CN114026117A - 用于卵巢癌的新型肿瘤特异性抗原及其用途 - Google Patents

用于卵巢癌的新型肿瘤特异性抗原及其用途 Download PDF

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Abstract

卵巢癌，尤其是高级别浆液性卵巢癌(HGSC)，是全球妇科恶性肿瘤的主要死因，但并未从癌症免疫疗法的最新进展中显著获益。虽然淋巴细胞浸润HGSC与较高的生存率相关，但可引发抗HGSC免疫应答的抗原的性质尚不清楚。本文描述了被大比例的卵巢肿瘤共享的新型肿瘤特异性抗原(TSA)。本文所述的大多数TSA(>80％)源自异常表达的未突变基因组序列，诸如在正常组织中不表达的内含子和基因间序列。描述了源自这些TSA的核酸、组合物、细胞和疫苗。还描述了TSA、核酸、组合物、细胞和疫苗用于治疗卵巢癌的用途。

Description

用于卵巢癌的新型肿瘤特异性抗原及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月25日提交的美国临时专利申请序列号62/866,089的权益，其通过援引并入本文。
技术领域
本公开一般地涉及癌症，且更具体地涉及可用于基于T细胞的癌症免疫疗法的卵巢癌特异性肿瘤抗原。
背景技术
卵巢癌是全球妇科恶性肿瘤死亡的主要原因，并且在美国导致每年超过14,000人死亡(1)。高级别浆液性卵巢癌(HGSC)占这些死亡人数的70-80％，且几十年来总体生存率没有显著变化(2)。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的丰度与总体生存率增加之间的正相关暗示了T细胞可以识别HGSC中的生物学相关肿瘤抗原(3,4)。此外，强有力的证据表明，与肿瘤上皮细胞相邻的HGSC TIL积极参与局部免疫编辑。事实上，在对来自38名患者的212个HGSC样本的多模式研究中，CD8+ TIL与恶性细胞多样性呈负相关(5)。与此一致，并考虑到免疫检查点抑制剂在几种肿瘤类型中的治疗效果，目前正在HGSC中使用一种或多种检查点抑制剂进行临床试验。然而，抗PD1的初步试验显示在HGSC中的活性有限(6,7)。
有鉴于此，迫切需要确定可引发针对卵巢肿瘤诸如HGSC的治疗性免疫应答的抗原(3,8)。此类抗原可用作疫苗(±免疫检查点抑制剂)或作为基于T细胞受体的方法(细胞疗法、双特异性生物制剂)的靶标(9)。
本说明书参考了许多文献，其内容通过援引以其整体并入本文。
发明内容
本公开提供了以下1至61项：
1.一种肿瘤抗原肽，其包含SEQ ID NO:1-103中所述的氨基酸序列之一。
2.如项1所述的肿瘤抗原肽，其包含SEQ ID NO:19-103中所述的氨基酸序列之一。
3.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*01:01分子结合并且包含SEQ ID NO:21、28、40、41、66或88中所述的氨基酸序列。
4.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*02:01分子结合并且包含SEQ ID NO:1、19、20、22、30、31、36、50、52、60、62、73、84、85、86或91中所述的氨基酸序列。
5.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*11:01分子结合并且包含SEQ ID NO:32、54、55、67、69、81、87、90或102中所述的氨基酸序列。
6.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*24:02分子结合并且包含SEQ ID NO:33或43中所述的氨基酸序列。
7.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*25:01分子结合并且包含SEQ ID NO:24中所述的氨基酸序列之一。
8.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*29:02分子结合并且包含SEQ ID NO:34或58中所述的氨基酸序列之一。
9.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*32:01分子结合并且包含SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列。
10.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*07:02分子结合并且包含SEQ ID NO:4、6、8、9、26、49、78、92、97或101中所述的氨基酸序列。
11.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*08:01分子结合并且包含SEQ ID NO:23、35、42、44、46、59、63、70、74、76、83或103中所述的氨基酸序列之一。
12.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*14:01分子结合并且包含SEQ ID NO:53中所述的氨基酸序列。
13.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*15:01分子结合并且包含SEQ ID NO:2、3或5中所述的氨基酸序列。
14.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*18:01分子结合并且包含SEQ ID NO:89中所述的氨基酸序列。
15.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*39:01分子结合并且包含SEQ ID NO:47、64、96或99中所述的氨基酸序列。
16.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*40:01分子结合并且包含SEQ ID NO:11、12或13中所述的氨基酸序列。
17.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*44:02分子结合并且包含SEQ ID NO:65中所述的氨基酸序列。
18.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*44:03分子结合并且包含SEQ ID NO:37或94中所述的氨基酸序列。
19.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*03:03分子结合并且包含SEQ ID NO:10、29、71或95中所述的氨基酸序列。
20.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*04:01分子结合并且包含SEQ ID NO:6或15中所述的氨基酸序列。
21.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*05:01分子结合并且包含SEQ ID NO:27中所述的氨基酸序列。
22.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*06:02分子结合并且包含SEQ ID NO:18或72中所述的氨基酸序列。
23.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*07:01分子结合并且包含SEQ ID NO:38、61或93中所述的氨基酸序列。
24.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*07:02分子结合并且包含SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列。
25.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*12:03分子结合并且包含SEQ ID NO:80中所述的氨基酸序列。
26.如项1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*14:02分子结合并且包含SEQ ID NO:25、57或79中所述的氨基酸序列。
27.如项1-26中任一项所述的肿瘤抗原肽，其由位于基因组的非蛋白质编码区的序列编码并且包含SEQ ID NO:1、4、6-8、10、13、15-27和36-99，优选SEQ ID NO:19-27和36-99中任一项所述的氨基酸序列。
28.如项27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是非翻译转录区(UTR)，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:1、8、10、13、15和19-27，优选SEQ ID NO:19-27中任一项所述的氨基酸序列。
29.如项27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是内含子，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:16、17和36-64，优选SEQ ID NO:36-64中任一项所述的氨基酸序列。
30.如项27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是基因间区，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:65-84中任一项所述的氨基酸序列。
31.如项27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是非编码RNA转录本(ncRNA)的外显子，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:4和85-92，优选SEQ ID NO:85-92中任一项所述的氨基酸序列。
32.如项27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是基因的反义链，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:93-99中任一项所述的氨基酸序列。
33.一种编码项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽的核酸。
34.如项33所述的核酸，其为mRNA或病毒载体。
35.一种脂质体，其包含项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽或项33或34所述的核酸。
36.一种组合物，其包含项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽、项31或32所述的核酸或者项33所述的脂质体以及药学上可接受的载体。
37.一种疫苗，其包含项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽、项33或34所述的核酸、项35所述的脂质体或者项36所述的组合物以及佐剂。
38.一种分离的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子，所述分离的MHC I类分子在其肽结合槽中包含项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽。
39.如项38所述的分离的MHC I类分子，其为多聚体形式。
40.如项39所述的分离的MHC I类分子，其中，所述多聚体是四聚体。
41.一种分离的细胞，其包含(i)项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽或(ii)包含编码项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽的核苷酸序列的载体。
42.一种分离的细胞，所述分离的细胞在其表面表达主要组织相容性复合体(MHC)I类分子，所述MHC I类分子在其肽结合槽中包含项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽。
43.如项42所述的细胞，其是抗原呈递细胞(APC)。
44.如项43所述的细胞，其中，所述APC是树突细胞。
45.一种T细胞受体(TCR)，其特异性识别项38-40中任一项所述的分离的MHC I类分子和/或在项42-44中任一项所述的细胞表面表达的MHC I类分子。
46.一种分离的CD8+ T淋巴细胞，所述分离的CD8+ T淋巴细胞在其细胞表面表达项45所述的TCR。
47.一种细胞群，其包含至少0.5％的如项46所限定的CD8+ T淋巴细胞。
48.一种治疗受试者卵巢癌的方法，包括向受试者施用有效量的：(i)项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)项33或34所述的核酸；(iii)项35所述的脂质体；(iv)项36所述的组合物；(v)项37所述的疫苗；(vi)项41-45中任一项所述的细胞；(vii)项46所述的CD8+ T淋巴细胞；或(viii)项47所述的细胞群。
49.如项48所述的方法，其中，所述卵巢癌是浆液性癌。
50.如项49所述的方法，其中，所述浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。
51.如项48-50中任一项所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法。
52.如项51所述的方法，其中，所述至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法是化疗剂、免疫疗法、免疫检查点抑制剂、放射疗法或手术。
53.(i)项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)项33或34所述的核酸；(iii)项35所述的脂质体；(iv)项36所述的组合物；(v)项37所述的疫苗；(vi)项41-45中任一项所述的细胞；(vii)项46所述的CD8+ T淋巴细胞；或(viii)项47所述的细胞群用于治疗受试者卵巢癌的用途。
54.(i)项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)项33或34所述的核酸；(iii)项35所述的脂质体；(iv)项36所述的组合物；(v)项37所述的疫苗；(vi)项41-45中任一项所述的细胞；(vii)项46所述的CD8+ T淋巴细胞；或(viii)项47所述的细胞群用于制造用于治疗受试者卵巢癌的药物的用途。
55.如项53或54所述的用途，其中，所述卵巢癌是浆液性癌。
56.如项55所述的用途，其中，所述浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。
57.如项53-56中任一项所述的用途，还包括使用至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法。
58.如项57所述的用途，其中，所述至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法是化疗剂、免疫疗法、免疫检查点抑制剂、放射疗法或手术。
59.(i)项1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)项33或34所述的核酸；(iii)项35所述的脂质体；(iv)项36所述的组合物；(v)项37所述的疫苗；(vi)项41-45中任一项所述的细胞；(vii)项46所述的CD8+ T淋巴细胞；或(viii)项47所述的细胞群，用于治疗受试者卵巢癌的用途。
60.根据项59所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+ T淋巴细胞或细胞群，其中，所述卵巢癌是浆液性癌。
61.根据项60所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+ T淋巴细胞或细胞群，其中，所述浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。
62.根据项59-61中任一项所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+ T淋巴细胞或细胞群，其中，所述肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+ T淋巴细胞或细胞群与至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法组合使用。
63.根据项62所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+ T淋巴细胞或细胞群，其中，所述至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法是化疗剂、免疫疗法、免疫检查点抑制剂、放射疗法或手术。
本发明的其它目的、优点和特征将在阅读以下仅以实例的方式参考附图给出的其具体实施方式的非限制性描述之后变得更加明显。
附图说明
在附图中：
图1示出了本研究中使用的TSA识别流程的示意性工作流。处理HGSC样本以进行免疫沉淀和RNA测序。使用MS分析识别肽序列，该分析通过在由RNA-Seq数据构建的定制的个体全球癌症数据库中搜索匹配来识别MAP。CDS：编码序列。
图2A-B描绘了编码aeTSA候选者的RNA在正常组织中的表达。热图示出了27种外周组织中aeTSA编码序列的平均RNA表达，颜色强度对应于按每亿个测序的读数平均对数转换的读数(rphm)计每种组织的表达水平。粗体框表示具有高于阈值RNA表达的组织/器官(平均rphm>10)。每种肽序列旁边的数字显示了相应RNA高于阈值表达的组织数量。
图3A-D示出大多数TSA源自未突变的非外显子序列。图3A：每个样本中识别的MAP(左)和TSA(右)的数量。图3B：散点图示出了每个样本识别的MAP和TSA数量之间的皮尔逊(Pearson)相关性。图3C：条形图示出了在本文研究的队列和Schuster等人的数据集中识别的TSA的起源。蓝色阴影描绘了由框内外显子翻译(内编码(Coding-in))、框外外显子翻译(外编码(Coding-out))或非外显子翻译(非编码(Noncoding))产生的TSA的数量。图3D：饼图示出了aeTSA的翻译阅读框(内饼)、详细的基因组来源(中饼)及其报告状态(外圈)。
图4示出了跨卵巢癌样本的aeTSA编码区的表达。热图示出了本研究报告的9个样本(左)和来自TCGA-OV队列的378个样本中编码每个aeTSA的区域的RNA表达，颜色强度显示了按每百万读数区域中映射的读数计的RNA水平。
图5A-B示出了拷贝数变化与几种aeTSA的表达相关。图5A：热图示出了位于基因内(左)或基因外(右)的aeTSA的aeTSA RNA表达水平与DNA拷贝数、启动子甲基化或基因表达之间的斯皮尔曼(Spearman)相关性。无可用数据显示为浅灰色。图5B：从具有臂水平扩增分数(底部)的每个染色体臂(顶部)识别的aeTSA数量。星号表示扩增被认为是显著的(Q值<0.25)。
图6A-E示出三种aeTSA的呈递可引发自发的抗肿瘤免疫应答。图6A-C：卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线描绘了TCGA-OV队列中四组患者的生存率。对于三个单独的aeTSA，一组可以呈递aeTSA(EP)，而三组不能(ED、ND和NP)。ED：aeTSA编码RNA的表达，不存在相关HLA同种异型；ND：无aeTSA编码RNA的表达，不存在相关HLA同种异型；EP：aeTSA编码RNA的表达，存在相关HLA同种异型；NP：无aeTSA编码RNA的表达，存在相关HLA同种异型。有色阴影代表95％的置信区间。指示了对数秩P值。图6D、E：来自图6C所示四组的肿瘤中T细胞和细胞毒性细胞的丰度。
图7示出了三种不同群体中个体HGSC呈递aeTSA的估计频率。为每种群体生成了100万模拟患者。当aeTSA的RNA被表达并且存在相关HLA同种异型时，则认为aeTSA存在于模拟患者中。aeTSA RNA表达的频率基于TCGA-OV RNA-Seq数据(如图4所示)。HLA同种异型频率从美国国家骨髓捐赠计划(USA National Marrow Donor Program)获得。红色虚线表示每种群体中每肿瘤的aeTSA的中位数。
图8A-B示出基于dbSNP的mTSA验证也由配对正常样本的测序数据支持。图8A：匹配dbSNP中报告的常见多态性的被排除的TSA候选者的实例。在配对正常样本中也可见变异核苷酸。图8B：具有dbSNP中不存在的变体的mTSA的实例。变异核苷酸仅一个读数检测为配对正常，这可能是测序错误。
图9示出了含有种系多态性的TSA候选者的编码序列的外周表达。当其编码序列和相应的参考序列在外周组织中具有受限的RNA表达时，在dbSNP中记录的具有单核苷酸变异的TSA候选者被认为是aeTSA。热图示出了27种外周组织中aeTSA编码序列的平均RNA表达，颜色强度对应于按每亿个测序的读数平均对数转换的读数(rphm)计每种组织的表达水平。粗体框表示平均rphm值高于10的组织/器官。每种肽序列旁边的数字显示了对于给定的肽具有可观的RNA表达的组织的数量。红色星号表示保留为aeTSA的肽。
图10是示出MAP数量与肿瘤大小之间的相关性的图。散点图示出了对于每种样品肿瘤大小(x轴)与每个HLA等位基因识别的MAP数量(y轴)之间的皮尔逊相关性。在该图中仅使用了来自Schuster等人的样本(最大的子组)以避免批次效应。
图11A-B是示出aeTSA表达与DNA拷贝数变异(CNV)之间的关系的图。图11A：使用费希尔(Fisher)精确检验计算的基因内aeTSA RNA表达与CNV之间显著相关性的富集分析。根据表达TSA的肿瘤比例对aeTSA进行分组(上半部分和下半部分)。图11B：aeTSA数量与染色体臂扩增之间的相关性。散点图示出了对于每种样本的染色体臂扩增(x轴)与从臂识别的aeTSA数量(y轴)之间的皮尔逊相关性。
具体实施方式
本文使用的遗传学、分子生物学、生物化学和核酸的术语和符号遵循该领域的标准论文和文献的术语和符号，例如Kornberg and Baker,DNA Replication,SecondEdition(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,Second Edition(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan and Read,Human Molecular Genetics,Second Edition(Wiley-Liss,New York,1999)；Eckstein,editor,Oligonucleotides andAnalogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991)；Gait,editor,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)等。所有术语应以其在相关领域中确立的典型含义来理解。
冠词“a”和“an”在本文中用于指代冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。例如，“元素”是指一个元素或一个以上的元素。在本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或元素或步骤或元素的组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的组。
除非在本文中另有说明，否则本文对数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独引用一样。范围内的值的所有子集也被并入到说明书中，就好像它们在本文中被单独引用一样。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的顺序进行。
除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且不对本发明的范围构成限制。
说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
在本文中，术语“约”具有其普通含义。术语“约”用于表示值包括用于确定该值的设备或方法的固有误差变化，或包括接近所述值的值，例如在所述值(或值范围)的10％或5％以内。
在本文所述的研究中，发明人使用基于蛋白质基因组学的方法从23种HGSC肿瘤中识别了111种TSA候选者(103种新颖的和8种先前报道的)。这些TSA的很大一部分(93)源自异常表达的未突变基因组序列，这些序列在正常组织中不表达。这些异常表达的TSA(在本文中称为aeTSA)被证明主要来源于非外显子序列，特别是内含子(31％)和基因间(22％)，并且它们的表达通过基因拷贝数变异和DNA甲基化而在转录水平上受到调节。这些aeTSA被大比例的HGSC共享，并且考虑到aeTSA表达频率和HLA等位基因频率，估计在白种人中，每种肿瘤的aeTSA的中位数为5。本文识别的新颖TSA候选者可用于基于卵巢癌T细胞的免疫疗法。
因此，在一个方面，本公开涉及包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)：SEQ ID NO:1-103，优选SEQ ID NO:19-103(表3A、3B)。
在一种实施方式中，本公开涉及由位于非翻译转录区(UTR)，即3'-UTR或5'-UTR区中的序列编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:1、8、10、13、15和19-27，优选SEQ ID NO:19-27。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽由位于5'-UTR中的序列编码并且包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:1、10、13、15和19-23，优选SEQ ID NO:19-23。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽由位于3'-UTR中的序列编码并且包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:8和24-27，优选SEQ ID NO:24-27。
在一种实施方式中，本公开涉及由位于内含子中的序列编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:16、17和36-64，优选SEQID NO:36-64。
在一种实施方式中，本公开涉及由位于基因间区中的序列编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:65-84。
在另一种实施方式中，本公开涉及由位于外显子中且源自移码的序列编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:6、7、18和28-35，优选SEQ ID NO:28-35。
在另一种实施方式中，本公开涉及由非编码RNA序列(ncRNA)(位于非编码转录物的外显子中)编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:4和85-92，优选SEQ ID NO:85-92。
在另一种实施方式中，本公开涉及由基因的反义序列编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:93-99。
在另一种实施方式中，本公开涉及由来自粘蛋白基因的序列编码的肿瘤抗原肽，其包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:100-103。
一般而言，在HLA I类上下文中呈递的肽诸如肿瘤抗原肽的长度在约7或8至约15，或优选8至14个氨基酸残基之间变化。在本公开的方法的一些实施方式中，包含本文限定的肿瘤抗原肽序列的更长的肽被人工装载到细胞诸如抗原呈递细胞(APC)中，由细胞处理并且肿瘤抗原肽由APC表面处的MHC I类分子呈递。在该方法中，可以将长度超过15个氨基酸残基的肽/多肽(即肿瘤抗原前体肽)装载到APC中，通过APC胞质溶胶中的蛋白酶进行处理，提供本文定义的相应肿瘤抗原肽用于呈递。在一些实施方式中，用于产生本文定义的肿瘤抗原肽的前体肽/多肽是例如1000、500、400、300、200、150、100、75、50、45、40、35、30、25、20或15个氨基酸或更少。因此，使用本文描述的肿瘤抗原肽的所有方法和过程包括使用更长的肽或多肽(包括天然蛋白质)，即肿瘤抗原前体肽/多肽，以诱导在由细胞(APC)处理后呈递“最终”8-14个肿瘤抗原肽。在一些实施方式中，本文提及的肿瘤抗原肽为约8至14、8至13或8至12个氨基酸长(例如，8、9、10、11、12或13个氨基酸长)，足够小用于直接配合HLA I类分子。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽包含20个氨基酸或更少，优选15个氨基酸或更少，更优选14个氨基酸或更少。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽包含至少7个氨基酸，优选至少8个氨基酸，更优选至少9个氨基酸。
如本文所用，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸以及其他氨基酸(例如，天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸、不由核酸序列编码的氨基酸等)的L-和D-异构体，用于肽化学以制备肿瘤抗原肽的合成类似物。天然存在的氨基酸的实例是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸等。其他氨基酸包括例如氨基酸的非遗传编码形式，以及L-氨基酸的保守置换。天然存在的非遗传编码氨基酸包括例如β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸(Aib)、4-氨基-丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸(例如，L-鸟氨酸)、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、L-高精氨酸(Hoarg)、N-乙酰赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2,4,-二氨基丁酸(D-或L-)、对氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸(HoSer)、磺基丙氨酸、ε-氨基己酸、δ-氨基戊酸或2,3-二氨基丁酸(D-或L-)等。这些氨基酸在生物化学/肽化学领域是众所周知的。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽仅包含天然存在的氨基酸。
在实施方式中，本文所述的肿瘤抗原肽包括具有改变的序列的肽，所述改变的序列含有相对于本文提及的序列的功能等效氨基酸残基的置换。例如，序列内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性(具有相似物理化学性质)的其他氨基酸置换，其充当功能等效物，导致沉默改变。序列内氨基酸的置换可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸(以及高精氨酸和鸟氨酸)。非极性(疏水)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。不带电荷的极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。氨基酸甘氨酸可以包括在非极性氨基酸家族或不带电(中性)极性氨基酸家族中。在氨基酸家族内进行的置换通常被理解为保守置换。本文提及的肿瘤抗原肽可包含所有L-氨基酸、所有D-氨基酸或L-和D-氨基酸的混合物。在一种实施方式中，本文提及的肿瘤抗原肽包含所有L-氨基酸。
在一种实施方式中，在包含表3A-3B中公开的序列之一或由表3A-3B中公开的序列之一组成的肿瘤抗原肽的序列中，可以通过替换为其他氨基酸来改性基本上不有助于与T细胞受体相互作用的氨基酸残基，所述其他氨基酸的并入基本上不影响T细胞反应性并且不消除与相关MHC的结合。
肿瘤抗原肽还可以是N-和/或C-末端封端的或改性的以防止降解，增加稳定性、亲和力和/或摄取。因此，在另一方面，本公开提供了式Z1-X-Z2的改性肿瘤抗原肽，其中X是包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一组成的肿瘤抗原肽：SEQ ID NO:1-103，优选SEQ ID NO:19-103(表3A、3B)。
在一种实施方式中，肿瘤抗原肽的氨基末端残基(即，N-末端处的游离氨基基团)被改性(例如，为了防止降解)，例如通过部分/化学基团(Z1)的共价连接。Z1可为一至八个碳的直链或支链烷基基团、或酰基基团(R-CO-)其中R为疏水部分(例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丙酰基或异-丁酰基)、或芳酰基基团(Ar-CO-)其中Ar是芳基基团。在一种实施方式中，酰基基团是C1-C16或C3-C16酰基基团(直链或支链、饱和或不饱和的)，在另一种实施方式中，是饱和的C1-C6酰基基团(直链或支链)或不饱和的C3-C6酰基基团(直链或支链)，例如乙酰基基团(CH3-CO-，Ac)。在一种实施方式中，Z1不存在。肿瘤抗原肽的羧基末端残基(即肿瘤抗原肽的C末端处的游离羧基基团)可以被改性(例如，为了防止降解)，例如通过酰胺化(OH基团被NH2基团取代)，因此在这种情况下Z2是NH2基团。在一种实施方式中，Z2可以是异羟肟酸基团，腈基团，酰胺(伯、仲或叔)基团，具有一到十个碳的脂肪族胺诸如甲胺、异丁胺、异戊胺或环己胺，芳族或芳烷基胺诸如苯胺、萘胺、苄胺、肉桂胺或苯乙胺，醇或CH2OH。在一种实施方式中，Z2不存在。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽包含以下氨基酸序列之一：SEQ IDNO:1-103，优选SEQ ID NO:19-103(表3A、3B)。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽由以下氨基酸序列之一组成：SEQ ID NO:1-103，优选SEQ ID NO:19-103(表3A、3B)，即其中Z1和Z2不存在。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*01:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成:SEQ ID NO:21、28、40、41、66或88。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*02:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:14、17、45、48、51、56、75、77、82、98或100，优选SEQ ID NO:45、48、51、56、75、77、82、98或100。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*03:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:1、19、20、22、30、31、36、50、52、60、62、73、84、85、86或91，优选SEQ ID NO:19、20、22、30、31、36、50、52、60、62、73、84、85、86或91。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*11:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:32、54、55、67、69、81、87、90或102。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*24:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:33或43。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*25:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:24.
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*29:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:34或58。
在另一方面，本公开提供了与HLA-A*32:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:16。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*07:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:4、6、8、9、26、49、78、92、97或101，优选SEQ ID NO:26、49、78、92、97或101。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*08:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:23、35、42、44、46、59、63、70、74、76、83或103。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*14:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:53。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*15:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:2、3或5。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*18:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:89。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*39:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:47、64、96或99。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*40:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:11、12或13。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*44:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:65。
在另一方面，本公开提供了与HLA-B*44:03分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:37或94。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*03:03分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:10、29、71或95，优选SEQ ID NO:29、71或95。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*04:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:6或15。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*05:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:27。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*06:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:18或72，优选SEQ ID NO:72。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*07:01分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:38、61或93。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*07:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:7。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*12:03分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:80。
在另一方面，本公开提供了与HLA-C*14:02分子结合的肿瘤抗原肽(或肿瘤特异性肽)，优选卵巢肿瘤抗原肽，其包含以下序列或由以下序列组成：SEQ ID NO:25、57或79。
在一种实施方式中，肿瘤抗原肽由位于非翻译转录区(UTR)，即3'-UTR或5'-UTR区中的序列编码。在另一种实施方式中，肿瘤抗原肽由位于内含子中的序列编码。在另一种实施方式中，肿瘤抗原肽由位于基因间区中的序列编码。在另一种实施方式中，肿瘤抗原肽由位于外显子中并源自移码的序列编码。
本公开的肿瘤抗原肽可通过在包含编码肿瘤抗原肽的核酸的宿主细胞中表达(重组表达)或通过化学合成(例如，固相肽合成)来产生。肽可以通过本领域众所周知的手动和/或自动固相程序容易地合成。合适的合成可以例如通过利用“T-boc”或“Fmoc”程序进行。固相合成的技术和程序在例如Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach,E.Atherton和R.C.Sheppard,IRL,Oxford University Press出版,1989中描述。替代地，肿瘤抗原肽可以通过片段缩合的方式制备，如例如以下所述的：Liu et al.,Tetrahedron Lett.37:933-936,1996；Baca et al.,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887,1995；Tam et al.,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216,1995；Schnolzer and Kent,Science 256:221-225,1992；Liu and Tam,J.Am.Chem.Soc.116:4149-4153,1994；Liu andTam,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6584-6588,1994；以及Yamashiro and Li,Int.J.Peptide Protein Res.31:322-334,1988)。可用于合成肿瘤抗原肽的其他方法描述于Nakagawa et al.,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092,1985。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽是化学合成的(合成肽)。本公开的另一实施方式涉及非天然存在的肽，其中所述肽由本文定义的氨基酸序列组成或基本上由本文定义的氨基酸序列组成并且已经合成产生(例如合成)为药学上可接受的盐。根据本公开的肿瘤抗原肽的盐与处于其体内状态的肽显著不同，因为体内产生的肽不是盐。肽的非天然盐形式可以调节肽的溶解度，特别是在包含肽的药物组合物的情况下，例如如本文公开的肽疫苗。优选地，盐是肽的药学上可接受的盐。
在一种实施方式中，本文提及的肿瘤抗原肽是基本上纯的。当化合物与自然伴随它的组分分离时，它是“基本上纯的”。通常，当化合物按重量计占样本中总材料的至少60％，更通常75％、80％或85％，优选超过90％，且更优选超过95％时，该化合物是基本上纯的。因此，例如，化学合成或通过重组技术产生的多肽通常基本上不含其天然相关组分，例如其来源大分子的组分。当核酸分子不与编码序列紧密接邻(即共价连接)时，核酸分子是基本上纯的，在该核酸分子源自的生物体的天然存在的基因组中，该编码序列通常与该核酸分子接邻。例如，可以通过从天然来源中提取；通过表达编码肽化合物的重组核酸分子；或通过化学合成来获得基本上纯的化合物。纯度可以使用任何合适的方法测量，诸如柱色谱、凝胶电泳、HPLC等。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽在溶液中。在另一种实施方式中，肿瘤抗原肽是固体形式，例如，冻干的。
在另一方面，本公开进一步提供了编码本文提及的肿瘤抗原肽或肿瘤抗原前体-肽的核酸(分离的)。在一种实施方式中，核酸包含约21个核苷酸至约45个核苷酸，约24个至约45个核苷酸，例如24、27、30、33、36、39、42或45个核苷酸。如本文所用，“分离的”是指与存在于该分子的天然环境中的其他组分或天然存在的来源大分子(例如，包括其他核酸、蛋白质、脂质、糖等)分离的肽或核酸分子。如本文所用，“合成的”是指未从其天然来源中分离的肽或核酸分子，例如，通过重组技术或使用化学合成产生的。本公开的核酸可用于重组表达本公开的肿瘤抗原肽，并且可包含在载体或质粒中，诸如克隆载体或表达载体，其可转染到宿主细胞中。在一种实施方式中，本公开提供了包含编码本公开的肿瘤抗原肽的核酸序列的克隆、表达或病毒载体或质粒。替代地，可将编码本公开的肿瘤抗原肽的核酸并入宿主细胞的基因组中。在任一情况下，宿主细胞表达由核酸编码的肿瘤抗原肽或蛋白质。如本文所用，术语“宿主细胞”不仅指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。宿主细胞可以是能够表达本文所述的肿瘤抗原肽的任何原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如，昆虫细胞，酵母或哺乳动物细胞)。载体或质粒含有插入的编码序列转录和翻译所必需的元件，也可含有其他组分诸如抗性基因、克隆位点等。可使用本领域技术人员熟知的方法构建表达载体，该表达载体包含编码肽或多肽的序列以及与其可操作地连接的合适的转录和翻译控制/调控元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。这样的技术描述于Sambrook.et al.(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,Plainview,N.Y.，和Ausubel,F.M.et al.(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.。“可操作地连接”是指组分的并列，特别是核苷酸序列，使得可以进行组分的正常功能。因此，与调控序列可操作地连接的编码序列是指核苷酸序列的构型，其中编码序列可以在调控序列的调节控制即转录和/或翻译控制下表达。如本文所用，“调控/控制区”或“调控/控制序列”是指参与调控编码核酸的表达的非编码核苷酸序列。因此，术语调控区包括启动子序列、调控蛋白结合位点、上游激活序列等。在一种实施方式中，编码本公开的肿瘤抗原肽的核酸(DNA、RNA)包含在脂质体或任何其他合适的载体内或连接至脂质体或任何其他合适的负载体。
在另一方面，本公开提供了包含(即呈递或结合至)肿瘤抗原肽的MHC I类分子。在一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A1分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*01:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A2分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*02:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A3分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*03:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A11分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*11:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A24分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*24:02分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A25分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*25:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A29分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*29:02分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-A32分子，在进一步的实施方式中是HLA-A*32:02分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B07分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*07:02分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B08分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*08:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B14分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*14:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B15分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*15:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B18分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*18:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B39分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*39:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B40分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*40:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-B44分子，在进一步的实施方式中是HLA-B*44:02或HLA-B*44:03分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C03分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*03:03分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C04分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*04:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C05分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*05:01分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C06分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*06:02分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C07分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*07:01或HLA-C*07:02分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C12分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*12:03分子。在另一种实施方式中，MHC I类分子是HLA-C14分子，在进一步的实施方式中是HLA-C*14:02分子。
在一种实施方式中，肿瘤抗原肽与MHC I类分子非共价结合(即，肿瘤抗原肽加载到或非共价结合至MHC I类分子的肽结合槽/袋)。在另一种实施方式中，肿瘤抗原肽与MHCI类分子(α链)共价连接/结合。在这样的构建体中，肿瘤抗原肽和MHC I类分子(α链)作为合成融合蛋白产生，通常具有短的(例如，5至20个残基，优选约8-12个，例如10个)柔性接头或间隔物(例如，聚甘氨酸接头)。在另一方面，本公开提供了编码融合蛋白的核酸，该融合蛋白包含与MHC I类分子(α链)融合的本文限定的肿瘤抗原肽。在一种实施方式中，MHC I类分子(α链)-肽复合物是多聚化的。因此，在另一方面，本公开提供了加载有(共价或非共价)本文提及的肿瘤抗原肽的MHC I类分子的多聚体。此类多聚体可连接至标签，例如荧光标签，其允许检测多聚体。已经开发了大量用于生产MHC多聚体的策略，所述MHC多聚体包括MHC二聚体、四聚体、五聚体、八聚体等(综述于Bakker and Schumacher,Current Opinion inImmunology 2005,17:428-433)。例如，MHC多聚体可用于检测和纯化抗原特异性T细胞。因此，在另一方面，本公开提供了用于检测或纯化(分离、富集)对本文限定的肿瘤抗原肽具有特异性的CD8+ T淋巴细胞的方法，该方法包括将细胞群与加载有(共价或非共价)肿瘤抗原肽的MHC I类分子的多聚体接触；以及检测或分离被MHC I类多聚体结合的CD8+ T淋巴细胞。被MHC I类多聚体结合的CD8+ T淋巴细胞可以使用已知方法分离，例如荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)。
在又一方面，本公开提供了细胞(例如，宿主细胞)，在一种实施方式中是分离的细胞，其包含本文提及的本公开的核酸、载体或质粒，即编码一种或多种肿瘤抗原肽的核酸或载体。在另一方面，本公开提供了在其表面表达与根据本公开的肿瘤抗原肽结合或呈递根据本公开的肿瘤抗原肽的MHC I类分子(例如，上文公开的等位基因之一的MHC I类分子)的细胞。在一种实施方式中，宿主细胞是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，优选人类细胞，细胞系或永生化细胞。在另一种实施方式中，细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一种实施方式中，宿主细胞是原代细胞、细胞系或永生化细胞。在另一种实施方式中，细胞是抗原呈递细胞(APC)。可以通过常规转化或转染技术将核酸和载体引入细胞中。术语“转化”和“转染”是指将外源核酸引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射和病毒介导的转染。转化或转染宿主细胞的合适方法可以例如在Sambrook et al.(同上)和其他实验室手册中找到。在体内将核酸引入哺乳动物细胞的方法也是已知的，并且可用于将本公开的载体或质粒递送至受试者以进行基因治疗。
可以使用本领域已知的多种方法将一种或多种肿瘤抗原肽加载到细胞诸如APC上。如本文所用，用肿瘤抗原肽“加载细胞”是指将编码肿瘤抗原肽的RNA或DNA或者肿瘤抗原肽转染到细胞中，或替代地用编码肿瘤抗原肽的核酸转化APC。也可以通过将细胞与外源性肿瘤抗原肽接触来加载细胞，所述外源性肿瘤抗原肽可以直接结合存在于细胞表面的MHC I类分子(例如，肽冲击细胞)。肿瘤抗原肽也可融合到促进其被MHC I类分子呈递的结构域或基序，例如融合到内质网(ER)回收信号、C端Lys-Asp-Glu-Leu序列(参见Wang etal.,Eur J Immunol.2004Dec；34(12):3582-94)。
在另一方面，本公开提供了包含本文限定的肿瘤抗原肽(或编码所述肽的核酸)中的任一种或任何组合的组合物或肽组合/库。在一种实施方式中，组合物包含本文限定的肿瘤抗原肽的任何组合(2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种肿瘤抗原肽的任何组合)，或编码所述肿瘤抗原肽的核酸的组合。本公开包括包含本文限定的肿瘤抗原肽的任何组合/亚组合的组合物。在另一种实施方式中，组合或库可以包括一种或多种已知的肿瘤抗原。
因此，在另一方面，本公开提供了组合物，其包含本文限定的肿瘤抗原肽中的任一种或其任何组合和表达MHC I类分子(例如，上文公开的等位基因之一的MHC I类分子)的细胞。用于本公开的APC不限于特定类型的细胞并且包括专职性APC，诸如树突细胞(DC)、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细胞，已知它们在其细胞表面呈递蛋白质抗原以被CD8+ T淋巴细胞识别。例如，可以通过从外周血单核细胞中诱导DC，然后在体外、离体或体内接触(刺激)肿瘤抗原肽来获得APC。APC也可以被激活以在体内呈递肿瘤抗原肽，其中向受试者施用本公开的一种或多种肿瘤抗原肽并且在受试者的身体中诱导呈递肿瘤抗原肽的APC。短语“诱导APC”或“刺激APC”包括用一种或多种肿瘤抗原肽或编码肿瘤抗原肽的核酸接触或加载细胞，使得由MHC I类分子在其表面呈递肿瘤抗原肽。如本文所述，根据本公开，可以间接加载肿瘤抗原肽，例如使用包含肿瘤抗原肽序列的较长肽/多肽(包括天然蛋白质)，然后在APC内对其进行处理(例如，通过蛋白酶)以在细胞表面产生肿瘤抗原肽/MHC I类复合物。在用肿瘤抗原肽加载APC并允许APC呈递肿瘤抗原肽后，APC可以作为疫苗被施用于受试者。例如，离体施用可以包括以下步骤：(a)从第一受试者收集APC，(b)将步骤(a)的APC与肿瘤抗原肽接触/加载，以在APC表面形成MHC I类/肿瘤抗原肽复合物；以及(c)将加载有肽的APC施用于需要治疗的第二受试者。
第一受试者和第二受试者可以是相同受试者(例如，自体疫苗)，或者可以是不同受试者(例如，同种异体疫苗)。替代地，根据本公开，提供了本文所述的肿瘤抗原肽(或其组合)用于制造用于诱导抗原呈递细胞的组合物(例如，药物组合物)的用途。此外，本公开提供了制造用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺，其中该方法或工艺包括将肿瘤抗原肽或其组合与药学上可接受的载体混合或配制的步骤。表达加载有本文限定的肿瘤抗原肽中的任一种或任何组合的MHC I类分子(例如，HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A29、HLA-A32、HLA-B07、HLA-B08、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B18、HLA-B39、HLA-B40、HLA-B44、HLA-C03、HLA-C04、HLA-C05、HLA-C06、HLA-C07、HLA-C12或HLA-C14分子)的细胞，诸如APC，可用于刺激/扩增CD8+ T淋巴细胞，例如自体CD8+T淋巴细胞。因此，在另一方面，本公开提供了组合物，其包含本文限定的肿瘤抗原肽中的任一种或任何组合(或编码其的核酸或载体)；表达MHC I类分子的细胞，以及T淋巴细胞，更特别地CD8+ T淋巴细胞(例如，包含CD8+ T淋巴细胞的细胞群)。
在一种实施方式中，组合物还包含缓冲剂、赋形剂、载体、稀释剂和/或介质(例如，培养基)。在另一种实施方式中，缓冲剂、赋形剂、载体、稀释剂和/或培养基是药学上可接受的缓冲剂、赋形剂、载体、稀释剂和/或介质(基质)。如本文所用，“药学上可接受的缓冲剂、赋形剂、载体、稀释剂和/或介质”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、粘合剂、润滑剂、填充剂、增稠剂、崩解剂、增塑剂、包衣、阻隔层制剂、润滑剂、稳定剂、缓释剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂等，它们是生理学相容的，不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对受试者无毒。此类基质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的(Rowe etal.,Handbook of pharmaceutical excipients,2003,4th edition,PharmaceuticalPress,London UK)。除非任何常规基质或试剂与活性化合物(肽、细胞)不相容，否则预期将其用于本公开的组合物中。在一种实施方式中，缓冲剂、赋形剂、载体和/或介质是非天然存在的缓冲剂、赋形剂、载体和/或介质。在一种实施方式中，本文限定的一种或多种肿瘤抗原肽，或编码所述一种或多种肿瘤抗原肽的核酸(例如，mRNA)包含在脂质体内或与脂质体复合，例如阳离子脂质体(参见，例如，Vitor MT et al.,Recent Pat Drug DelivFormul.2013Aug；7(2):99-110)。
在另一方面，本公开提供了组合物，其包含本文限定的肿瘤抗原肽中的任一种或任何组合(或编码所述肽的核酸)以及缓冲剂、赋形剂、载体、稀释剂和/或介质中的一种或多种。对于包含细胞(例如，APC、T淋巴细胞)的组合物，该组合物包含允许维持活细胞的合适介质。此类基质的典型实例包括盐溶液、Earl’s平衡盐溶液(Life
Figure BDA0003429593530000271
)或
Figure BDA0003429593530000272
(Baxter
Figure BDA0003429593530000273
)。在一种实施方式中，组合物(例如，药物组合物)是“免疫原性组合物”、“疫苗组合物”或“疫苗”。如本文所用，术语“免疫原性组合物”、“疫苗组合物”或“疫苗”是指包含一种或多种肿瘤抗原肽或疫苗载体的组合物或制剂，并且当施用于受试者时，其能够诱导针对其中存在的一种或多种肿瘤抗原肽的免疫应答。用于在哺乳动物中诱导免疫应答的疫苗接种方法包括使用疫苗或疫苗载体通过疫苗领域已知的任何常规途径施用，例如通过粘膜(例如，眼、鼻、肺、口腔、胃、肠、直肠、阴道或泌尿道)表面，通过肠胃外(例如，皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内)途径，或局部施用(例如，通过经皮递送系统诸如贴剂)。在一种实施方式中，肿瘤抗原肽(或其组合)与载体蛋白缀合(结合疫苗)以增加肿瘤抗原肽的免疫原性。因此，本公开提供了包含肿瘤抗原肽(或其组合)、或编码肿瘤抗原肽或其组合的核酸以及载体蛋白的组合物(缀合物)。例如，肿瘤抗原肽或核酸可与Toll样受体(TLR)配体(参见，例如，Zom et al.,Adv Immunol.2012,114:177-201)或聚合物/树枝状聚合物(参见，例如，Liu et al.,Biomacromolecules.2013Aug 12；14(8):2798-806)缀合或复合。在一种实施方式中，免疫原性组合物或疫苗还包含佐剂。“佐剂”是指当添加至免疫原性试剂诸如抗原(根据本公开的肿瘤抗原肽、核酸和/或细胞)时，在暴露于混合物后非特异性地增强或加强宿主中对该试剂的免疫应答的物质。目前用于疫苗领域的佐剂的实例包括(1)矿物盐(铝盐诸如磷酸铝和氢氧化铝、磷酸钙凝胶)、角鲨烯，(2)油基佐剂，诸如基于油乳剂和表面活性剂的制剂，例如MF59(微流化洗涤剂稳定的水包油乳液)、QS21(纯化皂苷)、AS02[SBAS2](水包油乳液+MPL+QS-21)，(3)颗粒佐剂，例如病毒微体(包含流感血凝素的单层脂质体负载体)、AS04([SBAS4]铝盐与MPL)、ISCOMS(皂苷和脂质的结构化复合物)、聚丙交酯co-乙交酯(PLG)，(4)微生物衍生物(天然的和合成的)，例如，单磷酰脂质A(MPL)、Detox(MPL+草分枝杆菌(M.Phlei)细胞壁骨架)、AGP[RC-529](合成的酰化单糖)、DC_Chol(能够自组织成脂质体的类脂免疫刺激剂)、OM-174(脂质A衍生物)、CpG基序(含有免疫刺激性CpG基序的合成寡核苷酸)、改性LT和CT(基因改性的细菌毒素以提供无毒佐剂效果)，(5)内源性人免疫调节剂，例如hGM-CSF或hIL-12(可以作为蛋白质或编码质粒施用的细胞因子)、Immudaptin(C3d串联阵列)，和/或(6)惰性负载体，诸如金颗粒等。
在一种实施方式中，肿瘤抗原肽或包含其的组合物是冻干形式。在另一种实施方式中，肿瘤抗原肽或包含其的组合物在液体组合物中。在另一种实施方式中，组合物中肿瘤抗原肽的浓度为约0.01μg/mL至约100μg/mL。在进一步的实施方式中，组合物中肿瘤抗原肽的浓度为约0.2μg/mL至约50μg/mL，约0.5μg/mL至约10、20、30、40或50μg/mL，约1μg/mL至约10μg/mL，或约2μg/mL。
如本文所述，表达加载有或结合本文限定的肿瘤抗原肽中的任一种或任何组合的MHC I类分子的细胞，诸如APC，可用于体内或离体刺激/扩增CD8+ T淋巴细胞。因此，在另一方面，本公开提供了能够与本文提及的MHC I类分子/肿瘤抗原肽复合物相互作用或结合的T细胞受体(TCR)分子，以及编码此类TCR分子的核酸分子，以及包含此类核酸分子的载体。根据本公开的TCR能够特异性地与肿瘤抗原肽相互作用或结合，所述肿瘤抗原肽加载于MHCI类分子上或由MHC I类分子呈递，优选在体外或体内活细胞表面上。TCR，且特别是编码本公开的TCR的核酸可以例如应用于基因转化/改性T淋巴细胞(例如CD8+ T淋巴细胞)或其他类型的淋巴细胞，产生特异性识别MHC I类/肿瘤抗原肽复合物的新T淋巴细胞克隆。在一种特定的实施方式中，从患者获得的T淋巴细胞(例如CD8+ T淋巴细胞)被转化以表达一种或多种识别肿瘤抗原肽的TCR，并将转化的细胞施用于患者(自体细胞输血)。在一种特定的实施方式中，从供体获得的T淋巴细胞(例如CD8+T淋巴细胞)被转化以表达一种或多种识别肿瘤抗原肽的TCR，并将转化的细胞施用于接受者(同种异体细胞输血)。在另一种实施方式中，本公开提供了T淋巴细胞，例如，被编码肿瘤抗原肽特异性TCR的载体或质粒转化/转染的CD8+ T淋巴细胞。在另一种实施方式中，本公开提供了使用用肿瘤抗原肽特异性TCR转化的自体或同种异体细胞治疗患者的方法。在又一种实施方式中，提供了肿瘤抗原特异性TCR在制造用于治疗癌症的自体或同种异体细胞中的用途。
在一些实施方式中，在用同种异体干细胞移植(ASCL)、同种异体淋巴细胞输注或自体淋巴细胞输注治疗之前或之后治疗用本公开的组合物(例如，药物组合物)治疗的患者。本公开的组合物包括：针对肿瘤抗原肽离体激活的同种异体T淋巴细胞(例如，CD8+ T淋巴细胞)；加载有肿瘤抗原肽的同种异体或自体APC疫苗；肿瘤抗原肽疫苗以及用肿瘤抗原特异性TCR转化的同种异体或自体T淋巴细胞(例如CD8+ T淋巴细胞)或淋巴细胞。根据本公开的提供能够识别肿瘤抗原肽的T淋巴细胞克隆的方法可以特异性靶向受试者(例如，移植接受者)，例如ASCT和/或供体淋巴细胞输注(DLI)接受者中表达肿瘤抗原肽的肿瘤细胞并且可以针对其产生。因此，本公开提供了编码和表达能够特异性识别或结合肿瘤抗原肽/MHC I类分子复合物的T细胞受体的CD8+ T淋巴细胞。所述T淋巴细胞(例如，CD8+ T淋巴细胞)可以是重组的(工程化的)或天然选择的T淋巴细胞。因此，本说明书提供了至少两种用于产生本公开的CD8+ T淋巴细胞的方法，其包括在有利于触发T细胞活化和扩增的条件下使未分化的淋巴细胞与肿瘤抗原肽/MHC I类分子复合物(通常在细胞诸如APC表面表达)接触的步骤，这可以在体外或体内(即在施用了APC疫苗的患者中，其中APC加载有肿瘤抗原肽，或在用肿瘤抗原肽疫苗治疗的患者中)进行。使用与MHC I类分子结合的肿瘤抗原肽的组合或库，可以产生能够识别多种肿瘤抗原肽的CD8+ T淋巴细胞群。替代地，肿瘤抗原特异性或靶向肿瘤抗原的T淋巴细胞可以通过克隆编码与MHC I类分子/肿瘤抗原肽复合物特异性结合的TCR(更特别地α和β链)的一种或多种核酸(基因)在体外或离体生产/产生(即工程化的或重组的CD8+ T淋巴细胞)。编码本公开的肿瘤抗原肽特异性TCR的核酸可以使用本领域已知的方法从针对肿瘤抗原肽激活的T淋巴细胞离体获得(例如，用加载有肿瘤抗原肽的APC)；或从对肽/MHC分子复合物表现出免疫应答的个体获得。本公开的肿瘤抗原肽特异性TCR可以在从移植接受者或移植供体获得的宿主细胞和/或宿主淋巴细胞中重组表达，并且任选地在体外分化以提供细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。可以使用任何合适的方法诸如转染(例如电穿孔)或转导(例如，使用病毒载体)将编码TCRα和β链的核酸(转基因)引入到T细胞(例如，来自待治疗的受试者或其他个体)中。可以使用众所周知的培养方法在体外扩大表达对肿瘤抗原肽具有特异性的TCR的工程化CD8+ T淋巴细胞。
本公开提供了被肿瘤抗原肽(即与在细胞表面表达的MHC I类分子结合的肿瘤抗原肽)或肿瘤抗原肽的组合特异性诱导、激活和/或扩增(扩大)的分离的CD8+ T淋巴细胞。本公开还提供了组合物，其包含能够识别根据本公开的肿瘤抗原肽或其组合(即，一种或多种与MHC I类分子结合的肿瘤抗原肽)的CD8+ T淋巴细胞和所述肿瘤抗原肽。在另一方面，本公开提供了富集CD8+ T淋巴细胞的细胞群或细胞培养物(例如，CD8+ T淋巴细胞群)，所述CD8+ T淋巴细胞特异性识别如本文所述的一种或多种MHC I类分子/肿瘤抗原肽复合物。这种富集的群体可以通过使用细胞诸如表达加载有(例如呈递)本文公开的一种或多种肿瘤抗原肽的MHC I类分子的APC进行特异性T淋巴细胞的离体扩增来获得。如本文所用，“富集”是指群体中肿瘤抗原特异性CD8+ T淋巴细胞的比例相对于天然细胞群(即未经历特异性T淋巴细胞的离体扩增步骤)显著更高。在进一步的实施方式中，细胞群中肿瘤抗原肽特异性CD8+ T淋巴细胞的比例为至少约0.5％，例如至少约0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％或3％。在一些实施方式中，细胞群中肿瘤抗原肽特异性CD8+ T淋巴细胞的比例为约0.5至约10％、约0.5至约8％、约0.5至约5％、约0.5至约4％、约0.5％至约3％、约1％至约5％、约1％至约4％、约1％至约3％、约2％至约5％、约2％至约4％、约2％至约3％、约3％至约5％或约3％至约4％。这种富集特异性识别一种或多种目标MHC I类分子/肽(肿瘤抗原肽)复合物的CD8+ T淋巴细胞的细胞群或培养物(例如，CD8+ T淋巴细胞群)可用于基于肿瘤抗原的癌症免疫疗法，如下详述。在一些实施方式中，进一步富集肿瘤抗原肽特异性CD8+ T淋巴细胞群，例如使用基于亲和力的系统，诸如加载有(共价或不共价)本文限定的肿瘤抗原肽的MHC I类分子的多聚体。因此，本公开提供了纯化或分离的肿瘤抗原肽特异性CD8+ T淋巴细胞群，例如，其中肿瘤抗原肽特异性CD8+ T淋巴细胞的比例为至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本公开还涉及根据本公开的任何肿瘤抗原肽、核酸、表达载体、T细胞受体、细胞(例如，T淋巴细胞、APC)和/或组合物或其任何组合作为药物或在药物制造中的用途。在一种实施方式中，药物用于治疗癌症，例如，癌症疫苗。本公开涉及根据本公开的任何肿瘤抗原肽、核酸、表达载体、T细胞受体、细胞(例如，T淋巴细胞、APC)和/或组合物(例如，疫苗组合物)或其任何组合，用于治疗癌症的用途，例如，作为癌症疫苗。本文识别的肿瘤抗原肽序列可用于生产合成肽，以用于i)体外引发和扩增肿瘤抗原特异性T细胞以注射到肿瘤患者，和/或ii)作为疫苗以诱导或增强癌症患者的抗肿瘤T细胞应答。
在另一方面，本公开提供了本文所述的肿瘤抗原肽或其组合(例如肽库)作为用于治疗受试者的癌症的疫苗的用途。本公开还提供了本文所述的肿瘤抗原肽或其组合(例如肽库)，用作疫苗以治疗受试者的癌症。在一种实施方式中，受试者是肿瘤抗原肽特异性CD8+T淋巴细胞的接受者。因此，在另一方面，本公开提供了治疗癌症的方法(例如，减少肿瘤细胞的数量、杀死肿瘤细胞)，所述方法包括向有需要的受试者施用(输注)有效量的识别(即表达结合其的TCR)一种或多种MHC I类分子/肿瘤抗原肽复合物(在细胞诸如APC的表面表达)的CD8+ T淋巴细胞。在一种实施方式中，该方法进一步包括，在施用/输注所述CD8+ T淋巴细胞之后，向所述受试者施用有效量的肿瘤抗原肽或其组合和/或表达加载有肿瘤抗原肽的MHC I类分子的细胞(例如，APC，诸如树突细胞)。在又一种实施方式中，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的加载有一种或多种肿瘤抗原肽的树突细胞。在又一种实施方式中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的同种异体或自体细胞，所述细胞表达与MHC I类分子所呈递的肿瘤抗原肽结合的重组TCR。
在另一方面，本公开提供了识别一种或多种加载有(呈递)肿瘤抗原肽或其组合的MHC I类分子的CD8+ T淋巴细胞用于治疗受试者的癌症(例如，减少肿瘤细胞数量、杀死肿瘤细胞)的用途。在另一方面，本公开提供了识别一种或多种加载有(呈递)肿瘤抗原肽或其组合的MHC I类分子的CD8+ T淋巴细胞用于制备/制造用于治疗受试者的癌症(例如，减少肿瘤细胞数量、杀死肿瘤细胞)的药物的用途。在另一方面，本公开提供了识别一种或多种加载有(呈递)肿瘤抗原肽或其组合的MHC I类分子的CD8+ T淋巴细胞(细胞毒性T淋巴细胞)，用于治疗受试者的癌症(例如，减少肿瘤细胞数量、杀死肿瘤细胞)的用途。在进一步的实施方式中，该用途还包括，在使用所述肿瘤抗原肽特异性CD8+ T淋巴细胞之后，使用有效量的肿瘤抗原肽(或其组合)和/或表达一种或多种加载有(呈递)肿瘤抗原肽的MHC I类分子的细胞(例如，APC)。
本公开还提供了在受试者中产生针对表达加载有本文公开的任何肿瘤抗原肽或其组合的人I类MHC分子的肿瘤细胞的免疫应答的方法，该方法包括施用特异性识别加载有肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽的组合的I类MHC分子的细胞毒性T淋巴细胞。本公开还提供了特异性识别加载有本文公开的任何肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽的组合的I类MHC分子的细胞毒性T淋巴细胞用于产生针对表达加载有肿瘤抗原肽或其组合的人I类MHC分子的肿瘤细胞的免疫应答的用途。
在一种实施方式中，本文所述的方法或用途进一步包括在治疗/使用之前确定由患者表达的HLA I类等位基因，并施用或使用与由患者表达的一种或多种HLA I类等位基因结合的肿瘤抗原肽。例如，如果确定患者表达HLA-A2*01、HLA-B14*01和HLA-C05*01，则可以在患者中施用或使用以下肿瘤抗原肽的任何组合：(i)SEQ ID NO:14、17、45、48、51、56、75、77、82、98和/或100(结合HLA-A2*01)，(ii)SEQ ID NO:53(结合HLA-B14*01)，和/或(iii)SEQ ID NO:27(结合HLA-C05*01)。
在一种实施方式中，癌症是实体癌，优选卵巢癌症(ovarian cancer)。在一种实施方式中，卵巢癌症是卵巢癌(ovarian carcinoma)。在一种实施方式中，卵巢癌症是上皮癌、浆液性癌、小细胞癌、原发性腹膜癌、透明细胞癌或腺癌、子宫内膜样腺癌、恶性混合苗勒管瘤、粘液性腺癌或囊腺癌、恶性布伦纳瘤、移行细胞癌、性索间质瘤、颗粒细胞瘤、Sertoli-Leydig瘤、生殖细胞瘤、无性细胞瘤、绒毛膜癌、未成熟(实性)或成熟畸胎瘤、卵黄囊瘤、鳞状细胞癌或继发性卵巢癌。在一种实施方式中，卵巢癌症是I型卵巢癌症。在另一种实施方式中，卵巢癌症是II型卵巢癌症。在一种实施方式中，卵巢癌症是浆液性癌。在进一步的实施方式中，浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。在一种实施方式中，卵巢癌症是I、II、III或IV期卵巢癌症。
在一种实施方式中，根据本公开的肿瘤抗原肽、核酸、表达载体、T细胞受体、细胞(例如，T淋巴细胞、APC)和/或组合物或其任何组合，可以与一种或多种另外的活性剂或疗法组合使用以治疗癌症，诸如化学疗法(例如，长春花生物碱、破坏微管形成的试剂(诸如秋水仙碱及其衍生物)、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂(诸如酪氨酸激酶抑制剂)、过渡金属配合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物(诸如核苷类似物)、烷化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯类、类视黄醇类(诸如全反式视黄酸或其衍生物)、格尔德霉素或其衍生物(诸如17-AAG)、手术、免疫检查点抑制剂(免疫治疗剂(例如，PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂、B7-1/B7-2抑制剂)、抗体、基于细胞的疗法(例如，CAR T细胞)。在一种实施方式中，根据本公开的肿瘤抗原肽、核酸、表达载体、T细胞受体、细胞(例如，T淋巴细胞、APC)和/或组合物与免疫检查点抑制剂组合施用/使用。
实施例
通过以下非限制性实施例更详细地说明本公开。
实施例1：材料和方法
人HGSC样本。从组织溶液(格拉斯哥,GB)获得HGSC 1～6的肿瘤碎片和HGSC 1～3的匹配的正常邻近组织。从玛格丽特公主癌症中心(Princess Margaret CancerRegistry)(多伦多，安大略省，加拿大)获得肿瘤组织(OV606)或腹水(OV633和OV642)。速冻样本用于RNA提取和MHCI相关肽分离。从美国国家生物技术信息中心序列阅读档案项目PRJNA398141下下载OvCa48～114的RNA测序数据，转换为fastq文件，并且和其他样本一样处理。该队列中样本的MS原始数据是通过PRIDE合作伙伴从ProteomeXchange Consortium下载的，标识符为PXD007635。使用OptiTypeTMv1.0和默认参数从RNA测序(RNA-Seq)数据中获得每种样本的HLA分型(24)。样本信息见表1。
表1
Figure BDA0003429593530000351
Figure BDA0003429593530000361
RNA提取和测序。对于HGSC 1～6，使用制造商推荐的
Figure BDA0003429593530000362
DNA/RNA/miRNA通用试剂盒(Qiagen)分离总RNA。对于OV606、OV633和OV642，使用
Figure BDA0003429593530000363
(Invitrogen)分离总RNA。在2100
Figure BDA0003429593530000364
(Agilent Genomics)上评估每种样本的RNA以确保RIN>6，并且用于对每种样本进行一次RNA-Seq的重复。使用KAPA Stranded mRNA-Seq试剂盒从富集polyA的mRNA制备cDNA文库。文库进一步扩增并用于
Figure BDA0003429593530000365
2000或Illumina
Figure BDA0003429593530000366
500上的双端RNA-Seq，每种样本产生1.5亿～3亿个读数。
生成用于MS分析的定制参考数据库。对于每种样本，通过连接两种模块：“标准癌症蛋白质组”和“癌症特异性蛋白质组”如前所述(15和美国临时申请No.62/724,760)，生成定制的“全球癌症数据库”。简而言之，使用Trimmomatic v0.35(25)针对衔接头和低质量3'碱基修剪RNA-Seq读数。为了生成标准癌症蛋白质组，使用STAR v2.5.1b将修剪后的读数与参考人类基因组版本GRCh38.88对齐。使用默认参数，用kallisto v0.43.0以每百万的转录物(tpm)量化转录表达。使用FreeBayes(26)识别核苷酸变体，并将其转换为不可知的单核苷酸多态性文件格式作为pyGeno(27)的输入。然后，通过在参考基因组中插入单碱基变异(FreeBayes质量>20)，使用pyGeno构建每种样本的样本特异性蛋白质组。表达的蛋白质的样本特异性序列(tpm>0)以fasta格式添加到标准癌症蛋白质组中。
为了生成癌症特异性蛋白质组，使用FASTX-Toolkit 0.0.14版对修剪后的R1读数进行反向补充，并与修剪后的R2读数一起用于生成33-和24-核苷酸长的k-mer数据库。为了排除测序错误并限制数据库大小，对33-核苷酸应用了最小k-mer出现的样本特定阈值：HGSC1～3为7，OV642为8，OV633为10，HGSC4和OV606为4，HGSC5为6，HGSC6为5，以及OvCa48～114为3。通过减去人胸腺上皮细胞(TEC)中表达的k-mer获得癌症特异性k-mer，然后通过NEKTAR的kmer_组装工具(内部开发的软件，https://github.com/iric-soft/nektar)将其组装到更长的序列(重叠群(contig))中。长度>34个核苷酸的重叠群被3-框翻译成氨基酸序列，并在内部终止密码子处分裂。产生的至少8个氨基酸长的子序列包含在相关的癌症特异性蛋白质组中。
MAP的分离。将肿瘤和组织样本切成小块(立方体，～3mm大小)，并添加5ml含有蛋白质抑制剂混合物的冰冷PBS(Sigma，cat#P8340-5ml)。首先将组织均质两次，使用设定为速度20000rpm的Ultra TurraxTMT25均质器(IKA-Labortechnik)持续20秒，然后使用设定为速度25,000rpm的Ultra TurraxTMT8均质器(IKA-Labortechnik)持续20秒。然后，将550μl冰冷10X裂解缓冲液(5％w/v CHAPS)添加到每个样本中。在4℃下翻滚孵育60分钟后，样本在4℃下以10000g旋转30分钟。将上清液转移到含有1mg W6/32抗体共价交联蛋白质A磁珠的新管中，以及将MAP如前所述进行免疫沉淀(28)。然后使用Speed-Vac干燥MAP提取物，并在MS分析前保持冷冻。
MS分析。将干燥的肽提取物重新悬浮在0.2％甲酸中。在Easy-nLC II系统上将肽提取物加载到自制的C18分析柱(15cm x150μm内径，填充C18Jupiter PhenomenexTM)上，具有56-min梯度、0-30％乙腈(0.2％甲酸)和600nl.min-1流速。用Q-ExactiveTMHF质谱仪(Thermo Fisher Scientific)分析样本。每个完整的MS谱，以60,000的分辨率采集，然后是20个MS/MS谱，其中选择最丰富的多电荷离子进行MS/MS测序，分辨率为30,000，自动增益控制目标为5x104，注射时间为100ms，以及碰撞能量为25％。对于HGSC4～6，每个完整的MS谱，以60,000的分辨率采集，然后是20个MS/MS谱，其中选择最丰富的多电荷离子进行MS/MS测序，分辨率为30,000，自动增益控制目标为2x104，注射时间为800ms，以及碰撞能量为25％。
MAP的识别。使用PEAKS 8.5或Peaks X(Bioinformatics Solution Inc.)识别肽，并针对全球癌症数据库搜索肽序列。对于肽识别，前体和碎片离子的容差分别设置为10ppm和0.01Da。对于来自Schuster等人(13)的样本，前体和碎片离子的容差分别设置为5ppm和0.5Da。氧化(M)和脱酰胺(NQ)的发生被认为是翻译后修饰。对PEAKS分数应用了样本特定阈值，以确保MAP列表仅包含5％的诱饵识别。根据以下标准进一步过滤通过该阈值的肽：8-11个氨基酸之间的肽长度，以及基于NetMHC4.0(29)预测的MHC等位基因亲和力排名≤2％。
TSA候选者的识别和验证。为了识别TSA候选者，将每个MAP及其编码序列分别查询到相关癌症和正常标准蛋白质组或癌症和正常24-核苷酸长的k-mer数据库。使用从六个人类胸腺(15和美国临时申请No.62/724,760)中收获的纯化的TEC的RNA-Seq读数构建正常标准蛋白质组和正常24-核苷酸长的k-mer数据库。在两种情况下MAP被标记为TSA候选者：i)在样本的正常标准蛋白质组中或正常(即TEC)k-mer中均未检测到肽序列，或ii)癌症和正常标准蛋白质组中均不存在肽，并且与TEC相比，它们的RNA编码序列在癌细胞中过表达了至少10倍。当一个MAP对应于几个RNA序列时，只有当所有序列都与TSA候选状态一致时，才认为它是TSA候选者。所有TSA候选者的MS/MS谱都经过手动验证以去除任何错误识别。对于具有可通过MS区分的RNA数据支持的I/L变体的TSA候选者，如果表达最多的变体是TSA候选者，则进一步检查两种变体。
最后，通过使用BLAT(UCSC基因组浏览器)在参考基因组(GRCh38)上映射包含MAP编码序列的读数，将基因组位置分配给所有MS验证的TSA候选者。排除读数与高变区(HLA、Ig或TCR基因)匹配的TSA候选者。如果TSA候选者在其MAP编码序列中包含与已知种系多态性不匹配的变体(在dbSNP v149中报告)，则它们被归类为mTSA。未突变的候选者被归类为aeTSA候选者，并对其在正常组织和器官中的表达进行进一步评估。
编码aeTSA候选者的序列的组织表达。27种不同组织的RNA-Seq数据从基因型组织表达(GTEx)门户网站(于2018年4月16日访问，phs000424.v7.p2)下载，并用于评估aeTSA候选者的编码序列的表达，如前所述(15)。RNA-Seq数据获得自50个供体，但子宫颈(n＝6)、输卵管(n＝7)、脂肪组织(n＝49)、膀胱(n＝12)和肾脏(n＝38)除外。本研究中使用的GTEx数据集的登录号列于表2中。简而言之，完全覆盖MAP编码序列的读数数量是通过从每种组织的RNA-Seq读数转化而来的24-mer数据库中MAP编码序列的24-mer集的最小出现来估计的。读数计数被标准化为每亿个测序读数的读数(rphm)并进一步对数转换(log10(rphm+1))，并在每种组织可用的所有RNA-Seq实验中取平均值。在除了MHC低组织(脑皮质、神经和睾丸)以外的组织中在rphm>10时没有外周表达的aeTSA候选者被认为是真正的aeTSA。
表2
Figure BDA0003429593530000391
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Figure BDA0003429593530000411
Figure BDA0003429593530000421
TSA编码区的表达。TSA编码区的RNA表达使用R包“QuasR”(30)的“qCount”函数从映射的bam文件中量化，参数方向为“相同(same)”，作为与TSA编码链上的TSA编码区重叠的所有读数的计数。计数被标准化为每亿个映射读数的读数。在aeTSA表达分析中，我们专门分析了单个aeTSA映射到的独特区域，因为周围序列的上下文可能会影响aeTSA表达。
来自TCGA的临床和基因组数据。使用R包“TCGAbiolinks”(31)从TCGA开放访问数据库下载了处理的和标准化的hg38第3级数据，用于HM27甲基化、DNA拷贝数变异、RNA-Seq基因表达以及临床数据。从Broad Institute TCGA基因组数据分析中心(doi:10.7908/C1P84B9Q)下载臂水平DNA拷贝数改变。
免疫细胞分数。基于RNA-Seq数据估计代表免疫细胞群的免疫细胞分数。对于每种肿瘤，如Danaher等人(32)所述，将分数估计为其标记基因的对数转换FPKM值的平均值。
aeTSA呈递的频率。进行生物信息学模拟以估计个体患者呈递的aeTSA数量。该估计基于两个参数。首先，aeTSA表达的可能性基于TCGA-OV队列中表达相应RNA的肿瘤比例。对于包含种系SNP的aeTSA，表达可能性计算如下：(表达aeTSA的TCGA肿瘤的比例)x(给定群体中的SNP频率)。SNP频率是从基因组聚合数据库(Genome Aggregation Database)中获得的。其次，HLA等位基因频率是从美国国家骨髓捐赠计划(NMDP)中检索到的：欧裔美国人(n＝1242890)、非裔美国人(n＝416581)和中国人(n＝99672)。接下来，根据给定人群中报告的频率，用六个HLAI类等位基因模拟患者的HLA基因型。由于假设六个HLA等位基因是独立事件，因此模拟患者中的一些HLA基因座是纯合的。当aeTSA和相关HLA等位基因都被表达时，认为aeTSA在模拟患者中呈递。每个aeTSA的表达被认为是独立的事件，除了重叠aeTSA的表达状态仅对同一重叠组模拟一次。为三个群体中的每一个生成了100万模拟患者及其aeTSA呈递状态，并用于绘制分布图。
统计分析和数据可视化。使用R v3.5.1或Python v2.7.6进行分析和图像化。R中的“gplots”包用于生成肿瘤中TSA编码区表达的热图。除非另有说明，否则相关测试是使用R函数“cor.test”和斯皮尔曼方法完成的。涉及分布比较的检验采用ANOVA测试进行，组间成对比较采用威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验进行。生存分析的对数秩P值是用“生存”包计算的。
实施例2：蛋白质基因组学分析在23种HGSC中识别出111种TSA。
为了获得TSA景观的系统级特征，使用高通量串联质谱MS(MS/MS)分析(34-36)进行直接MAP识别。当前的搜索引擎依赖于用户定义的蛋白质数据库来将每个获得的MS/MS谱与肽序列进行匹配(37)。因此，测试样本中的肽只有在其序列包含在参考数据库中时才能被搜索引擎识别。由于通用参考蛋白质数据库诸如UniProt不包含样本特异性突变、框外翻译事件和非外显子序列，因此要捕获由所有基因组区域编码的TSA，对于每种肿瘤需要构建包含肿瘤特异性翻译产物的定制数据库。因此，最近描述的蛋白质基因组学方法(15)用于从分析的每种样本的RNA-Seq读数构建定制的搜索数据库。这种定制的数据库包含两种模块：标准蛋白质组(外显子的框内翻译)和癌症特异性蛋白质组，其是减去正常RNA序列(来自TEC)后的癌症特异性RNA序列的3-框翻译(图1)。TEC被用作正常对照有两个原因：i)它们在未成熟T细胞发育期间建立免疫耐受(即中枢耐受)中的关键作用，以及ii)与其他类型的体细胞相比，它们具有显著的混杂表达更多转录物的能力(38)。来自九种主要HGSC样本的MAP通过MHC I分子的免疫沉淀获得，然后通过液相色谱-MS/MS进行分析(15,28)。通过将本文所述的蛋白质基因组学方法应用于可获得匹配RNA-Seq和MS数据的样本，还重新分析了Schuster等人(13)报告的额外的14个HGSC队列的免疫肽组学数据。每种TSA候选者都通过手动验证谱和基因组位置来确认。
dbSNP中不存在的重叠基因组变异的候选者不太可能代表种系多态性，并因此被标记为mTSA。这种分类从分析的23种样本中产生了18种mTSA(表3A)。这些mTSA以前都没有报道过。在18种mTSA中，7种来自框内外显子翻译，4种来自框架外外显子翻译，以及8种来自非编码序列。对于三种肿瘤，存在匹配的正常组织并且RNA-Seq分析确认mTSA变体不是种系多态性(图8A-8B)。对于没有匹配的正常组织的肿瘤，不能正式排除某些mTSA可能对应于dbSNP中不存在的罕见多态性。mTSA的数量可能被稍微高估的可能性只会强化以下结论，即每种肿瘤少于1种mTSA(18种mTSA/23种肿瘤)，mTSA在HGSC中很罕见，并因此代表不太有吸引力的靶标。此外，由于经典的TSA发现方法严格关注由框内外显子翻译产生的mTSA，因此他们将仅发现本文报告的111种TSA中的7种。
表3A：本研究中识别的mTSA的特征
Figure BDA0003429593530000451
对于未突变的TSA候选者，应用严格的标准来识别那些真正的aeTSA，即其表达是癌症特异性的。为此，分析了它们在人体27种外周组织中的RNA表达。其编码RNA在除了MHC低组织(脑、神经、睾丸)以外的任何外周组织中表达(rphm>10)的所有候选者都被排除在aeTSA列表之外。当aeTSA候选者的编码序列包含种系单多态性(在dbSNP中报告的)时，只有当包含SNP的序列和参考序列满足上述标准时，该候选者才被标记为有效的aeTSA(图9)。总体而言，93种aeTSA候选者满足这些严格的标准(图2，表3B和3C)，其中85种据我们所知从未被报道过(表2B)。有趣的是，93种aeTSA中有5种在睾丸中表达，这表明某些癌症种系性抗原(CGA)是aeTSA，但大多数aeTSA不是CGA。CGA由通常仅由生殖细胞表达的标准外显子编码，且它们在癌细胞中的异常表达主要由表观遗传学改变驱动。然而，一些CGA由成体mTEC表达(16)，并且在mTEC(或其他体细胞组织)中表达的CGA被视为TAA，而不被任何正常组织(包括mTEC)表达的CGA被视为真正的aeTSA。
每种aeTSA都被分配了一个基因组位置。当可能存在多个位置时，选择具有匹配RNA读数的最高出现率的位置。表3B和3C中报告了所有TSA的特征。严格的方法可能低估了非典型翻译(5'UTR、3'UTR、基因间、移码)导致的aeTSA总数，这在形式上是可能的。事实上，虽然用于在肿瘤中生成MAP的阅读框是已知的，但当它们的编码RNA在一些正常组织中表达时，它无法推断出哪个阅读框可能被翻译。因此，此类aeTSA候选者被排除在外，以避免在TSA列表中包含误报。
表3B：本研究中识别的新型aeTSA的特征
Figure BDA0003429593530000461
Figure BDA0003429593530000471
Figure BDA0003429593530000481
1“翻译事件”列总结了TSA编码序列与ORF的关系，ORF之外为“非编码”、ORF重叠但移码为“外编码”、ORF匹配为“内编码”。
2“基因组起源”列根据Ensembl的生物型进一步注释了aeTSA。例如，根据Ensembl，“反义”是指序列作为注释基因处于相反的位置；“标准”是指标准的/注释的ORF；“ncRNA”是没有ORF的注释的RNA。
3“ncRNA”是指TSA编码序列与非编码转录物的外显子匹配时的情况。
4“非编码反义”是指TSA编码序列是Ensembl注释中基因的反义，因此它是非编码区。
表3C：本研究中识别的先前报告的aeTSA的特征
Figure BDA0003429593530000491
实施例3：大多数HGSC TSA是由非标准翻译产生的未突变的MAP
每种样本平均识别出2200种独特的MAP，总共发现111种独特的TSA(图3A)。每种样本识别的TSA数量与MAP数量显著相关(图3B)。此外，每种HLA等位基因的MAP数量与肿瘤样本大小之间存在适度的相关性(图10)。这与肿瘤样本大小是MS分析中的限制性因素的观点一致(28)。原则上，源自突变的非编码序列的TSA可以被指定为mTSA或aeTSA。任意地，决定将它们标记为mTSA。基本原理是，无论其基因组起源(外显子与否)，mTSA都有望成为“私有TSA”，即不会被大比例的肿瘤共享。相比之下，未突变的aeTSA理论上可以被很大比例的HGSC共享。
值得注意的是，在当前研究中或由Schuster等人最初处理的样本中识别出的TSA特征非常相似(图3C)。这表明本文所述的蛋白质基因组学方法可以应用于一般的RNA-Seq和MS数据，并且表面上不受实验室间变化性的影响。在这两列中，约83％的TSA是未突变的，并且大多数TSA由非标准翻译产生：主要来自非编码区，并在较小程度上来自框外外显子翻译(图3C)。aeTSA的两个特征值得注意：i)80％源自非编码序列，特别是内含子(31％)和基因间(22％)；以及ii)90％是新颖的MAP(图3D)。先前报道的MAP源自框内外显子翻译，但与处理的转录本(由Ensembl数据库注释的生物型)匹配的MAP除外，其相应的蛋白质同种型包含在UniProt数据库中(13,39-43和美国专利公开No.2012/0077696A1)。
实施例4：aeTSA编码转录物在卵巢癌症样本中的表达。
为了确定aeTSA编码转录物的癌症特异性表达是由随机转录噪声还是由反复转录异常引起，分析了编码本研究样本和TCGA卵巢癌症队列样本中识别的93种aeTSA的基因组区域的RNA表达。编码aeTSA的区域在相当大比例的卵巢癌中表达：72种(77％)在至少10％的样本中表达，且16种(17％)在至少80％的样本中表达(图4)。这些共同表达的区域具有在患者之间产生共享TSA的很高的潜力。因此可以得出结论，这组93种aeTSA编码转录物在HGSC中的表达不是罕见或随机事件，而是HGSC的共同特征。
实施例5：aeTSA表达的基因组相关性。
为了了解aeTSA表达的机制，使用来自TCGA-OV数据集的多组学数据来探索aeTSARNA表达与局部遗传或表观遗传畸变之间的关系。当适用时，测试了局灶DNA拷贝数变化(focal DNA copy number change)、基因启动子区域上的DNA甲基化水平和每种aeTSA的RNA表达之间的相关性(图5A)。当aeTSA源自作为基因一部分的基因组区域(外显子、内含子或UTR)时，还分析了相关基因的表达与aeTSA表达之间的相关性。在后一种情况下，观察到了基因和aeTSA表达之间的明显的相关性(图5A)。这表明，对于编码区在基因中的aeTSA，aeTSA表达的调控通常会影响整个基因。此外，DNA拷贝数的变化显示与aeTSA的RNA表达水平呈正相关；基因内aeTSA和基因外aeTSA(反义和基因间)都是这种情况。这表明DNA拷贝数改变对aeTSA表达有重大影响。值得注意的是，这种相关性对于在更大比例的肿瘤中表达的基因内aeTSA尤其强(图11A)。当检查aeTSA编码区的染色体分布时，发现在HGSC中经常扩增的几种染色体臂产生了许多aeTSA(图5B)。例如，通常在卵巢癌症中扩增的3号染色体长臂(44)是8种aeTSA的来源。作为最大的扩增区域之一，位于3q26.2(44)的MECOM产生了3种重叠的外显子框外aeTSA(表3B)。然而，要产生aeTSA，染色体臂的扩增并不总是必要的(例如，15q)，也不是充分的(例如，8q)(图5B、图11B)。
由于TCGA用于分析DNA甲基化的技术(HM27阵列)，无法获得基因外aeTSA和一些aeTSA源基因的启动子的甲基化数据。因此，启动子甲基化的分析仅限于17种aeTSA的子集。尽管如此，对于6种aeTSA，发现DNA甲基化和aeTSA表达之间存在显著相关性(图5A)。5例中呈负相关，且1例中呈正相关。这与启动子去甲基化经常导致转录增强的观点一致。值得注意的是，显示出最高负相关的两种基因是MAGEC1(＝-0.53,Padj＝1.6x10-26)和MAGEA4(＝-0.51,Padj＝6.7x10-25)，在图5A中由带箭头的黑条表示。MAGE家族的基因是在多种癌症类型中过表达的CGA，包括HGSC(3)。总体而言，可以得出结论，aeTSA表达至少部分地在转录水平上受基因拷贝数变异和DNA甲基化的调控。
实施例6：三种aeTSA的表达与改善的生存率相关
接下来，评估了一些aeTSA是否可能引发自发保护性免疫应答。由于aeTSA在肽水平上的表达，除了aeTSA RNA的表达外，还需要相关HLA同种异型的存在，因此解决这个问题很复杂。因此，根据个体aeTSA RNA的表达(或不表达)和相关HLA同种异型的存在(或不存在)，将来自TCGA队列的患者细分为四个亚组。三种aeTSA的呈递与更有利的临床结局相关(图6A-C)。HLA等位基因的多态性大大降低了每个组的规模，并因此也降低了该分析的统计功效。因此，三种aeTSA的对数秩p值在0.013至0.076的范围内(图6A-C)。尽管如此，两种观察结果提供了支持证据，表明这些相关性具有生物学意义。首先，这些aeTSA的“保护作用”似乎受HLA限制：在表达aeTSA RNA的患者中，当他们也表达相关HLA等位基因时，生存率更高。其次，RTHQMNTFQR aeTSA及其相关的HLA同种异型的表达显示与由T细胞和细胞毒性T细胞的肿瘤浸润呈正相关(图6D、E)；ANOVA，p<0.05。
实施例7：由个体肿瘤呈递的aeTSA的中位数
通过93种aeTSA的列表，最终估计了该研究可能有益于TSA靶向免疫疗法的范围。因此，随机模拟了一百万名患者中93种aeTSA的呈递状态。为了估计HLA等位基因频率，使用了来自美国国家骨髓捐赠计划的三个最大数据集：欧裔美国人、非裔美国人和中国人(45)。使用给定群体中的等位基因频率、TCGA-OV肿瘤中的表达比例和SNP频率(当适用时)，独立随机生成六种HLA等位基因和aeTSA表达状态。每种个体肿瘤的aeTSA数量计算为表达的HLA-aeTSA对的总和。根据这些模拟，确定在98％的欧洲白种人、74％的非裔美国人和78％的中国人中可以发现至少一种aeTSA，并且每种肿瘤的aeTSA的中位数在欧洲白种人中为5、在非裔美国人中为2以及在中国人中为4(图7)。这些人群之间的差异是由HLA等位基因频率的变化以及肿瘤样本主要来自欧洲白种人这一事实造成的。怀疑这些计算低估了每种肿瘤的aeTSA数量，主要有三个原因。首先，没有考虑到超过50％的MAP结合两种或更多种HLA同种异型，通常跨越超型或甚至基因座(46)的事实。其次，编码给定MAP的基因组区域经常产生由不同HLA同种异型呈递的重叠的MAP(23)。第三，对于dbSNP中列出的包含非同义SNP的五种aeTSA，假设了样本中只有产生MAP的SNP变体是有效的，而其他SNP变体不产生MAP。之所以采用这种谨慎的策略，是因为单个氨基酸的变化可能足以消除MAP呈递(47)。可以得出的结论是，包括当前93种aeTSA的集合在内的疫苗将几乎覆盖所有患有HGSC的白种人，以及很大比例的非裔美国人和亚洲人(例如中国人)。
尽管已经通过其特定实施方式的方式在上文中描述了本技术，但是在不脱离所附权利要求中限定的本发明的精神和本质的情况下可以对其进行修改。在权利要求中，词语“包含/包括”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括相应的复数参考。
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<400> 52
Ser Leu Asn Ser Arg Ser Gln Leu Lys
1 5
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Ser Arg Lys Ala His His Ala Leu
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Ser Ser Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Ser Ser Ser Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Thr Leu Ile Pro Arg Ile Leu Thr Leu
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Thr Leu Leu Pro Asp Leu Gln Thr Leu
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Thr Leu Val Val Ser Ile Ile Ile Tyr
1 5
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Thr Asn Ile Ile Lys His Leu Leu
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Thr Val Gln Asn Ser Arg Ser Leu Lys
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Val Leu Phe Leu Lys Leu Glu Leu Leu
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Val Leu Ser Pro Pro Leu Ser Pro Lys
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Tyr Leu Ala Thr Lys Phe Met Pro Ile
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Ser His Asn Leu Pro Ala Asn Ile Leu
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Thr Glu Ile Ser Asn Ser Gln Ala Ala
1 5
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Thr Pro Ser Ser His Leu Gly Leu Leu Ser Tyr
1 5 10
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Val Thr Ile Asp Thr Thr Gln Thr Lys
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Ala Pro Ala Ser Phe Ala Ala Thr Arg
1 5
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Ala Thr Leu Gln Ala Ala Ile Leu Tyr Glu Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Asp Leu Leu Lys Lys Thr Val Leu
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Asp Ser Ile Lys Ala Ser Thr Thr Leu
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Phe Ile Leu Asp Ile Ala Lys Leu Leu
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Ile Val Ser Ala Gln Asn Leu Ile Lys
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
Leu Cys Ile Lys Arg Phe Leu Ile
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 75
Leu Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Phe Leu
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
Leu Leu Gln Lys Arg Val Pro Glu
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Leu Leu Ser Ser Lys Leu Leu Leu Met
1 5
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
Leu Pro Gly Val Thr Arg Ser Leu
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 79
Leu Thr His Leu Val Ser Gln Glu Leu
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
Leu Thr Thr Thr Arg Val Ala Thr Ile
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Leu Val Phe Asn Ile Ile Leu His Arg
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
Met Val Ala Arg Leu Thr Pro Leu Leu
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Asn Ile Leu Gly Lys Ser Leu Thr Leu
1 5
<210> 84
<211> 9
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<213> 智人
<400> 84
Arg Leu Ala Thr Ala Pro Ser Glu Lys
1 5
<210> 85
<211> 9
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<213> 智人
<400> 85
Arg Thr Ala Thr Pro Leu Thr Met Lys
1 5
<210> 86
<211> 10
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<213> 智人
<400> 86
Arg Thr Ala Thr Pro Leu Thr Met Lys Lys
1 5 10
<210> 87
<211> 10
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<213> 智人
<400> 87
Arg Thr His Gln Met Asn Thr Phe Gln Arg
1 5 10
<210> 88
<211> 10
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<213> 智人
<400> 88
Tyr Leu Asp Thr Ala Gln Lys Asn Leu Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Glu Asn Val Leu Ser Lys Leu Tyr
1 5
<210> 90
<211> 9
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<213> 智人
<400> 90
Gly Thr Ala Gln Val Gly Ile Thr Lys
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Val Leu Ala Gly Thr Val Leu Phe Lys
1 5
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Arg Pro Gly Ala Gly Pro Pro Gly Ile Leu
1 5 10
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Ile Ile His Ser Ser Ser Leu Leu Leu
1 5
<210> 94
<211> 10
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<213> 智人
<400> 94
Ala Glu His Gln Glu Gly Thr Gly Thr Trp
1 5 10
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Glu Ala Leu Pro Asp Leu Glu Gln Leu
1 5
<210> 96
<211> 9
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<213> 智人
<400> 96
Gly Lys Asp Pro Asn Pro Val Val Leu
1 5
<210> 97
<211> 8
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<213> 智人
<400> 97
Pro Ser Pro Leu Arg Pro Ser Leu
1 5
<210> 98
<211> 10
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<213> 智人
<400> 98
Ser Leu Leu Asn Val Ile Gly Leu Ser Val
1 5 10
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Tyr Arg Ala Leu Ser Leu Ala Gly Leu
1 5
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Ser Leu Gly Ala Gly Leu Ser Pro Cys Leu
1 5 10
<210> 101
<211> 9
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<213> 智人
<400> 101
Ser Pro Gln Thr Gln Thr His Thr Leu
1 5
<210> 102
<211> 10
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<213> 智人
<400> 102
Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys
1 5 10
<210> 103
<211> 9
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<213> 智人
<400> 103
Thr Pro Lys Leu Arg Glu Thr Ser Val
1 5
<210> 104
<211> 9
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<213> 智人
<400> 104
Ala Ser Asn Pro Val Ile Lys Lys Lys
1 5
<210> 105
<211> 9
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<213> 智人
<400> 105
Ala Glu Glu Glu Ile Met Lys Lys Ile
1 5
<210> 106
<211> 9
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<213> 智人
<400> 106
Phe Ala Phe Gly Glu Pro Arg Glu Leu
1 5
<210> 107
<211> 9
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<213> 智人
<400> 107
Gly Thr Ser Pro Pro Ser Val Glu Lys
1 5
<210> 108
<211> 9
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<213> 智人
<400> 108
Ile Met Lys Lys Ile Arg Glu Ser Tyr
1 5
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Arg Val Lys Ser Thr Ile Ser Ser Leu
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met
1 5

Claims (63)

1.一种肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:1-103中所述的氨基酸序列之一。
2.如权利要求1所述的肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:19-103中所述的氨基酸序列之一。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*01:01分子结合并且包含SEQ ID NO:21、28、40、41、66或88中所述的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*02:01分子结合并且包含SEQ ID NO:1、19、20、22、30、31、36、50、52、60、62、73、84、85、86或91中所述的氨基酸序列。
5.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*11:01分子结合并且包含SEQ ID NO:32、54、55、67、69、81、87、90或102中所述的氨基酸序列。
6.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*24:02分子结合并且包含SEQ ID NO:33或43中所述的氨基酸序列。
7.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*25:01分子结合并且包含SEQ ID NO:24中所述的氨基酸序列之一。
8.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*29:02分子结合并且包含SEQ ID NO:34或58中所述的氨基酸序列之一。
9.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-A*32:01分子结合并且包含SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列。
10.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*07:02分子结合并且包含SEQ ID NO:4、6、8、9、26、49、78、92、97或101中所述的氨基酸序列。
11.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*08:01分子结合并且包含SEQ ID NO:23、35、42、44、46、59、63、70、74、76、83或103中所述的氨基酸序列之一。
12.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*14:01分子结合并且包含SEQ ID NO:53中所述的氨基酸序列。
13.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*15:01分子结合并且包含SEQ ID NO:2、3或5中所述的氨基酸序列。
14.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*18:01分子结合并且包含SEQ ID NO:89中所述的氨基酸序列。
15.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*39:01分子结合并且包含SEQ ID NO:47、64、96或99中所述的氨基酸序列。
16.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*40:01分子结合并且包含SEQ ID NO:11、12或13中所述的氨基酸序列。
17.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*44:02分子结合并且包含SEQ ID NO:65中所述的氨基酸序列。
18.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-B*44:03分子结合并且包含SEQ ID NO:37或94中所述的氨基酸序列。
19.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*03:03分子结合并且包含SEQ ID NO:10、29、71或95中所述的氨基酸序列。
20.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*04:01分子结合并且包含SEQ ID NO:6或15中所述的氨基酸序列。
21.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*05:01分子结合并且包含SEQ ID NO:27中所述的氨基酸序列。
22.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*06:02分子结合并且包含SEQ ID NO:18或72中所述的氨基酸序列。
23.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*07:01分子结合并且包含SEQ ID NO:38、61或93中所述的氨基酸序列。
24.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*07:02分子结合并且包含SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列。
25.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*12:03分子结合并且包含SEQ ID NO:80中所述的氨基酸序列。
26.如权利要求1或2所述的肿瘤抗原肽，其中，所述肿瘤抗原肽与HLA-C*14:02分子结合并且包含SEQ ID NO:25、57或79中所述的氨基酸序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的肿瘤抗原肽，所述肿瘤抗原肽由位于基因组的非蛋白质编码区的序列编码并且包含SEQ ID NO:1、4、6-8、10、13、15-27和36-99，优选SEQ IDNO:19-27和36-99中任一项所述的氨基酸序列。
28.如权利要求27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是非翻译转录区(UTR)，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:1、8、10、13、15和19-27，优选SEQ ID NO:19-27中任一项所述的氨基酸序列。
29.如权利要求27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是内含子，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:16、17和36-64，优选SEQ ID NO:36-64中任一项所述的氨基酸序列。
30.如权利要求27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是基因间区，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:65-84中任一项所述的氨基酸序列。
31.如权利要求27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是非编码RNA转录本(ncRNA)的外显子，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:4和85-92，优选SEQ IDNO:85-92中任一项所述的氨基酸序列。
32.如权利要求27所述的肿瘤抗原肽，其中，所述基因组的非蛋白质编码区是基因的反义链，并且所述肿瘤抗原肽包含SEQ ID NO:93-99中任一项所述的氨基酸序列。
33.一种编码权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽的核酸。
34.如权利要求33所述的核酸，所述核酸为mRNA或病毒载体。
35.一种脂质体，所述脂质体包含权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽或权利要求33或34所述的核酸。
36.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽、权利要求33或34所述的核酸或者权利要求35所述的脂质体以及药学上可接受的载体。
37.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽、权利要求33或34所述的核酸、权利要求35所述的脂质体或者权利要求36所述的组合物以及佐剂。
38.一种分离的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子，所述分离的MHC I类分子在其肽结合槽中包含权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽。
39.如权利要求38所述的分离的MHC I类分子，所述分离的MHC I类分子为多聚体形式。
40.如权利要求39所述的分离的MHC I类分子，其中，所述多聚体是四聚体。
41.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含(i)权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽或(ii)包含编码权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽的核苷酸序列的载体。
42.一种分离的细胞，所述分离的细胞在其表面表达主要组织相容性复合体(MHC)I类分子，所述MHC I类分子在其肽结合槽中包含权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽。
43.如权利要求42所述的细胞，所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。
44.如权利要求43所述的细胞，其中，所述APC是树突细胞。
45.一种T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体特异性识别权利要求38-40中任一项所述的分离的MHC I类分子和/或在权利要求42-44中任一项所述的细胞表面表达的MHC I类分子。
46.一种分离的CD8+T淋巴细胞，所述分离的CD8+T淋巴细胞在其细胞表面表达权利要求45所述的TCR。
47.一种细胞群，所述细胞群包含至少0.5％的如权利要求46所限定的CD8+T淋巴细胞。
48.一种治疗受试者卵巢癌的方法，包括向受试者施用有效量的：(i)权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)权利要求33或34所述的核酸；(iii)权利要求35所述的脂质体；(iv)权利要求36所述的组合物；(v)权利要求37所述的疫苗；(vi)权利要求41-45中任一项所述的细胞；(vii)权利要求46所述的CD8+T淋巴细胞；或(viii)权利要求47所述的细胞群。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述卵巢癌是浆液性癌。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。
51.如权利要求48-50中任一项所述的方法，进一步包括向受试者施用至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法。
52.如权利要求51所述的方法，其中，所述至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法是化疗剂、免疫疗法、免疫检查点抑制剂、放射疗法或手术。
53.(i)权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)权利要求33或34所述的核酸；(iii)权利要求35所述的脂质体；(iv)权利要求36所述的组合物；(v)权利要求37所述的疫苗；(vi)权利要求41-45中任一项所述的细胞；(vii)权利要求46所述的CD8+T淋巴细胞；或(viii)权利要求47所述的细胞群用于治疗受试者卵巢癌的用途。
54.(i)权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)权利要求33或34所述的核酸；(iii)权利要求35所述的脂质体；(iv)权利要求36所述的组合物；(v)权利要求37所述的疫苗；(vi)权利要求41-45中任一项所述的细胞；(vii)权利要求46所述的CD8+T淋巴细胞；或(viii)权利要求47所述的细胞群用于制造用于治疗受试者卵巢癌的药物的用途。
55.如权利要求53或54所述的用途，其中，所述卵巢癌是浆液性癌。
56.如权利要求55所述的用途，其中，所述浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。
57.如权利要求53-56中任一项所述的用途，还包括使用至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法。
58.如权利要求57所述的用途，其中，所述至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法是化疗剂、免疫疗法、免疫检查点抑制剂、放射疗法或手术。
59.(i)权利要求1-32中任一项所述的肿瘤抗原肽；(ii)权利要求33或34所述的核酸；(iii)权利要求35所述的脂质体；(iv)权利要求36所述的组合物；(v)权利要求37所述的疫苗；(vi)权利要求41-45中任一项所述的细胞；(vii)权利要求46所述的CD8+T淋巴细胞；或(viii)权利要求47所述的细胞群，用于治疗受试者卵巢癌的用途。
60.根据权利要求59所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+T淋巴细胞或细胞群，其中，所述卵巢癌是浆液性癌。
61.根据权利要求60所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+T淋巴细胞或细胞群，其中，所述浆液性癌是高级别浆液性癌(HGSC)。
62.根据权利要求59-61中任一项所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+T淋巴细胞或细胞群，其中，所述肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+T淋巴细胞或细胞群与至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法组合使用。
63.根据权利要求62所述用途的肿瘤抗原肽、核酸、脂质体、组合物、疫苗、细胞、CD8+T淋巴细胞或细胞群，其中，所述至少一种另外的抗肿瘤剂或疗法是化疗剂、免疫疗法、免疫检查点抑制剂、放射疗法或手术。
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