragile)，曼陀罗(Datura stramonium)，双花扁豆(Dolichosbiflorus)，龙牙花(Erythrina corallodendron)，鸡冠刺桐(Erythrina cristagalli)，欧洲卫矛(Euonymus europaeus)，大豆(Glycine max)，螺旋蜗牛(Helix aspersa)，玛瑙螺(Helix pomatia)，香豌豆(Lathyrus odoratus)，兵豆(Lens culinaris)，美洲鲎(Limuluspolyphemus)，番茄(Lysopersicon esculentum)，桑橙(Maclura pomifera)，苦瓜(Momordica charantia)，鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)，莫桑比克眼镜蛇(Naja mocambique)，以及凝集素伴刀豆球蛋白A，琥珀酰-伴刀豆球蛋白(Succinyl-Concanavalin)A，栽培小麦(Triticum vulgaris)，荆豆(Ulex europaeus)I、II和III，接骨木(Sambucus nigra)，朝鲜槐(Maackia amurensis)，黄蛞蝓(Limax fluvus)，美洲龙虾(Homarus americanus)，黄道蟹(Cancer antennarius)和翅荚百脉根(Lotustetragonolobus)。
靶向分子的选择将取决于纳米结构组合物的使用方法以及待靶向的细胞或组织。靶向分子通常可以增加纳米结构对细胞或组织的结合亲和性，或者可以将组装物靶向器官中的特定组织或组织中的特定细胞类型。
2.成像剂和诊断剂
在一些形式中，纳米结构包含一种或多种成像剂。在一些形式中，纳米结构包含一种或多种诊断剂。剂可以既是成像剂也是诊断剂。如本文所用，术语“成像剂”是指可通过多种技术检测的任何分子。可用的成像剂包括可在体内施用及随后被检测的部分。
在一些形式中，本发明公开的纳米结构包含金纳米粒子作为成像剂。在一些形式中，金纳米粒子包含在(1)“甜甜圈”中心的孔内，(2)在连续圆环样结构管内的闭合空腔内，或(3)这两者。
货物成像剂或诊断剂可以是同位素。这种同位素可用作例如治疗剂、可检测剂或两者。可用的同位素的实例包括：镥177(177Lu)，铼188(188Re)，镓68(68Ga)，钇90(90Y)，锝99m(99mTc)，钬166(166Ho)、碘131(131I)，铟-111(111In)，氟-18(18F)，碳-11(11C)，氮-13(13N)，氧-15(15O)，溴-75(75Br)，溴-76(76Br)、碘-124(124I)、铊-201(201Tl)、锝-99(99Tc)和碘-123(123I)。
可用于本发明公开的组合物和成像方法中的成像剂包括但不限于染料、放射性标记和荧光分子。成像剂可以是例如促进直接或间接检测的任何部分，优选通过非侵入性和/或体内显像技术检测。例如，成像剂可以通过任何已知的成像技术检测，包括例如放射学技术。成像剂可以包括例如造影剂。造影剂可例如是Feridex。例如，在一些形式中，成像剂包含钽化合物。在一些形式中，成像剂包含碘，例如放射性碘。例如，在一些形式中，成像剂包含有机碘酸，例如碘羧酸、三碘苯酚、碘仿和/或四碘乙烯。在一些形式中，成像剂包括非放射性可检测试剂，例如非放射性同位素。例如，氧化铁和Gd可以某些形式用作非放射性成像剂。成像剂还可以包括放射性同位素、酶、荧光团和量子点
Figure GDA0003438633250000371
例如，检测部分可以是酶、生物素、金属或表位标签。其它已知或新发现的可检测标记物被考虑用作具有提供的纳米结构的成像剂。例如，在一些形式中，成像剂包含钡化合物，例如硫酸钡。
成像剂的实例包括放射造影剂，例如泛影酸钠盐二水合物、碘和硫酸钡，荧光成像剂，例如丽丝胺罗丹明(Lissamine Rhodamine)PE，荧光或非荧光染色剂或染料，例如其可以赋予可见色或在可见或其它波长(例如红外线或紫外线)下反射电磁辐射特征光谱，如罗丹明、放射性同位素、正电子发射同位素，如18F或124I(尽管半衰期短正电子发射同位素可施加一些限制)、金属、铁磁性化合物、顺磁性化合物例如钆、超顺磁性化合物例如氧化铁和抗磁性化合物例如硫酸钡。可以选择成像剂以优化由所选成像技术产生的图像的可用性。例如，可以选择成像剂以增强感兴趣的特征例如胃肠息肉和正常胃肠组织之间的对比度。
成像可以使用任何合适的成像技术来完成，例如X射线、计算机断层扫描(CT)、MRI、正电子发射断层扫描(PET)或SPECT。在一些形式中，纳米结构可以与核医学成像剂如铟-III或锝99、PET成像剂或MRI成像剂如纳米粒子偶联。
成像技术的示例包括磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)。成像剂在其应用中通常可分为诊断性或治疗性。因此，成像剂和诊断剂可以包含相同的制剂、部分或化合物。由于辐射对组织的破坏作用，尽可能准确地靶向放射性药物的生物分布是有用的。PET可以使用例如用18F、11C、13N和15O、75Br、76Br和124I等正电子发射体标记的成像剂。SPECT可以使用例如用单光子发射器(例如201Tl、99Tc、123I和131I)标记的成像剂。
基于葡萄糖和基于氨基酸的化合物可用作成像剂。基于氨基酸的化合物在分析肿瘤细胞时更有用，因为其更快地被吸收并掺入蛋白质合成中。在基于氨基酸的化合物中，含有11C和18F的化合物已被成功使用。适合成像的包含11C的放射性标记氨基酸包括例如L-[1-11C]亮氨酸(Keen et al.J.Cereb.Blood Folw Metab.1989(9):429-45)，L-[1-11C]酪氨酸(Wiesel et al.J.Nucl.Med.1991(32):2041-49)，L-[甲基-11C]甲硫氨酸(Comar etal.Eur.J.Nucl.Med.1976(1):11-14)和L-[1-11C]甲硫氨酸(Bolster etal.Appl.Radiat.Isot.1986(37):1069-70)。
PET涉及使用重合法检测来自短寿命正电子发射放射性同位素的湮没光子形式的伽马射线，包括但不限于半衰期约为110分钟的18F，半衰期约为20分钟的11C，半衰期约为10分钟的13N，半衰期约为2分钟的15O。对于PET成像研究，可以使用[11C]间羟基麻黄碱(HED)和2-[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)等化合物。SPECT可以使用寿命更长的同位素，包括但不限于半衰期约为6小时的99mTc和半衰期约为74小时的201Tl。放射性碘化的间碘苄基胍(MIBG)是一种放射性示踪剂，其可用于核医学成像研究。
3.治疗剂和预防剂
核酸纳米结构可以通过与治疗剂和/或预防剂、特别是基于蛋白质或核酸的治疗剂和/或预防剂共价或非共价结合而修饰。例如，一种或多种治疗剂和/或预防剂可以与核酸纳米结构的外部结合，封装在“甜甜圈”中心的孔内，封装在连续圆环样结构的管内的闭合空腔内，或其组合。可以根据纳米结构的设计以及与治疗剂和/或预防剂相互作用的位点的位置来确定定位。
本发明公开的纳米结构可用于携带、呈现和/或递送任何治疗剂和/或预防剂，因为其代表了帮助将剂递送至细胞和组织的一般模式和平台。因此，任何治疗剂均可以用作本发明公开的纳米结构组合物中的货物。治疗剂和药物的综合列表可见于许多地方，例如Orange Book和美国食品和药物管理局维护的其它列表(信息可在网站fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ucm129662.htm和fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/default.htm获取)及其它国家维护的类似列表，以及在clinicaltrials.gov/(关于正在进行临床试验的药物和治疗剂)。
可用的治疗剂可以是例如细胞毒性剂，如本文所用，其可以是直接或间接促进细胞死亡的任何分子。可用的细胞毒性剂包括但不限于小分子、多肽、肽、肽模拟物、核酸分子、细胞和病毒。作为非限制性实例，可用的细胞毒性剂包括细胞毒性小分子，例如阿霉素(doxorubicin)、多西紫杉醇(docetaxel)或曲妥单抗(trastuzumab)；抗微生物肽，例如下文进一步描述的那些；促凋亡多肽，例如胱天蛋白酶(caspase)和毒素，例如胱天蛋白酶-8；白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素如DAB389EGF、蓖麻毒素(ricin)；和细胞毒性细胞，例如细胞毒性T细胞。参见例如Martin et al.,Cancer Res.60:3218-3224(2000)；Kreitman and Pastan,Blood 90:252-259(1997)；Allam etal.,CancerRes.57:2615-2618(1997)及Osborne and Coronado-Heinsohn,Cancer J.Sci.Am.2:175(1996)。本领域技术人员理解，本文描述的或本领域已知的这些和另外的细胞毒性剂可用于本发明公开的组合物和方法。
在一些形式中，治疗剂可以是一种或多种小分子激酶抑制剂或植物化学物质或核酸药物，例如脱氧核酶、核酶、siRNA、shRNA、DNA、PNA、RNA和DNA适体，或miRNA、小分子、抗体、肽、氨基酸、脂质、多糖、生长因子、细胞因子、生物活性肽、酶和细胞毒性药物。
在一些形式中，货物包含治疗剂和/或预防剂，例如生物制剂，其可以被物理地包埋、包封和/或与纳米结构非共价结合。
合适的生物制剂包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体、免疫球蛋白及其抗原结合片段、生长因子(例如重组人生长因子)、抗原、干扰素、细胞因子、激素和其它蛋白质、氨基酸和肽，例如胰岛素，及其组合。在一些情况下，生物制剂是选自英夫利昔单抗
Figure GDA0003438633250000391
阿达木单抗
Figure GDA0003438633250000392
或其组合的单克隆抗体(mAb)。
本领域已知的其它抗体包括但不限于在Kaplon H et al.,MAbs.2018Feb/Mar；10(2):183-203中讨论的那些抗体，所述文章通过引用以其全部内容并入本文。示例的抗体包括：拉那鲁单抗(lanadelumab)，立赞利珠单抗(crizanlizumab)，瑞利珠单抗(ravulizumab)，依替珠单抗(eptinezumab)，瑞莎珠单抗(risankizumab)，萨特利珠单抗(satralizumab)，布洛赛珠单抗(brolucizumab)，PRO140，戈沙妥组单抗(sacituzumabgovitecan)，帕舒托-莫塞妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)，西米普利单抗(cemiplimab)，乌妥昔单抗(ublituximab)，兰帕珠单抗(lampalizumab)，罗乐单抗(roledumab)，依帕伐单抗(emapalumab)，法司努单抗(fasinumab)，他尼组单抗(tanezumab)，依曲利组单抗(etrolizumab)，NEOD001，更汀芦单抗(gantenerumab)，阿尼鲁单抗(anifrolumab)，曲美木单抗(tremelimumab)，伊沙妥昔单抗(isatuximab)，BCD-100，卡罗妥昔单抗(carotuximab)，卡瑞利珠单抗(camrelizumab)，IBI308，维汀-格仑妥木单抗(glembatumumab vedotin)，索星-米妥昔单抗(mirvetuximab soravtansine)，奥蒙-托珀妥珠单抗(oportuzumab monatox)，L19IL2/L19TNF。
其它抗体在国际专利号WO2017186928、WO2018007327、WO2018031954、WO2018039247、WO2018015539和美国专利公开号US20180037634、US20180000935中公开，上述专利通过引用以其全部内容并入本文。
示例的生物制剂也可以是FDA批准的治疗性单克隆抗体，包括但不限于：
Figure GDA0003438633250000401
(托珠单抗(tocilizumab)，GENENTECH)，
Figure GDA0003438633250000402
(本妥昔单抗(brentuximab vedotin)，SEATTLE GENETICS)，
Figure GDA0003438633250000403
(阿达木单抗(adalimumab-atto)，AMGEN INC)，
Figure GDA0003438633250000404
(obiltoxaximab，ELUSYS THERAPEUTICS INC)，
Figure GDA0003438633250000405
(奥法木单抗(ofatumumab)，GLAXO GRP LTD)，
Figure GDA0003438633250000406
(贝伐单抗(bevacizumab)，GENENTECH)，
Figure GDA0003438633250000407
(avelumab，EMD SERONO INC)，
Figure GDA0003438633250000408
(贝利单抗(belimumab)，HUMAN GENOME SCIENCES INC.)，
Figure GDA0003438633250000409
(奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)，WYETH PHARMS INC)，
Figure GDA00034386332500004010
(博纳吐单抗(blinatumomab)，AMGEN)，
Figure GDA00034386332500004011
(阿仑单抗(alemtuzumab)，GENZYME)，
Figure GDA00034386332500004012
(赛妥珠单抗(certolizumab pegol)，UCB INC)，
Figure GDA00034386332500004013
(瑞利珠单抗(reslizumab)，TEVA RESPIRATORY LLC)，
Figure GDA00034386332500004014
(苏金单抗(secukinumab)，NOVARTIS PHARMS CORP)，
Figure GDA00034386332500004015
(阿达木单抗(adalimumab-adbm)，BOEHRINGERINGELHEIM)，
Figure GDA00034386332500004016
(雷莫芦单抗(ramucirumab)，ELI LILLY AND CO)，
Figure GDA00034386332500004017
(达雷木单抗(daratumumab)，JANSSEN)，
Figure GDA00034386332500004018
(倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)，TARO)，
Figure GDA00034386332500004019
(dupilumab，REGENERONPHARMACEUTICALS)，
Figure GDA00034386332500004020
(艾洛珠单抗(elotuzumab)，BRISTOL MYERS SQUIBB)，
Figure GDA00034386332500004021
(vedolizumab，TAKEDA PHARMS USA)，
Figure GDA00034386332500004022
(西妥昔单抗(cetuximab)，IMCLONE)，
Figure GDA0003438633250000411
(benralizumab，ASTRAZENECA AB)，
Figure GDA0003438633250000412
(obinutuzumab，GENENTECH)，
Figure GDA0003438633250000413
(emicizumab，GENENTECH INC)，
Figure GDA0003438633250000414
(曲妥珠单抗(trastuzumab)，GENENTECH)，
Figure GDA0003438633250000415
(阿达木单抗(adalimumab)，ABBVIE INC)，
Figure GDA0003438633250000416
(康纳单抗(canakinumab)，NOVARTIS PHARMS)，
Figure GDA0003438633250000417
(tildrakizumab-asmn，MERCK SHARP DOHME)，
Figure GDA0003438633250000418
(durvalumab，ASTRAZENECA UK LTD)，
Figure GDA0003438633250000419
(英利昔单抗(infliximab)-dyyb，CELLTRIONINC)，
Figure GDA00034386332500004110
(英利昔单抗(infliximab)-qbtx，PFIZER INC)，
Figure GDA00034386332500004111
(ado-trastuzumab emtansine，GENENTECH)，
Figure GDA00034386332500004112
(sarilumab，SANOFI SYNTHELABO)，
Figure GDA00034386332500004113
(派姆单抗(pembrolizumab)，MERCK SHARP DOHME)，
Figure GDA00034386332500004114
(olaratumab，ELI LILLY AND CO)，
Figure GDA00034386332500004115
(阿仑单抗(alemtuzumab)，GENZYME)，
Figure GDA00034386332500004116
(兰尼单抗(ranibizumab)，GENENTECH)，
Figure GDA00034386332500004117
(贝伐单抗(bevacizumab)-awwb，AMGEN INC)，
Figure GDA00034386332500004118
(gemtuzumab ozogamicin，WYETHPHARMS INC)，
Figure GDA00034386332500004119
(imciromab pentetate，CENTOCOR INC)，
Figure GDA00034386332500004120
(美泊利单抗(mepolizumab)，GLAXOSMITHKLINE LLC)，
Figure GDA00034386332500004121
(ocrelizumab，GENENTECH INC)，
Figure GDA00034386332500004122
(trastuzumab-dkst，MYLAN GMBH)，
Figure GDA00034386332500004123
(纳武单抗(nivolumab)，BRISTOL MYERS SQUIBB)，
Figure GDA00034386332500004124
(帕妥珠单抗(pertuzumab)，GENENTECH)，
Figure GDA00034386332500004125
(耐昔妥珠单抗(necitumumab)，ELI LILLY CO)，
Figure GDA00034386332500004126
(阿利库单抗(alirocumab)，SANOFI AVENTIS)，
Figure GDA00034386332500004127
(idarucizumab，BOEHRINGER INGELHEIM)，
Figure GDA00034386332500004128
(地诺单抗(denosumab)，AMGEN)，
Figure GDA00034386332500004129
(capromab pendetide，CYTOGEN)，
Figure GDA00034386332500004130
(raxibacumab，HUMAN GENOME SCIENCES INC.)，
Figure GDA00034386332500004131
(英夫利昔单抗(infliximab)，CENTOCOR INC)，
Figure GDA00034386332500004132
(infliximab-abda，SAMSUNG BIOEPSISCO LTD)，
Figure GDA00034386332500004133
(阿西单抗(abciximab)，CENTOCOR INC)，
Figure GDA00034386332500004134
(依伏库单抗(evolocumab)，AMGEN INC)，
Figure GDA00034386332500004135
(利妥昔单抗(rituximab)，GENENTECH)，
Figure GDA00034386332500004136
(brodalumab，VALEANT LUXEMBOURG)，SIMPONI
Figure GDA00034386332500004137
(戈利木单抗(golimumab)，JANSSEN BIOTECH)，
Figure GDA00034386332500004138
(巴利昔单抗(basiliximab)，NOVARTIS)，
Figure GDA00034386332500004139
(依库丽单抗(eculizumab)，ALEXION PHARM)，
Figure GDA00034386332500004140
(优特克单抗(ustekinumab)，CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC)，
Figure GDA0003438633250000421
(优特克单抗(ustekinumab)，JANSSEN BIOTECH)，
Figure GDA0003438633250000422
(司妥昔单抗(siltuximab)，JANSSENBIOTECH)，
Figure GDA0003438633250000423
(帕利珠单抗(palivizumab)，MEDIMMUNE)，
Figure GDA0003438633250000424
(ixekizumab，ELI LILLY AND CO)，
Figure GDA0003438633250000425
(阿特珠单抗(atezolizumab)，GENENTECH INC)，
Figure GDA0003438633250000426
(guselkumab，JANSSEN BIOTECH)，
Figure GDA0003438633250000427
(ibalizumab-uiyk，TAIMED BIOLOGICS USA)，
Figure GDA0003438633250000428
(那他珠单抗(natalizumab)，BIOGEN IDEC)，
Figure GDA0003438633250000429
(dinutuximab，UNITED THERAP)，
Figure GDA00034386332500004210
(帕尼单抗(panitumumab)，AMGEN)，
Figure GDA00034386332500004211
(地诺单抗(denosumab)，AMGEN)，
Figure GDA00034386332500004212
(奥马珠单抗(omalizumab)，GENENTECH)，
Figure GDA00034386332500004213
(伊匹单抗(ipilimumab)，BRISTOL MYERSSQUIBB)，
Figure GDA00034386332500004214
(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，SPECTRUM PHARMS)，
Figure GDA00034386332500004215
(达克珠单抗(daclizumab)，BIOGEN)，
Figure GDA00034386332500004216
(bezlotoxumab，MERCK SHARP DOHME)。
其它类型的治疗剂或预防剂可以选自蛋白质、抗炎药、非抗炎剂、类固醇、麻醉剂(例如利多卡因)、镇痛剂、解热剂、抗感染剂例如抗细菌剂、抗真菌剂、避孕药、免疫抑制剂、化学治疗剂、生长因子、细胞因子、免疫调节分子。这些可以是小分子、蛋白质、肽、糖和多糖、脂质和脂蛋白或脂多糖，以及核酸，例如小干扰RNA、microRNA、PiRNA、核酶和编码蛋白质或肽的核苷酸。在一些情况下，细胞可以是货物(例如治疗剂和/或预防剂)。
4.其它剂/货物
在一些形式中，核酸纳米结构包括基因编辑部分，或包括能够结合基因编辑部分的组分。可作为货物包含的示例性基因编辑部分是CRISPR RNA，其用于通过CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶、talens和三链体(triplex)形成寡核苷酸进行基因编辑。
CRISPR(簇生的规律间隔短回文重复)是包含多个短的直接重复碱基序列的DNA基因座的首字母缩写词。原核CRISPR/Cas系统已适用于真核生物的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)(见例如Cong,Science,15:339(6121):819–823(2013)和Jinek,et al.,Science,337(6096):816-21(2012))。通过使用期望的元件包括cas基因和特别设计的CRISPR转染细胞，可以在任何期望位置切割和修饰生物体的基因组。使用CRISPR/Cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法在WO 2013/176772和WO 2014/018423中有详细描述，所述专利通过引用以其全部内容并入本文。
通常，“CRISPR系统”统称是指转录物和参与表达或指导CRISPR相关(Cas)基因活性的其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR序列(例如，tracrRNA或tracrRNA活性部分)、tracr-配对序列(包括在内源性CRISPR系统背景中的“同向重复”和tracrRNA加工的部分同向重复)、引导序列(也称为内源性CRISPR系统中的“间隔区”)，或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。与引导序列可操作地连接的一个或多个tracr配对序列(例如同向重复序列-间隔区-同向重复序列)也可以被称为核酸酶加工前的pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)或核酸酶加工后的crRNA。
在一些形式中，纳米结构可以携带、呈递和/或递送CRISPR核糖核蛋白复合物(例如Cas9蛋白+gRNA)、RNA引导的核酸内切酶(或编码这种酶的mRNA)、crRNA、引导RNA、tracrRNA，或其组合。
在一些形式中，核酸纳米结构包括锌指核酸酶蛋白或核酸构建体或编码锌指核酸酶(ZFN)的构建体。ZFN通常是融合蛋白，其包括源自与切割结构域连接的锌指蛋白的DNA结合结构域。
最常见的切割结构域是IIS型酶Fokl。Fokl催化DNA的双链切割，在一个链上距离其识别位点9个核苷酸，在另一个链上距离其识别位点13个核苷酸。参见例如美国专利号5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Liet al.Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 89(1992):4275-4279；Liet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2764-2768(1993)；Kim etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:883-887(1994a)；Kim et al.J.Biol.Chem.269:31,978-31,982(1994b)。一种或多种这些酶(或其酶促功能片段)可用作切割结构域的来源。
DNA结合结构域原则上可以设计为靶向任何感兴趣的基因组位置，可以是Cys2His2锌指的串联阵列，每个锌指通常识别靶DNA序列中的三至四个核苷酸。Cys2His2结构域具有一般结构：Phe(有时为Tyr)-Cys-(2至4个氨基酸)-Cys-(3个氨基酸)-Phe(有时为Tyr)-(5个氨基酸)-Leu-(2个氨基酸)-His-(3个氨基酸)-His。通过将多个锌指连接在一起(数量变化：在已发表的研究中，每个单体使用了三至六个锌指)，ZFN对可以设计为与长度为18-36个核苷酸的基因组序列结合。
工程化方法包括但不限于合理设计和各种经验选择方法。合理设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列结合。参见例如美国专利号6,140,081；6,453,242；6,534,261；6,610,512；6,746,838；6,866,997；7,067,617；美国公开专利申请号2002/0165356；2004/0197892；2007/0154989；2007/0213269；以及国际专利申请公开号WO 98/53059和WO 2003/016496。
在一些形式中，DNA、RNA、PNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、小分子或染料或其组合作为货物包含在纳米结构中。
在一些形式中，货物包含功能性核酸(例如反义核酸、mRNA、miRNA、piRNA、siRNA或其组合)。本文描述了抑制靶基因的转录、翻译或功能的功能性核酸。
功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，例如结合靶分子或催化特定反应。功能性核酸分子可分为以下非限制性类别：反义分子、RNAi(siRNA、miRNA和piRNA)、适体、核酶、三链体形成分子和外部引导序列。功能性核酸分子可以作为靶分子所具有的特定活性的效应物、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其它分子的重新活性。
在一些形式中，功能性核酸是siRNA、shRNA、miRNA或piRNA。在一些形式中，组合物包括表达功能性核酸的载体。制备和使用在体内表达功能性核酸例如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA、piRNA、EGS、核酶和适体的载体的方法是本领域已知的。
先前的研究工作表明，DNA折纸作为抗癌药物如多柔比星(doxorubicin)的载体具有增加的细胞内在化和增加的靶细胞杀伤以及规避耐药性(Jiang Q etal.,Journal ofthe American Chemical Society 134.32:13396-13403(2012))。因此，在一些形式中，小分子如抗癌药物阿霉素可以通过嵌入掺入纳米结构中。
在一些形式中，货物可包含癌症化疗剂。如本文所用，“癌症化疗剂”是抑制癌细胞增殖、生长、寿命或转移活性的化学剂。这种癌症化疗剂可以是但不限于紫杉烷(taxane)如多西紫杉醇(docetaxel)；蒽环类药物(anthracyclin)，如阿霉素；烷化剂；长春花生物碱；抗代谢物；铂剂，如顺铂或卡铂；类固醇，如甲氨蝶呤；抗生素，如阿霉素(adriamycin)；异磷酰胺；或选择性雌激素受体调节剂；抗体，如曲妥珠单抗(trastuzumab)；紫杉醇，如Abraxane；Doxil。
在一些形式中，货物可包含治疗性多肽。如本文所用，治疗性多肽可以是具有生物学有用功能的任何多肽。有用的治疗性多肽包括但不限于细胞因子、抗体、细胞毒性多肽；促凋亡肽；免疫调节肽、促炎肽、免疫刺激肽；抗炎肽；免疫抑制肽；和抗血管生成多肽。作为非限制性实例，有用的治疗性多肽可以是细胞因子，例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，干扰素-α(IFN-α)；干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL)-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、淋巴细胞趋化因子(LTN)或树突细胞趋化因子1(DC-CK1)；抗HER2抗体或其片段；细胞毒性多肽，包括毒素或胱天蛋白酶，例如白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素例如DAB389EGF或蓖麻毒蛋白；促凋亡多肽，例如D(KLAKLAK)2(SEQ ID NO:13)；免疫调节肽；促炎肽，免疫刺激肽；抗炎肽；免疫抑制肽；或抗血管生成多肽，例如血管抑制素、内皮抑制素、血小板反应蛋白、血小板因子4；anastellin；或本文进一步描述的或本领域已知的那些多肽之一。应当理解，这些和其它具有生物活性的多肽可以是“治疗性多肽”。
在一些形式中，货物可以包含促细胞凋亡剂、免疫调节剂、促炎剂、免疫刺激剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、抗菌剂、细胞毒性剂、促细胞存活剂、细胞分化剂、神经保护剂、抗关节炎剂、抗病毒剂、促凋亡剂、免疫调节剂、促炎剂、免疫刺激剂、抗炎剂、免疫抑制剂、抗血管生成剂、促血管生成剂、毒素、细胞毒性剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一种或多种信号传导途径的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、化疗剂、造影剂、成像剂、标记、标记剂，或其组合。
D.试剂盒
上述材料以及其它材料可以任何合适的组合包装在一起作为试剂盒，用于执行或帮助执行本发明公开的方法。如果给定试剂盒中的试剂盒组分被设计和调适以在本发明公开的方法中一起使用，则其是有用的。例如，公开了包含一种或多种核酸纳米结构组合物和使用说明书的试剂盒。所述试剂盒还可包含制造的物品例如结构、机器、装置等，以及与所提供的含有纳米结构的组合物一起使用的组合物、化合物、材料等。
方法
本发明公开的方法和组合物适用于多种应用，包括但不限于治疗、诊断和分析应用。本文还提供了用于转运和施用在本文中通常称为货物的治疗剂、生物活性化合物、生物分子试剂、生物催化剂和其它感兴趣的分子化合物的纳米结构。本发明还公开了其它应用，这些应用从公开内容显而易见和/或将为本领域技术人员所理解。
本文描述了与本发明公开的核酸纳米结构及其应用相关的各种方法。例如，公开了核酸纳米结构的组装、核酸纳米结构的产生、货物与核酸纳米结构的附着和/或封装的方法，以及用于各种应用的核酸组装组合物的施用。
特别地，公开了通过向对象施用本文提供的任何纳米结构而向对象递送治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂或预防剂的方法。
还提供了治疗对象的疾病或病症的方法。所述治疗方法可包括向对象施用本发明公开的核酸纳米结构，该核酸纳米结构将有效量的治疗剂和/或预防剂递送至对象的一种或多种靶细胞或组织。
还公开了任何公开的纳米结构组合物，其用于检测和/或诊断对象的特定状态或病症，例如癌症。还公开了任何公开的组合物，其用于在对象中可视化癌症。还公开了任何公开的组合物，其用于在对象中定位癌症。
还公开了任何公开的组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。还公开了任何公开的组合物在制造用于癌症检测的药物中的用途。
还公开了癌症诊断方法，其包括向有需要的对象施用有效量的任何一种或多种公开的组合物。
A.核酸组装组合物的施用
本发明公开的核酸纳米结构组合物可以施用于任何需要其的细胞、组织或对象。通常，可以基于核酸纳米结构的货物以及对细胞、组织和对象的货物的需要，将核酸纳米结构组合物施用于细胞、组织和对象。
预期本发明公开的组合物可以通过足以递送有效量的纳米结构的任何方法施用，包括静脉注射。用于本公开方法的组合物包括以下组合物：组合物中的纳米结构和包含在其中的货物以有效实现预期目的的量包含在组合物中。
如本文所用，“对象”包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何其它生物体或实体。对象可以是脊椎动物，更具体地是哺乳动物(例如人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。对象可以是无脊椎动物，更具体地是节肢动物(例如昆虫和甲壳类动物)。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年和新生儿对象以及胎儿，无论是雄性还是雌性，均将被涵盖在内。患者是指患有疾病或病症的对象。术语“患者”包括人和兽医对象。
“治疗”和“处理”是指以治愈、减轻、稳定或预防疾病、病理状况或病症为目的对对象的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症发展的治疗；支持治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或病症的特定疗法的治疗。应当理解，治疗虽然旨在治愈、减轻、稳定或预防疾病、病理状况或病症，但不需要实际上获得治愈、减轻、稳定或预防。治疗效果可以如本文所述和本领域已知的适用于所涉及的疾病、病理状况或病症的方式进行测量或评估。可以以定性和/或定量的方式进行这种测量和评估。因此，例如疾病、病理状况或病症的特性或特征和/或疾病、病理状况或病症的症状可以降低至任何效果或任何量。
细胞可以在体外。或者，细胞可以在体内并且可以存在于对象(例如哺乳动物，例如人)中。“细胞”可以来自任何生物体，包括但不限于细菌的细胞。
在一些形式中，可以将本文所述的组合物施用于需要缓解或改善经鉴别的医学状况的对象，所述对象包括人或动物，包括但不限于小鼠、狗、猫、马、牛或绵羊等。
本文提供的术语组合物(例如含有纳米结构的组合物)的“有效量”是指无毒性但足以提供期望结果的化合物的量。正如下文指出的，需要的精确量因对象而异，这取决于对象的物种、年龄和一般状况、待治疗疾病的严重程度、所用的特定化合物、其施用模式等。因此，不可能指定精确“有效量”。然而，合适的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验而确定。
本文所述化合物的剂量或量足够大以在进行递送的方法中产生期望效果。剂量不应大至引起不良副作用，例如不需要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随对象的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，可由本领域技术人员确定。剂量可由医师根据所涉及对象的临床状况进行调整。剂量、给药方案和给药途径可以变化。
在一些形式中，导入或施用于对象的本公开化合物和组合物的剂量是有效提供期望的治疗、毒性、成像、诊断和/或预防效果的量。例如，在一些形式中，施用的纳米结构及其组合物的量是有效成像或可视化对象的组织、器官或身体部位的量。在一些形式中，施用的纳米结构及其组合物的量是有效诊断对象患有特定疾病、病症、损伤、异常或缺陷等例如肿瘤或癌症的量。在一些形式中，施用的纳米结构及其组合物的量是向对象的细胞、组织或受体部分有效提供毒性作用的量。在一些形式中，施用的纳米结构及其组合物的量是有效治疗或预防对象的一种或多种疾病或病症或其症状的量。例如，在一些形式中，施用的纳米结构及其组合物的量是在对象中有效减少肿瘤负荷、减少肿瘤生长、减少癌细胞增殖或存活力或其组合的量。
可以通过评估特定形式的病史、体征、症状和客观实验室检测来确定根据本文所述方法施用特定剂量的组合物的功效，所述检测已知可用于评估需要治疗指定疾病和/或病症的对象的状态。这些体征、症状和客观的实验室检测将根据治疗或预防的特定疾病或病症而有所不同，正如治疗这种患者的任何临床医生或在这个领域进行实验的研究人员所已知。例如，如果基于与适当对照组的比较和/或对一般人群或特定个体中疾病正常进展的了解：(1)对象的身体状况显示出改善(例如肿瘤已部分或完全消退)，(2)疾病或病症的进展显示稳定、减慢或逆转，或(3)减少或消除了对治疗疾病或病症的其它药物的需求，则特定的治疗方案将被认为是有效的。
“药学上可接受的”是指不是生物学上或其它方面不期望的材料，即所述材料可以与所选化合物一起施用于对象而不引起任何不期望的生物学效应或以有害方式与包含其的药物组合物的任何其它组分相互作用。
任何公开的组合物均可以与药学上可接受的载体组合使用。本文所述的组合物(例如含有纳米结构的组合物)可方便地配制成由一种或多种组合物与药学上可接受的载体组成的药物组合物。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,latestedition,by E.W.Martin Mack Pub.Co.,Easton,PA，其公开了制备药物组合物的典型载体和的常规方法，其可以与本文所述的组合物的制备结合使用，并通过引用并入本文。这些载体最典型的是将组合物施用于人的标准载体。在一些形式中，这些载体包括溶液，例如无菌水、盐水和生理pH值的缓冲溶液。其它组合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。
除了选择的分子之外，本文所述的药物组合物可以包括但不限于载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
本文所述的纳米结构及其药物组合物可以多种方式施用于对象，这取决于是需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域。任何合适的给药途径均可用于本发明公开的纳米结构和药物组合物。例如，给药途径可以包括经外用、肠道、局部、全身或肠胃外途径施用。例如，施用可以是瘤内、瘤周、皮试(epicutaneous)、吸入、灌肠、结膜、滴眼、滴耳、肺泡、鼻、鼻内、阴道、阴道内、经阴道、肠内、口服、口内、经口、肠道、直肠、直肠内、经直肠、注射、输注、静脉内、动脉内、肌肉内、脑内、心室内、脑室内、心内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内、海绵体内、髓内、眼内、颅内、经皮、经粘膜、经鼻、吸入、脑池内、硬膜上(epidural)、硬膜外(peridural)、玻璃体内等。
因此，例如本文所述的药物组合物可以作为眼用溶液和/或软膏施用于眼睛表面。此外，药物组合物可以经阴道、直肠、鼻内、口服、吸入或肠胃外例如通过皮内、皮下、肌内、腹膜内、直肠内、动脉内、淋巴管内、静脉内、鞘内和气管内途径施用。如果使用肠胃外给药，通常特征在于通过注射施用。注射剂可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液、适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或作为乳剂。最近修订的肠胃外给药方法涉及使用缓释或持续释放系统，以保持恒定剂量。参见例如美国专利号3,610,795，其通过引用并入本文。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂，其也可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外施用的载体包括氯化钠溶液、Ringer's葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸Ringer's液或固定油。静脉内施用的载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于Ringer's葡萄糖的那些制剂)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或期望的。
用于口服施用的组合物可以包括粉剂或颗粒剂、悬浮液或水溶液或非水相介质、胶囊、小袋或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。
本公开的组合物和方法通过如下编号的段落可以进一步理解。
1.一种核酸纳米结构，其具有含有闭合三维空腔的连续圆环样结构，所述纳米结构包含多个子单元，
其中每个子单元包括核心域和连接域，其中核心域界定具有包围开放区域的多个边的多边形，其中所述边和开放区域界定所述子单元的平面，其中连接域包括一个或多个接头，
其中每个子单元的第一边与另一子单元的第一边共平面，其中每个子单元位于另外两个子单元之间，并与另外两个子单元连接，其中连接的子单元的平面彼此面对，从而形成子单元的堆叠，其中连接的子单元的平面基本上垂直于子单元第一边的平面，并且在与子单元第一边的平面水平的方向上相对于连接于给定子单元的子单元倾斜，其中连接的子单元的平面之间的倾斜在子单元的堆叠中产生弯曲，由此连接的子单元形成连续圆环样结构，所述连续圆环样结构具有由堆叠子单元的开放区域界定的闭合三维空腔，
其中子单元之间的连接由接头形成，其中每个接头具有一定的长度，其中每个接头的长度被配置为在连接的子单元的平面之间产生倾斜，从而产生连续的圆环样结构，其中所述纳米结构中的子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。
2.段落1的纳米结构，其中每个子单元的多边形是六边形、八边形、五边形、七边形、四边形或三角形。
3.段落1或2的纳米结构，其具有50-100nm的内部直径、外部直径或两者，包括端值。
4.段落1至3任一项的纳米结构，其包括8-40个子单元，包括端值。
5.段落4的纳米结构，其包括16或32个子单元。
6.段落1至5任一项的纳米结构，其中每个子单元包含6-20个单链核酸链。
7.段落6的纳米结构，其中每个子单元包含12个单核酸链。
8.段落1至7任一项的纳米结构，其中所述核心域包含一个支架核酸链和n-1个订书钉核酸链，其中n是子单元多边形的边数，其中每个订书钉链包含侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，其中每个订书钉链的中心区与支架链结合以形成双链体区。
9.段落8的纳米结构，其中所述中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
10.段落1至9任一项的纳米结构，其中每个子单元的多边形是六边形或八边形。
11.段落10的纳米结构，其中每个子单元的多边形是六边形。
12.段落11的纳米结构，其中所述核心域包含一个支架核酸链(链1)和五个订书钉核酸链(链2-6)，其中每个订书钉链包含侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，其中每个订书钉链的中心区与支架链结合以形成双链体区。
13.段落12的纳米结构，其中所述中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
14.段落8至13任一项的纳米结构，其中每对彼此相邻的双链体区被配置为形成双面角，其中每个双面角近似于所述多边形顶点的角。
15.段落14的纳米结构，其中所述双面角是120°。
16.段落8至15任一项的纳米结构，其中每个突出区与侧翼双链体区成约90°的双面角。
17.段落8至16任一项的纳米结构，其中所述5’突出区各自单独地包含8-16个核苷酸，包括端值，所述3’突出区各自单独地包含8-16个核苷酸，包括端值，或两者。
18.段落8至17任一项的纳米结构，其中所述子单元的每个双链体区包含20个碱基对，其中胸苷残基存在于每个双链体区之间。
19.段落8至18任一项的纳米结构，其中在中心区和一个或两个突出区之间的核心域的每个链上存在未配对的胸苷残基。
20.段落8至19任一项的纳米结构，其中所述连接域包含n个单链核酸接头，其中所述接头与核心域的一个或多个突出区互补。
21.段落8至19任一项的纳米结构，其中所述连接域包含六个单链核酸接头(链7-12)，其中所述核酸接头与核心域的一个或多个突出区互补。
22.段落19至21任一项的纳米结构，其中所述连接域的一个或多个接头与核心域的突出区之间的互补程度在16-32个碱基对的范围内，包括端值。
23.段落1至22任一项的纳米结构，其中所述核酸、核酸链和接头是DNA。
24.段落6至23任一项的纳米结构，其中所有的链和接头在序列上是独特的。
25.段落1至24任一项的纳米结构，其还包含治疗剂、毒性剂、靶向剂、成像剂、诊断剂或预防剂，或其组合。
26.段落1至24任一项的纳米结构，其还包含成像剂，其中所述成像剂包含金纳米粒子。
27.段落1至24任一项的纳米结构，其还包含靶向剂，其中所述靶向剂包含适体。
28.段落1至24任一项的纳米结构，其还包含分子，其中所述分子是DNA、RNA、PNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、小分子或染料。
29.段落25至28任一项的纳米结构，其中所述剂或分子与所述纳米结构共价或非共价结合。
30.段落25至28任一项的纳米结构，其中所述剂或分子被封装在所述纳米结构内。
31.一种将治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂或预防剂递送给对象的方法，所述方法包括向对象施用段落25至30任一项的纳米结构。
32.一种制造段落1至24任一项的纳米结构的方法，所述方法包括对包含所述链和接头的混合物施加温度转变，使得所述链和接头退火。
33.段落32的方法，其中所述温度转变发生在16小时的时间段内。
34.段落32或33的方法，其中所述温度转变包括从90℃至20℃的温度变化。
35.段落32至34任一项的方法，其中所述链和接头以大约等摩尔浓度存在。
通过参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和评估本发明权利要求的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在仅为示例性的并且不旨在限制本发明公开。
实施例1：使用单链DNA寡核苷酸形成DNA mazzocchio纳米结构
方法
ssDNA设计
使用Tiamat(Williams S.,et al.,InDNA Computing.DNA 2008.Lecture Notesin Computer Science,Vol.5347(eds Goel,A.Simmel,F.C.&Sosik,P.)pp90-101(2008))来设计12个单链DNA序列以制备由六边形子单元组成的DNA mazzocchio。6个单链DNA寡核苷酸用于制造核心六边形子单元，6个不同长度的其它连接链用于连接子单元并同时引入弯曲(图1B-1C)。
单链DNA寡核苷酸通过固相合成法获得，并通过标准脱盐进行纯化。
序列如下所示：
链1：
GATAGGCCGAGATCTGAGGATGCTGGCTCACGCCATTGGCTCGCGACCCCGTCCGCTAGACGTTATGCACAAGGCGTTGTCATTAGATGCTTAGGTGCTCAGGCCGTAATGAGGCCGCTTGGCTGCGTTCCTCCGCCGCTTGGGAACAGCCCCGC(SEQ ID NO:1)
链2：
TCCAGCTCTGCGGACGGGGTCGCGAGCCATTCGAGGGCT(SEQ ID NO:2)
链3：
TCGCCTGTAATACGCCTTGTGCATAACGTCTTGCCAACCC(SEQ ID NO:3)
链4：
TGCCCGTACCCTGGTGCACCTAAGCATCTAATGACTCTGCGGAAGA(SEQ ID NO:4)
链5：
TACCCCACTTTAGCGATAGCGGCCTCATTACGGCCTGTGCTACCCGTACGGA(SEQ ID NO:5)
链6：
ATCAGTACGATTGGCGTGAGCCAGCATCCTCTAGCGGCGGAGGAACGCAGCCTAGGCGGAACTCTTCGG(SEQ ID NO:6)
链7：
TCGCTAAAGTGGGGTACCGAAGAGTTCCGCCT(SEQ ID NO:7)
链8：
GATCTCGGCCTATCGCGGGGCTGTTCCC(SEQ ID NO:8)
链9：
TCGTACTGATGAGCCCTCGA(SEQ ID NO:9)
链10：
GAGCTGGAGGGTTGGC(SEQ ID NO:10)
链11：
TTACAGGCGATCTTCCGCAG(SEQ ID NO:11)
链12：
CCAGGGTACGGGCATCCGTACGGGTAGC(SEQ ID NO:12)
在上述链1-12序列中(SEQ ID NO:1-12)，粗斜体T核苷酸是转折点。
纳米结构的形成
将12个单链DNA序列通过热退火过程组装在一起。简而言之，将单链DNA首先作为在无核酸酶水中100μM的储液进行稀释。通过将在20mM Tris、2mM EDTA和12.5mM醋酸镁中混合等量的每种寡核苷酸，使每个链的终浓度为7.5μM，由此制备含有等量的12个单链DNA寡核苷酸的溶液。由于这种mazzocchio设计使用16个子单元，因此使用该方案制备的mazzocchio浓度为468.75nM。然后在热循环仪中对混合物进行缓慢退火过程。应用于混合物的温度转变如下：在90℃温育5分钟，然后以每分钟-0.1℃的速率从90℃缓慢冷却至20℃。
凝胶电泳
使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和琼脂糖凝胶电泳验证单链序列正确组装为mazzocchio结构。将150nM的不同DNA组合在12％聚丙烯酰胺凝胶中在100V和4℃下电泳1小时。为了可视化，将凝胶用SyBr金核酸凝胶染料染色。
透射电子显微镜检查(TEM)
TEM用于鉴定最终的DNA mazzocchio纳米结构。首先将5μl DNA mazzocchio样品在辉光放电的400目铜载网(Ted Pella,Inc.)上吸附1分钟。然后用2％乙酸双氧铀染色1分钟。将染色的样品用蒸馏水洗涤两次以除去过量的乙酸双氧铀。使用Philips CM 100透射电子显微镜在100kV工作电压下观察网格上染色的DNA mazzocchio样品。DNA mazzocchio的电子显微照片是在网格的不同位置以73,000X至105,000X的放大倍数捕获的。为了通过实验确定DNA mazzocchio的直径，通过ImageJ软件分析图像。
结果
DNA mazzocchio是一种纳米结构，其灵感来自Da Vinci在15世纪对由32个八角形子单元截面组成的超环面圆环的几何学研究(图1A)。在该实验中，成功制备了DNAmazzocchio纳米结构，其由16个六边形子单元组成(图1B)；每个子单元由12个单链DNA寡核苷酸组成(图1C)。如图1C所示，12个单链DNA序列通过热退火过程组装在一起，并彼此相互作用。
通过PAGE对纳米结构的表征显示这些链正确组装。由支架链、订书钉链和接头DNA链的各种组合形成的结构的尺寸对应于单独的链相互作用的预期尺寸。最终产物mazzocchio的尺寸太大，无法通过PAGE进行分析，因此使用琼脂糖凝胶电泳进行进一步表征。结果表明，mazzocchio的尺寸是有限的。这表明使用不同长度的接头引入弯曲是成功的。
使用透射电子显微镜检查(TEM)，发现mazzocchio纳米结构的平均直径为49.30±10.37nm(60.48nm、47.43nm和40nm的平均)。这个实验确定的直径对应于设计的/预期的尺寸。
实施例2：DNA mazzocchio纳米结构比DNA四面体纳米结构更有效地携带多柔比星
方法
DNA mazzocchio(来自实施例1)和DNA四面体纳米结构通过退火过程制成。将多个单链DNA按等比率混合并置于热循环仪中加热(95℃进行5分钟)，然后缓慢冷却(过夜降至20℃)。
将10μM多柔比星与不同浓度的DNA mazzocchio和DNA四面体纳米结构(如图2的X轴所示)在室温下一起孵育1小时。然后，将13μl混合物置于384孔微滴定板中并插入读板器。使用读板器(Varioskan Flash by Thermo Fisher Scientific)在以下参数测量荧光：激发488nm/发射595nm；带宽12nm；测量时间：500ms。从一式三份实验中获得误差线作为标准误差。
结果
使用DNA四面体与DNA mazzocchio在载药效率方面进行比较。最广为人知的抗癌药物是多柔比星，其具有嵌入DNA并抑制癌细胞生长的能力。用DNA纳米结构封装可以保护正常细胞免受多柔比星毒性。重要的是开发有效的载体以将足够量的药物递送至癌细胞，同时保持进入细胞的效率。图2示出四面体和mazzocchio之间关于多柔比星加载/封装的比较。
由于多柔比星的嵌入抑制了其荧光，因此加载效率可以通过半数最大抑制浓度(IC50)来确定。发现四面体和mazzocchio的IC50分别为1.54±0.36μM和0.48±1.92μM。据观察，mazzocchio携带多柔比星的效率是四面体的三倍。
应当理解，本发明公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种纳米结构”包括多种这样的纳米结构，提及“所述纳米结构”是提及本领域技术人员已知的一种或多种纳米结构及其等效物，等等。
在本说明书的整个描述和权利要求中，“包含”一词及其变化用语例如“包括”意为“包括但不限于”，并不旨在排除例如其它添加剂、成分、整数或步骤。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可能或不可能发生或存在，所述描述包括其中所述事件、情况或材料发生或存在的实例以及其不发生或不存在的实例。
除非上下文另有明确说明，否则使用“可能”一词表示所指对象或条件的选项或能力。通常，以这种方式使用“可能”意在肯定地陈述所述选项或能力，同时也保持开放，即在所提及的对象或条件的其它形式或实施方案中可能不存在所述选项或能力。除非上下文另有明确说明，否则使用“可以”一词表示所指对象或条件的选项或能力。通常，以这种方式使用“可以”意在肯定地陈述所述选项或能力，同时也保持开放，即在所提及的对象或条件的其它形式或实施方案中可能不存在所述选项或能力。除非上下文另有明确说明，否则本文使用的“可以”并不指对象或条件的未知或不确定的特征。
在本文中范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另外特别指明，否则还特别涵盖和认为公开的是从一个特定值和/或至另一个特定值的范围。类似地，当值以近似值表示时，通过使用先行词“约”，将理解所述特定值构成另一个特别预期的实施方案，除非上下文另有明确指示，否则应将其视为公开的。将进一步理解的是，除非上下文另外特别指明，否则每个范围的端点对于涉及或不涉及另一个端点均是重要的。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有个别值和值的子范围也特别涵盖并且应当被认为是公开的，除非上下文另外特别指明。最后，应当理解，所有范围均涉及以范围列举的范围，以及从并包括第一个端点至并包括第二个端点的单个数字的集合。在后一种情况下，应该理解的是，可以选择任何单个数字作为所述范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从并包括第一个端点至并包括第二个端点的一组数字或值，从中可以选择该组的单个成员(即单个数字)作为所述范围指示的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了一些或全部这些实施方案，前文描述均适用。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本方法和组合物的实践或测试中可以使用与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料，但特别有用的方法、装置和材料如本文所述。本文引用的出版物和引用其的材料特此通过引用并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而先于本公开。不承认任何参考构成现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者的主张，申请人保留质疑引用文件的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管本文参考了许多出版物，但这样的参考并不构成承认这些文件中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。
尽管对于材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但这不应被解释为也不承认这种选项和替代方案彼此等效，或者特别是明显的替代品。因此，例如不同货物分子的列表并不表示所列出的货物分子彼此之间是显而易见的，也不是对等同性或显而易见性的承认。
本文公开的每种组合物旨在并且应该被认为是在本文特别公开的。此外，可以在本公开中鉴别的每个亚组旨在并且应该被认为是在本文中特别公开的。因此，特别涵盖任何组合物或组合物的亚组可以被明确包括或除外于应用，或者包括或除外于组合物列表中。
本领域技术人员将认识到或能仅使用常规实验来确定本文描述的方法和组合物的具体实施方案的许多等同物。这种等同物旨在包含在以下权利要求中。
序列表
<110> 香港大学
<120> 核酸MAZZOCCHIO及其制造和使用方法
<130> UHK 00832 PCT
<150> 62/832,646
<151> 2019-04-11
<160> 13
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列- 链1
<400> 1
gataggccga gatctgagga tgctggctca cgccattggc tcgcgacccc gtccgctaga 60
cgttatgcac aaggcgttgt cattagatgc ttaggtgctc aggccgtaat gaggccgctt 120
ggctgcgttc ctccgccgct tgggaacagc cccgc 155
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链2
<400> 2
tccagctctg cggacggggt cgcgagccat tcgagggct 39
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-链3
<400> 3
tcgcctgtaa tacgccttgt gcataacgtc ttgccaaccc 40
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链4
<400> 4
tgcccgtacc ctggtgcacc taagcatcta atgactctgc ggaaga 46
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列- 链5
<400> 5
taccccactt tagcgatagc ggcctcatta cggcctgtgc tacccgtacg ga 52
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链6
<400> 6
atcagtacga ttggcgtgag ccagcatcct ctagcggcgg aggaacgcag cctaggcgga 60
actcttcgg 69
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链7
<400> 7
tcgctaaagt ggggtaccga agagttccgc ct 32
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列- 链8
<400> 8
gatctcggcc tatcgcgggg ctgttccc 28
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链9
<400> 9
tcgtactgat gagccctcga 20
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链10
<400> 10
gagctggagg gttggc 16
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链11
<400> 11
ttacaggcga tcttccgcag 20
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 链12
<400> 12
ccagggtacg ggcatccgta cgggtagc 28
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> D-氨基酸
<222> (1)..(14)
<400> 13
Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
1 5 10

Claims (35)

1.一种核酸纳米结构，其具有含有闭合三维空腔的连续圆环样结构，所述纳米结构包含多个子单元，
其中每个子单元包括核心域和连接域，其中所述核心域界定具有包围开放区域的多个边的多边形，其中所述边和开放区域界定所述子单元的平面，其中所述连接域包括一个或多个接头，
其中每个子单元的第一边与另一子单元的第一边共平面，其中每个子单元位于另外两个子单元之间，并与另外两个子单元连接，其中所述连接的子单元的平面彼此面对，从而形成子单元的堆叠，其中所述连接的子单元的平面基本上垂直于所述子单元的第一边的平面，并且在与所述子单元的第一边的平面水平的方向上相对于连接于给定子单元的子单元倾斜，其中连接的子单元的平面之间的倾斜在所述子单元的堆叠中产生弯曲，由此所述连接的子单元形成所述连续圆环样结构，所述连续圆环样结构具有由所述堆叠子单元的开放区域界定的闭合三维空腔，
其中所述子单元之间的连接由所述接头形成，其中每个接头具有一定的长度，其中每个接头的长度被配置为在所述连接的子单元的平面之间产生倾斜，从而产生所述连续圆环样结构，其中所述纳米结构中的所述子单元和接头形成延伸的超分子螺旋形结构。
2.权利要求1的纳米结构，其中每个子单元的多边形是六边形、八边形、五边形、七边形、四边形或三角形。
3.权利要求1或2的纳米结构，其具有50-100nm的内部直径、外部直径或两者，包括端值。
4.权利要求1至3中任一项的纳米结构，其包括8-40个子单元，包括端值。
5.权利要求4的纳米结构，其包括16或32个子单元。
6.权利要求1至5中任一项的纳米结构，其中每个子单元包含6-20个单链核酸链。
7.权利要求6的纳米结构，其中每个子单元包含12个单核酸链。
8.权利要求1至7中任一项的纳米结构，其中所述核心域包含一个支架核酸链和n-1个订书钉核酸链，其中n是子单元多边形的边数，其中每个订书钉链包含侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，其中每个订书钉链的中心区与支架链结合以形成双链体区。
9.权利要求8的纳米结构，其中所述中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
10.权利要求1至9中任一项的纳米结构，其中每个子单元的多边形是六边形或八边形。
11.权利要求10的纳米结构，其中每个子单元的多边形是六边形。
12.权利要求11的纳米结构，其中所述核心域包含一个支架核酸链(链1)和五个订书钉核酸链(链2-6)，其中每个订书钉链包含侧接3’突出区、5’突出区或两者的中心区，其中每个订书钉链的中心区与支架链结合以形成双链体区。
13.权利要求12的纳米结构，其中所述中心区侧接3’突出区和5’突出区两者。
14.权利要求8至13中任一项的纳米结构，其中每对彼此相邻的双链体区被配置为形成双面角，其中每个双面角近似于所述多边形的顶点的角。
15.权利要求14的纳米结构，其中所述双面角是120°。
16.权利要求8至15中任一项的纳米结构，其中每个突出区与侧翼双链体区成约90°的双面角。
17.权利要求8至16中任一项的纳米结构，其中所述5’突出区各自单独地包含8-16个核苷酸，包括端值，所述3’突出区各自单独地包含8-16个核苷酸，包括端值，或两者。
18.权利要求8至17中任一项的纳米结构，其中所述子单元的每个双链体区包含20个碱基对，并且其中胸苷残基存在于每个双链体区之间。
19.权利要求8至18中任一项的纳米结构，其中在所述中心区和一个或两个所述突出区之间的核心域的每个链上存在未配对的胸苷残基。
20.权利要求8至19中任一项的纳米结构，其中所述连接域包含n个单链核酸接头，其中所述接头与所述核心域的一个或多个突出区互补。
21.权利要求8至19中任一项的纳米结构，其中所述连接域包含六个单链核酸接头(链7-12)，其中所述核酸接头与所述核心域的一个或多个突出区互补。
22.权利要求19至21中任一项的纳米结构，其中所述连接域的一个或多个接头与所述核心域的突出区之间的互补程度在16-32个碱基对的范围内，包括端值。
23.权利要求1至22中任一项的纳米结构，其中所述核酸、核酸链和接头是DNA。
24.权利要求6至23中任一项的纳米结构，其中所有的链和接头在序列上均是独特的。
25.权利要求1至24中任一项的纳米结构，其还包含治疗剂、毒性剂、靶向剂、成像剂、诊断剂或预防剂，或其组合。
26.权利要求1至24中任一项的纳米结构，其还包含成像剂，其中所述成像剂包含金纳米粒子。
27.权利要求1至24中任一项的纳米结构，其还包含靶向剂，其中所述靶向剂包含适体。
28.权利要求1至24中任一项的纳米结构，其还包含分子，其中所述分子是DNA、RNA、PNA、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、小分子或染料。
29.权利要求25至28中任一项的纳米结构，其中所述剂或分子与所述纳米结构共价或非共价结合。
30.权利要求25至28中任一项的纳米结构，其中所述剂或分子被封装在所述纳米结构内。
31.一种将治疗剂、毒性剂、成像剂、诊断剂或预防剂递送至对象的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求25至30中任一项的纳米结构。
32.一种制造权利要求1至24中任一项的纳米结构的方法，所述方法包括对包含所述链和接头的混合物施加温度转变，使得所述链和接头退火。
33.权利要求32的方法，其中所述温度转变发生在16小时的时间段内。
34.权利要求32或33的方法，其中所述温度转变包括从90℃至20℃的温度变化。
35.权利要求32至34中任一项的方法，其中所述链和接头以约等摩尔浓度存在。
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